本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無苦味的蝦類低分子肽及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖和加工的大國，近幾年僅蝦類的年產(chǎn)量都超過100萬噸。其中，蝦類加工產(chǎn)生大量的下腳料，以及捕撈獲得大量難以加工的小蝦，約占蝦類總量的40％以上，通常只能被用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料或生產(chǎn)蝦醬食品等。蝦類加工下腳料和低值小蝦富含蛋白質(zhì)，近期成為人們開發(fā)氨基酸、活性肽、調(diào)味基料等產(chǎn)品的重要資源。低分子肽具有易被吸收和呈味等特性，其不同風(fēng)味取決于肽鏈長短、氨基酸組成及排列等，是食品工業(yè)領(lǐng)域中開發(fā)和應(yīng)用的熱點(diǎn)。但是，肽鏈經(jīng)酶解作用后，過多的疏水氨基酸暴露于肽端，易導(dǎo)致產(chǎn)物呈現(xiàn)苦味，嚴(yán)重的苦味會(huì)影響低分子肽在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。
低分子肽苦味去除的方法目前主要有吸附法、掩蓋法、微膠囊化法、酶解法和微生物法等，其中酶解法和微生物法是具有巨大潛力的脫苦方法，是苦味去除研究的熱點(diǎn)。酶解脫苦法主要直接利用氨肽酶對(duì)肽端的疏水氨基酸進(jìn)行切除，微生物脫苦法則通過微生物分泌氨肽酶，進(jìn)而切除肽端的疏水氨基酸而達(dá)到脫苦目的。氨肽酶高產(chǎn)菌種報(bào)道極少，國內(nèi)氨肽酶制劑生產(chǎn)尚是空白，目前僅有諾維信公司生產(chǎn)的風(fēng)味蛋白酶制劑可以應(yīng)用于低分子肽的脫苦。但是，風(fēng)味蛋白酶制劑是內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的混合制劑，利用它進(jìn)行酶解脫苦時(shí)，低分子肽酶解程度不易控制，易造成產(chǎn)物分子過小和特定產(chǎn)物得率過低。另外，氨肽酶提取與純化的成本約占酶制劑生產(chǎn)成本的70％左右，如果直接利用氨肽酶制劑進(jìn)行脫苦，還有生產(chǎn)成本過高的缺點(diǎn)。因此，選育氨肽酶高產(chǎn)菌種，直接利用微生物發(fā)酵法對(duì)低分子肽進(jìn)行脫苦，將具有產(chǎn)物得率高、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，是未來最具有應(yīng)用潛力的脫苦方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種枯草芽孢桿菌。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種無苦味的蝦類低分子肽的制備方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到無苦味的蝦類低分子肽。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述無苦味的蝦類低分子肽的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌，菌種命名為Bacillus subtilis YBPE-4，是從豆豉中分離獲得的。
所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YBPE-4的保藏信息：保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年6月30日，保藏地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC NO:M 2016359。
一種無苦味的蝦類低分子肽的制備方法，包含如下步驟：
(1)蝦類酶解：將經(jīng)干燥處理的蝦粉碎過篩，得到粉體；粉體與水混合，然后加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后加熱對(duì)酶進(jìn)行滅活，得到酶解液；
(2)種子液的準(zhǔn)備：取部分步驟(1)制得的酶解液，加入15～25g/L可溶性淀粉和1.5～2.5g/L磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH6.5～7.5，滅菌冷卻后接入氨肽酶產(chǎn)生菌菌種，然后33～37℃、160～200rpm下培養(yǎng)24～28h，得到種子液；
(3)低分子肽的發(fā)酵脫苦：取剩余步驟(1)制得的酶解液，加入30～40g/L可溶性淀粉和1.5～2.0g/L磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH6.5～7.5，裝入通氣攪拌發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接入步驟(2)制得的種子液，于33～37℃下進(jìn)行發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200～250rpm，根據(jù)菌體需氧量控制通氣比為0.2～1.6vvm(相對(duì)于發(fā)酵液的初始體積)，至132～144h結(jié)束發(fā)酵；
(4)脫苦后低分子肽的分離與干燥：將步驟(3)發(fā)酵后的發(fā)酵液進(jìn)行菌體滅活，然后離心去除發(fā)酵液中菌體和大顆粒物質(zhì)，收集上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜進(jìn)行超濾除去上清液中大分子物質(zhì)，得到透過液；再利用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過液進(jìn)行濃縮并去除小分子物質(zhì)，得到濃縮液；然后，將超濾濃縮液進(jìn)一步真空蒸發(fā)濃縮并干燥，得到無苦味的低分子肽。
為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟(2)中所述的可溶性淀粉和磷酸二氫鉀均為食品級(jí)原料；
步驟(1)中所述的蝦優(yōu)選為小蝦，小蝦屬于低值蝦，才注重綜合利用；如果是大蝦，主要直接用于食用或簡單加工后食用。
步驟(1)中所述的過篩優(yōu)選為過80～120目篩；
步驟(1)中所述的水與粉體的質(zhì)量比(液固比)優(yōu)選為(15～20):1；
步驟(1)中所述的中性蛋白酶的用量為每克蛋白質(zhì)(粉體所含蛋白)加入4000～5000U的中性蛋白酶；
步驟(1)中所述的酶解的條件優(yōu)選為45～55℃酶解4～6h；
步驟(1)中所述的滅活的條件優(yōu)選為加熱至80℃～90℃，恒溫10～15min；
步驟(2)中所述的酶解液的用量為步驟(1)制得的酶解液總質(zhì)量的5％～10％；
步驟(2)中所述的氨肽酶產(chǎn)生菌優(yōu)選為枯草芽孢桿菌YBPE-4，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016359；
步驟(2)中所述的種子液中的菌體濃度優(yōu)選為(1.0～2.5)×1010個(gè)/mL；
步驟(2)和步驟(3)中所述的滅菌的條件優(yōu)選為121℃滅菌20min；
步驟(3)中所述的發(fā)酵液發(fā)酵至72h，亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到3400～4000U/mL；
步驟(4)中所述的滅活的條件優(yōu)選為121～125℃，保溫15～25min，對(duì)菌體進(jìn)行加熱滅活；加熱滅活后優(yōu)選冷卻至70～75℃后再離心；
步驟(4)中所述的離心的條件優(yōu)選為5000～6000rpm離心15～25min；
步驟(4)中所述的收集上清液的方式優(yōu)選為：發(fā)酵液離心分離后，優(yōu)選用相當(dāng)于20％～30％發(fā)酵液體積的去離子水洗滌離心沉淀物，然后離心分離洗滌液，收集合并兩次離心所得的上清液；
步驟(4)所述的利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過濾，當(dāng)濃縮液體積達(dá)到上清液體積的10％～12％時(shí)，向濃縮液加入2～3倍體積的去離子水，再進(jìn)行第二次超濾，使最終的濃縮液體積為發(fā)酵液體積的10％～12％，收集與合并兩次超濾的透過液；
步驟(4)中所述的濃縮液的體積優(yōu)選為透過液的10％～12％；
步驟(4)中所述的濃縮的方式優(yōu)選為：利用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過液進(jìn)行濃縮，當(dāng)濃縮液體積達(dá)到透過液體積的10％～12％時(shí)，向濃縮液加入2～3倍體積的去離子水，再進(jìn)行第二次超濾，使最終的濃縮液體積為透過液體積的10％～12％，收集最終的濃縮液；
步驟(4)中所述的超濾濃縮液真空蒸發(fā)濃縮后，去除55％～65％水分；
步驟(4)中所述的干燥優(yōu)選噴霧干燥；
一種無苦味的蝦類低分子肽，通過上述制備方法制備得到；
所述的無苦味的蝦類低分子肽的分子量為360～5000Da，相對(duì)于原料中蛋白質(zhì)的得率為51％～54％；
所述的無苦味的蝦類低分子肽在食品生產(chǎn)或食品添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。
本發(fā)明原理：中性蛋白酶是內(nèi)切型蛋白酶，用于蝦蛋白的水解，可從任意位置切斷肽鏈，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為不同分子量的低分子肽；枯草芽孢桿菌CCTCC NO:M 2016359是高產(chǎn)氨肽酶的菌種，在含有上述低分子肽的培養(yǎng)基中進(jìn)行生長和代謝，可大量分泌氨肽酶，從肽鏈N端切除疏水氨基酸，使低分子肽的苦味減弱或消除；微生物發(fā)酵脫苦后，經(jīng)離心分離、超濾膜分離與濃縮，再經(jīng)干燥，最后可獲得無苦味的低分子肽。本發(fā)明的核心是氨肽酶高產(chǎn)菌種的發(fā)酵技術(shù)，通過微生物發(fā)酵脫苦作用，消除低分子肽的苦味，解決低分子肽苦味限制其應(yīng)用的問題。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
(1)本發(fā)明利用氨肽酶高產(chǎn)菌種對(duì)低分子肽進(jìn)行發(fā)酵脫苦，與風(fēng)味蛋白酶脫苦法相比，不但具有苦味去除效果好、產(chǎn)物得率高等優(yōu)點(diǎn)，而且可節(jié)約酶制劑分離純化成本，有利于降低綜合生產(chǎn)成本。
(2)本發(fā)明在脫苦前，無需對(duì)酶解分離液進(jìn)行分離、干燥等處理，直接利用蝦干粉酶解液配制成氨肽酶高產(chǎn)菌種的培養(yǎng)基，可節(jié)省中間產(chǎn)物干燥而產(chǎn)生的能耗費(fèi)用，也有利于降低生產(chǎn)成本。
(3)本發(fā)明選擇低值蝦為原料，綜合利用酶解技術(shù)、微生物發(fā)酵技術(shù)和超濾膜分離技術(shù)等制取無苦味的低分子肽，既為低值蝦的綜合利用提供一個(gè)有效途徑，也為其它低值水產(chǎn)品的綜合利用提供有價(jià)值的參考，有利于促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及加工業(yè)的發(fā)展。
(4)本發(fā)明將蝦類經(jīng)干燥、粉碎、中性蛋白酶酶解，分離得到酶解液。利用酶解液、可溶性淀粉和磷酸二氫鉀配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接入成熟的枯草芽孢桿菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)培養(yǎng)液，進(jìn)行攪拌通氣發(fā)酵132～144h；發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，獲得上清液，經(jīng)超濾膜過濾，獲得分子量為360～5000Da的濾液；濾液經(jīng)干燥，最后獲得無苦味的蝦類低分子肽產(chǎn)品。本發(fā)明具有蝦類低分子肽苦味去除效果好、產(chǎn)物得率高等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)成本較低，適宜于低值蝦產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)無苦味低分子肽，應(yīng)用前景良好。
附圖說明
圖1是本發(fā)明蝦類多肽的微生物脫苦流程圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
中性蛋白酶購自北京奧博星生物科技有限公司，酶活力6.0×104U/g；
實(shí)施例中涉及到的滅菌的條件為121℃滅菌20min；
亮氨酸氨肽酶活力定義：在40℃、pH8.0的條件下，每分鐘催化L-亮氨酸-4-硝基苯胺生成1μg對(duì)硝基苯胺所需的酶量為1個(gè)酶活力單位；
實(shí)施例1
(1)氨肽酶高產(chǎn)菌種的分離與篩選
富集培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，冷卻后備用。
平板分離培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，酪蛋白15g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，冷卻后備用。
斜面培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，冷卻后備用。
發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉40g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，冷卻后備用。
豆豉為市售材料，將10g豆豉接入200mL的富集培養(yǎng)基中，置于30℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板分離培養(yǎng)基，置于30℃下培養(yǎng)36～48h，挑取菌落周圍有明顯透明圈的菌株56株，接入斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)出菌苔后，置于4℃冰箱保藏。
將各菌株的斜面菌種分別接入裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，每瓶接入2環(huán)菌苔，置于37℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)72h。培養(yǎng)液在6000rpm條件下離心20min，取上清液，測定氨肽酶活力。氨肽酶活力測定方法參照文獻(xiàn)(吳慶勛,谷海先,趙光鰲.N+注入誘變選育氨肽酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件初步優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(1):15-18)。經(jīng)測定，菌株YBPE-4(即枯草芽孢桿菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359)的產(chǎn)酶最高，其發(fā)酵液的氨肽酶活力達(dá)3882U/mL，故優(yōu)選為本發(fā)明的發(fā)酵菌種。
(2)菌種的鑒定
利用16S rDNA進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，首先提取菌株YBPE-4(即枯草芽孢桿菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359)的16S rDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、純化，送至測序公司進(jìn)行序列檢測，然后在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中檢索同源性。
經(jīng)序列檢測，該菌種的1492R/27F PCR產(chǎn)物的DNA片段總長為1439bp，即枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YBPE-4菌株的16S rDNA序列，具體如下：
TCCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTGTAGGAGCCAGCCGCCGAAGTGACATG。
經(jīng)同源性檢索，發(fā)現(xiàn)該菌種與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性達(dá)99％，故該菌種被鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YBPE-4。
(3)菌種的保藏
將該菌種送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，上述鑒定結(jié)果獲得中國典型培養(yǎng)物保藏中心的確認(rèn)，并獲得保藏編號(hào)，即為枯草芽孢桿菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359。
所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YBPE-4的保藏信息：保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年6月30日，保藏地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC NO:M 2016359。
實(shí)施例2
(1)蝦類酶解
將經(jīng)干燥處理的小蝦粉碎過100目篩，得到粉體；稱取1200g粉體(蛋白質(zhì)含量為56.2％)，加入18L水，混勻；然后加入56.2g中性蛋白酶，55℃酶解4h，然后加熱至85℃恒溫12min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，得到酶解液；
(2)種子液的準(zhǔn)備
取900mL酶解液，加入18g可溶性淀粉和1.8g磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH7.0，平均分裝入5個(gè)1000mL三角瓶，滅菌冷卻后，接入枯草芽孢桿菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)的斜面菌種，每瓶接入2環(huán)菌苔，于37℃、160rpm下培養(yǎng)24h，得到菌體濃度為1.08×1010個(gè)/mL的種子液；
(3)低分子肽的發(fā)酵脫苦
取剩余的酶解液17.1L，加入684g可溶性淀粉和29.93g磷酸二氫鉀，混勻，調(diào)節(jié)pH7.0，裝入30L的通氣攪拌發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接入900mL步驟(2)制得的種子液，啟動(dòng)攪拌和通入無菌空氣進(jìn)行發(fā)酵：在發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度控制為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速控制為220rpm；發(fā)酵0～60h，隨著菌體量增大，通氣量由3.6L/min逐步增大至28.8L/min；發(fā)酵61～72h，通氣量控制為28.8L/min；發(fā)酵73～108h，通氣量控制為21.6L/min；發(fā)酵109～120h，通氣量控制為18L/min；發(fā)酵121～144h，通氣量控制為14.4L/min；發(fā)酵至144h，結(jié)束發(fā)酵；其中，發(fā)酵至72h，發(fā)酵液的亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到3426U/mL；
(4)脫苦后低分子肽的分離與干燥
用蒸汽加熱步驟(3)發(fā)酵后的發(fā)酵液至123℃，保溫20min，冷卻至70℃，5500rpm離心20min，用5.4L去離子水洗滌離心沉淀物，再進(jìn)行第二次離心，收集與合并兩次離心所得的上清液，得到18.6L上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾，當(dāng)發(fā)酵液濃縮至2.23L時(shí)，加入6.69L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.23L，收集與合并兩次超濾的透過液，得透過液23L；然后用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃液體積達(dá)到2.76L時(shí)，加入8.28L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.76L，收集濃縮液，即為分子量為360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、溫度60℃的條件下進(jìn)行真空蒸發(fā)，將濃縮液進(jìn)一步濃縮至1.24L，再進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為75℃，最后得到365g粉體產(chǎn)品，即為無苦味的低分子肽。經(jīng)檢測與計(jì)算，粉體產(chǎn)品中低分子肽含量為94.8％，低分子肽相對(duì)于蛋白質(zhì)的得率為51.3％。以硫酸奎寧溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物進(jìn)行苦味的感官評(píng)定，所得產(chǎn)品沒有苦味。
實(shí)施例3
(1)蝦類酶解
將經(jīng)干燥處理的小蝦粉碎過80目篩，得到粉體；稱取900g粉體(蛋白質(zhì)含量為56.2％)，加入18L水，混勻；然后加入33.72g中性蛋白酶，50℃酶解5h，然后加熱至80℃，恒溫15min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，得到酶解液；
(2)種子液的準(zhǔn)備
取1800mL酶解液，加入27g可溶性淀粉和2.7g磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH6.5，平均分裝入10個(gè)1000mL三角瓶，滅菌冷卻后，接入枯草芽孢桿菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)的斜面菌種，每瓶接入2環(huán)菌苔，于33℃、200rpm下培養(yǎng)28h，得到菌體濃度為2.49×1010個(gè)/mL的種子液；
(3)低分子肽的發(fā)酵脫苦：
取剩余的酶解液16.2L，加入567g可溶性淀粉和32.4g磷酸二氫鉀，混勻，調(diào)節(jié)pH6.5，裝入30L的通氣攪拌發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接入1800mL步驟(2)制得的種子液，啟動(dòng)攪拌和通入無菌空氣進(jìn)行發(fā)酵：在發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度控制為33℃，攪拌轉(zhuǎn)速控制為250rpm；發(fā)酵0～54h，隨著菌體量增大，通氣量由3.6L/min逐步增大至28.8L/min；發(fā)酵55～64h，通氣量控制為28.8L/min；發(fā)酵65～72h，通氣量控制為25.2L/min；發(fā)酵73～84h，通氣量控制為21.6L/min；發(fā)酵85～102h，通氣量控制為18L/min；發(fā)酵103～132h，通氣量控制為14.4L/min；發(fā)酵至132h，結(jié)束發(fā)酵；其中，發(fā)酵至72h，發(fā)酵液的亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到3992U/mL；
(4)脫苦后低分子肽的分離與干燥
用蒸汽加熱步驟(3)發(fā)酵后的發(fā)酵液至121℃，保溫25min，冷卻至72℃，5000rpm離心25min，用3.6L去離子水洗滌離心沉淀物，再進(jìn)行第二次離心，收集與合并兩次離心所得的上清液，得到18.4L上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾，當(dāng)上清液濃縮至1.84L時(shí)，加入3.68L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至1.84L，收集與合并兩次超濾的透過液，得透過液20.2L；然后用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃液體積達(dá)到2.02L時(shí)，加入4.04L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.02L，收集濃縮液，即為分子量為360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、溫度60℃的條件下進(jìn)行真空蒸發(fā)，將濃縮液進(jìn)一步濃縮至0.707L，再進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為75℃，最后得到285g粉體產(chǎn)品，即為無苦味的低分子肽。經(jīng)檢測與計(jì)算，粉體產(chǎn)品中低分子肽含量為95.3％，低分子肽相對(duì)于蛋白質(zhì)的得率為53.7％。以硫酸奎寧溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物進(jìn)行苦味的感官評(píng)定，所得產(chǎn)品沒有苦味。
實(shí)施例4
(1)蝦類酶解
將經(jīng)干燥處理的小蝦粉碎過120目篩，得到粉體；稱取1100g粉體(蛋白質(zhì)含量為56.2％)，加入19.25L水，混勻，加入46.37g中性蛋白酶，于45℃酶解6h，然后加熱至90℃，恒溫10min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，得到酶解液；
(2)種子液的準(zhǔn)備
取1540mL酶解液，加入38.5g可溶性淀粉和3.85g磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH7.5，平均分裝入8個(gè)1000mL三角瓶，121℃滅菌20min，冷卻后，接入枯草芽孢桿菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)的斜面菌種，每瓶接入2環(huán)菌苔，于35℃、180rpm下培養(yǎng)26h，得到菌體濃度為1.77×1010個(gè)/mL的種子液；
(3)低分子肽的發(fā)酵脫苦：
取剩余的酶解液17.71L，加入531g可溶性淀粉和26.57g磷酸二氫鉀，混勻，調(diào)節(jié)pH7.5，裝入30L的通氣攪拌發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接入1540mL步驟(2)制得的種子液，啟動(dòng)攪拌和通入無菌空氣進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度控制為35℃，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200rpm；發(fā)酵0～60h，隨著菌體量增大，通氣量由3.85L/min逐步增大至30.8L/min；發(fā)酵61～72h，通氣量控制為30.8L/min；發(fā)酵73～84h，通氣量控制為23L/min；發(fā)酵85～108h，通氣量控制為19.25L/min；發(fā)酵109～140h，通氣量控制為15.4L/min；發(fā)酵至140h，結(jié)束發(fā)酵；其中，發(fā)酵至72h，發(fā)酵液的亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到3764U/mL；
(4)脫苦后低分子肽的分離與干燥
用蒸汽加熱步驟(3)發(fā)酵后的發(fā)酵液至125℃，保溫15min，冷卻至75℃，6000rpm離心15min，用4.8L去離子水洗滌離心沉淀物，再進(jìn)行第二次離心，收集與合并兩次離心所得的上清液，得到20.2L上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾，當(dāng)上清液濃縮至2.22L時(shí)，加入5.55L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.22L，收集與合并兩次超濾的透過液，得透過液23.5L；然后用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃液體積達(dá)到2.59L時(shí)，加入6.48L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.59L，收集濃縮液，即為分子量為360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、溫度60℃的條件下進(jìn)行真空蒸發(fā)，將濃縮液進(jìn)一步濃縮至1.04L，再進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為75℃，最后得到348g粉體產(chǎn)品，即為無苦味的低分子肽。經(jīng)檢測與計(jì)算，粉體產(chǎn)品中低分子肽含量為94.9％，低分子肽相對(duì)于蛋白質(zhì)的得率為53.4％。以硫酸奎寧溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物進(jìn)行苦味的感官評(píng)定，所得產(chǎn)品沒有苦味。
對(duì)比實(shí)施例1
(1)蝦類酶解
將經(jīng)干燥處理的小蝦粉碎過100目篩，得到粉體；稱取900g粉體(蛋白質(zhì)含量為56.2％)，加入18L水，混勻，加入33.72g中性蛋白酶，于50℃酶解5h，然后加熱至80℃，恒溫10min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，得到酶解液；
(2)風(fēng)味蛋白酶的酶解脫苦
在步驟(1)制得的酶解液中，加入40.5g風(fēng)味蛋白酶(諾維信公司，酶活力1.5×104U/g)，于50℃酶解2h，然后加熱至80℃，恒溫15min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫備用；
(3)脫苦后低分子肽的分離與干燥
將脫苦后的酶解液于5000rpm離心20min，用5.4L去離子水洗滌離心沉淀物，再進(jìn)行第二次離心，收集與合并兩次離心所得的上清液，得到21.5L上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃縮液體積為2.15L時(shí)，加入6.45L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.15L，收集與合并兩次超濾的透過液，得透過液25.8L；然后，用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃液體積達(dá)到2.58L時(shí)，加入5.16L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.58L，收集濃縮液，即為分子量為360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、溫度60℃的條件下進(jìn)行真空蒸發(fā)，將濃縮液進(jìn)一步濃縮至0.92L，再進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為75℃，最后得到218g粉體產(chǎn)品。經(jīng)檢測與計(jì)算，粉體產(chǎn)品中低分子肽含量為94.3％，低分子肽相對(duì)于蛋白質(zhì)的得率為40.6％。以硫酸奎寧溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物進(jìn)行苦味的感官評(píng)定(參考文獻(xiàn)：潘進(jìn)權(quán).毛霉AS3.2778脯氨酸氨肽酶的部分純化及性質(zhì)研究【J】.食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(4):26-31)，所得產(chǎn)品呈現(xiàn)微苦。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。