肽的制作方法
【專利說明】肽 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及肽，其至少部分可衍生于VIII因子（FVIII)。所述肽可以用于減少或 阻止VIII因子抑制物抗體的形成（例如在A型血友病治療和獲得性血友病中）。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 血友病
[0004] 血友病屬于一組可遺傳血液病癥，其包括A型血友病、B型血友病（Christmas?。?以及馮維勒布蘭德氏?。╒onWillebrand'sdisease)。
[0005] 在血友病中，由于基本凝血因子部分或完全缺失，血液凝結的能力嚴重降低，導致 出血時間增加。
[0006]A型血友病是凝血因子VIII的缺陷，而B型血友病是凝血因子IX的缺陷。在兩種 疾病中，缺陷基因發(fā)現于X染色體上，因此這些病患是X連鎖的。A型血友病比B型血友病 常見五倍。
[0007] 血友病是一種終身的遺傳基因病患，其影響作為攜帶者的女性以及遺傳病患的男 性。約三分之一的新診斷沒有以前的家族史。其出現于世界各地，并在所有人種群體中發(fā) 生。在英國，約有6000人受到血友病的影響。
[0008] 血友病患者在損傷后長時間出血。外部損傷例如割傷和擦傷通常不造成嚴重問 題；通過應用一定程度的壓力并覆蓋受到影響的區(qū)域（例如使用膏藥），通?？赡苤寡?。
[0009] 主要的問題是進入關節(jié)、肌肉和軟組織的內出血，其可以自發(fā)發(fā)生。內出血例如進 入腦部的出血非常難以應對，并可能致命。關節(jié)中的反復出血導致劇烈的疼痛并可能導致 關節(jié)炎和/或長期關節(jié)損傷，導致殘疾。
[0010] 血友病的治療通常是通過置換缺失的凝血因子。在輕度或中度血友病中，可以在 出血發(fā)生時給予注射（按需治療）。然而，在重度血友病中，給予定期預防性注射來幫助血 液凝結，并最小化長期關節(jié)損傷的可能性。
[0011]A型血友病的凝血因子置換療法的潛在嚴重并發(fā)癥是中和VIII因子促凝血功能 的抗體的形成。VIII因子抑制物發(fā)生于大約25%的重度A型血友病中。由于患有先天性A 型血友病的患者可能是FVIII遺傳缺陷的，抑制物的合成是針對施用來阻止或治療出血事 件的外源蛋白的同種免疫應答。
[0012] ⑶4+T細胞在針對FVIII的免疫應答中扮演中心角色。在被抗原提呈細胞 (APCs)吸收后，FVIII經歷蛋白降解為肽片段（Reding等，（2006)Haemophilia12(supp 6) 30-36)。這些肽然后與MHCII類分子聯(lián)合，提呈在APC的表面。這一復合物然后被FVIII 特異性的CD4+T細胞的T細胞受體識別。在合適的共刺激信號存在下，這一識別最終引起 CD4+細胞指導B細胞的抗體合成。
[0013] 抑制物形成的發(fā)生率最初隨著VIII因子治療的數量而增加，但在50-100暴露天 數后似乎達到穩(wěn)定。抑制物的形成在重度血友病中比在中度或輕度疾病中更為常見，并且 一些分子缺陷（最清楚的是VIII因子輕鏈中的大缺失和無義突變）似乎偏向于抑制物的 形成。參數例如濃度、置換因子的類型（純化的或重組的），以及治療史也可能影響抗體產 生的可能性。
[0014] 帶有抑制物的血友病患者的處理是持續(xù)的挑戰(zhàn)。使用脫敏技術的免疫耐受誘導 (ITI)在一些帶有針對VIII因子的同種抗體的相同患者中是成功的。這種治療方法要求對 因子置換療法的進行中的暴露，因此是一種長期的策略。
[0015] 雖然ITI可以是成功的，但相當大比例（約30% )的患者未能對ITI響應。帶 有高抑制物滴度的患者不太可能對治療響應。另一個重要的影響因素是ITI開始時的年 齡，當患者超過20歲時，成功率大幅下降（Hay等，（2005)SeminarsinThrombosisand Hemostasis32:15-21)。
[0016]當ITI療法不成功時，抑制物通常會存留一生，并且因為這些病人通常是高反應 者，必須使用FVIII繞過產品（例如活化的凝血酶原復合物濃縮物（FEIBA?)，以及重組活化 的FVII)治療出血事件。然而，這些試劑的使用與不良反應關聯(lián)，例如彌散性血管內凝血， 急性心肌梗塞，肺檢子和血檢形成（Acharya和DiMichele(2006)BestPractice&Research ClinicalHaematology19:51-66)。
[0017] 免疫抑制療法有時用于未能對ITI反應的患者。治療包括施用免疫抑制藥物例如 環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide)、潑尼松（prednisone)、硫挫嗓呤（azathioprine)和環(huán)抱素 (cyclosporine)，其非特異性靶向免疫系統(tǒng)。這些治療可以具有與一般的免疫抑制相關的 副作用。
[0018]對使用Rituximab?(-種針對B細胞⑶20抗原的人源化單克隆抗體）的選擇性B細胞耗竭有新的興趣。然而，在一些使用這種藥物治療的兒童中發(fā)生了輸注反應、血清病 以及機會性感染（X*iMichele(2007)JThrombHaemost5:143-50)。
[0019] 獲得性血友病
[0020] 獲得性血友病是一種罕見的自身免疫病患，其在每百萬人中影響1到4個人。在 這種病患中，生來沒有血友病的受試者形成出針對一種凝血因子例如VIII因子的抗體。據 認為懷孕和自身免疫疾病例如類風濕性關節(jié)炎和癌癥可能增加形成獲得性血友病的風險。 雖然引起其產生的根本免疫機制不同，在響應凝結因子置換療法中產生的FVIII抑制物的 臨床表現和那些在獲得性血友病中產生的FVIII抑制物的臨床表現類似。
[0021] 獲得性血友病患者具有接近25%的死亡率，部分因為獲得性抑制物和嚴重出血并 發(fā)癥相關。獲得性自身抗體抑制物的療法主要是基于需要控制或阻止急性出血并發(fā)癥（其 通常威脅生命和肢體），其次是根除自身抗體來恢復正常凝血。
[0022] -些與低滴度自身抗體抑制物（〈5個Bethesda單位）相關的出血可以通過高劑 量FVIII濃縮物的施用有效治療。豬FVIII濃縮物曾經被認為是用于獲得性血友病相關出 血的重要一線療法，因為其是提供在實驗室中實際測量輸注后FVIII凝結活性水平的機會 的唯一置換療法。因為豬血漿庫被豬細小病毒污染，這一產品在2004年從市場上移除?，F 在，"繞過"試劑是最為常用的，但存在促凝性（thrombogenicity)的潛在風險，并且對于每 個產品僅有約80%的效力。通過血衆(zhòng)除去法（plasmapheresis)和身體外免疫吸附的血衆(zhòng) 置換對于臨時減少抑制物滴度，使得足以繞過試劑或FVIII置換提供充分止血可以是必要 的。
[0023]自身抗體抑制物的根除依賴于免疫抑制措施，例如：（1)在3-6周中施用 30% -50%效力的皮質類固醇；（2)使用細胞毒性和骨髓抑制性化療試劑，例如環(huán)磷酰胺、 環(huán)孢素、2-氯脫氧腺苷；（3)使用靜脈內免疫球蛋白的免疫調節(jié)；以及（4)使用利普西單抗 (rituximab)的選擇性B淋巴細胞耗竭。Rituximab?的響應者可能要求同時使用類固醇， 而且復發(fā)可能響應再治療。
[0024] 因此，所有目前可用的降低A型血友病治療相關的同種抗體產生和獲得性血友病 中自身抗體產生的方法都有缺點。因此，需要改進的方法來在A型血友病和獲得性血友病 中解決抗FVIII抗體的問題。
[0025] 本發(fā)明的發(fā)明人已經發(fā)現，有可能通過使用FVIII衍生肽預耐受化 (pre-toerise)患者來阻止FVIII抑制物抗體的形成，以及通過施用FVIII衍生肽以減少 FVIII抑制物抗體來治療病患，例如血友病。
[0026] 發(fā)明概述
[0027] 因此，本發(fā)明的第一個方面涉及能夠誘導或恢復對FVIII的耐受性的肽，其至少 部分序列衍生于FVIII。
[0028] 在本發(fā)明第一個方面的第一個實施方案中，本發(fā)明提供包含FVIII衍生序列 DNMVTFRNQASRPY的肽，其具有以下序列中的一項：
[0029] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 17)
[0030] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 18)
[0031] Lys-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No. 19)
[0032] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 25)
[0033] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 26)
[0034] Lys-Glu-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No. 27)
[0035] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 29)
[0036] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 30)以及
[0037] Glu-Lys-Gly-Asp-Asn-Ile-Met-Val-Thr-Phe-Arg-Asn-Gln-Ala-Ser-Arg-Pr〇-T yr-Gly-Glu-Lys(SEQ ID No.31)。
[0038] 在第二個實施方案中，本發(fā)明提供包含FVIII衍生序列PRCLTRYYSSFVNME的肽，其 具有以下序列中的一項：
[0039] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ ID No. 1)
[0040] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu(SEQ ID No. 2)
[0041] Lys-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQIDNo. 3)
[0042] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.5)
[0043] Glu-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQ IDNo.7)
[0044] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.9)
[0045] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Glu(SEQ IDNo.10)
[0046] Lys-Glu-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Glu-Lys(SEQ IDNo.11)以及
[0047] Glu-Lys-Gly-Pr〇-Arg-Cys-Leu-Thr-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ser-Phe-Val-Asn-Met-G lu-Gly-Lys-Lys(SEQ IDNo.13)。
[0048] 在第二個方面，本發(fā)明提供包含多種肽的組合物，其包括根據本發(fā)明第一個方面 的一種或多種肽。
[0049] 所述組合物可以包含根據本發(fā)明第一個方面的第一個實施方案的至少一種肽和 根據第二個實施方案的至少一種肽。
[0050] 所述組合物可以包含具有SEQIDNO. 1的肽和具有SEQIDN0. 17的肽。
[0051] 所述組合物可以是試劑盒的形式，其中所述多種肽是分開提供的，用于分開、隨 后、序貫或同時施用。
[0052] 本發(fā)明的所述肽或試劑盒可以用于抑制、減輕或阻止VIII因子抑制物抗體的形 成。
[0053] 本發(fā)明還提供了此類肽或組合物在制造抑制、減少或阻止VIII因子抑制物抗體 形成的藥物中的用途。
[0054] 本發(fā)明也提供用于抑制、阻止或減少受試者中VIII因子抑制物抗體的形成的方 法，其包含將這種肽或組合物施用于所述受試者的步驟。
[0055] 所述受試者可以是FVIII缺陷的，特別是所述受試者可以具有A型血友病，并可以 或即將經歷VIII因子置換療法。
[0056] 或者，所述受試者可以具有或有風險染上獲得性血友病。
[0057] VIII因子抑制物在表達HLA-DR2的個體中更常找到。因此，通過本發(fā)明所述方法 治療的受試者可以是HLA-DR2陽性的。
[0058] 附圖簡述
[0059] 圖1:修飾的FVIII肽的溶解度
[0060]共測試了 32 種肽：其中 16 種基于FVIII肽PRCLTRYYSSFVNME( "PRCLT"）（SEQID No. 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13) ;16 種基于FVIII肽DNMVTFRNQASRPY( "DNMV"） (SEQIDN〇.17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32)。測試了其相對于無 關對照肽（4Y)的溶解度，已知所述無關對照肽對于作為耐受化抗原的應用是足夠可溶的。 在圖表中，綠色代表至少與4Y-樣可溶的肽，橙色代表不太與4Y-樣可溶，但相當接近的 肽，紅色代表不與4Y-樣可溶的肽。編碼為綠色的