本發(fā)明屬于生活污水處理領(lǐng)域，具體地涉及一種水體凈化復(fù)合微生物菌劑的制備方法。
技術(shù)背景
我國面臨著水量型缺水和水質(zhì)型缺水的雙重考驗，人均水資源占有量低于世界平均水平，居民用水量逐漸加大，對于水環(huán)境質(zhì)量的關(guān)注和要求日漸提高。大量未處理生活污水的直接排放對于我國水環(huán)境的質(zhì)量造成了安全隱患如引起附近水體的富營養(yǎng)化等。生活污水主要來源于洗滌、廚房、沖廁，特征污染物為COD、TN、TP、SS、氨氮，其中總磷含量高容易造成水體的惡臭現(xiàn)象，并且我國污水處理總磷存在時高時低的波動情況，因此找出能夠持續(xù)高效降解污水中總磷的有效方法具有重要意義。
生物處理技術(shù)是利用微生物的代謝作用以污水中的磷元素作為營養(yǎng)基質(zhì)或者底物進(jìn)行降解，從而達(dá)到凈化污水的目的。與物理化學(xué)方法相比，生物處理法成本低，同時用于污水處理的微生物繁殖快，容易培養(yǎng)，適應(yīng)不同種類廢水環(huán)境的能力強。在生物處理技術(shù)領(lǐng)域，高效降解生活污水中特征污染物的菌株對污水的生物降解發(fā)揮著重要作用。
目前，用于高效降解生活污水的復(fù)合菌株的確定一般采用正交方法，正交方法存在單因素試驗次數(shù)多、周期長等弊端。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于水體凈化的復(fù)合微生物的篩選方法，具有省時、省力、省成本的優(yōu)勢。
本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種用于水體凈化的復(fù)合微生物菌劑的制備方法，步驟如下：
（1）菌種活化：
將在4℃溫度下斜面保存的1447酵母菌（CGMCC NO.2.3889）、枸杞酵母菌（CGMCC NO.2.3854）、酒精酵母菌（CGMCC NO.2.3868）、枯草芽孢桿菌（CGMCC NO.1.2172）、巨大芽孢桿菌（CGMCC NO.1.2927）活化，將其分別劃線于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上，其中酵母菌于28℃培養(yǎng)2天，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)1天；
（2）種子液制備：挑取活化的菌落，分別以1%接種量接種到各自液體培養(yǎng)基中，酵母菌于28℃、180rpm培養(yǎng)2天，細(xì)菌于37℃、220rpm培養(yǎng)1天；
所述種子培養(yǎng)基組成為：
酵母菌培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0，121℃滅菌20min；
細(xì)菌培養(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.2-7.4，121℃滅菌20min；
（3）菌種篩選
取處于生長至對數(shù)中期的五種菌體的種子液稀釋后調(diào)整為OD600為0.9，以五種菌體種子液添加量作為影響污水中總磷降解效果的因素，用minitab軟件中的分析因子設(shè)計對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，選用實驗次數(shù)為N=20次的實驗方法進(jìn)行PB實驗設(shè)計，設(shè)計兩個空白作為誤差分析項，對于每個菌體分別選取高水平（1）和低水平（-1），其中高水平的含義為向100mL污水中添加1.5mL種子液，低水平的含義為向100mL污水中添加1mL種子液，以污水中總磷降解率作為響應(yīng)值，單因素T檢驗（顯著性差別檢驗）結(jié)果表明1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌的p值小于0.05（置信限度為95%），由此確定1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌為影響污水中總磷降解的顯著性菌株；
（4）菌種復(fù)合
選取1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌作為降解污水中總磷的顯著性因素進(jìn)行最陡爬坡實驗，三株顯著性菌株對于污水中總磷降解顯示為正效應(yīng)，因此對于1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌分別選擇以3mL、2mL、1mL種子液體積作為變化的步長，酒精酵母和枯草芽孢桿菌選擇平均水平1.5mL進(jìn)行最陡爬坡實驗以找出使污水中總磷降解率能夠達(dá)到最佳水平的組合即中心點，1447酵母菌11mL、枸杞酵母9mL、酒精酵母1.5mL、巨大芽孢桿菌5mL、枯草芽孢桿菌1.5mL；
運用minitab軟件分析程序?qū)?0組實驗的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。經(jīng)過回歸方程擬合，因素1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌、酒精酵母和枯草芽孢桿菌對污水中總磷降解率的影響可以用函數(shù)式表示：
Y=93.095+1.082X1+1.668X2+1.15X3-3.288X12-2.419X22-4.824X32+0.719X1X2-2.994X1X3+2.375X2X3；
模型只顯示顯著性因素對總磷降解率的影響，不考慮非顯著性因素對于污水中總磷的降解效果，PB實驗已經(jīng)驗證顯著性因素；
其中Y代表污水中總磷的降解率；
X1，X2，X3分別代表1447酵母菌種子液體積，枸杞酵母種子液體積，巨大芽孢桿菌種子液體積；
用minitab軟件擬合回歸模型，擬合模型結(jié)果顯示調(diào)整系數(shù)R2=0.9768，說明模型可以解釋實驗所得的污水中總磷降解率的變化，方程擬合較好，實驗結(jié)果可信；
回歸模型分別對X1，X2，X3進(jìn)行求導(dǎo)解方程，得出實際所加1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌種子液體積分別為11mL、9mL、5mL；
（4）驗證試驗：進(jìn)行驗證污水處理實驗，實驗得出的總磷降解率的平均值與模型預(yù)測數(shù)值接近，說明模型能夠反應(yīng)出篩選出的菌株對于污水中總磷降解率的影響，用此方法確定出的最佳菌株組成具有可行性，最終確定用于污水處理的復(fù)合菌株配比為：1447酵母菌11mL、枸杞酵母9mL、酒精酵母1.5mL、巨大芽孢桿菌5mL、枯草芽孢桿菌1.5mL，總磷降解率為93.2%，處理后污水中總磷含量為4.5g/l，達(dá)到污水排放三級標(biāo)準(zhǔn)。
其中所述污水處理條件具體為：將培養(yǎng)至對數(shù)期的相應(yīng)菌株的種子液接種到生活污水中，隨后在搖床上以20℃、110rpm的條件進(jìn)行為期4天的凈化處理。取污水于10mL離心管中，于5000rpm、10min進(jìn)行離心處理，取上清液進(jìn)行總磷含量的測定，總磷含量測定采用過硫酸鉀消解法。
制備處理2L污水的混合菌株的種子液，分別檢測OD600數(shù)值（稀釋后調(diào)整為0.9），以脫脂奶粉作為保護(hù)劑，按照添加量5%與混合菌液進(jìn)行混合。設(shè)定噴霧干燥進(jìn)口溫度為110℃，出口溫度60℃，進(jìn)料速度16mL/min，霧化驅(qū)動，壓力0.6MPa，過100目篩收集樣品后于4℃條件下保存。
本發(fā)明創(chuàng)新點： PB實驗設(shè)計通常用于發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的相關(guān)研究，本文利用PB實驗設(shè)計確定影響污水中總磷降解的關(guān)鍵菌株，根據(jù)關(guān)鍵菌株的效應(yīng)以一定步長實施最斗爬坡實驗確定總磷降解率達(dá)到最佳水平的菌株組合即中心點，以污水中總磷降解率作為響應(yīng)值，以中心點顯示的理論種子液體積添加量實施中心復(fù)合實驗，以確定回歸模型。由回歸方程可以得知實際污水中總磷降解達(dá)到最佳效果所對應(yīng)的實際種子液添加量。由此方法可以最終確定污水處理領(lǐng)域中的菌株復(fù)配問題。這種方法具有省時、省力的優(yōu)勢，為污水處理領(lǐng)域混合菌株的配比以及其它領(lǐng)域的研究提供了一種可嘗試行的方法。
具體實施方式
一種用于水體凈化的復(fù)合微生物菌劑的制備方法，步驟如下：
（1）菌種活化：
將在4℃溫度下斜面保存的1447酵母菌（CGMCC NO.2.3889）、枸杞酵母菌（CGMCC NO.2.3854）、酒精酵母菌（CGMCC NO.2.3868）、枯草芽孢桿菌（CGMCC NO.1.2172）、巨大芽孢桿菌（CGMCC NO.1.2927）活化，將其分別劃線于相應(yīng)固體培養(yǎng)基上，其中酵母菌于28℃培養(yǎng)2天，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)1天；
（2）種子液制備：挑取活化的菌落，分別以1%接種量接種到各自液體培養(yǎng)基中，酵母菌于28℃、180rpm培養(yǎng)2天，細(xì)菌于37℃、220rpm培養(yǎng)1天；
所述種子培養(yǎng)基組成為：
酵母菌培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 6.0，121℃滅菌20min；
細(xì)菌培養(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.2-7.4，121℃滅菌20min；
（3）菌種篩選
取處于生長至對數(shù)中期的五種菌體的種子液稀釋后調(diào)整為OD600為0.9，以五種菌體種子液添加量作為影響污水中總磷降解效果的因素，用minitab軟件中的分析因子設(shè)計對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，選用實驗次數(shù)為N=20次的實驗方法進(jìn)行PB實驗設(shè)計，設(shè)計兩個空白作為誤差分析項，對于每個菌體分別選取高水平（1）和低水平（-1），其中高水平的含義為向100mL污水中添加1.5mL種子液，低水平的含義為向100mL污水中添加1mL種子液，以污水中總磷降解率作為響應(yīng)值，單因素T檢驗（顯著性差別檢驗）結(jié)果表明1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌的p值小于0.05（置信限度為95%），由此確定1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌為影響污水中總磷降解的顯著性菌株；
（4）菌種復(fù)合
選取1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌作為降解污水中總磷的顯著性因素進(jìn)行最陡爬坡實驗，三株顯著性菌株對于污水中總磷降解顯示為正效應(yīng)，因此對于1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌分別選擇以3mL、2mL、1mL種子液體積作為變化的步長，酒精酵母和枯草芽孢桿菌選擇平均水平1.5mL進(jìn)行最陡爬坡實驗以找出使污水中總磷降解率能夠達(dá)到最佳水平的組合即中心點，1447酵母菌11mL、枸杞酵母9mL、酒精酵母1.5mL、巨大芽孢桿菌5mL、枯草芽孢桿菌1.5mL；
運用minitab軟件分析程序?qū)?0組實驗的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。經(jīng)過回歸方程擬合，因素1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌、酒精酵母和枯草芽孢桿菌對污水中總磷降解率的影響可以用函數(shù)式表示：
Y=93.095+1.082X1+1.668X2+1.15X3-3.288X12-2.419X22-4.824X32+0.719X1X2-2.994X1X3+2.375X2X3；
模型只顯示顯著性因素對總磷降解率的影響，不考慮非顯著性因素對于污水中總磷的降解效果，PB實驗已經(jīng)驗證顯著性因素；
其中Y代表污水中總磷的降解率；
X1，X2，X3分別代表1447酵母菌種子液體積，枸杞酵母種子液體積，巨大芽孢桿菌種子液體積；
用minitab軟件擬合回歸模型，擬合模型結(jié)果顯示調(diào)整系數(shù)R2=0.9768，說明模型可以解釋實驗所得的污水中總磷降解率的變化，方程擬合較好，實驗結(jié)果可信；
回歸模型分別對X1，X2，X3進(jìn)行求導(dǎo)解方程，得出實際所加1447酵母菌、枸杞酵母菌、巨大芽孢桿菌種子液體積分別為11mL、9mL、5mL；
（4）驗證試驗：進(jìn)行驗證污水處理實驗，實驗得出的總磷降解率的平均值與模型預(yù)測數(shù)值接近，說明模型能夠反應(yīng)出篩選出的菌株對于污水中總磷降解率的影響，用此方法確定出的最佳菌株組成具有可行性，最終確定用于污水處理的復(fù)合菌株配比為：1447酵母菌11mL、枸杞酵母9mL、酒精酵母1.5mL、巨大芽孢桿菌5mL、枯草芽孢桿菌1.5mL，總磷降解率為93.2%，處理后污水中總磷含量為4.5g/l，達(dá)到污水排放三級標(biāo)準(zhǔn)。
其中所述污水處理條件具體為：將培養(yǎng)至對數(shù)期的相應(yīng)菌株的種子液接種到生活污水中，隨后在搖床上以20℃、110rpm的條件進(jìn)行為期4天的凈化處理。取污水于10mL離心管中，于5000rpm、10min進(jìn)行離心處理，取上清液進(jìn)行總磷含量的測定，總磷含量測定采用過硫酸鉀消解法。
制備處理2L污水的混合菌株的種子液，分別檢測OD600數(shù)值（稀釋后調(diào)整為0.9），以脫脂奶粉作為保護(hù)劑，按照添加量5%與混合菌液進(jìn)行混合。設(shè)定噴霧干燥進(jìn)口溫度為110℃，出口溫度60℃，進(jìn)料速度16mL/min，霧化驅(qū)動，壓力0.6MPa，過100目篩收集樣品后于4℃條件下保存。