本發(fā)明涉及一種降解煙堿的解淀粉芽孢桿菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18)以及利用該菌降解煙絲浸提液和煙株上部煙葉中煙堿的方法，屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

煙堿又名尼古丁，是存在于煙草中的主要生物堿，占生物堿量95％以上，也是卷煙和煙葉中的主要危害成分之一。目前的煙草生產(chǎn)需要煙葉中的煙堿含量達到適中即可，而我國煙草種植過程中由于大量施加化肥，導(dǎo)致上部煙葉中煙堿含量過高，部分上部煙葉中的煙堿含量達到5％以上；造成了該部分煙葉丟失了可利用的價值。據(jù)估算，每株煙草的上部煙葉的丟棄達到了3-5片之多，即有近20％以上的煙葉無法利用，這對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來說，是巨大的資源浪費。因此，本發(fā)明的目的是最大限度的利用上部煙葉，同時尋找一種適合普通煙堿降解的微生物。

目前控制或降低煙草中煙堿含量的方法主要有三種：第一種是對煙草種植進行調(diào)控：調(diào)控的方向主要從煙草的選育、煙草的栽培、煙草的生態(tài)、煙草的管理等各個方面來控制或降低煙草中煙堿含量；第二種是運用化學(xué)處理法：處理的方向是使用熱水、有機溶劑等對煙葉進行漂洗、萃取、蒸餾等操作，從而將煙葉上部分煙堿洗脫掉；第三種是利用微生物和酶降解煙堿。前兩種辦法不僅費時費力、經(jīng)濟成本高，而且降煙堿效果欠佳，而利用微生物降低卷煙煙堿含量、提高煙葉品質(zhì)、提高資源利用率等具有重大意義。因此，利用微生物降解煙株煙堿是最大限度利用上部煙葉，同時降低煙草中煙堿對人體、煙草生產(chǎn)帶來危害的有效途徑之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題是控制或降低現(xiàn)有的煙草生長過程中上部煙葉的煙堿含量，提供一種能降解上部煙葉煙堿的解淀粉芽孢桿菌DGY18，并利用該解淀粉芽孢桿菌DGY18降低上部煙葉、煙絲浸提液的煙堿含量、提高煙葉可利用性。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明使用以下技術(shù)方案：

一種降解煙堿的解淀粉芽孢桿菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18)，保藏編號為CGMCC NO.11900。

所述的解淀粉芽孢桿菌DGY18的應(yīng)用方法：將解淀粉芽孢桿菌DGY18配制成菌懸液，接種至煙絲浸提液，或者直接在健康煙株葉面噴灑。

應(yīng)用于煙絲浸提液接種的解淀粉芽孢桿菌DGY18菌懸液的制備方法為：純菌株接入5mL液體煙堿培養(yǎng)基中,30℃,200r/min搖床震蕩培養(yǎng)2d，然后將培養(yǎng)液10000r/min離心10min，收集菌體，用0.9％生理鹽水將離心后的菌體配制成菌體濃度為10⁷-10⁸CFU/mL的菌懸液。

所述的煙堿培養(yǎng)基配方:K₂HPO₄ 13.3g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，微量元素溶液0.5mL，調(diào)pH至7.0，定容至1000mL，滅菌后以濾菌法加入1g純煙堿，混勻；所述的微量元素溶液是用0.1mol/L鹽酸將MnSO₄·7H₂O 0.4g，CaCl₂·2H₂O 0.2g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.2g溶解并定容至100mL。

按煙絲浸提液體積5-10％接種解淀粉芽孢桿菌DGY18后，在30℃條件下120r/min搖床培養(yǎng)4-8天。

所述的煙絲浸提液配方：稱取10g煙絲粉，13.3g K₂HPO₄·3H₂O，4g KH₂PO₄·3H₂O，0.2g MgSO₄·7H₂O，1g麥芽糖，1g蛋白胨，量取0.5mL微量元素溶液加入到500mL的蒸餾水中，用蒸餾水定容至1000mL，分裝，殺菌；所述的微量元素溶液是用0.1mol/L鹽酸將MnSO₄·7H₂O 0.4g，CaCl₂·2H₂O 0.2g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.2g溶解并定容至100mL。

應(yīng)用于煙株葉面噴灑的解淀粉芽孢桿菌DGY18菌懸液的制備方法為：純菌株接入100mL液體營養(yǎng)培養(yǎng)基30℃，120r/min的搖床振蕩培養(yǎng)過夜，按體積百分比取5％-10％培養(yǎng)液加入到2.5L的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。

所述的液體營養(yǎng)基配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1000mL，調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2。

每株健康煙株噴灑25mL菌懸液。

所述的內(nèi)生菌的解淀粉芽孢桿菌DGY18獲得方法為：

取生長性狀良好、無病蟲害癥狀的、有代表性的健康煙草整株煙草植株，于超凈工作臺下分別取其葉脈、莖、根，用無菌水處理干凈，分別取其前中后三段，分別放入75％的酒精中浸泡5min，用無菌濾紙擦干；去除外表皮切成薄片；用無菌鑷子將薄片放到三種培養(yǎng)基的表面，每個平板放3片。將平板分別放置于37℃與28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3天，將生長出來的煙草內(nèi)生菌放在煙堿培養(yǎng)基中，觀察其生長情況。將初篩得到的降煙堿純菌株分別接入裝有5mL液體煙堿培養(yǎng)基的試管中,搖床震蕩培養(yǎng)2d,然后將培養(yǎng)液10000r/min離心10min，用0.9％生理鹽水將離心后的菌體配制成菌懸液，再將5mL菌懸液加入裝有45mL液體煙堿培養(yǎng)基的三角瓶中,每種降煙堿株3個平行,于30℃,200r/min的搖床振蕩培養(yǎng),以50mL未加煙堿的液體培養(yǎng)基作為空白,每2d測1次培養(yǎng)液中的煙堿含量,判定菌株降解煙堿的能力。

菌株DGY18在牛肉膏瓊脂平板上生長良好，菌落周圍不整齊，呈現(xiàn)鋸齒狀，菌落白色、表面不濕潤、干燥而有皺褶，邊緣凸起，不透明。在光學(xué)顯微鏡下觀察，DGY18菌株為規(guī)則的長桿菌，兩段鈍圓而平整，往往成對分布，中生芽孢，菌體周圍無夾膜或粘液層。營養(yǎng)瓊脂平板生長情況很好，菌落形狀不規(guī)則，邊緣齒輪型，呈乳白色，表面粗糙、褶皺，凹起，不透明。菌株DGY18是一種桿菌，成對生長，兩端鈍圓，在48小時后有芽孢產(chǎn)生，無莢膜。

根據(jù)16SrDNA序列分析，確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名為Bacillus amyloliquefaciens DGY18。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明從煙草植株中分離一株降解煙堿的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌DGY18，利用該內(nèi)生菌可使上部煙葉中的煙堿降解30％-40％；煙絲浸提液中的煙堿降解98％。本發(fā)明比使用煙草種植、化學(xué)處理法等調(diào)控措施來降低煙草中煙堿含量的方法更省時省力，而且成本低、降煙堿效果更佳，不僅降低了煙堿的含量，還提高了煙草的可利用性，因而內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌DGY18在降低上部煙葉煙堿含量方面具有良好的應(yīng)用前景。

解淀粉芽孢桿菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18)

保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏編號為：CGMCC No.11900

保藏日期：2015年12月22日

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

具體實施方式：

下面結(jié)合實施例證進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。

煙絲浸提液中煙堿降解率的測定：

配制一系列濃度梯度的含有煙堿的溶液，在紫外可見分光光度計上測煙堿的吸光度值，得到吸光度值和煙堿濃度的線性相關(guān)曲線。

煙堿降解率的計算過程：

煙堿降解率＝100％×(C₀－C₁)/C₀

C₀：接入菌株解淀粉芽孢桿菌DGY18前液體煙堿培養(yǎng)基中煙堿濃度；

C₁：接入解淀粉芽孢桿菌DGY18后某天液體煙堿培養(yǎng)基中煙堿濃度。

煙葉中煙堿含量的測定：

準確稱取煙葉樣品0.1g到100ml三角瓶中，再稱取樣品兩倍的活性炭粉末加入25ml，0.5mol/L的HCl溶液搖勻，在沸水中加熱5min，取出定容至250ml容量瓶中，用濾紙過濾，去掉開始的10ml濾液，再過濾大約30ml進行比色，分光光度計測定濾液，236nm、259nm、282nm波長處的吸光度。

計算公式：

游離煙堿(mg/g)＝1.059×[A₂₅₉—0.5(A₂₃₆+A₂₈₂)]×V×1 000/樣品重×(1-含水率)×34.3×1 000

1.059為校正系數(shù)，V為定容體積，34.3為煙堿的比吸收系數(shù)。

實施例1

煙絲浸提液配方：稱取10g煙絲粉，13.3g K₂HPO4·3H₂O，4g KH₂PO₄·3H₂O，0.2g MgSO₄·7H₂O，1g麥芽糖，1g蛋白胨，量取0.5mL微量元素溶液(微量元素溶液是用0.1mol/L鹽酸將MnSO₄·7H₂O 0.4g，CaCl₂·2H₂O 0.2g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.2g溶解并定容至100mL。)加入到500mL的蒸餾水中，用蒸餾水定容至1000mL，分裝，殺菌。

應(yīng)用于煙絲浸提液接種的解淀粉芽孢桿菌DGY18菌懸液的制備：純菌株接入5mL液體煙堿培養(yǎng)基中,30℃,200r/min搖床震蕩培養(yǎng)2d，然后將培養(yǎng)液10000r/min離心10min，收集菌體，用0.9％生理鹽水將離心后的菌體配制成菌懸液(菌體濃度為10⁷-10⁸CFU/mL)。

煙堿培養(yǎng)基配方:K₂HPO₄ 13.3g，KH₂PO₄ 4g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，微量元素溶液0.5mL，調(diào)pH至7.0，定容至1000mL，滅菌后以濾菌法加入1g純煙堿，混勻；所述的微量元素溶液是用0.1mol/L鹽酸將MnSO₄·7H₂O 0.4g，CaCl₂·2H₂O 0.2g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.2g溶解并定容至100mL。

按煙絲浸提液體積5-10％接種解淀粉芽孢桿菌DGY18后，在30℃條件下120r/min搖床培養(yǎng)4-8天；最后煙堿降解率達98％。

實施例2

應(yīng)用于煙株葉面噴灑的解淀粉芽孢桿菌DGY18菌懸液的制備：純菌株接入100mL液體營養(yǎng)培養(yǎng)基30℃，120r/min的搖床振蕩培養(yǎng)過夜，按體積百分比取5％-10％培養(yǎng)液加入到2.5L的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。液體營養(yǎng)基配方：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，水1000mL，調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2。在煙草生長進入成熟期，每株煙重點噴灑上部的6片煙葉，每株煙株噴灑25mL菌液，處理20天(每隔2天處理一次，即第1、4、7、10、13、16、19天各處理一次，于當(dāng)天的傍晚進行處理)，第0、3、6、9、12、15、18天(于當(dāng)天早晨取樣)對各處理煙株的煙葉各取樣一次，采用所述的煙堿測定方法對煙株的煙堿含量進行測定，在試驗期間，煙堿含量下降了30％-40％。