專利名稱：與tall-1結(jié)合的肽和相關(guān)分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及2001年5月11日提交的美國臨時申請60/290,196，該申請被引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
在對腫瘤壞死進行若干年的研究之后，最終在1984年克隆了腫瘤壞死因子(TNFs)α和β。在隨后的幾年中，發(fā)現(xiàn)了TNF細胞因子超家族，包括fas配體(FasL)、CD27配體(CD27L)、CD30配體(CD30L)、CD40配體(CD40L)、TNF-相關(guān)的細胞程序死亡誘導(dǎo)配體(TRAIL，又被稱為AGP-1)，骨保護素(osteoprotegerin)結(jié)合蛋白(OPG-BP或OPG配體)，4-1BB配體，LIGHT，APRIL，和TALL-1。Smith等(1994)，Cell 76959-962；Lacey等(1998)，Cell 93165-176；Chichepotiche等(1997)，J.Biol.Chem.27232401-32410；Mauri等(1998)，Immunity 821-30；Hahne等(1998)，J.Exp.Med.1881185-90；Shu等(1999)，J.Leukocyte Biology 65680-3。該家族是通過它的結(jié)構(gòu)，特別是C-末端而統(tǒng)一化的。另外，迄今為止，已知的大多數(shù)成員是在免疫區(qū)室(compartment)中表達的，不過，某些成員也可以在其他組織或器官中表達。Smith等(1994)，Cell 76959-62。除了LT-α以外的所有配體都是II型跨膜蛋白，以在C-末端細胞外結(jié)構(gòu)域中的保守的150個氨基酸區(qū)域為特征。盡管局限于僅有20-25％的相同性，所述保守的150個氨基酸結(jié)構(gòu)域折疊成特有的β-折疊片夾層，并且三聚體化。所述保守片段可以通過蛋白水解釋放，從而產(chǎn)生可溶性功能形式。Banner等(1993)，Cell 73431-445。
該配體家族的很多成員都是在富含淋巴的組織中表達的，并且在免疫系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Smith等(1994)。例如，TNFα主要是由巨噬細胞合成的，并且是炎性反應(yīng)和免疫防御的重要介體。Tracey & Cerami(1994)，Ann.Rev.Med.45491-503。Fas-L主要在激活的T細胞中表達，調(diào)節(jié)胸腺細胞的TCR介導(dǎo)的細胞程序死亡。Nagata，S.& Suda，T.(1995)Immunology Today 1639-43；Castrim等(1996)，Immunity 5617-27。CD40L也能通過激活的T細胞表達，提供了B細胞存活、增殖和免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)變的重要信號。Noelle(1996)，Immunity4415-9。
業(yè)已鑒定了大多數(shù)TNF配體家族成員的關(guān)聯(lián)受體。所述受體在它們的細胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)擁有特有的多個富含半胱氨酸的重復(fù)序列，并且在細胞質(zhì)區(qū)內(nèi)不具有催化性基序。Smith等(1994)。所述受體信號通過直接與死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(例如TRADD，F(xiàn)ADD，和RIP)或TRAF蛋白(例如TRAF2，TRAF3，TRAF5，和TRAF6)相互作用，啟動多樣的和重疊的信號傳導(dǎo)途徑，例如，細胞程序死亡，NF-κB激活，或JNK激活。Wallach等(1999)，Annual Review of Immunology 17331-67。所述信號傳導(dǎo)事件導(dǎo)致細胞死亡、增殖、激活或分化。每一個受體成員的表達方式是不同的。例如，TNFR1是在多種組織和細胞中表達的，而OPGL的細胞表面受體主要局限于破骨細胞。Hsu等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 963540-5。
最近，多個研究小組業(yè)已證實TNF家族配體具有相同的或大體上相似的序列。所述配體擁有各種不同的名稱neutrokineα(WO98/18921，
公開日為1998年5月7日)，63954(WO98/27114，
公開日為1998年6月25日)，TL5(EP869 180，
公開日為1998年10月7日)，NTN-2(WO98/55620和WO98/55621，
公開日為1998年12月10日)，TNRL1-α(WO9911791，
公開日為1999年3月11日)，kay配體(WO99/12964，
公開日為1999年3月18日)，和AGP-3(1999年2月12日提交的美國臨時申請60/119,906和1999年11月18日提交的60/166,271)；和TALL-1(WO00/68378，
公開日為2000年11月16日)。以上每一份文獻都被引入本文作為參考。在下文中，上面所報導(dǎo)的配體被統(tǒng)稱為TALL-1。
TALL-1是TNF配體超家族的一個成員，它在功能上與B細胞存活和增殖相關(guān)。超量表達TALL-1的轉(zhuǎn)基因小鼠，具有嚴重的B細胞增殖過度和狼瘡樣自身免疫疾病。Khare等(2000)PNAS 97(7)3370-3375)。TACI和BCMA都起著TALL-1細胞表面受體的作用。Gross等(2000)，Nature 404995-999；Ware(2000)，J.Exp.Med.192(11)F35-F37；Ware(2000)，Nature 404949-950；Xia等(2000)，J.Exp.Med.192(1)137-143；Yu等(2000)，Nature Immunology 1(3)252-256；Marsters等(2000)，Current Biology 10785-788；Hatzoglou等(2000)J.of Immunology 1651322-1330；Shu等(2000)PNAS 97(16)9156-9161；Thompson等(2000)J.Exp.Med.192(1)129-135；Mukhopadhyay等(1999)J.Biol.Chem.274(23)15978-81；Shu等(1999)J.Leukocyte Biol.65680-683；Gruss等(1995)Blood 85(12)3378-3404；Smith等(1994)，Cell 76959-962；美國專利5,969,102，于1999年10月19日授權(quán)；WO00/67034，
公開日為2000年11月9日；WO00/40716，
公開日為2000年7月13日；WO99/35170，
公開日為1999年7月15日。以上兩種受體都是在B細胞上表達的，并且通過與TRAF蛋白相互作用傳導(dǎo)信號。另外，TACI和BCMA還能結(jié)合TNF配體家族的另一個成員APRIL。Yu等(2000)，NatureImmunology 1(3)252-256。還證實了APRIL能誘導(dǎo)B細胞增殖。
迄今為止，尚未披露采用TALL-1的肽調(diào)節(jié)劑的重組或修飾蛋白。重組和修飾蛋白是一類新興的治療劑。蛋白治療劑的有用的修飾包括與一種抗體的“Fc”結(jié)構(gòu)域結(jié)合，以及與諸如聚乙二醇(PEG)和葡聚糖的聚合物連接。所述修飾在題為“作為治療劑的修飾肽”的公開號為WO00/24782專利申請中有詳細說明，該專利申請被以全文形式引入本文參考。
一種開發(fā)治療劑的非常不同的方法是肽文庫篩選。蛋白配體與它的受體的相互作用，通常是在較大的界面上進行的。不過，正如在人類生長激素及其受體上所證實的，在所述界面上僅有少數(shù)的關(guān)鍵殘基提供了大部分的結(jié)合能量。Clackson等(1995)，Science 267383-6。所述蛋白配體總體上在正確拓撲學(xué)上僅僅發(fā)揮結(jié)合表位的作用，或發(fā)揮與結(jié)合無關(guān)的功能。因此，僅為“肽”長度(2-40個氨基酸)的分子能夠結(jié)合在特定大型蛋白配體的受體蛋白上。所述肽可以模擬所述大型蛋白配體的生物活性(“肽刺激劑”)或通過競爭結(jié)合，抑制所述大型蛋白配體的生物活性(“肽拮抗劑”)。
噬菌體展示肽文庫業(yè)已作為鑒定所述肽刺激劑和拮抗劑的有效方法出現(xiàn)。例如，參見Scott等(1990)，Science 249386；Devlin等(1990)，Science 249404；美國專利5,223,409，于1993年6月29日授權(quán)；美國專利5,733,731，于1998年5月31日授權(quán)；美國專利5,498,530，于1996年3月12日授權(quán)；美國專利5,432,018，于1995年7月11日授權(quán)；美國專利5,338,665，于1994年8月16日授權(quán)；美國專利5,922,545，于1999年7月13日授權(quán)；WO96/40987，于1996年12月19日公開；和WO98/15833，
公開日為1998年4月16日(以上每一份文獻都被以全文形式引入本文作為參考)。在所述文庫中，通過與絲狀噬菌體的外被蛋白融合展示隨機的肽序列。通常，所展示的肽是針對固定的靶蛋白親和洗脫的。所保留的噬菌體可以通過連續(xù)循環(huán)的親和純化和再繁殖富集?？梢詫ψ罴呀Y(jié)合肽進行測序，以便確定在一個或多個結(jié)構(gòu)上相關(guān)的肽家族內(nèi)的關(guān)鍵殘基。例如，參見Cwirla等(1997)，Science 2761696-9，其中，鑒定了兩個不同的家族。所述肽序列還可能暗示哪些殘基可以通過丙氨酸掃描或通過在DNA水平上的誘變被安全地取代?？梢灾苽洳⑶液Y選誘變文庫，以便進一步優(yōu)化所述最佳結(jié)合物的序列。Lowman(1997)，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26401-24。
還可利用蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)分析揭示能模擬大型蛋白配體的結(jié)合活性的肽。在所述分析中，晶體結(jié)構(gòu)可以揭示所述大型蛋白配體的關(guān)鍵殘基的身份和相對取向，通過它可以設(shè)計一種肽。例如，參見Takasaki等(1997)，Nature Biotech.151266-70。所述分析方法還可用于研究受體蛋白和通過噬菌體展示篩選的肽之間的相互作用，這種研究可以揭示所述肽的其他修飾，以便提高結(jié)合親和力。
其他方法與肽研究中的噬菌體展示進行競爭?？梢詫⒁环N肽文庫融合在lac抑制子的羧基末端，并且在大腸桿菌中表達。另一種基于大腸桿菌的方法可以通過與肽聚糖-結(jié)合的脂蛋白(PAL)融合展示在細胞外膜上。在以下說明中，上述和其他方法被統(tǒng)稱為“大腸桿菌展示”。在另一種方法中，在核糖體釋放之前終止隨機RNA翻譯，得到了仍然與相關(guān)的RNA結(jié)合的多肽文庫。在以下說明中，上述及相關(guān)的方法被統(tǒng)稱為“核糖體展示”。其他方法采用與RNA連接的肽；例如，PRO融合技術(shù)，Phylos，Inc.。例如，參見Roberts & Szostak(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412297-303。在以下說明中，該方法以及相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“RNA-肽篩選”。業(yè)已開發(fā)出了化學(xué)衍生的肽文庫，其中，將肽固定在諸如聚乙烯棒或溶劑可滲透的樹脂上的穩(wěn)定的、非生物學(xué)材料上。另一種化學(xué)衍生的肽文庫利用照相平板印刷技術(shù)掃描固定在玻璃載玻片上的肽。在以下說明中，上述和相關(guān)方法被統(tǒng)稱為“化學(xué)-肽篩選”?；瘜W(xué)-肽篩選的優(yōu)點可能是，它可以使用D-氨基酸或其他非天然類似物，以及非肽因子。生物學(xué)和化學(xué)方法在以下文獻中進行過綜述Wells & Lowman(1992)，Curr.Opin.Biotechnol.3355-62。從理論上講，人們可以通過噬菌體展示、RNA-肽篩選和上面提到的其他方法發(fā)現(xiàn)任何蛋白的肽模擬物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及能調(diào)節(jié)TALL-1活性的治療劑。根據(jù)本發(fā)明，TALL-1的調(diào)節(jié)劑可以包括一種氨基酸序列Dz2Lz4(SEQ ID NO108)，其中，z2是氨基酸殘基，而z4是蘇氨?；虍惲涟滨?。TALL-1的所述調(diào)節(jié)劑包括具有下式的分子I(a) a1a2a3CDa6La8a9a10Ca12a13a14(SEQ.ID.NO100)其中a1，a2，a3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；a6是氨基酸殘基；a9是堿性或疏水性殘基；a8是蘇氨?；虍惲涟滨＃籥12是中性極性殘基；a13和a14各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基。
I(b) b1b2b3Cb5b6Db8Lb10b11b12b13b14Cb16b17b18(SEQ.ID.NO104)其中b1和b2各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；b3是酸性或酰胺殘基；b5是氨基酸殘基；b6是芳族殘基；
b8是氨基酸殘基；b10是T或I；b11是堿性殘基；b12和b13各自獨立地是氨基酸殘基；b14是中性極性殘基；和b16，b17和b18各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基。
I(c) c1c2c3Cc5Dc7Lc9c10c11c12c13c14Cc16c17c18(SEQ.ID.NO105)其中c1，c2和c3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；c5是氨基酸殘基；c7是氨基酸殘基；c9是T或I；c10是堿性殘基；c11和c12各自獨立地是氨基酸殘基；c13是中性極性殘基；c14是氨基酸殘基；c16是氨基酸殘基；c17是中性極性殘基；和c18是氨基酸殘基或者是缺失的。
I(d) d1d2d3Cd5d6d7WDd10Ld12d13d14Cd15d16d17(SEQ.ID.NO106)其中d1，d2和d3各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；d5，d6和d7各自獨立地是氨基酸殘基；d10是氨基酸殘基；d13是T或I；d14是氨基酸殘基；而d16，d17和d18各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基。
I(e) e1e2e3Ce5e6e7De9Le11Ke13Ce15e16e17e18(SEQ.ID.NO107)
其中e1，e2和e3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；e5，e6，e7，e9和e13各自獨立地是氨基酸殘基；e11是T或I；和e15，e16和e17各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基。
I(f) f1f2f3Kf5Df7Lf9f10Qf12f13f14(SEQ.ID NO109)其中f1，f2和f3是缺失的或者是氨基酸殘基(當(dāng)f12，f13，f14之一是C時，f1，f2和f3中的一個優(yōu)選是C)；f5是W，Y或F(優(yōu)選W)；f7是氨基酸殘基(優(yōu)選L)；f9是T或I(優(yōu)選T)；f10是K，R或H(優(yōu)選K)；f12是C，中性極性殘基，或者堿性殘基(優(yōu)選W，C或R)；f13是C，中性極性殘基或者是缺失的(優(yōu)選V)；和f14是任何氨基酸殘基或者是缺失的；其前提是，f1，f2和f3中只有一個可以是C，并且f12，f13和f14中只有一個可以是C。
上面的式I(a)至I(f)的化合物整合了Dz2Lz4以及下面的SEQID NO63。正如在下面的實施例1中所披露的，I(f)的序列是作為共有序列衍生的。在式I(f)的化合物中，優(yōu)選下式I(f) f1f2f3KWDf7Lf9KQf12f13f14(SEQ.ID NO125)屬于式I(f)的化合物包括SEQ ID NOS32，58，60，62，63，66，67，69，70，114，115，122，123，124，147-150，152-177，179，180，187。
同樣符合本發(fā)明的是具有以下共有基序的化合物PFPWE(SEQ ID NO110)它也能結(jié)合TALL-1。
另外，符合本發(fā)明的化合物是具有下式的化合物I(g) g1g2g3Cg5PFg8Wg10Cg11g12g13(SEQ.ID.NO.101)其中g(shù)1，g2和g3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；g5是中性極性殘基；g8是中性極性殘基；g10是酸性殘基；g12和g13各自獨立地是氨基酸殘基；和g14是缺失的或者是氨基酸殘基。
I(h) h1h2h3CWh6h7WGh10Ch12h13h14(SEQ.ID.NO102)其中h1，h2和h3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；h6是疏水性殘基；h7是疏水性殘基；h10是酸性或極性疏水性殘基；和h12，h13和h14各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基。
I(i) i1i2i3Ci5i6i7i8i9i10Ci12i13i14(SEQ.ID.NO103)其中i1是缺失的或者是氨基酸殘基；i2是中性極性殘基；i3是氨基酸殘基；i5，i6，i7和i8各自獨立地是氨基酸殘基；i9是酸性殘基；i10是氨基酸殘基；i12和i13各自獨立地是氨基酸殘基；和i14是中性極性殘基。
由式I(g)-I(i)所定義的化合物也能結(jié)合TALL-1。
另外，根據(jù)本發(fā)明，TALL-1的調(diào)節(jié)劑包括
a)TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(例如，式I(a)-I(i)的氨基酸序列)，優(yōu)選氨基酸序列Dz2Lz4，或者通過噬菌體展示、RNA-肽篩選或上面提到的其他技術(shù)由它所衍生的序列；和b)一種媒介物(vehicle)，如聚合物(例如，PEG或葡聚糖)或Fc結(jié)構(gòu)域，它是優(yōu)選的；其中，所述媒介物是與TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域共價連接的。正如下文所披露的，所述媒介物和TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可以通過TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的N-或C-末端連接。優(yōu)選的是媒介物是Fc結(jié)構(gòu)域，而優(yōu)選的Fc結(jié)構(gòu)域是IgG Fc結(jié)構(gòu)域。在本文中，所述Fc-連接的肽被稱為“肽體(peptibodies)”。優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包括在下面的表1和2中所披露的氨基酸序列。其他TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，可以通過本文所提到的噬菌體展示，RNA-肽篩選和其他技術(shù)制備。
另外，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)TALL-1調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括a.篩選至少一種能結(jié)合TALL-1的肽；和b.讓所述肽與一種媒介物共價連接。
優(yōu)選的媒介物是Fc結(jié)構(gòu)域。步驟(a)優(yōu)選是通過選自下面的表2中的肽序列或選自本文所提到的噬菌體展示、RNA-肽篩選或其他技術(shù)完成的。
本發(fā)明的化合物可以通過標(biāo)準合成方法、重組DNA技術(shù)或制備肽和融合蛋白的任何其他方法制備。包括非肽部分的本發(fā)明的化合物，可以通過標(biāo)準有機化學(xué)反應(yīng)合成，另外，在需要時還可以采用標(biāo)準肽化學(xué)反應(yīng)。
與本發(fā)明的化合物相關(guān)的主要用途是作為治療劑或預(yù)防劑。所述與媒介物連接的肽，可能具有與所述肽所模擬的天然配體相當(dāng)-或者甚至更高-的活性。
通過將本發(fā)明的化合物與合適的藥用載體材料配制在一起，并且給需要它的諸如人(或其他哺乳動物)的患者施用有效量，本發(fā)明的化合物可用于治療和預(yù)防目的。本發(fā)明還包括其他相關(guān)的方面。
通過閱讀附圖和本發(fā)明的詳細說明，可以了解本發(fā)明的很多其他特征和優(yōu)點。
附圖的簡要說明

圖1表示典型Fc雙體，它可能源于IgG1抗體。附圖中的“Fc”表示本發(fā)明“Fc結(jié)構(gòu)域”含義內(nèi)的任何Fc變體?！癤1”和“X2”表示如下文所定義的肽或接頭肽組合。具體的雙體如下A，D單一二硫鍵結(jié)合的雙體。IgG1抗體在該抗體的鉸鏈區(qū)通常具有兩個二硫鍵。圖1A和1D中的Fc結(jié)構(gòu)域可以通過在兩個二硫鍵位點之間截斷或通過用非活性殘基(例如，丙氨酰)取代半胱氨酰殘基。在圖1A中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域連接在所述肽的氨基末端；在圖1D中，連接在羧基末端。
B，E雙二硫鍵雙體。該Fc結(jié)構(gòu)域可以通過截短親代抗體以便保留Fc結(jié)構(gòu)域鏈上的兩個半胱氨酰殘基而形成或者通過用包括編碼所述Fc結(jié)構(gòu)域的序列的構(gòu)建體表達。在圖1B中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域連接在所述肽的氨基末端；在圖1E中，連接在羧基末端。
C，F(xiàn)非共價雙體。該Fc結(jié)構(gòu)域可以通過截短或取代消除半胱氨酰殘基而形成。人們可能需要消除半胱氨酰殘基，以便避免通過該半胱氨酰殘基與存在于其他宿主細胞中的蛋白的半胱氨酰殘基起反應(yīng)所形成的雜質(zhì)。所述Fc結(jié)構(gòu)域的非共價結(jié)合由于將所述雙體保持在一起。其他雙體可以通過使用源于不同類型抗體(例如，IgG2，IgM)的Fc結(jié)構(gòu)域形成。
圖2表示本發(fā)明優(yōu)選化合物的結(jié)構(gòu)，它以藥理學(xué)活性肽的串聯(lián)重復(fù)為特征。圖2A表示單鏈分子，并且還可以表示該分子的第一構(gòu)建體。圖2B表示一種雙體，其中，所述接頭肽部分僅存在于該雙體的一條鏈上。圖2C表示在兩條鏈上都具有肽部分的雙體。圖2C所示的雙體是在某些宿主細胞中表達編碼圖3A所示的單鏈的DNA構(gòu)建體時能自主形成。在其他宿主細胞中，將所述細胞放置在有利于雙體形成的條件下，或者所述雙體可以在體外形成。
圖3表示可用于本發(fā)明中的人IgG1 Fc的典型核酸和氨基酸序列(分別為SEQ ID NOS1和2)。
圖4A-4F表示編碼肽和接頭的NdeI-SalI片段的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS3-27)。
圖5A-5M表示pAMG21-RANK-Fc載體的核苷酸序列(SEQ IDNO28)，它被用于構(gòu)建本發(fā)明的Fc-連接的分子。以上附圖確定了有關(guān)核酸的多種特征，包括·啟動子區(qū)PcopB，PrepA，RNAI，APHII，luxPR，和luxPL；·編碼APHII，luxR的mRNA；·copB蛋白，copT，repAI，repA4，APHII，luxR，RANK，和Fc蛋白的編碼序列和氨基酸序列；·蛋白copB，CRP的結(jié)合位點；·發(fā)卡T1，T2，T7，和toop；·lux蛋白的操縱子位點；·Pfl1108I，BglII，ScaI，BmnI，DrdII，DraIII，BstBI，AceIII，AflII，PflMI，BglI，SfiI，BstEII，BspLullI，NspV，BplI，EagI，BcgI，NsiI，BsaI，Psp1406I，AatII，BsmI，NruI，NdeI，ApaLI，Acc65I，KpnI，SalI，AccI，BspEI，AhdI，BspHI，EconI，BsrGI，BmaI，SmaI，SexAI，BamHI和BlpI的酶限制位點。
圖6A和6B表示插入pCFM1656的單一的AatII(pCFM1656上4364號位置)和SacII(pCFM1656的4585號位置)限制位點之間的DNA序列(SEQ ID NO97)，以便形成表達質(zhì)粒pAMG21(ATCC保藏號98113)。
圖7表示能抑制TALL-1介導(dǎo)的B細胞增殖的TALL-1肽體(SEQ ID NO70)。在存在10納克/毫升TALL-1+2微克/毫升抗IgM抗體的條件下，將來自B6小鼠的純化B細胞(105)與標(biāo)明數(shù)量的TALL-1共有肽體一起在96孔平板上培養(yǎng)，重復(fù)3次。培養(yǎng)18小時之后，通過放射性[3H]胸苷吸收測定增殖。所示出的數(shù)據(jù)表示平均值±SD三個重復(fù)的孔。
圖8表示TALL-1 N-末端串聯(lián)雙體肽體(參見表5B中的SEQ IDNO123，124)優(yōu)選被用于抑制TALL介導(dǎo)的B細胞增殖。在存在10納克/毫升TALL-1+2微克/毫升抗IgM抗體的條件下，將來自B6小鼠的純化B細胞(105)與標(biāo)明數(shù)量的TALL-1 12-3肽體和TALL共有肽體(表5B中的SEQ ID NOS115和122)或相關(guān)的雙體肽體(SEQID NOS123，124)一起在96孔平板上培養(yǎng)，重復(fù)3次。培養(yǎng)18小時之后，通過放射性[3H]胸苷吸收測定增殖。所示出的數(shù)據(jù)表示平均值±SD三個重復(fù)的孔。
圖9表示以高親和力與AGP3結(jié)合的AGP3肽體。使用雙曲線單位點均勻結(jié)合模型由非線性回歸的競爭曲線獲得了解離平衡常數(shù)(KD)(KinExTM軟件)。對于與人AGP3(SEQ ID NO123)結(jié)合的AGP3肽體來說，KD大約為4pM。
圖10A和10B。在Biacore競爭測定中，AGP3肽體能抑制人類和鼠類AGP3。將可溶性人TACI蛋白固定在B1芯片上。將1nM重組人AGP3蛋白(上圖)或5nM重組鼠類AGP3蛋白(下圖)與標(biāo)明數(shù)量的AGP3肽體一起培養(yǎng)，然后加注到受體表面上。示出了相對的人AGP3和鼠AGP3結(jié)合反應(yīng)(SEQ ID NO123)。
圖11A和11B。在Biacore競爭測定中，AGP3肽體抑制了AGP3與所有三種受體TACI，BCMA和BAFFR的結(jié)合。將重組可溶性受體TACI，BCMA和BAFFR蛋白固定在CM5芯片上。將1nM重組人AGP3(上圖)與標(biāo)明數(shù)量的AGP3肽體一起培養(yǎng)，然后加注到每一種受體表面上。測定AGP3的相對結(jié)合。類似地，將1nM重組APRIL蛋白與標(biāo)明數(shù)量的AGP3肽體一起培養(yǎng)，然后加注到每一種受體表面上。AGP3肽不能抑制APRIL與所有三種受體的結(jié)合(SEQ ID NO123)。
圖12A和12B。AGP3能抑制通過人AGP3刺激誘導(dǎo)的小鼠血清免疫球蛋白含量的提高。每天1次，連續(xù)7天給Balb/c小鼠腹膜內(nèi)注射1mg/Kg人AGP3蛋白，同時注射標(biāo)明劑量的鹽水、人Fc或AGP3肽體，并且在第8天放血。通過ELISA測定血清總IgM和IgA含量(SEQ ID NO123)。
圖13.AGP3肽體治療減輕了小鼠CIA模型的關(guān)節(jié)炎嚴重程度。通過在尾巴根處經(jīng)皮注射用完全弗氏佐劑乳化的牛II型膠原(bCII)，對8-12周大的DBA/1雄性小鼠進行免疫，并且在首次免疫之后三周，通過用不完全弗氏佐劑乳化的bCII進行強化免疫。從強化免疫當(dāng)天開始用標(biāo)明劑量的AGP3肽體治療4周時間。正如以前所披露的(Khare等，J.Immunol..1553653-9，1995)，采用0-3的評分等級，分別對所有4只爪子進行關(guān)節(jié)炎嚴重性評分(SEQ ID NO123)。
圖14.AGP3肽體治療抑制了抗膠原抗體在小鼠CIA模型中的產(chǎn)生。如上文所述，在最后一次處理之后1周(35天)采集血清樣品。通過ELISA分析，測定血清抗膠原II抗體含量(SEQ ID NO123)。
圖15A和15B。AGP3肽體治療延緩了蛋白尿的發(fā)作，并且改善了NZB/NZW狼瘡小鼠的存活。用PBS或標(biāo)明劑量的AGP3肽體(SEQID NO123)或人Fc蛋白對易感狼瘡的5個月大小的NZB×NZBW F1小鼠進行腹膜內(nèi)注射治療，每周3次，共8周時間。在整個實驗期間，用Albustix試劑條(Bayer AG)每月評估尿液中的蛋白。
圖16A和16B表示優(yōu)選的TALL-1結(jié)合肽體的核酸和氨基酸序列(SEQ ID NOS189和123)。
發(fā)明詳述術(shù)語的定義除非在特定情況中另有限定，在本說明書中所使用的術(shù)語定義如下一般定義術(shù)語“包括(comprising)”表示化合物在特定序列的N-或C-末端中的一個或兩個上可以包括其他氨基酸。當(dāng)然，所述其他氨基酸不應(yīng)當(dāng)明顯干擾該化合物的活性。
另外，本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的可以藥用的鹽。術(shù)語“生理學(xué)可接受的鹽”表示已知的或者后來發(fā)現(xiàn)的在藥理學(xué)上可接受的任何鹽。某些具體例子是乙酸鹽；三氟乙酸鹽；氫鹵酸鹽，如氫氯酸鹽和氫溴酸鹽；硫酸鹽；檸檬酸鹽；酒石酸鹽；乙醇酸鹽；和草酸鹽。
氨基酸術(shù)語“酸性殘基”表示具有包括酸性基團的側(cè)鏈的D-或L-形式的具有包括酸性基團的側(cè)鏈的氨基酸殘基。典型的酸性殘基包括D和E。
術(shù)語“酰胺殘基”表示具有包括酸性基團的酰胺衍生物的側(cè)鏈的D-或L-形式的氨基酸。典型的殘基包括N和Q。
術(shù)語“芳族殘基”表示具有芳族基團的側(cè)鏈的D-或L-形式的氨基酸殘基。典型的芳族殘基包括F，Y，和W。
術(shù)語“堿性殘基”表示具有堿性基團的側(cè)鏈的D-或L-形式的氨基酸殘基。典型的堿性殘基包括H，K，和R。
術(shù)語“親水性殘基”表示包括極性基團側(cè)鏈的D-或L-形式的氨基酸殘基。典型的親水性殘基包括C，S，T，N，和Q。
術(shù)語“非功能殘基”表示具有缺少酸性、堿性或芳族基團的側(cè)鏈的D-或L-形式的氨基酸殘基。典型的非功能性氨基酸殘基包括M，G，A，V，I，L和正亮氨酸(Nle)。
術(shù)語“中性極性殘基”表示具有缺少堿性、酸性或極性基團的側(cè)鏈的D-或L-形式的氨基酸殘基。典型的中性極性氨基酸殘基包括A，V，L，I，P，W，M，和F。
術(shù)語“極性疏水性殘基”表示具有包括極性基團的側(cè)鏈的D-或L-形式的氨基酸殘基。典型的極性疏水性氨基酸殘基包括T，G，S，Y，C，Q，和N。
術(shù)語“疏水性殘基”表示具有缺少堿性或酸性基團的側(cè)鏈的D-或L-形式的氨基酸殘基。典型的疏水性氨基酸殘基包括A，V，L，I，P，W，M，F(xiàn)，T，G，S，Y，C，Q，和N。
肽術(shù)語“肽”表示具有1-40個氨基酸的分子，優(yōu)選具有5-20個氨基酸的分子。典型的肽可以包括天然存在分子的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域或隨機化的序列。
術(shù)語“隨機化的”在用于表示肽序列時，是指完全隨機的序列(例如，通過噬菌體展示方法或RNA-肽篩選方法選擇的)和天然存在的分子上的一個或多個殘基，被天然存在的分子上的某個位置上不存在的氨基酸殘基所取代的序列。用于鑒定肽序列的典型方法，包括噬菌體展示，大腸桿菌展示，核糖體展示，RNA-肽篩選，和化學(xué)篩選等。
術(shù)語“TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域”表示能結(jié)合TALL-1的任何氨基酸序列，并且包括天然存在的序列或隨機化的序列。典型的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域可以通過噬菌體展示或本文提到過的其他方法鑒定或衍生。
術(shù)語“TALL-1拮抗劑”表示能與TALL-1結(jié)合，并且增強或減弱一種或多種特定參數(shù)的分子，所述增強或減弱與完整長度天然TALL-1對所述參數(shù)的影響相反。例如，所述活性可以通過披露于以下文獻中的測定方法測定題為“TNF-相關(guān)蛋白”的
公開日為2000年8月17日的WO00/47740的專利申請的材料和方法部分的標(biāo)題為“AGP-3的生物學(xué)活性”的小部分。
媒介物和肽體術(shù)語“媒介物(vehicle)”表示能抑制治療性蛋白降解和/或延長半衰期，減弱毒性，減弱免疫原性或提高其生物學(xué)活性的分子。典型的媒介物包括Fc結(jié)構(gòu)域(它是優(yōu)選的)以及線性聚合物(例如聚乙二醇(PEG)，聚賴氨酸，葡聚糖等)；支鏈聚合物(例如，參見于1981年9月15日授予Denkenwalter等的美國專利4289872；于1993年7月20日授予Tam的5229490；于1993年10月28日公開的Frechet等的WO93/21259)；脂類；膽甾醇類(如類固醇)；糖類或寡聚糖(例如葡聚糖)；能與挽救受體結(jié)合的任何天然或合成蛋白、多肽或肽；白蛋白，包括人血清白蛋白(HSA)，亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，和其他諸如此類的蛋白和蛋白片段。下面將對媒介物作進一步說明。
術(shù)語“天然Fc”表示包括通過消化完整抗體而產(chǎn)生的序列的單體或多聚體形式的分子或序列。天然Fc的原始免疫球蛋白來源優(yōu)選人類來源，并且可以是任何免疫球蛋白，不過優(yōu)選IgG1和IgG2。天然Fc’s由單聚體多肽組成，所述單聚體多肽可以通過共價(二硫鍵)和非共價結(jié)合，連接成雙體或多聚體形式。天然Fc分子的單體亞基之間的分子間二硫鍵的數(shù)量，根據(jù)類型(例如IgG，IgA，IgE)或亞型(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgA1，IgGA2)在1-4之間變化。天然Fc的一種例子是通過木瓜蛋白酶消化IgG所產(chǎn)生的二硫鍵連接的雙體(參見Ellison等(1982)，Nucleic Acids Res.104071-9)。本文所使用的術(shù)語“天然Fc”是對單體、雙體和多聚體形式的統(tǒng)稱。
術(shù)語“Fc變體”表示由天然Fc修飾而來的分子或序列，不過，它仍然包括對挽救受體的結(jié)合位點FcRn。國際申請WO97/34631(
公開日為1997年9月25日)和WO96/32478披露了典型的Fc變體，以及與所述挽救受體的相互作用，以上申請被以全文形式引入本文作為參考。因此，術(shù)語“Fc變體”包括來自非人天然Fc的人源化分子或序列。另外，天然Fc包括可以除去的位點，因為它們提供了本發(fā)明融合分子所不需要的結(jié)構(gòu)特征或生物學(xué)活性。因此，術(shù)語“Fc變體”包括缺少一個或多個天然Fc位點或殘基的分子或序列，所述位點或殘基影響或與(1)二硫鍵形成，(2)與選擇的宿主細胞的不兼容性，(3)在選擇的宿主細胞中表達時N-末端的不一致性，(4)糖基化，(5)與補體的相互作用，(6)與Fc受體而不是挽救受體結(jié)合，或(7)抗體決定型細胞細胞毒性(ADCC)相關(guān)。下面將對Fc變體作更詳細地說明。
術(shù)語“Fc結(jié)構(gòu)域”包括如上文所定義的天然Fc和Fc變體分子和序列。對于Fc變體和天然Fc’s來說，術(shù)語“Fc結(jié)構(gòu)域”包括單體或多聚體形式，無論是通過消化完整抗體而形成的還是通過其他方式形成的。
用于表示Fc結(jié)構(gòu)域或分子的術(shù)語“多聚體(multimer)”包括表示具有兩個或兩個以上共價、非共價或同時通過共價和非共價相互作用結(jié)合的多肽鏈的分子的Fc結(jié)構(gòu)域。IgG分子典型地形成雙體；IgM，五聚體；IgD，雙體；和IgA，單體，雙體，三體，或四聚體。多聚體可以通過采用Fc的天然Ig來源的序列和所產(chǎn)生的活性或通過衍生(如下文所定義的)所述天然Fc而形成。
用于Fc結(jié)構(gòu)域或分子上的術(shù)語“雙體(dimer)”包括表示具有兩個共價或非共價結(jié)合的多肽鏈的分子的Fc結(jié)構(gòu)域。因此，在圖1中示出了本發(fā)明范圍內(nèi)的典型的雙體。
術(shù)語“衍生化”和“衍生物”或“衍生化的”包括有關(guān)過程和所得到的相應(yīng)的化合物，其中(1)所述化合物具有一個環(huán)狀部分，例如，在所述化合物內(nèi)半胱氨酰殘基之間的交聯(lián)；(2)所述化合物是交聯(lián)的或具有交聯(lián)位點；例如，所述化合物具有一個半胱氨酸殘基，因此在培養(yǎng)中或在體內(nèi)形成交聯(lián)的雙體；(3)一個或多個肽鍵被非肽鍵所取代；(4)N-末端被-NRR1，NRC(O)R1，-NRC(O)OR1，-NRS(O)2R1，-NHC(O)NHR琥珀亞胺基或取代過的或未取代過的芐氧基羰基-NH-所取代，其中R和R1和環(huán)狀取代基如下文所定義；(5)C-末端被-C(O)R2或-NR3R4所取代，其中，R2，R3和R4如下文所定義；和(6)其中的單個氨基酸組份通過用能夠與特定側(cè)鏈或末端殘基起反應(yīng)的試劑處理修飾過的化合物。在下文中將對衍生物作進一步說明。
術(shù)語“肽體”表示包括Fc結(jié)構(gòu)域和至少一種肽的分子。所述肽體可以是多聚體或它的雙體或片段，并且它們可以是衍生化的。在本發(fā)明中，當(dāng)V1是Fc結(jié)構(gòu)域時，下面的式II-VI的分子是肽體。
化合物的結(jié)構(gòu)一般說明。本發(fā)明人鑒定了能夠與TALL-1結(jié)合并且調(diào)節(jié)其生物學(xué)活性的序列?？梢酝ㄟ^上面所提到的方法對所述序列進行修飾，通過所述修飾可以改變一個或多個氨基酸，同時保持或者甚至提高所述肽的結(jié)合親和力。
在根據(jù)本發(fā)明制備的物質(zhì)的組合物中，可以通過肽的N-末端或C-末端將所述肽與媒介物連接。所述任何肽都可以串聯(lián)連接(即順序連接)，有或沒有接頭。因此，本發(fā)明的媒介物-肽分子可以通過下式表示II(X1)a-V1-(X2)b其中V1是媒介物(優(yōu)選是Fc結(jié)構(gòu)域)；X1和X2各自獨立地選自-(L1)c-P1，-(L1)c-P1-(L2)d-P2，-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3，和-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4；p1，p2，p3和P4各自獨立地是TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的序列，如式I(a)-I(i)的序列；L1，L2，L3和L4各自獨立地是接頭；和a，b，c，d，e和f各自獨立地是0或1，其前提是，a和b中的至少一個是1。
因此，化合物II包括下式的優(yōu)選化合物IIIX1-V1和它的多聚體，其中，V1是Fc結(jié)構(gòu)域，并且連接在A1的C-末端；IVV1-X2
以及它的多聚體，其中，V1是Fc結(jié)構(gòu)域，并且與A2的N-末端連接；VV1-(L1)c-P1和它的多聚體，其中，V1是Fc結(jié)構(gòu)域，并且與-(L1)c-P1的N-末端連接；和VIV1-(L1)c-P1-(L2)d-P2和它的多聚體，其中，V1是Fc結(jié)構(gòu)域，并且與-L1-P1-L2-P2的N-末端連接。
肽。本發(fā)明的肽可以用作TALL-1調(diào)節(jié)肽或用作式II-VI分子中的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的分子包括可以通過本領(lǐng)域已知方法制備的肽序列。
優(yōu)選的肽序列是具有下文所述取代基的上面的式I(a)的序列。
表1——優(yōu)選的肽取代基
優(yōu)選的肽序列如下面的表2所示表2——優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域
應(yīng)當(dāng)指出的是，TALL-1的已知受體與優(yōu)選的肽具有某些序列同源性12-3 LPGCKWDLLIKQWVCDPLBAFFR MRRGPRSLRGRDAPVPTPCVPTECYDLLVRKCVDCRLLTACITICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASIBCMAFVSPSQEIRGRFRRMLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRC(分別為序列SEQ ID NOS33，195，196和197)。
任何含有半胱氨酸殘基的肽都可以與另一種含有Cys的肽交聯(lián)，它們中的一個或兩個可以與媒介物連接。任何具有一個以上Cys殘基的肽也都可以形成肽內(nèi)二硫鍵。上述任何肽都可以按下文所述方法衍生化。
其他有用的肽序列可以通過對表2中的氨基酸序列進行保守性和/或非保守性修飾而形成。
保守性修飾能產(chǎn)生具有類似于對它進行所述修飾的肽的功能和化學(xué)特征的肽。相反，通過在氨基酸序列上進行選擇性取代可以獲得對所述肽的功能和/或化學(xué)特征的實質(zhì)性修飾，所述修飾在以下方面的作用顯著不同維持(a)取代部位的分子主鏈的結(jié)構(gòu)，例如，作為折疊或螺旋構(gòu)象，(b)所述分子對于靶位點的電荷或疏水性；或(c)所述分子的大小。
例如，“保守性氨基酸取代”可能包括非天然殘基對天然氨基酸殘基的取代，以便對該位點上的氨基酸殘基的極性或電荷少有或沒有影響。另外，正如以前說明“丙氨酸掃描誘變時”所披露的，所述多肽上的任何天然殘基都可以用丙氨酸取代(例如，參見MacLennan等，1998，Acta Physiol.Scand.Suppl.64355-67；Sasaki等，1998，Adv.Biophys.351-24，以上文獻討論了丙氨酸掃描誘變)。
理想的氨基酸取代(無論是保守性或非保守性取代)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員在需要進行所述取代時確定。例如，可以用氨基酸取代鑒定所述肽序列的重要殘基，或用于提高或減弱本文所披露的肽或媒介物-肽分子(參見上式)的親和力。典型的氨基酸取代如表3所示。
表3-氨基酸取代
在某些實施方案中，保守性氨基酸取代還包括非天然存在的氨基酸殘基，這些殘基是通過化學(xué)肽合成整合的，而不是通過在生物學(xué)系統(tǒng)中合成整合的。
正如在上面的“術(shù)語的定義”部分所指出的，天然存在的殘基可以根據(jù)可用于序列修飾的共同的側(cè)鏈特性進行分類。例如，非保守性取代可能涉及一種類型的成員對另一種類型的成員的取代?？梢詫⑺鋈〈鷼埢鶎?dǎo)入所述肽的與非人直向同源基因同源的區(qū)域，或?qū)胨龇肿拥姆峭磪^(qū)。另外，人們還可以用P或G進行修飾，以便影響側(cè)鏈的方向。
在進行所述修飾時，可以考慮氨基酸的親水性指數(shù)。根據(jù)其疏水性和電荷特征，為每一種氨基酸確定一個親水指數(shù)，所述親水指數(shù)為異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
親水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白的相互作用生物學(xué)功能方面的重要性為本領(lǐng)域所公知。Kyte等，J.Mol.Biol.，157105-131(1982)。已知，某些氨基酸可以取代具有類似親水指數(shù)或得分的其他氨基酸，并且仍然保留類似的生物學(xué)活性。在進行基于親水性指數(shù)的改變時，優(yōu)選取代其親水指數(shù)在±2以內(nèi)的氨基酸，特別優(yōu)選在±1范圍內(nèi)的氨基酸，更優(yōu)選±0.5范圍內(nèi)的氨基酸。
本領(lǐng)域還可以理解的是，類似氨基酸的取代還可以根據(jù)親水性有效進行。一種蛋白的最大局部平均親水性，是由其相鄰氨基酸的親水性決定的，這種親水性與它的免疫原性和抗原性相關(guān)，即與該蛋白的生物學(xué)特性相關(guān)。
業(yè)已為氨基酸確定了以下親水性值精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。在基于類似的親水性值進行取代時，優(yōu)選取代其疏水性值在±2以內(nèi)的氨基酸，特別優(yōu)選在±1范圍內(nèi)的氨基酸，更優(yōu)選±0.5范圍內(nèi)的氨基酸。人們還可以根據(jù)親水性從一級氨基酸序列上確定表位。所述區(qū)域又被稱作“表位核心區(qū)”。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用眾所周知的技術(shù)確定在上述序列中所提供的多肽的合適的變體。為了確定所述分子的可以改變而又不破壞活性的合適部位，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以針對被認為是對活性不重要的區(qū)進行。例如，當(dāng)來自相同物種或來自其他物種的具有相似活性的相似的多肽是已知的時，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將一種肽的氨基酸序列與類似肽的序列進行比較。通過這種比較，人們可以確定在類似多肽之間保守的所述分子的殘基和部分。還可以理解的是，在一種肽的相對所述類似肽而言不保守的部位上進行的改變，不大可能對所述肽的活性和/或結(jié)構(gòu)造成負面影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解的是，即使是在相對保守的區(qū)域，人們也可以用化學(xué)上類似的氨基酸取代天然存在的氨基酸，同時又保留了其活性(保守性氨基酸殘基取代)。因此，即使是對生物學(xué)活性或結(jié)構(gòu)重要的部位也可以進行保守性氨基酸取代，而又不破壞其生物學(xué)活性或不會對所述肽的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生負面影響。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進行結(jié)構(gòu)-功能研究，以便確定類似肽上的對活性或結(jié)構(gòu)重要的殘基。就所述比較而言，人們可以預(yù)測一種肽上的氨基酸殘基的重要性，所述殘基相當(dāng)于對類似肽的活性或結(jié)構(gòu)重要的氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用化學(xué)上類似的氨基酸取代所述肽的推測的重要氨基酸殘基。
人們還可以相對類似多肽的結(jié)構(gòu)，分析三維結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。根據(jù)所述信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以推測一種肽的氨基酸殘基相對其三維結(jié)構(gòu)的排列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇不對推測存在于所述蛋白表面上的氨基酸殘基進行基團改變，因為所述殘基可能參與和其他分子的重要的相互作用。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備在每一個需要的氨基酸殘基上包括單一的氨基酸取代的測驗變體。然后，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的活性測定方法篩選所述變體?？梢岳盟鰯?shù)據(jù)收集有關(guān)合適變體的信息。例如，如果人們發(fā)現(xiàn)對一個特定氨基酸殘基的取代會導(dǎo)致受到破壞的、不希望的減弱的或不合適的活性的話，具有這種取代的變體就應(yīng)當(dāng)避免。換句話說，根據(jù)從所述常規(guī)實驗所收集到信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地確定應(yīng)當(dāng)避免單獨的或與其他突變組合的進一步取代的氨基酸。
大量的科技文獻業(yè)已披露了對二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。參見Moult J.，Curr.Op.in Biotech.，7(4)422-427(1996)，Chou等，Biochemistry，13(2)222-245(1974)；Chou等，Biochemistry，113(2)211-222(1974)；Chou等，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，4745-148(1978)；Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47251-276和Chou等，Biophys.J.，26367-384(1979)。另外，目前可以獲得用于協(xié)助預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的計算機程序。預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的一種方法是基于同源性模擬。例如，具有超過30％的序列相同性，或超過40％的相似性的兩種多肽或蛋白通常具有類似的結(jié)構(gòu)拓撲關(guān)系。蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)的最近的增長，業(yè)已提供了增強了的二級結(jié)構(gòu)的可預(yù)測性，包括在一種多肽或蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)的折疊的潛在數(shù)量。參見Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1)244-247(1999)。有人業(yè)已提出(Brenner等Curr.Op.Struc.Biol.，7(3)369-376(1997))，在特定多肽或蛋白內(nèi)存在有限數(shù)量的折疊，并且一旦分析了關(guān)鍵數(shù)量的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)預(yù)測將獲得極高的精確性。
預(yù)測二級結(jié)構(gòu)的其他方法包括“threading”(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)377-87(1997)；Sippl等，Structure，4(1)15-9(1996))，“分布分析”(Bowie等，Science，253164-170(1991)；Gribskov等，Meth.Enzym.，183146-159(1990)；Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)4355-8(1987))，和“進化連鎖”(參見Home，同上，和Brenner，同上)。
媒介物。本發(fā)明需要通過N-末端、C-末端或一個氨基酸殘基的側(cè)鏈與一種肽連接的至少一個媒介物(V1)的存在。還可以使用多個媒介物，例如，位于每一個末端的Fc′s，或位于一個末端的Fc或位于另一個末端或側(cè)鏈上的PEG基團。典型的媒介物包括·Fc結(jié)構(gòu)域；·能夠與挽救受體結(jié)合的其他蛋白、多肽、或肽；·人血清白蛋白(HSA)；·亮氨酸拉鏈(LZ)結(jié)構(gòu)域；·聚乙二醇(PEG)，包括5kD，20kD，和30kD PEG，以及其他聚合物；·葡聚糖；以及本領(lǐng)域已知的其他分子，以便提供延長了的半衰期和/或?qū)Φ鞍姿饨到庾饔没蚯宄饔玫谋Ｗo作用。
優(yōu)選的媒介物是Fc結(jié)構(gòu)域。所述Fc結(jié)構(gòu)域可以與所述肽的N或C末端或同時與N和C末端融合。優(yōu)選與N末端融合。
正如上文所提到的，在本發(fā)明范圍內(nèi)，F(xiàn)c變體是合適的媒介物?？梢詫μ烊籉c進行深入修飾，以便形成本發(fā)明的Fc變體，其前提是保留了與挽救受體的結(jié)合。例如，參見WO97/34631和WO96/32478。在所述Fc變體中，人們可以去掉天然Fc的一個或多個位點，這些位點所提供的結(jié)構(gòu)特征或功能活性是本發(fā)明的融合分子所不需要的。例如，人們還可以通過取代或缺失殘基，將殘基插入所述位點，或截短含有所述位點的部分除去所述位點。所述插入或取代的殘基還可以是改變了的氨基酸，例如肽模擬物或D-氨基酸。因為多種原因，需要Fc變體，其中的某些原因?qū)⒃谙旅媾?。典型的Fc變體包括這樣的分子和序列，其中1.消除了參與二硫鍵形成的位點。所述位點的消除可以避免與存在于被用來生產(chǎn)本發(fā)明分子的宿主細胞中的其他含有半胱氨酸的蛋白的反應(yīng)。為此，位于N-末端的含有半胱氨酸的片段可以截短或可以將半胱氨酸殘基缺失或用其他氨基酸(例如丙氨酰、絲氨酰)取代。具體地講，人們可以截去SEQ ID NO2的N-末端20個氨基酸的片段或缺失或取代位于SEQ ID NO2的7和10號位置上的半胱氨酸殘基。即使是消除了半胱氨酸殘基，單鏈Fc結(jié)構(gòu)域仍然能形成非共價結(jié)合在一起的雙體Fc結(jié)構(gòu)域。
2.對天然Fc進行修飾，以便使它與特定宿主細胞的兼容性提高。例如，人們可以消除靠近典型的天然Fc的N-末端的PA序列，該序列可以被大腸桿菌中的消化酶，如脯氨酸亞氨基肽酶識別。人們還可以增加一個N-末端甲硫氨酸殘基，特別是當(dāng)所述分子是在諸如大腸桿菌的細菌細胞中重組表達時。SEQ ID NO2的Fc結(jié)構(gòu)域就是這樣一種Fc變體。
3.去掉天然Fc的N-末端的一部分，以便避免在特定宿主細胞中表達時N-末端的不一致性。為此，人們可以去掉位于N-末端的前20個氨基酸殘基中的任一個，特別是1，2，3，4和5號位置上的氨基酸殘基。
4.去掉一個或多個糖基化位點。通常被糖基化的殘基(例如天冬酰胺)可以賦予細胞裂解反應(yīng)?？梢匀サ羲鰵埢?，或者用非糖基化殘基(例如丙氨酸)取代。
5.去掉參與和補體的相互作用的位點，如Clq結(jié)合位點。例如，人們可以去掉或取代人IgG1的EKK序列。對于本發(fā)明的分子來說，補體恢復(fù)可能不是有利的，因此，可以避免這種Fc變體。
6.去掉影響與除了挽救受體以外的Fc受體結(jié)合的位點。天然Fc可能具有與某些白血細胞相互作用的位點，這些位點對本發(fā)明的融合分子來說是不需要的，因此可能去掉。
7.去掉了ADCC位點。ADCC位點是本領(lǐng)域所公知的。例如，有關(guān)IgG1的ADCC位點參見Molec.Immunol.29(5)633-9(1992)。這些位點同樣是本發(fā)明的融合分子所不需要的，因此可以去掉。
8.當(dāng)天然Fc源于非人抗體時，所述天然Fc可以是人源化的。通常，為了將天然Fc人源化，人們可以用正常情況下存在于人類天然Fc上的殘基取代非人天然Fc上的特定殘基。用于抗體人源化的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
優(yōu)選的Fc變體包括以下變體。在SEQ ID NO2(圖3)中，15號位置上的亮氨酸可以用谷氨酸取代；99號位置上的谷氨酸可以用丙氨酸取代；而101和103號位置上的賴氨酸可以用丙氨酸取代。另外，一個或多個酪氨酸殘基可以用苯丙氨酸殘基取代。
其他媒介物可以是能夠與挽救受體結(jié)合的蛋白、多肽、肽、抗體、抗體片段、或小分子(例如，肽模擬化合物)。例如，人們可以將披露于以下美國專利中的多肽用作媒介物美國專利5,739,277，于1998年4月14日授予Presta等。還可以通過噬菌體展示或?qū)εcFcRn挽救受體的結(jié)合的RNA-肽篩選選擇肽。所述挽救受體-結(jié)合化合物也包括在“媒介物”的含義范圍內(nèi)，并且屬于本發(fā)明的范圍。可以篩選所述媒介物的延長了的半衰期(例如，通過避免由蛋白酶識別的序列)和降低了的免疫原性(通過有利于非免疫原性的序列，如在抗體人源化中所發(fā)現(xiàn)的)。
正如上文所指出的，還可將聚合物媒介物用于V1。用于連接被用作媒介物的化學(xué)部分的各種方法目前都可以獲得，例如，參見專利合作條約(PCT)國際公開號WO 96/11953，題為“N-末端化學(xué)修飾的蛋白組合物和方法”，以它的全文形式引入本文作為參考。在該PCT公開文本中披露了水溶性聚合物與蛋白N-末端的選擇性連接。
一種優(yōu)選的聚合物媒介物是聚乙二醇(PEG)。PEG基團可以具有任何常見的分子量，并且可以是線性的或分支的。PEG的平均分子量優(yōu)選在大約2千道爾頓(″kD″)-大約100kD，更優(yōu)選大約5kD-大約50kD，最優(yōu)選大約5kD-大約10kD。通過可以通過乙?；蜻€原性烷基化連接在本發(fā)明的化合物上，通過PEG部分上的活性基團(例如，醛基、氨基、硫醇基、或酯基)連接在本發(fā)明化合物的活性基團上(例如，醛基、氨基、或酯基)。
用于合成肽的PEG化的有用方法，包括通過在溶液中形成綴合鍵(conjugate linkage)結(jié)合一個肽和一個PEG部分，它們各自具有能彼此相互起反應(yīng)的特殊的官能團。所述肽可以通過常規(guī)固相合成方便地制備。通過位于特定位點上的一個合適的官能團將所述肽“預(yù)活化”在與所述PEG部分反應(yīng)之前，對所述前體進行純化和全面表征。所述肽與PEG的連接通常是在水相中進行的，并且可以通過反相分析HPLC方便地監(jiān)測。可以通過制備HPLC，方便地純化PEG化的肽，并且通過分析HPLC、氨基酸順序和激光解吸質(zhì)譜分析表征。
多糖聚合物是可用于蛋白修飾的另一種類型的水溶性聚合物。葡聚糖是由主要通過α1-6連鍵連接的單個葡萄糖亞基組成的多糖聚合物。葡聚糖本身能夠以多種分子量存在，并且可以方便地獲得大約1kD-大約70kD的分子量。葡聚糖是可以單獨作為媒介物或與另一種媒介物(例如Fc)組合用于本發(fā)明中的合適的水溶性聚合物，例如，參見WO 96/11953和WO 96/05309。業(yè)已報道了與治療性或診斷免疫球蛋白綴合的葡聚糖。例如，參見歐洲專利公開號0 315 456，該專利以其全文形式引入本文作為參考。當(dāng)葡聚糖被用作本發(fā)明的媒介物時，優(yōu)選大約1kD-大約20kD的葡聚糖。
接頭?？梢赃x擇任何“接頭”基團。在存在接頭時，其化學(xué)結(jié)構(gòu)并不重要，因為它主要起著間隔基團的作用。所述接頭優(yōu)選是由通過肽鍵連接在一起的氨基酸形成。因此，在優(yōu)選實施方案中，所述接頭是由通過肽鍵連接的1-30個氨基酸組成，其中，所述氨基酸是從20種天然存在的氨基酸中選擇的。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，其中的某些氨基酸可以是糖基化的。在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述1-20個氨基酸是從甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、和賴氨酸中篩選的。更優(yōu)選的是，主要由空間上非位阻的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸組成的接頭。因此，優(yōu)選的接頭是與甘氨酸(特別是(Gly)4，(Gly)5)，聚(Gly-Ala)，和聚丙氨酸。接頭的其他特定例子有(Gly)3Lys(Gly)4(SEQ ID NO40)；
(Gly)3AsnGlySer(Gly)2(SEQ ID NO41)；(Gly)3Cys(Gly)4(SEQ ID NO42)；和GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO43)。
為了解釋上述命名方法，例如，(Gly)3Lys(Gly)4表示Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO40)。Gly和Ala的組合同樣是優(yōu)選的。這里所提供的接頭是舉例性的；本發(fā)明范圍內(nèi)的接頭可以更長，并且可以包括其他殘基。
優(yōu)選的接頭是包括超過5個氨基酸的氨基酸接頭，合適的接頭具有高達大約500個選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、蘇氨酸、蘇氨酸或天冬氨酸的氨基酸。最優(yōu)選的是大約20-50個氨基酸的接頭。一類優(yōu)選的接頭是具有下式的接頭GSGSATGGSGSTASSGSGSATx1x2(SEQ ID NO193)和GSGSATGGSGSTASSGSGSATx1x2GSGSATGGSGSTASSGSGSATx3x4(SEQ ID NO194)其中，x1和x3各自獨立地是堿性或疏水性殘基，而x2和x4各自獨立地是疏水性殘基。特別優(yōu)選的接頭是GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM(SEQ ID NO59)GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM(SEQ ID NO190)GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS(SEQ ID NO191)，和GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM(SEQ ID NO192)。
非肽接頭也是可行的。例如，可以使用烷基接頭，如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。所述烷基接頭還可以通過諸如低級烷基(例如C1-C6)低級?；?，鹵基(例如，Cl，Br)，CN，NH2，苯基等的非空間位阻基團所取代。一種代表性的非肽接頭是PEG接頭，
其中，n是這樣的，它使得該接頭的分子量為100-5000kD，優(yōu)選100-500kD。還可以改變所述肽接頭，以便形成與上文所述相同形式的衍生物。
衍生物。本發(fā)明人還披露了所述化合物的肽和/或媒介物部分的衍生化。所述衍生物可以提高所述化合物的溶解度、吸收性、生物學(xué)半衰期等。所述部分還可以消除或減弱所述化合物的任何不希望的副作用等。代表性衍生物包括以下化合物，其中1.所述化合物或它的某些部分是環(huán)狀的，例如，可以將所述肽部分修飾成包括兩個或兩個以上Cys殘基(例如在所述接頭上)，它可以通過形成二硫鍵而環(huán)化。
2.將所述化合物交聯(lián)或者使得它能夠在分子間交聯(lián)。例如，可以將所述肽部分修飾成包括一個Cys殘基，并且因此能夠與一種類似分子形成分子間二硫鍵。所述化合物還可以通過其C-末端交聯(lián)，如下面的分子所示。
在式VIII中，每一個“V1”通?？梢员硎綟c結(jié)構(gòu)域的一條鏈。
3.一個或多個肽基[-C(O)NR-]連接(鍵)被非肽基連接所取代。典型的非肽基連接是-CH2-氨甲酸[-CH2-OC(O)NR-]，磷酸根，-CH2-磺酰胺[-CH2-S(O)2NR-]，脲[-NHC(O)NH-]，-CH2-仲胺，和烷基化肽[-C(O)NR6-其中，R6是低級烷基]。
4.N-末端是衍生化的。通常，N-末端可以?；蛘咝揎棾扇〈?。典型的N-末端衍生基團包括-NRR1(而不是NH2)，-NRC(O)R1，-NRC(O)OR1，-NRS(O)2R1，-NHC(O)NHR1，琥珀酰亞胺，或芐氧基羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R1分別是氫或低級烷基，并且，其中所述苯環(huán)可以用1-3個選自C1-C4烷基，C1-C4烷氧基，氯和溴的取代基取代。
5.游離的C-末端是衍生化的。通常，C-末端是酯化或酰胺化的。舉例來說，典型的C-末端衍生基團包括例如-C(O)R2，其中，R2是低級烷氧基，或-NR3R4，其中R3和R4獨立地是氫或C1-C8烷基(C1-C4烷基)。
6.二硫鍵被另一種鍵，優(yōu)選更穩(wěn)定的交聯(lián)部分(例如亞烷基)所取代。例如，參見Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9；Alberts等(1993)Thirteenth Am.Pep.Symp.，357-9。
7.一種或多個獨立的氨基酸殘基是修飾過的。正如在下面詳細披露的，已知各種衍生劑能夠與各種特定的側(cè)鏈或末端殘基專一性起反應(yīng)。
賴氨酰殘基和氨基末端殘基可以與琥珀酸或其他羧酸酸酐起反應(yīng)，它能顛倒賴氨酰殘基的電荷。適合衍生含有α氨基的殘基的其他合適的試劑包括亞胺基酯，如甲基吡啶亞胺(picolinimidate)；磷酸吡多醛；吡多醛；氯溴氫酸；三硝基苯磺酸；O-甲基異脲；2，4-戊二酮；和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
精氨酰殘基可以通過與任一種常規(guī)試劑或若干種常規(guī)試劑的組合起反應(yīng)進行修飾，所述試劑包括苯基吡多醛，2，3-丁二酮，1，2-環(huán)己二酮，和茚三酮。精氨酰殘基的衍生化，需要該反應(yīng)在堿性條件下進行，因為胍官能團具有高的pKa。另外，所述試劑還可以與賴氨酸的基團和精氨酰胺ε-氨基起反應(yīng)。
業(yè)已對酪氨酰殘基的特殊修飾進行過深入研究，特別感興趣的是通過與芳族重氮化合物或四硝基甲烷起反應(yīng)將光譜標(biāo)記導(dǎo)入酪氨酰殘基。最常見的是，利用N-?；溥蚝退南趸淄榉謩e形成o-乙酰酪氨酰類和3-硝基衍生物。
可以通過與碳二亞胺(R′-N＝C＝N-R’)起反應(yīng)，選擇性地修飾羧基側(cè)鏈基團(天冬氨酰和谷氨酰)，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮翁-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。另外，可以通過與銨離子起反應(yīng)，將天冬氨酰和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)化成天冬酰胺和谷安酰胺殘基。
可以對谷氨酰胺和天冬酰胺殘基進行脫酰胺化，形成相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基，另外，所述殘基是在溫和的酸性條件下脫酰氨化的。所述殘基的任一種形式都屬于本發(fā)明的范圍。
半胱酰胺殘基可以被氨基酸殘基或其他部分所取代，以便消除二硫鍵，或者相反，使交聯(lián)穩(wěn)定。例如，參見Bhatnagar等(1996)，J.Med.Chem.393814-9。
通過雙功能試劑的衍生化，可用于將肽或它們的功能衍生物交聯(lián)在水不溶性支持基質(zhì)上或交聯(lián)在其他大分子媒介物上。常用的交聯(lián)劑包括，例如，1，2-二(重氮乙酰)-2-苯基乙烷，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞氨酯，例如，與4-重氮水楊酸形成的酯，高雙功能亞胺酸酯，包括二琥珀酰亞胺酯，包括3，3′-二硫二(琥珀酰亞胺丙酸)，和雙功能馬來酰胺，如2-N-馬來酰-1，8-辛烷。諸如甲基-3-[(p-重氮苯基)二硫]丙酸亞胺酸酯的衍生劑能產(chǎn)生可以光活化的中間物，所述中間物能夠在存在光線的條件下形成交聯(lián)鍵。另外，將披露于美國專利3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中的諸如氰溴酸活化的碳水化合物和活性底物的活性水不溶性基質(zhì)用于蛋白固定化。
可以將碳水化合物(寡糖)基團方便地連接在蛋白上的已知是糖基化位點的位點上。一般，當(dāng)它們是Asn-X-Ser/Thr序列的一部分時，o-連接的寡糖連接在絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基上，而N-連接的寡糖連接在天冬酰胺(Asn)殘基上，其中，X可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。X是除了脯氨酸以外的19種天然存在的氨基酸中的一種。出現(xiàn)在每一種類型中的N-連接的和O-連接的寡糖和糖殘基的結(jié)構(gòu)是不同的。通常在兩種類型上常見的一類糖是N-乙酰神經(jīng)氨酸(被稱為唾液酸)。唾液酸通常是N-連接的和O-連接的寡糖的末端殘基，并且通過它的負電荷，可賦予所述糖基化化合物酸性特性。所述位點可以整合到本發(fā)明化合物的接頭上，并且優(yōu)選是在所述多肽化合物的重組生產(chǎn)期間由細胞糖基化的(例如，在哺乳動物細胞內(nèi)，如CHO，BHK，COS)。不過，所述位點還可以通過本領(lǐng)域已知的合成或半合成方法糖基化。
其他可行的修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰和蘇氨酰殘基的羥基基團的磷酸化，Cys中的硫原子的氧化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α氨基的甲基化。Creighton，ProteinsStructure andMolecule Properties(W.H.Freeman & Co.，San Francisco)，pp.79-86(1983)。
本發(fā)明的化合物還可以在DNA水平上改變。所述化合物的任何部分的DNA序列都可以改變成與所選擇的宿主細胞更兼容的密碼子。對于大腸桿菌(它是優(yōu)選的宿主細胞)來說，優(yōu)化密碼子在本領(lǐng)域是公知的?？梢匀〈艽a子，以便消除限制位點或包括沉默的限制位點，這將有助于在特定的宿主細胞中加工所述DNA?？梢詫⑺雒浇槲?、接頭和肽DNA序列修飾成包括上述任何序列變化。
生產(chǎn)方法本發(fā)明的化合物在很大程度上可以通過重組DNA技術(shù)在轉(zhuǎn)化過的宿主細胞中生產(chǎn)。為此，制備了編碼所述肽的重組DNA分子。制備所述DNA分子的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，可以利用合適的限制酶將編碼所述肽的序列從DNA上切除。另外，可以通過化學(xué)合成技術(shù)合成所述DNA分子，如氨基磷酸酯方法。另外，還可以使用所述技術(shù)的組合。
本發(fā)明還包括能夠在合適的宿主中表達所述肽的載體。所述載體包括可操作地與合適的表達控制序列連接的編碼所述肽的DNA分子。在將DNA分子插入所述載體之前或之后，進行該操作性連接的方法是眾所周知的。表達控制序列包括啟動子、激活子、增強子、操縱子、核糖體結(jié)合位點、起始信號、終止信號、加帽信號、聚腺苷酸化信號、和與轉(zhuǎn)錄或翻譯控制相關(guān)的其他信號。
將所得到的在它上面具有所述DNA分子的載體用于轉(zhuǎn)化合適的宿主。該轉(zhuǎn)化可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法進行。
大量現(xiàn)有的和眾所周知的宿主細胞中的任一種，都可用于實施本發(fā)明。特定宿主的選擇取決于本領(lǐng)域所認可的多種因素。其中包括，例如，與所選擇的表達載體的兼容性，由所述DNA分子所編碼的肽的毒性，轉(zhuǎn)化速度，肽回收的難易程度，表達特征，生物安全性和成本。所述因素的平衡必須符合以下理解，即并非所有的宿主在表達特定DNA序列時都同樣有效。在這種一般性指導(dǎo)下，有用的微生物宿主包括細菌(如大腸桿菌)，酵母(如酵母菌)和其他培養(yǎng)中的真菌，昆蟲，植物，哺乳動物(包括人類)細胞，或本領(lǐng)域已知的其他宿主。
然后，培養(yǎng)并且純化轉(zhuǎn)化過的宿主，宿主細胞可以在常規(guī)發(fā)酵條件下培養(yǎng)，以便表達所需要的化合物。所述發(fā)酵條件是本領(lǐng)域所熟知的。最后，通過本領(lǐng)域所熟知的方法從培養(yǎng)物中純化所述肽。
所述化合物還可以通過合成方法制備。例如，可以使用固相合成技術(shù)。合適的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，并且包括披露于以下文獻中的技術(shù)Merrifield(1973)，Chem.Polypeptides，pp.335-61(Katsoyannis和Panayotis eds.)；Merrifield(1963)，J.Am.Chem.Soc.852149；Davis等(1985)，Biochem.Intl.10394-414；Stewart和Young(1969)，Solid Phase Peptide Synthesis；美國專利3,941,763；Finn等(1976)，The Proteins(3rded.)2105-253；和Erickson等(1976)，TheProteins(3rded.)2257-527。固相合成是生產(chǎn)單一肽的優(yōu)選技術(shù)，因為它是生產(chǎn)小型肽的最經(jīng)濟的方法。
可以通過眾所周知的有機化學(xué)技術(shù)合成含有衍生化的肽或含有非肽基團的化合物。
化合物的用途本發(fā)明的化合物特別適用于治療B-細胞介導(dǎo)的自身免疫病。具體地講，本發(fā)明的化合物可用于治療、預(yù)防、緩解、診斷或預(yù)測狼瘡，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，和狼瘡相關(guān)的疾病和癥狀。其他優(yōu)選的疾病包括B-細胞介導(dǎo)的癌癥，包括B-細胞淋巴瘤。
本發(fā)明的化合物還可用于治療關(guān)節(jié)的炎性癥狀。關(guān)節(jié)的炎性癥狀包括能以不同程度使世界范圍內(nèi)的數(shù)百萬人痛苦和致殘的慢性關(guān)節(jié)疾病。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種關(guān)節(jié)疾病，其中，軟骨和骨骼被稱為血管翳的增殖的、侵入性結(jié)締組織緩慢侵蝕，所述組織來自關(guān)節(jié)滑液膜。所述疾病可能涉及外周關(guān)節(jié)疾病，如滑囊，腱鞘和腱，以及關(guān)節(jié)外組織，如皮下組織，心血管系統(tǒng)，肺，脾，淋巴結(jié)，骨骼肌，神經(jīng)系統(tǒng)(中樞和外周神經(jīng))和眼睛(Silberberg(1985)，Anderson′sPathology，Kissane(ed.)，II1828)。骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，其特征是關(guān)節(jié)軟骨的退化改變和關(guān)節(jié)周圍的骨頭和軟骨的活躍增殖。骨關(guān)節(jié)炎是一種細胞介導(dǎo)的活性過程，它有可能是因為軟骨細胞對代謝和合成刺激作出的不適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)所導(dǎo)致的。據(jù)報導(dǎo)，關(guān)節(jié)軟骨的某些基質(zhì)分子的改變出現(xiàn)在早期骨關(guān)節(jié)炎中(Thonar等(1993)，Rheumatic disease clinics of North America，Moskowitz(ed.)，19635-657和Shinmei等(1992)，Arthritis Rheum.，351304-1308)。TALL-1，TALL-1R和它的調(diào)節(jié)劑被認為可用于治療所述癥狀和相關(guān)的癥狀。
本發(fā)明的化合物還可用于治療多種其他疾病和失調(diào)，包括·急性胰腺炎；·ALS；·Alzheimer′s病·哮喘·動脈硬化；·自身免疫溶血性貧血；·癌癥，特別是與B細胞相關(guān)的癌癥；·惡病質(zhì)/厭食；·慢性疲勞綜合癥；·硬變(例如，原發(fā)性膽汁肝硬變)·糖尿病(例如，胰島素糖尿病)；·發(fā)熱；·腎小球腎炎，包括IgA腎小球腎炎和原發(fā)性腎小球腎炎；·Goodpasture′s綜合癥；·Guillain-Barre綜合癥；·移植物抗宿主?。?br> ·Hashimoto′s甲狀腺炎；·出血性休克；·痛覺過敏；·炎性腸炎；·關(guān)節(jié)的炎性癥狀，包括骨關(guān)節(jié)炎，牛皮癬關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；·由拉傷，扭傷，軟骨損傷，創(chuàng)傷，整形手術(shù)，感染或其他病變過程導(dǎo)致的炎性癥狀；·胰島素依賴型糖尿??；·缺血性損傷，包括大腦缺血(例如，由創(chuàng)傷、癲癇、出血或中風(fēng)所導(dǎo)致的大腦損傷，上述每一種疾病都可能導(dǎo)致神經(jīng)變性)；·認知障礙；·肺病(例如，ARDS)；·多發(fā)性骨髓瘤；·多發(fā)性硬化；·重癥肌無力；·骨髓性(例如，AML和CML)和其他白血?。弧ぜ〔?例如，肌肉蛋白代謝，特別是敗血癥)；·神經(jīng)毒性(例如，通過HIV誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性)；·骨質(zhì)疏松；·疼痛；·帕金森病；·天皰瘡；·多發(fā)性肌炎/皮膚肌炎；·肺炎，包括自身免疫肺炎；·pre-term labor；·牛皮癬·Reiter′s病·再灌注損傷；·膿毒性休克；·由放射治療產(chǎn)生的副作用；
·Sjogren′s綜合癥；·睡眠紊亂；·臨時性下頜骨關(guān)節(jié)??；·血小板減少癥，包括特發(fā)性血小板減少癥和自身免疫新生兒血小板減少癥；·腫瘤轉(zhuǎn)移；·眼色素層炎；和·脈管炎。
本發(fā)明的化合物可以單獨施用，或者與治療有效量的其他藥物組合施用，包括止痛劑，疾病修飾抗風(fēng)濕病藥物(DMARDs)，非甾醇抗炎性藥物(NSAIDs)，和任何免疫和/或炎癥調(diào)節(jié)劑。因此，本發(fā)明的化合物還可以與以下藥物一起施用；·TNF/TNF受體家族其他成員的調(diào)節(jié)劑，包括TNF拮抗劑，如etanercept(EnbrelTM)，sTNF-RI，onercept，D2E7，和RemicadeTM。
·神經(jīng)生長因子(NGF)調(diào)節(jié)劑。
·IL-1抑制劑，包括IL-lra分子，如anakinra和最近發(fā)現(xiàn)的IL-lra-樣分子，如IL-1Hyl和IL-1Hy2；披露于1998年12月1日授權(quán)的美國專利5,844,099中的IL-1 IL-1“trap”；IL-1抗體，溶解的IL-1受體等。
·IL-6抑制劑(例如，IL-6的抗體)。
·IL-8抑制劑(例如，IL-8的抗體)。
·IL-18抑制劑(例如，IL-18結(jié)合蛋白，溶解的IL-18受體，或IL-18抗體。
·白介素-1轉(zhuǎn)化酶(ICE)調(diào)節(jié)劑。
·胰島素樣生長因子(IGF-1，IGF-2)和它的調(diào)節(jié)劑。
·轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)，TGF-β家族成員，和TGF-β調(diào)節(jié)劑。
·成纖維細胞生長因子FGF-1-FGF-10，和FGF調(diào)節(jié)劑。
·骨保護素(OPG)，OPG類似物，骨保護劑，和OPG配體的抗體(OPG-L)。
·骨合成劑，如甲狀旁腺素(PTH)，PTH片段，和結(jié)合了PTH片段的分子(例如，PTH(1-34)-Fc)。
·PAF拮抗劑。
·角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)，KGF-相關(guān)分子(例如KGF-2)，和KGF調(diào)節(jié)劑。
·COX-2抑制劑，如CelebrexTM和VioxxTM。
·前列腺素類似物(例如，E系列前列腺素)。
·基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)調(diào)節(jié)劑。
·氧化氮合成酶(NOS)調(diào)節(jié)劑，包括誘導(dǎo)型NOS的調(diào)節(jié)劑。
·糖皮質(zhì)素受體的調(diào)節(jié)劑。
·谷氨酸受體的調(diào)節(jié)劑。
·脂多糖(LPS)含量的調(diào)節(jié)劑。
·抗癌制劑，包括致癌基因(例如，fos，jun)的抑制劑和干擾素。
·去甲腎上腺素和它的調(diào)節(jié)劑和模擬物。
藥用組合物一般說明。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明化合物的藥用組合物的方法。所述藥用組合物可以注射施用，或口服，經(jīng)肺、鼻腔、經(jīng)皮施用，或以其他形式施用。一般，本發(fā)明包括含有有效數(shù)量的本發(fā)明化合物的藥用組合物，同時還含有可以藥用的稀釋劑，防腐劑，穩(wěn)定劑，乳化劑，佐劑和/或載體。所述組合物包括各種緩沖成分的稀釋劑(例如，Tris-HCl，乙酸，磷酸)，pH和離子強度；添加劑，如洗滌劑和穩(wěn)定劑(例如，Tween 80，Polysorbate 80)，抗氧化劑(例如，抗壞血酸，偏亞硫酸氫鈉)，防腐劑(例如，Thimersol，芐醇)和填充物質(zhì)(例如，乳糖，甘露糖醇)；將所述材料結(jié)合到諸如聚乳酸，聚乙醇酸的聚合物的顆粒狀制劑中的材料，或結(jié)合到脂質(zhì)體。還可以使用透明質(zhì)酸，并且這種材料具有改善在循環(huán)系統(tǒng)中的持續(xù)時間的作用。所述組合物可以影響本發(fā)明蛋白和衍生物的物理狀態(tài)，穩(wěn)定性，體內(nèi)釋放速度和體內(nèi)清除速度。例如，參見Remington′sPharmaceutical Sciences，18th Ed.(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)pages 1435-1712，該文獻被以全文形式引入本文作為參考。所述組合物可以以液體形式制備，或者以干燥粉末形式制備，如冷凍干燥形式。置入式緩釋制劑也是可行的，如經(jīng)皮制劑。
口服劑型。本發(fā)明涉及口服固體劑型，這種劑型一般披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences(1990)，18th Ed.，Mack PublishingCo.Easton PA18042的第89章，該文獻以全文形式引入本文作為參考。固定劑型包括片劑、膠囊、丸劑、藥片或錠劑、扁膠囊或小藥丸。還可將脂質(zhì)體或蛋白類膠囊用于制備本發(fā)明組合物(例如，在美國專利4,925,673中所報導(dǎo)的蛋白類微球)。還可以使用脂質(zhì)體膠囊化，并且可以用各種聚合物對脂質(zhì)體進行衍生化(例如美國專利5,013,556)。在以下文獻的第10章披露了用于治療的可行的固體劑型Marshall，K.，Modern Pharmaceutics(1979)，edited by G.S.Banker andC.T.Rhodes，第10章，該文獻被以全文形式引入本文作為參考。一般，所述制劑可以包括本發(fā)明的化合物，和惰性成分，這些惰性成分可以對抗腸胃環(huán)境，并且在小腸中釋放生物學(xué)活性材料。
另外，還具體涉及上述本發(fā)明化合物的口服劑型。如果必要的話，可以對所述化合物進行化學(xué)修飾，以便口服輸送更為有效。一般，所涉及到的化學(xué)修飾是將至少一種成分連接在化合物分子本身上，其中，所述部分可以(a)抑制蛋白水解作用；和(b)從胃或小腸中吸收到血液中。另外還希望所述化合物的總體穩(wěn)定性提高，以及在體內(nèi)的循環(huán)時間延長?？捎米鞅景l(fā)明的共價連接媒介物的部分也可用于這一目的。所述分子的例子包括PEG，乙二醇和丙二醇的共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯基醇，聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。例如，參見Abuchowski和Davis，Soluble Polymer-Enzyme Adducts，Enzymes as Drugs(1981)，Hocenberg和Roberts，eds.，Wiley-Interscience，New York，NY，pp.36783；Newmark，等(1982)，J.Appl.Biochem.4185-9?？梢允褂玫钠渌酆衔锸蔷?1，3-二氧戊環(huán)和聚1，3，6-tioxocane。優(yōu)選的用于藥物用途的，如上文所述，是PEG成分。
對于口服輸送劑型來說，還可以使用修飾過的脂族氨基酸的鹽，如N-(8-[2-羥基苯甲?；鵠氨基)辛酸鈉(SNAC)，作為一種載體以便增強本發(fā)明治療性化合物的吸收。業(yè)已在通過EmisphereTechnologies進行的II期實驗中，證實了使用SNAC的肝素制劑的臨床效力。參見美國專利5,792,451，“口服藥物輸送組合物和方法”。
本發(fā)明的化合物可以作為粒度為大約1毫米的顆粒小團形式的細的多顆粒添加在所述制劑中。用于膠囊施用的所述材料的制劑還可以作為粉末、略微壓縮的栓劑，甚至是作為片劑。所述治療劑可以通過壓縮制備。
還可以添加著色劑和香味劑。例如，可以制備所述蛋白(或衍生物)(如通過脂質(zhì)體或小球膠囊)，然后，進一步包含在食品中，如含有著色劑和香味劑的冰鎮(zhèn)飲料。
人們可以用一種惰性材料稀釋或增加本發(fā)明化合物的體積。所述稀釋劑可以包括碳水化合物，特別是甘露糖醇，α-乳糖，無水乳糖，纖維素，蔗糖，改性葡聚糖和淀粉。某些無機鹽也可用作填充材料，包括三磷酸鈣，碳酸鎂和氯化鈉。某些可以從商業(yè)渠道獲得的稀釋劑包括Fast-Flo，Emdex，STA-Rx 1500，Emcompress和Avicell。
在所述治療劑的制劑中還可以添加分散劑，以便制成固體劑型。用作分散劑的材料包括，但不局限于淀粉，包括基于淀粉的商業(yè)化分散劑，Explotab。淀粉乙醇酸鈉，Amberlite，羧甲基纖維素鈉，超級支鏈淀粉，藻酸鈉，明膠，橙皮，酸性羧甲基纖維素，天然海綿和膨潤土都可以使用。另一種形式的分散劑是不溶性陽離子交換樹脂。粉末狀的樹膠可以用作分散劑以及用作粘接劑，并且所述樹膠可以包括粉狀樹膠，如瓊脂，Karaya或黃耆膠。
可以使用粘接劑將所述治療劑保持在一起，以便形成硬的片劑，并且包括來自天然產(chǎn)品的材料，如合歡膠，黃耆膠，淀粉和明膠。其他材料包括甲基纖維素(MC)，乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可用于醇溶液中，以便使所述治療劑顆粒化。
在所述治療劑的配方中還可以添加抗摩擦劑，以便防止在制備過程發(fā)生粘連?？梢詫櫥瑒┯米髦委焺┖湍＞弑谥g的一個層，所述潤滑劑可以包括，但不局限于硬脂酸，包括它的鎂和鈣鹽，聚四氟乙烯(PTFE)，液體石蠟，植物油和蠟。還可以使用可溶性潤滑劑，如十二烷基硫酸鈉，十二烷基硫酸鎂，各種分子量的聚乙二醇，Carbowax 4000和6000。
可以添加能夠在制備期間改善藥物的流動特性，并且在壓縮期間有助于重新排列的滑動劑。所述滑動劑包括淀粉、滑石、火成硅和水合硅鋁酸鹽。
為了幫助將本發(fā)明的化合物溶解在含水環(huán)境中，可以添加作為濕潤劑的表面活性劑。表面活性劑可以包括陰離子洗滌劑，如十二烷基硫酸鈉，二辛基硫代琥珀酸鈉，和二辛基磺酸鈉?？梢允褂藐栯x子洗滌劑，并且包括benzalkonium chloride或benzethonium chloride。在所述制劑中可以作為表面活性劑使用的非離子洗滌劑包括lauromacrogol 400，polyoxyl 40硬脂酸，聚氧乙烯氫化蓖麻油10，50和60，硬脂酸單甘油酯，polysorbate 40，60，65和80，蔗糖脂肪酸酯，甲基纖維素和羧甲基纖維素。所述表面活性劑可以單獨或作為不同比例的混合物存在于所述蛋白或衍生物的制劑中。
在所述制劑中還可以添加增強所述化合物吸收的添加劑。例如，可能具有這種特性的添加劑有脂肪酸油酸，亞油酸和亞麻酸。
可能需要控制釋放制劑?？梢詫⒈景l(fā)明的化合物結(jié)合在惰性基質(zhì)中。該基質(zhì)可以通過擴散或溶出機制釋放；例如，樹膠。還可以將緩慢降解的基質(zhì)整合在所述制劑中，例如，藻酸，多糖。本發(fā)明化合物的另一種形式的控制釋放是一種基于Oros治療系統(tǒng)的方法(AlzaCorp.)，即，將所述藥物包在半透膜中，由于滲透作用，這種膜使得水能夠進入并且通過單一的小孔將藥物從里面推出。某些腸包衣也具有緩釋效果。
可以將其他包衣劑用于所述制劑。其中包括多種可用于包衣鍋(pan)的多種糖類。所述治療劑還能夠以薄膜包衣的片劑形式提供，并且用于這種場合的材料被分成兩類。第一類是非腸衣材料，并且包括甲基纖維素，乙基纖維素，羥乙基纖維素，甲基羥基-乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基-甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，providone和聚乙二醇。第二類包括糖衣材料，它通常是苯二甲酸的酯。
可以將材料的混合物用于提供最佳膜包衣。膜包衣可以在鍋包衣器或流化床或通過壓縮包衣進行。
肺輸送形式。本發(fā)明還涉及本發(fā)明蛋白(或其衍生物的肺輸送)。所述蛋白(或衍生物)是通過吸入輸送到哺乳動物肺中的，并且通過肺上皮襯里細胞到達血液系統(tǒng)(包括這一方面內(nèi)容的其他報導(dǎo)包括Adjei等，Pharma.Res.(1990)7565-9；Adjei等(1990)，Internatl.J.Pharmaceutics 63135-44(leuprolide acetate)；Braquet等(1989)，J.Cardiovasc.Pharmacol.13(suppl.5)s.143-146(內(nèi)皮肽1)；Hubbard等(1989)，Annals Int.Med.3206-12(α1-抗胰蛋白酶)；Smith等(1989)，J.Clin.Invest.841145-6(α1-蛋白酶)；Oswein等(March1990)，“蛋白的氣溶膠化”，Proc.Symp.Resp.Drug Delivery II，Keystone，Colorado(重組人生長激素)；Debs等(1988)，J.Immunol.1403482-8(干擾素γ和腫瘤壞死因子α)和Platz等，美國專利5,284,656(粒細胞集落刺激因子)。
在實施本發(fā)明時，可以使用多種為了肺輸送治療制品而設(shè)計的機械裝置，包括，但不局限于霧化器，計量劑量的吸入器，和粉末吸入器，所有這些裝置都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。適用于實施本發(fā)明的市售裝置的某些具體例子包括Ultravent霧化器，由Mallinckrodt，Inc.生產(chǎn)，St.Louis，Missouri；Acorn II噴霧器，由Marquest Medical Products生產(chǎn)，Englewood，Colorado；Ventolin計量劑量吸入器，由Glaxo Inc.生產(chǎn)，Research Triangle Park，NorthCarolina；和Spinhaler粉末吸入器，由Fisons Corp.生產(chǎn)，Bedford，Massachusetts。
所有上述裝置都需要使用適合分配本發(fā)明化合物的制劑。通常，每一種制劑對所使用的裝置的類型是專一的，并且除了用于治療的稀釋劑、佐劑和/或載體之外可以使用合適的推進劑材料。
本發(fā)明的化合物最優(yōu)選以顆粒形式制備，平均粒度小于10微米，最優(yōu)選0.5-5微米，以便最有效地輸送到肺的遠端。
可以藥用的載體包括碳水化合物，如海藻糖，甘露糖醇，木糖醇，蔗糖，乳糖和山梨糖醇。用于制劑中的其他成分可以包括DPPC，DOPE，DSPC和DOPC?？梢允褂锰烊换虮砻婧铣杀砻婊钚詣??？梢允褂肞EG(可以不是用于對所述蛋白或類似物進行衍生化)?？梢允褂闷暇厶?，如環(huán)葡聚糖?？梢允褂媚懰猁}和其他相關(guān)的強化劑?？梢允褂美w維素和纖維素衍生物?？梢允褂冒被幔缬糜诰彌_液制備。
另外，還可以使用脂質(zhì)體，微膠囊或微球體，包含體復(fù)合物或其他類型的載體。
適用于噴射型或超聲波型的噴霧器的制劑通常包括溶解在水中的本發(fā)明的化合物，每毫升溶液中生物學(xué)活性蛋白的濃度大約0.1-25毫克。所述制劑還可以含有緩沖劑和一種簡單的糖(例如，用于蛋白穩(wěn)定和調(diào)節(jié)滲透壓)。噴霧器制劑還可以包括表面活性劑，以便降低或防止由表面誘導(dǎo)的形成氣溶膠的溶液的霧化所導(dǎo)致的蛋白的聚集。
用于計量劑量吸入器裝置的制劑通常包括細碎的粉末，它含有借助于表面活性劑而懸浮在推進劑中的本發(fā)明的化合物。所述推進劑可以是任何用于這一目的的常規(guī)材料，如氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴、或烴，包括三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷，或它們的組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。還可以將油酸用作表面活性劑。
用于從粉末吸入器中分配的制劑可以包括含有本發(fā)明化合物的細碎的干燥粉末并且還可以包括填充劑，如乳糖、山梨糖醇，蔗糖，甘露糖醇，海藻糖，或木糖醇，其用量有利于所述粉末從該裝置中分散，例如占該制劑重量的50-90％。
鼻腔輸送形式。還涉及本發(fā)明化合物的鼻腔輸送。鼻腔輸送可以使在將所述治療產(chǎn)品施用到鼻腔之后使所述蛋白直接輸送到血液中，而不需要使所述產(chǎn)品沉積在肺里。適合鼻腔輸送的制劑包括含有葡聚糖或環(huán)葡聚糖的制劑。通過其他黏膜的輸送也是可行的。
劑量。與用于治療上述癥狀的方法相關(guān)的劑量方案可以由主治醫(yī)生確定，要考慮多種可能改變藥物作用的因素，例如患者的年齡、癥狀、體重、性別和飲食，任何感染的嚴重程度、施用時間和其他臨床因素。一般，每天的方案應(yīng)當(dāng)在每千克體重0.1-1000微克本發(fā)明化合物的范圍內(nèi)，優(yōu)選每千克體重0.1-150微克。
特別優(yōu)選的實施方案本發(fā)明人業(yè)已確定了在下面的表4中列舉的優(yōu)選肽的優(yōu)選結(jié)構(gòu)。符號“A”可以是本文所披露的任何接頭，或者可能簡單地表示一種普通的肽鍵(即不存在接頭)。為了清楚起見，串聯(lián)重復(fù)和接頭是分開示出的。
表4-優(yōu)選實施方案
“V1”是如本文前面所定義的Fc結(jié)構(gòu)域。除了在表4中所列舉的之外，本發(fā)明人還提出了異源雙體，其中，F(xiàn)c雙體的每一條鏈與一種不同的肽序列連接；例如，其中每一種Fc與選自表2的一種不同的序列連接。
本發(fā)明的所有化合物都可以通過在PCT申請WO 99/25044中所披露的方法制備。
下面將通過實際例子對本發(fā)明作進一步說明，這些例子是說明性的而不是限制性的。
實施例1肽肽噬菌體展示1.磁性珠制備
A.固定在磁性珠上的Fc-TALL-1將重組Fc-TALL-1蛋白固定在蛋白A Dynabeads(Dynal)上，濃度為每100微升從生產(chǎn)商那里購買的磁性珠原料中使用8微克的Fc-TALL-1。通過使用磁鐵將所述珠吸到試管的一側(cè)，并且將液體移出，用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌所述珠兩次，并且重新懸浮在PBS中。以上述濃度將Fc-TALL-1蛋白添加到洗滌過的磁性珠中，并且在室溫下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)1小時。然后通過以1％的最終濃度添加牛血清白蛋白(BSA)并且在4℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜，對Fc-TALL-1包衣的珠進行封閉。然后用PBST(含有0.05％Tween-20)的PBS洗滌所得到的Fc-TALL-1包衣的珠，然后進行所述篩選方法。
B.陰性篩選珠制備為了進行陰性篩選，還制備了另外的珠。對每一種淘選條件來說，對從生產(chǎn)商那里購買的250微升的珠原料進行上述方法的處理(1A部分)，所不同的是，去掉了用FTALL-1培養(yǎng)的步驟。在最后的洗滌步驟中，將所述珠分成5個50微升的等份。
2.TALL-1結(jié)合噬菌體的篩選A.總體方法將兩種絲狀噬菌體文庫TN8-IX(5×109獨立轉(zhuǎn)化體)和TN12-I(1.4×109獨立轉(zhuǎn)化體)(Dyax Corp.)用于篩選TALL-1結(jié)合噬菌體。對每一個文庫進行pH 2洗脫或‘珠洗脫’(2E部分)。因此，對于TALL-1項目來說，采用了四種不同的淘選條件(TN8-IX使用pH2洗脫方法，TN8-IX使用珠洗脫方法，TN12-I使用pH2洗脫方法，而TN12-I使用珠洗脫方法)。對每一種條件來說進行三輪選擇。
B.陰性篩選對每一種淘選條件來說，從所述文庫母液中等分出大約100個隨機的文庫等分體(對于TN8-IX來說為5×1011pfu，而對于TN12-I來說為1.4×1011pfu)，并且用PBST稀釋到300微升。在最后一次洗滌之后，將液體從為了進行陰性篩選而制備的珠的第一個50微升等份樣品中吸出(1B部分)。將300微升稀釋過的文庫的母液添加所述珠中。所得到的混合物在室溫下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)10分鐘。利用磁力將噬菌體上清液吸出，并且添加到第二個50微升的等份樣品中，進行另一個陰性篩選步驟。通過這種方式，進行了5個陰性篩選步驟。
C.利用Fc-TALL-1蛋白包衣的珠進行篩選在最后的陰性篩選步驟之后(1A部分)將噬菌體上清液添加到最后的洗滌步驟之后的Fc-TALL-1包衣的珠中。在室溫下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)該混合物2小時，使特定噬菌體與所述靶蛋白結(jié)合。在將上清液去掉之后，用PBST洗滌所述珠7次。
D.結(jié)合噬菌體的pH2洗脫在最后的洗滌步驟之后(2C部分)。通過添加200微升的CBST(50mM檸檬酸鈉，150mM氯化鈉，0.05％Tween-20，pH2)將結(jié)合的噬菌體從磁性珠上洗脫。在室溫下培養(yǎng)5分鐘之后，將含有洗脫的噬菌體的液體吸出，并且轉(zhuǎn)移到另一只試管中。通過添加200微升CBST并且培養(yǎng)5分鐘再次重復(fù)所述洗脫步驟。將來自兩個洗滌步驟的液體混合在一起，并且添加100微升2M Tris溶液(pH8)，以便中和pH。添加500微升Min A Salts溶液(60mM K2HPO4，33mM KH2PO4，7.6mM(NH4)SO4，和1.7mM檸檬酸鈉)，將最終體積調(diào)整為1毫升。
E.‘珠洗脫’在最后的洗滌之后，將液體吸出(2C部分)，將1ml Min A鹽溶液添加到所述珠中。將該珠混合物直接添加到濃縮細菌樣品中進行感染(3A和3B部分)。
3.擴增A.鋪平板細胞的制備在含有12.5μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，將新鮮大腸桿菌(XL-1Blue MRF′)培養(yǎng)物生長到OD600＝0.5。對每一種淘選(panning)條件來說，在冰上冷卻20毫升的該培養(yǎng)物，并且離心。將細菌沉淀物重新懸浮在1毫升的Min A鹽溶液中。
B.轉(zhuǎn)導(dǎo)將來自不同洗脫方法的每一種混合物(2D和2E部分)添加到濃縮細菌樣品(3A部分)中，并且在37℃下培養(yǎng)15分鐘。將2毫升NZCYM培養(yǎng)基(2×NZCYM，50μg/ml氨芐青霉素)添加到每一種混合物中，并且在室溫下培養(yǎng)15分鐘。將所得到的4毫升溶液鋪在50μg/ml氨芐青霉素的大型NZCYM瓊脂平板上，并且在37℃下培養(yǎng)過夜。
C.噬菌體收獲將在大型NZCYM瓊脂平板(3B部分)上生長過夜的每一種細菌/噬菌體混合物刮取到35毫升LB培養(yǎng)基中，并且再用35毫升的LB培養(yǎng)基進一步漂洗所述瓊脂平板。對所得到的存在于LB培養(yǎng)基中的細菌/噬菌體混合物進行離心，以便使細菌沉淀。將50毫升的噬菌體上清液轉(zhuǎn)移到新的試管中，并且添加12.5毫升的PEG溶液(20％PEG8000，3.5M乙酸銨)，并且在冰上培養(yǎng)2小時，以便使噬菌體沉淀。通過離心使沉淀的噬菌體下落，并且重新懸浮在6毫升的噬菌體再懸浮緩沖液中(250mM NaCl，100mM Tris，pH8，1mM EDTA)。通過離心再次純化該噬菌體溶液，除去其余的細菌，并且通過添加1.5毫升PEG溶液再次沉淀噬菌體。在離心步驟之后，將噬菌體沉淀重新懸浮在400微升PBS中。對該溶液進行最后的離心，以便消除其余的細菌碎片。通過標(biāo)準噬斑形成測定對所得到的噬菌體制劑進行滴定(Molecular Cloning，Maniatis等3rdEdition)。
4.另兩輪篩選和擴增在第二輪中，將來自第一輪(3C部分)的擴增噬菌體(1010pfu)用作輸入噬菌體，進行篩選和擴增步驟(2和3部分)。將來自第二輪的擴增噬菌體(1010pfu)再用作輸入噬菌體進行第三輪篩選和擴增(2和3部分)。在第三輪的洗脫步驟之后(2D和2E部分)，向在噬菌體形成測定(3C部分)那樣對少量的洗脫噬菌體進行鋪平板。挑選單獨的噬斑，并且放入在每一個孔中含有100微升TE緩沖液的96孔微量滴定板上。將所述主平板放入37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時，以便將噬菌體洗脫到TE緩沖液中。
5.克隆分析(噬菌體ELISA和測序)通過噬菌體ELISA和測序方法分析噬菌體克隆。根據(jù)來自這兩種分析的組合結(jié)果對序列進行分級。
A.噬菌體ELISA將XL-1 BlueMRF′培養(yǎng)物生長到OD600達到0.5。將30微升的該培養(yǎng)物等分到96孔微量滴定板的每一個孔中。將10微升洗脫噬菌體(第四部分)添加到每一個孔中，并且在室溫下感染細菌15分鐘。向每一個孔中添加130微升含有12.5μg/ml四環(huán)素和50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。然后在37℃下培養(yǎng)所述微量滴定板過夜。在4℃下，讓重組TALL-1蛋白(1μg/ml，溶解在PBS中)對96孔Maxisorp平板(NUNC)進行包衣過夜。作為對照，以與TALL-1蛋白相同的摩爾濃度將重組Fc-Trail蛋白包衣在另一個Maxisorp平板上。
在次日，將蛋白包衣的Maxisorp平板中的液體倒掉，并且每一個孔用300微升的2％BSA溶液在37℃下封閉1小時。倒掉BSA溶液，并且用PBST溶液洗滌所述孔3次。在最后的洗滌步驟之后，將50微升PBST添加到蛋白包衣的Maxisorp平板的每一個孔中。將96孔微量滴定板上的每一種50微升的過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到TALL-1包衣的平板以及對照Fc-Trail包衣平板的相應(yīng)的孔中。在室溫下培養(yǎng)這兩種類型平板上的100微升混合物1小時。將液體從Maxisorp平板上倒掉，并且用PBST洗滌孔5次。將HRP-綴合的抗-M13抗體(Pharmacia)稀釋1∶7500倍，并且將100微升稀釋液添加到Maxisorp平板上的每一個孔中，在室溫下培養(yǎng)1小時。再次倒掉液體，并且用PBST洗滌所述孔7次。將100微升四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(Sigma)添加到每一個孔中，以便進行顯色反應(yīng)，并且用50微升的5N H2SO4溶液終止該反應(yīng)。在平板讀數(shù)器(Molecular Devices)上讀出OD450。
B.噬菌體克隆的測序?qū)γ恳环N噬菌體克隆來說，測序模板是通過PCR方法制備的。利用以下寡核苷酸的擴增大約500個核苷酸片段引物 1(5′-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3′)(SEQ IDNO56)和引物 2(5′-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3′(SEQ IDNO57)。
為每一種克隆制備以下混合物
用熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System 9700，Applied Biosystems)執(zhí)行以下程序94℃，5分鐘；[94℃，30秒，55℃，30秒，72℃，45秒]×30輪；72℃，7分鐘；冷卻到4℃。通過將每一個PCR反應(yīng)的5微升樣品在1％瓊脂糖凝膠上電泳，檢查所述PCR產(chǎn)物。使用QIAquick Multiwell PCR純化試劑盒(Qiagen)，按照生產(chǎn)商的方法對來自每一種反應(yīng)的45微升的PCR產(chǎn)物進行純化。然后用ABI 377測序儀(Perkin-Elmer)，按照生產(chǎn)商推薦的方法對所得到的產(chǎn)物進行測序。
6.序列分級和共有序列測定A.序列分級將由可變核苷酸序列(5B部分)翻譯的肽序列與ELISA數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。將與TALL-1包衣的孔中表現(xiàn)出高的OD450，并且在Fc-Trail包衣的孔中表現(xiàn)出低的OD450的克隆被認為更重要一些。多次出現(xiàn)的序列也被認為是重要的。根據(jù)以上標(biāo)準選擇候選序列作為肽或肽體進行進一步分析。分別從TN8-IX和TN12-I文庫中選擇5個和9個候選肽序列。
B.共有序列確定從TN12-I文庫中選擇的大部分序列包括一個非常保守的DBL基序。該基序在從TN8-IB文庫中選擇的序列中同樣是保守的。在從TN8-IB文庫中獲得的序列中也觀察到了另一種基序PFPWE(SEQ IDNO110)。
根據(jù)DBL基序確定了一種共有肽FHDCKWDLLTKQWVCHGL(SEQ ID NO58)。由于來自TN12-I文庫的肽是活性最高的肽，通過DBL基序?qū)谏鲜龇诸悩?biāo)準(5A部分)上面26種肽序列進行排比。通過確定在每一個位置上出現(xiàn)次數(shù)最多的氨基酸獲得了加下劃線的“核心氨基酸序列”。靠近所述核心序列的兩個半胱氨酸是TN12-I文庫中的固定氨基酸。所有共有肽上的其余的氨基酸序列來自候選肽之一TALL-1-12-10(表2，SEQID NO37)。在B細胞增殖測定中，來自該共有序列的肽和肽體是最活躍的。
實施例2肽體構(gòu)建一套12 TALL-1抑制肽體(表5)，其中，將每一種肽的一個單體融合在人IgG1的Fc區(qū)的框內(nèi)。每一種TALL-1抑制肽體是通過以下方法構(gòu)建的，對表6所示的寡核苷酸對進行退火，以便產(chǎn)生編碼所述肽和接頭的雙鏈體，它包括5個甘氨酸殘基和一個纈氨酸殘基，是作為NdeI-SalI片段形式出現(xiàn)的。將該雙鏈分子連接到同樣用NdeI和SalI消化過的含有人Fc基因的載體上(pAMG21 RANK-Fc，如本文所披露的)。通過電穿孔將所得到的連接混合物轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株2596細胞中(GM221，如本文所披露的)。篩選克隆產(chǎn)生重組蛋白產(chǎn)物和擁有具備正確核苷酸序列的基因融合體的能力。對每一種肽體選擇一個這樣的克隆。所述融合蛋白的核苷酸和氨基酸序列如圖4A-4F所示。
表5.用于制備TALL-1抑制肽體的肽序列和寡核苷酸
表5B TALL-1抑制性肽體
表6用于肽體構(gòu)建的寡核苷酸
pAMG21-RANK-Fc載體pAMG21。表達質(zhì)粒pAMG21(ATCC保藏號98113)可源于Amgen表達載體pCFM1656(ATCC保藏號69576)，而后者又源于在美國專利4,710,473中所披露的Amgen表達載體系統(tǒng)。pCFM1656質(zhì)粒pCFM836質(zhì)粒通過以下方式源于(美國專利4,710,473)·通過用T4聚合物補平末端，隨后進行平端連接破壞兩個內(nèi)源NdeI限制位點；·用從pCFM636(專利號4,710,473)中獲得的含有PL啟動子(參見下面的SEQ ID NO95)的類似片段取代單一的AatII和Clal限制位點之間的含有合成PL啟動子的DNA序列；和·用具有SEQ ID NO96序列的寡核苷酸取代位于單一Clal和Kpnl限制位點之間的小DNA序列。
SEQ ID NO95Aat II5′CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT-3′TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA--AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA--TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT--TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3′-ATGGTGACCCCCACTATGACTCGTGTAGC5′ClaISEQ ID NO96
5′CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3′3′TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5′ClaIKpnI然后可以通過PCR重疊寡核苷酸誘變和DNA序列取代進行一系列的定點堿基改變由CFM1656制備表達質(zhì)量pAMG21。從緊靠質(zhì)粒復(fù)制啟動子PcopB的5’末端的BglII位點(質(zhì)粒bp 180)開始，并且向質(zhì)粒復(fù)制基因方向進行，進行下面的表7中所示出的堿基對改變。
表7-產(chǎn)生pAMG21的堿基對改變pAMG21bp#pCFM1656中的bp改變成pAMG21中的bp# 204 T/A C/G# 428 A/T G/C# 509 G/C A/T# 617 -- 插入2個G/C bp# 679 G/C T/A# 980 T/A C/G# 994 G/C A/T# 1004A/T C/G# 1007C/G T/A# 1028A/T T/A# 1047C/G T/A# 1178G/C T/A# 1466G/C T/A# 2028G/C bp缺失# 2187C/G T/A# 2480A/T T/A# 2499-2502AGTGGTCATCACCAGT# 2642TCCGAGC7bp缺失AGGCTCG# 3435G/C A/T# 3446G/C A/T# 3643A/T T/A用下面的DNA序列(SEQ ID NO97)取代位于單一AatII(pCFM1656上的4364號位置)和SacII(pCFM1656上的4585號位置)限制位點之間的DNA序列。 5′GCGTAACGTATGCATGGTCTCC-(pANG21中的4358號位置) 3′TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG--CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT--GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA--GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGC--CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG--CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC--GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG--CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGT--GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCA-AatII-TTCTACAAACTCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC--AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG--TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC--AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG--GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC--CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG--TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC--ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTG--ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATATTTATTTTTC--TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG--GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAATTAATGGTATGTTCATACACGCATGTAAAAATA--CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT--AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT--TTGATAGATATATCAACAGAAAGAGACTTACACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATA--TAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAA--ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGGTCACTATTCTGGACTACTAAAGCGAAGAAATT--TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTG--AATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAAGGTTAATTAGCCAC--AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCAT--TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTA--AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG--TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATC--AATGAGGATAAATGATCGCGAGTAAATAATATTCACAATGTACCATTTTAGTCATATCAG--TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC--ATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTTTAATTTTATTAATTATTCTGT--TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACA--AAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTACCTATTGTTTGTC--TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG--GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA--CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT--ATTGGATTTTTGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG--TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC-
-TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT--ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA--CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA--GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCT-SacII-GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAA--CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTT--GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA--CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT--ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGG--TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCC--AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3′[SacII粘性末端]-TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5′(pAMG21中的5904號位置)在連接該取代DNA序列的粘性末端之間，破壞了外側(cè)的AatII和SacII位點。在取代的DNA上具有單一的AatII和SacII位點。
將編碼與Fc的N-末端融合的人RANK的基因以NdeI-BamHI片段形式連接在pAMG21上，以便制備Amgen菌株#4125。對該構(gòu)建體進行修飾，以便在RANK和Fc的結(jié)合部分插入一個纈氨酸密碼子。相鄰的纈氨酸和天冬氨酸密碼子形成了一個單一的SalI位點。這使得所述肽可以融合在Fc3的N-末端的NdeI和SalI位點之間。在插入一個新的NdeI和SalI片段之后，破壞了RANK序列。在圖5A-5M中提供了所述載體的序列。
GM221(Amgen#2596)。Amgen宿主菌株#2596是源于Amgen菌株#393的大腸桿菌K-12菌株，后者是大腸桿菌W1485的衍生物，它是從耶魯大學(xué)的大腸桿菌遺傳學(xué)資源中心獲得的，New Haver，Connecticut(CGSC菌株6159)。業(yè)已將它修飾在早期ebg區(qū)含有溫度敏感型λ抑制子cI857s7，在晚期ebg區(qū)含有l(wèi)acIQ抑制子(68分鐘)。這兩個抑制基因的存在，使得該宿主能夠使用多種表達系統(tǒng)，不過，這兩種抑制子與luxPR的表達無關(guān)。未轉(zhuǎn)化過的宿主沒有抗生素抗性。
業(yè)已對cI857s7基因的核糖體結(jié)合位點進行了修飾，以便包括強化的RBS。業(yè)已將它插入1170和1411號核苷酸位置之間的ebg操縱子，所述編號是按照Genbank保藏號M64441Gb_Ba進行的，缺失了插入的ebg序列。下面示出了插入片段的序列，用小寫字母表示位于下面所示插入序列旁側(cè)的ebg序列(SEQ ID NO98)ttattttcgtGCGGCCGCACCATTATCACCGCCAGAGGTAAACTAGTCAACACGCACGGTGTTAGATATTTATCCCTTGCGGTGATAGATTGAGCACATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGGATAATATATGAGCACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTCGCCTTAAAGCAATTTATGAAAAAAAGAAAAATGAACTTGGCTTATCCCAGGAATCTGTCGCAGACAAGATGGGGATGGGGCAGTCAGGCGTTGGTGCTTTATTTAATGGCATCAATGCATTAAATGCTTATAACGCCGCATTGCTTACAAAAATTCTCAAAGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCTTCAATCGCCAGAGAATCTACGAGATGTATGAAGCGGTTAGTATGCAGCCGTCACTTAGAAGTGAGTATGAGTACCCTGTTTTTTCTCATGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTAAGCTTAGAACCTTTACCAAAGGTGATGCGGAGAGATGGGTAAGCACAACCAAAAAAGCCAGTGATTCTGCATTCTGGCTTGAGGTTGAAGGTAATTCCATGACCGCACCAACAGGCTCCAAGCCAAGCTTTCCTGACGGAATGTTAATTCTCGTTGACCCTGAGCAGGCTGTTGAGCCAGGTGATTTCTGCATAGCCAGACTTGGGGGTGATGAGTTTACCTTCAAGAAACTGATCAGGGATAGCGGTCAGGTGTTTTTACAACCACTAAACCCACAGTACCCAATGATCCCATGCAATGAGAGTTGTTCCGTTGTGGGGAAAGTTATCGCTAGTCAGTGGCCTGAAGAGACGTTTGGCTGATAGACTAGTGGATCCACTAGTgtttctgccc利用被稱為Mmebg-cI857s7基因強化RBS#4的重組噬菌體將所述構(gòu)建體輸送到F’tet/393的染色體中。在重組和分離之后，只有上述染色體插入片段還保留在所述細胞內(nèi)。將它重新命名為F’tet/GM101。然后通過將lacIQ構(gòu)建體輸送到2493和2937號核苷酸之間的ebg操縱子上將F’tet/GM101進行修飾，所述編號是按照Genbank保藏號M64441Gb_Ba進行的，缺失了插入的ebg序列。下面示出了插入片段的序列，用小寫字母表示位于下面所示插入序列旁側(cè)的ebg序列(SEQ ID NO99)ggcgganaccGACGTCCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAAAAAGTCGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGCTCCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTCTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTCATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAAGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTCGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGACAGCTCCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGACAGTAAGGTACCATAGGATCCaggcacagga用被稱為AGebg-LacIQ#5的重組噬菌體將所述構(gòu)建體輸送到F’tet/GM101的染色體中。在重組和分離之后，只有上述染色體插入片段還保留在所述細胞內(nèi)。將它重新命名為F’tet/GM221。在LB中使用濃度為25微克/毫升的吖啶橙將F’tet附加體從所述菌株中清除。所述清除后的菌株被確定為四環(huán)素敏感性，并且作為GM221保存。
在大腸桿菌中的表達。在37℃下在LB培養(yǎng)基中生長存在于大腸桿菌GM221中的每一種pAMG21-Fc-融合構(gòu)建體的培養(yǎng)物。通過以20納克/毫升的最終濃度向培養(yǎng)基中添加合成的自身誘導(dǎo)劑N-(3-羥基疊烷酰)-DL-高絲氨酸內(nèi)酯實現(xiàn)了來自luxPR啟動子的基因產(chǎn)物表達的誘導(dǎo)。在37℃下再培養(yǎng)3小時。3小時之后，通過顯微技術(shù)檢查包含體的存在，然后通過離心收集。在誘導(dǎo)過的培養(yǎng)物中觀察到了折射包含體的存在，這表明Fc融合體最有可能以不可溶的級份在大腸桿菌中產(chǎn)生的。通過重新懸浮在含有10％β-巰基乙醇的Laemmli樣品緩沖液中直接裂解細胞沉淀，并且通過SDS-PAGE分析。在每一種場合下，在SDS-PAGE凝膠上都觀察到了分子量大致相當(dāng)?shù)膹姷目捡R斯染色帶。
實施例3TALL-1肽體能抑制TALL-1介導(dǎo)的B細胞增殖。
通過陰性選擇從C57BL/6脾中分離小鼠B淋巴細胞(MACSCD43(Ly-48)Microbeads，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)。在MEM(10％熱失活FCS，5×10-5M 2-巰基乙醇，100U/ml青霉素，100微克/毫升鏈霉素)中培養(yǎng)純化的(105)B細胞，培養(yǎng)是在96孔平底組織培養(yǎng)平板上進行的，重復(fù)3次，在37℃，5％二氧化碳的條件下用2微克/毫升山羊F(ab’)2抗小鼠IgM(Jackson ImmunoResearchLaboratory，West Grove，Pennsylvania)和標(biāo)明數(shù)量的重組TALL-1肽體培養(yǎng)4天時間。在經(jīng)過18小時的培養(yǎng)時間之后，根據(jù)放射性3[H]胸苷的吸收測定增殖。
實施例4TALL-1肽體能抑制TALL-1與它的受體結(jié)合用AGP3(又被稱為TALL-1，Khare等，Proc.Natl.Acad.Sci.973370-3375，2000)對Reacti-Gel 6x(Pierce)進行預(yù)先包衣，并且用BSA封閉。在室溫下將100皮摩爾和40皮摩爾的AGP3肽體樣品與標(biāo)明的各種濃度的人AGP3一起培養(yǎng)8小時，然后通過人AGP3-包衣的珠。通過熒光(Cy5)標(biāo)記的山羊的抗人Fc抗體(JacksonImmunoResearch)定量珠結(jié)合的肽體的數(shù)量。結(jié)合信號與在結(jié)合平衡時游離肽體的濃度成正比。解離平衡常數(shù)(KD)是利用雙曲線單一位點同源結(jié)合模型(KinExTM軟件)從競爭曲線的非線性回歸獲得的。對于與人AGP3結(jié)合的AGP3肽體(SEQ ID NO123)來說，KD大約為4皮摩爾(圖10)。
為了確定AGP3肽體是否能中和鼠AGP3結(jié)合和人AGP3結(jié)合，采用了BIAcore中和測定。所有實驗都是在室溫下在BIAcore 3000上進行的。用10mM乙酸pH4.0將人TACI-Fc蛋白(Xia等，J.Exp.Med.192，137-144，2000)固定在B1芯片上，達到2900RU的水平。將空白流式細胞用作背景對照。使用含有0.005％P20的流動PBS緩沖液(不含鈣或鎂)，在沒有和有所標(biāo)明的各種數(shù)量的AGP3肽體(x軸)的條件下培養(yǎng)1nM重組人AGP3(在添加了0.1毫克/毫升BSA的流動緩沖液中)，然后加注到所述受體表面上。再生是通過以下方式進行的使用8mM甘氨酸pH1.5，1分鐘，25mM 3-[環(huán)己基氨基]-1-丙磺酸(CAPS)pH10.5，1mM氯化鈉，1分鐘。為了測定鼠AGP3結(jié)合，在上述緩沖液中將人his-標(biāo)記的TACI固定到1000RU上。在有和沒有圖11中所標(biāo)明的各種量的AGP3肽體(x軸)的條件下，培養(yǎng)5nM重組鼠AGP3(在添加了0.1毫克/毫升BSA的流動緩沖液中)，然后加注到受體表面上。再生是按照以下方式進行的10mM氯化氫pH2，2次，30秒，測定了在有和沒有AGP3肽體(SEQ ID NO123)的條件下人和鼠AGP3的相對結(jié)合(y軸)。相對結(jié)合反應(yīng)是作為(RU-RU空白/Ruo-RU空白)測定的。AGP3肽體(SEQ ID NO123)能抑制人和鼠AGP3與它的受體ACTI的結(jié)合(圖11A和11B)。
為了檢驗這種AGP3肽體是否能抑制AGP3與所有三種受體(TACI，BCMA和BAFFR)的結(jié)合，將重組可溶性受體TACI，BCMA和BAFFR蛋白固定在CM5芯片上。使用10mM乙酸，pH4，將人TACI-Fc蛋白固定在6300RU上，將BCMA-Fc固定在5000RU上，而將BAFR-Fc固定在6000RU上。將1nM重組人AGP3(在含有0.1毫克/毫升BSA和0.1毫克/毫升肝素的流動緩沖液中)或1nM重組APRIL蛋白(Yu等，Nat.Immunol.，1252-256，2000)與標(biāo)明數(shù)量的AGP3肽體一起培養(yǎng)，然后加注到每一種受體表面上。AGP3實驗的再生是這樣進行的8mM甘氨酸pH1.5，1分鐘，然后使用25mMCAPS，pH10.5，1mM氯化鈉，1分鐘。APRIL實驗的再生是這樣進行的8mM甘氨酸pH2，1分鐘，然后使用25mM CAPS，pH4.5，1mM氯化鈉，1分鐘。測定了AGP3和APRIL的相對結(jié)合。AGP3肽體(SEQ ID NO123)能抑制AGP3與所有三種受體的結(jié)合(圖12A)。AGP3肽體不會影響APRIL與所述受體的結(jié)合(圖12B)。
實施例5AGP3肽體能抑制AGP3介導(dǎo)的B細胞增殖通過陰性篩選從C57BL/6脾中分離小鼠B淋巴細胞(MACSCD43(Ly-48)Microbeads，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)?；颈匦枧囵B(yǎng)基(MEM)，10％熱失活胎牛血清(FCS)，5×10-5M 2-巰基乙醇，100U/ml青霉素，100微克/毫升鏈霉素)中培養(yǎng)純化的(105)B細胞，培養(yǎng)是在96孔平底組織培養(yǎng)平板上進行的，重復(fù)3次，在37℃，5％二氧化碳的條件下用10納克/毫升AGP3(TALL-1)蛋白和2微克/毫升山羊F(ab’)2抗小鼠IgM(Jackson ImmunoResearchLaboratory，West Grove，Pennsylvania)和標(biāo)明數(shù)量AGP3肽體(SEQ IDNO123)一起培養(yǎng)4天時間。在經(jīng)過18小時的培養(yǎng)時間之后，根據(jù)放射性3[H]胸苷的吸收測定增殖。
實施例6在小鼠中AGP3肽體對AGP3-刺激Ig產(chǎn)生的影響對從Charles River Laboratory，Wilmington，MA.購買的小鼠(Balb/c雌性9-14周大的體重為19-21克)的小鼠進行處理。每天用1毫克/千克人AGP3 i.p.處理小鼠(n＝10)1次，連續(xù)進行5天，然后用5毫克/千克或0.5毫克/千克AGP3肽體(SEQ ID NO123)或用鹽水或5毫克/千克人Fc處理。其他小鼠不進行處理。在第6天宰殺小鼠，以便測定血清IgM和IgA，是通過ELISA測定的。簡單地講，用對IgM或IgA專一的捕捉抗體(Southern BiotechmologyAssociates，Birmingham，AL)對平板進行包衣，封閉，并且添加標(biāo)準稀釋液(IgM購自Calbiochem，San Diego，CA，而IgA購自SouthernBiotechmology Associates)或測試樣品。使用對IgM或IgA專一的生物素化的抗體(Southern Biotechmology Associates)，neutravidin-綴合的過氧化物酶(Pierce，Rockford，IL)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)微孔過氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)觀察捕捉的Ig。在Thermomax ELISA讀數(shù)器(Molecular Devices，Menlo Park，CA)上對光學(xué)密度進行定量。
通過5毫克/千克的抗AGP3肽體(SEQ ID NO123)而不是通過0.5毫克/千克抑制由人AGP3-刺激的IgM和IgA的血清含量的提高(圖14A和14B)。
實施例7AGP3肽體降低小鼠體內(nèi)脾B細胞數(shù)量用5毫克/千克或1/5毫克/千克或0.5毫克/千克的AGP3肽體(SEQ ID NO123)或用鹽水或用5毫克/千克的人Fc連續(xù)i.p.處理小鼠(如上文所述，n＝7)7天時間。在第8天宰殺小鼠，以便統(tǒng)計脾B細胞數(shù)量。將脾臟收集到鹽水，并通過手工勻漿融合破碎，以便得到細胞懸浮液?？偟募毎麛?shù)量是通過H1E計數(shù)器(Techincon，Tarrytowu，NY)獲得的。B細胞的百分比是通過免疫熒光雙染色和流式細胞測定獲得的，分別使用了熒光素異硫氰酸酯(FITC)綴合的和藻紅素(PE)-綴合的Ab抗AD3和B220抗體(PharMingen，SanDiego，CA)和FACScan分析儀(Becton and Dickinson，Mountain View，CA)。確定B細胞是CD3-B220+。在所有劑量下，AGP3肽體(SEQID NO123)能以劑量響應(yīng)形式減少脾B細胞數(shù)量(圖14)(SEQ IDNO123)。
實施例8AGP3肽體能減輕小鼠CIA模型的關(guān)節(jié)炎嚴重程度用乳化在完全弗氏佐劑(Difco)中的牛II型膠原(bCII)(從由他大學(xué)購買)通過在尾巴根處經(jīng)皮注射對8-12周大的DBA/1小鼠(獲自Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)進行免疫。每次注射100微升含有100微克的bCII。在首次免疫之后3周，用乳化在不完全弗氏佐劑中的bCII進行加強免疫。從加強免疫當(dāng)天開始進行治療4周時間。檢查小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。正如以前所披露的(Khare等，J.Immunol.1553653-9，1995)，對所有四只爪子分別進行0-3的評分。因此，對每一只動物來說，關(guān)節(jié)炎嚴重程度可以在0-12之間變化。AGP3(SEQ ID NO123)肽體治療顯著減輕了關(guān)節(jié)炎評分的嚴重程度(圖15)。
在最后治療(第35天)之后1周采集血清樣品，分析抗膠原抗體含量。用溶解在碳酸緩沖液中的50微升4微克/毫升的牛CII溶液對高結(jié)合ELISA平板(Immulon，Nunc)進行包衣，并且在冰箱中冷藏保持平板過夜。用冰鎮(zhèn)水洗滌平板3次。用75微升的由PBS/.05％tween20/1％BSA組成的封閉溶液封閉非專一性結(jié)合1小時。以1∶25，1∶100，1∶400，和1∶1600的比例在稀釋平板上稀釋樣品(用封閉緩沖液稀釋)，并且將25微升所述樣品添加到ELISA平板的每一個孔中，使最終稀釋倍數(shù)為100，400，1600和6400，最終體積為100微升/孔。在室溫下培養(yǎng)3小時之后，再次洗滌平板3次。將100微升用封閉緩沖液稀釋的二級抗體(大鼠抗小鼠IgM，IgG2a，IgG2b，IgG1，IgG3-HRP)添加到每一個孔中，并且培養(yǎng)平板至少2小時。洗滌平板4次。將100微升TMB溶液(Sigma)添加到每一個孔中，并且用50微升的25％硫酸終止反應(yīng)。用ELISA平板讀數(shù)器在450nm波長下對所述平板進行讀數(shù)。將OD與單位/毫升表示的標(biāo)準庫進行比較。與PBS或Fc對照處理組相比，AGP3肽體(SEQ ID NO123)降低了血清抗膠原II IgG1，IgG 3，IgG 2a和IgG 2b水平(圖16)。
實施例9AGP3肽體治療NZB/NZW狼瘡小鼠用PBS或標(biāo)明劑量的AGP3肽體或人Fc蛋白通過i.p.治療5周大的易感狼瘡的NZB×NZBWF1小鼠，每周3次，共8周時間。在治療之前用Albustix試劑條(Bayer AG)對尿液中的蛋白進行預(yù)篩選。在本研究中不包括尿液中超過100毫克/dl蛋白的小鼠。在該實驗的整個過程中，每月評估尿液中的蛋白。AGP3肽體(SEQ ID NO123)治療導(dǎo)致了蛋白尿發(fā)作的推遲，并且提高了成活率(圖17)。
AGP3肽體治療降低了小鼠的B細胞數(shù)量。Balb/c小鼠接受了7次每天1次的腹膜內(nèi)注射標(biāo)明數(shù)量的AGP3肽體(SEQ ID NO123)或人Fc蛋白。在第8天，收集脾，并且對B220+B細胞進行FACS分析，如表8所示。
表8AGP3 Pb能減少正常小鼠的B細胞數(shù)量
現(xiàn)在對本發(fā)明進行了全面說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在不超出所提出的本發(fā)明構(gòu)思和范圍的前提下，可以對它進行多種改變和改進。
序列表<110>AMGEN INC.
<120>與TALL-1結(jié)合的肽和相關(guān)分子<130>A-743(PCT)<140>PCT/US 02/15273<141>2002-05-13<150>US 60/290,196<151>2001-05-11<160>197<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>684<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(684)<400>1atg gac aaa act cac aca tgt cca cct tgt cca gct ccg gaa ctc ctg48Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu1 5 10 15ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc96Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu20 25 30atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc144Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser35 40 45cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag192His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu50 55 60gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg240Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr65 70 75 80tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat288Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc336Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro100 105 110atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag384Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln115 120 125gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc432Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val130 135 140agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg480Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val145 150 155 160gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct528Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro165 170 175ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc576Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr180 185 190gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg624Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val195 200 205atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg672Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu210 215 220tct ccg ggt aaa684Ser Pro Gly Lys225<210>2<211>228<212>PRT<213>人<400>2Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu1 5 10 15Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser35 40 45His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu50 55 60Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr65 70 75 80Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn85 90 95Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro100 105 110Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln115 120 125Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val130 135 140Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val145 150 155 160Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro165 170 175Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr180 185 190Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val195 200 205Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu210 215 220
Ser Pro Gly Lys225<210>3<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(61)<400>3t atg ccg ggt act tgt ttc ccg ttc ccg tgg gaa tgc act cac gct ggt 49Met Pro Gly Thr Cys Phe Pro Phe Pro Trp Glu Cys Thr His Ala Gly1 5 10 15gga ggc ggt ggg g 62Gly Gly Gly Gly20<210>4<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>4Met Pro Gly Thr Cys Phe Pro Phe Pro Trp Glu Cys Thr His Ala Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Gly20<210>5<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段
<220>
<221>CDS<222>(2)..(61)<400>5t atg tgg ggt gct tgt tgg ccg ttc ccg tgg gaa tgt ttc aaa gaa ggt49Met Trp Gly Ala Cys Trp Pro Phe Pro Trp Glu Cys Phe Lys Glu Gly1 5 10 15gga ggc ggt ggg g62Gly Gly Gly Gly20<210>6<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>6Met Trp Gly Ala Cys Trp Pro Phe Pro Trp Glu Cys Phe Lys Glu Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Gly20<210>7<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(61)<400>7t atg gtt ccg ttc tgt gac ctg ctg act aaa cac tgt ttc gaa gct ggt49Met Val Pro Phe Cys Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Phe Glu Ala Gly1 5 10 15
gga ggc ggt ggg g 62Gly Gly Gly Gly20<210>8<211>20<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>8Met Val Pro Phe Cys Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Phe Glu Ala Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Gly20<210>9<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>9t atg ggt tct cgt tgt aaa tac aaa tgg gac gtt ctg act aaa cag tgt49Met Gly Ser Arg Cys Lys Tyr Lys Trp Asp Val Leu Thr Lys Gln Cys1 5 10 15ttc cac cac ggt gga ggc ggt ggg g74Phe His His Gly Gly Gly Gly Gly20<210>10<211>24<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>10Met Gly Ser Arg Cys Lys Tyr Lys Trp Asp Val Leu Thr Lys Gln Cys1 5 10 15Phe His His Gly Gly Gly Gly Gly20<210>11<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>11t atg ctg ccg ggt tgt aaa tgg gac ctg ctg atc aaa cag tgg gtt tgt49Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15gac ccg ctg ggt gga ggc ggt ggg g74Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly Gly20<210>12<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>12Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15
Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly Gly20<210>13<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>13t atg tct gct gac tgt tac ttc gac atc ctg act aaa tct gac gtt tgt49Met Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys1 5 10 15act tct tct ggt gga ggc ggt ggg g74Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly20<210>14<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>14Met Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys1 5 10 15Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly20<210>15<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>15t atg tct gac gac tgt atg tac gac cag ctg act cgt atg ttc atc tgt49Met Ser Asp Asp Cys Met Tyr Asp Gln Leu Thr Arg Met Phe Ile Cys1 5 10 15tct aac ctg ggt gga ggc ggt ggg g74Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly20<210>16<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>16Met Ser Asp Asp Cys Met Tyr Asp Gln Leu Thr Arg Met Phe Ile Cys1 5 10 15Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly20<210>17<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>17t atg gac ctg aac tgt aaa tac gac gaa ctg act tac aaa gaa tgg tgt49Met Asp Leu Asn Cys Lys Tyr Asp Glu Leu Thr Tyr Lys Glu Trp Cys
1 5 10 15cag ttc aac ggg gtg gag gcg gtg ggg 76Gln Phe Asn Gly Val Glu Ala Val20<210>18<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>18Met Asp Leu Asn Cys Lys Tyr Asp Glu Leu Thr Tyr Lys Glu Trp Cys1 5 10 15Gln Phe Asn Gly Val Glu Ala Val20<210>19<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>19t atg ttc cac gac tgt aaa tac gac ctg ctg act cgt cag atg gtt tgt49Met Phc His Asp Cys Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Arg Gln Met Val Cys1 5 10 15cac ggt ctg ggt gga ggc ggt ggg g74His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly20<210>20<211>24<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>20Met Phe His Asp Cys Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Arg Gln Met Val Cys1 5 10 15His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly20<210>21<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>21t atg cgt aac cac tgt ttc tgg gac cac ctg ctg aaa cag gac atc tgt49Met Arg Asn His Cys Phe Trp Asp His Leu Leu Lys Gln Asp Ile Cys1 5 10 15ccg tct ccg ggt gga ggc ggt ggg g74Pro Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly20<210>22<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>22Met Arg Asn His Cys Phe Trp Asp His Leu Leu Lys Gln Asp Ile Cys1 5 10 15
Pro Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly20<210>23<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>23t atg gct aac cag tgt tgg tgg gac tct ctg ctg aaa aaa aac gtt tgt49Met Ala Asn Gln Cys Trp Trp Asp Ser Leu Leu Lys Lys Asn Val Cys1 5 10 15gaa ttc ttc ggt gga ggc ggt ggg g74Glu Phe Phe Gly Gly Gly Gly Gly20<210>24<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>24Met Ala Asn Gln Cys Trp Trp Asp Ser Leu Leu Lys Lys Asn Val Cys1 5 10 15Glu Phe Phe Gly Gly Gly Gly Gly20<210>25<211>74<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>NdeI至SalI片段<220>
<221>CDS<222>(2)..(73)<400>25t atg ttc cac gac tgc aaa tgg gac ctg ctg acc aaa cag tgg gtt tgc49Met Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15cac ggt ctg ggt gga ggc ggt ggg g74His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly20<210>26<211>24<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成構(gòu)建體<400>26Met Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly20<210>27<211>7285<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pAMG21-RANK-Fc載體<400>27gatcagcagt ccccggaaca tcgtagctga cgccttcgcg ttgctcagtt gtccaacccc 60ggaaacggga aaaagcaagt tttccccgct cccggcgttt caataactga aaaccatact120atttcacagt ttaaatcaca ttaaacgaca gtaatccccg ttgatttgtg cgccaacaca180
gatcttcgtc acaattctca agtcgctgat ttcaaaaaac tgtagtatcc tctgcgaaac240gatccctgtt tgagtattga ggaggcgaga tgtcgcagac agaaaatgca gtgacttcct300cattgagtca aaagcggttt gtgcgcagag gtaagcctat gactgactct gagaaacaaa360tggccgttgt tgcaagaaaa cgtcttacac acaaagagat aaaagttttt gtcaaaaatc420ctctgaagga tctcatggtt gagtactgcg agagagaggg gataacacag gctcagttcg480ttgagaaaat catcaaagat gaactgcaaa gactggatat actaaagtaa agactttact540ttgtggcgta gcatgctaga ttactgatcg tttaaggaat tttgtggctg gccacgccgt600aaggtggcaa ggaactggtt ctgatgtgga tttacaggag ccagaaaagc aaaaaccccg660ataatcttct tcaacttttg cgagtacgaa aagattaccg gggcccactt aaaccgtata720gccaacaatt cagctatgcg gggagtatag ttatatgccc ggaaaagttc aagacttctt780tctgtgctcg ctccttctgc gcattgtaag tgcaggatgg tgtgactgat cttcaccaaa840cgtattaccg ccaggtaaag aacccgaatc cggtgtttac accccgtgaa ggtgcaggaa900cgctgaagtt ctgcgaaaaa ctgatggaaa aggcggtggg cttcacttcc cgttttgatt960tcgccattca tgtggcgcac gcccgttcgc gtgatctgcg tcgccgtatg ccaccagtgc1020tgcgtcgtcg ggctattgat gcgctcttgc aggggctgtg tttccactat gacccgctgg1080ccaaccgcgt ccagtgctcc atcaccacgc tggccattga gtgcggactg gcgacggagt1140ctgctgccgg aaaactctcc atcacccgtg ccacccgtgc cctgacgttc ctgtcagagc1200tgggactgat tacctaccag acggaatatg acccgcttat cgggtgctac attccgaccg1260atatcacgtt cacatctgca ctgtttgctg ccctcgatgt atcagaggag gcagtggccg1320ccgcgcgccg cagccgtgtg gtatgggaaa acaaacaacg caaaaagcag gggctggata1380ccctgggcat ggatgaactg atagcgaaag cctggcgttt tgttcgtgag cgttttcgca1440gttatcagac agagcttaag tcccgtggaa taaagcgtgc ccgtgcgcgt cgtgatgcgg1500acagggaacg tcaggatatt gtcaccctgg tgaaacggca gctgacgcgc gaaatcgcgg1560aagggcgctt cactgccaat cgtgaggcgg taaaacgcga agttgagcgt cgtgtgaagg1620agcgcatgat tctgtcacgt aaccgtaatt acagccggct ggccacagct tccccctgaa1680agtgacctcc tctgaataat ccggcctgcg ccggaggctt ccgcacgtct gaagcccgac1740
agcgcacaaa aaatcagcac cacatacaaa aaacaacctc atcatccagc ttctggtgca1800tccggccccc cctgttttcg atacaaaaca cgcctcacag acggggaatt ttgcttatcc1860acattaaact gcaagggact tccccataag gttacaaccg ttcatgtcat aaagcgccat1920ccgccagcgt tacagggtgc aatgtatctt ttaaacacct gtttatatct cctttaaact1980acttaattac attcatttaa aaagaaaacc tattcactgc ctgtccttgg acagacagat2040atgcacctcc caccgcaagc ggcgggcccc taccggagcc gctttagtta caacactcag2100acacaaccac cagaaaaacc ccggtccagc gcagaactga aaccacaaag cccctccctc2160ataactgaaa agcggccccg ccccggtccg aagggccgga acagagtcgc ttttaattat2220gaatgttgta actacttcat catcgctgtc agtcttctcg ctggaagttc tcagtacacg2280ctcgtaagcg gccctgacgg cccgctaacg cggagatacg ccccgacttc gggtaaaccc2340tcgtcgggac cactccgacc gcgcacagaa gctctctcat ggctgaaagc gggtatggtc2400tggcagggct ggggatgggt aaggtgaaat ctatcaatca gtaccggctt acgccgggct2460tcggcggttt tactcctgtt tcatatatga aacaacaggt caccgccttc catgccgctg2520atgcggcata tcctggtaac gatatctgaa ttgttataca tgtgtatata cgtggtaatg2580acaaaaatag gacaagttaa aaatttacag gcgatgcaat gattcaaaca cgtaatcaat2640atcgggggtg ggcgaagaac tccagcatga gatccccgcg ctggaggatc atccagccgg2700cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa ggcggcggtg gaatcgaaat2760ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc gaaccccaga gtcccgctca2820gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc2880gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt2940agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc3000agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gagtcacgac3060gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag3120cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg3180tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt3240
atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga3300tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt3360gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc3420tgcctcgtcc tgcaattcat tcaggacacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg3480gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc3540ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc3600ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tctgatcttg atcccctgcg3660ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact ttgcagggct tcccaacctt3720accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct gtccataaaa ccgcccagtc3780tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt ctctttgcgc ttgcgttttc3840ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt cagcaccgtt tctgcggact3900ggctttctac gtgttccgct tcctttagca gcccttgcgc cctgagtgct tgcggcagcg3960tgaagctaca tatatgtgat ccgggcaaat cgctgaatat tccttttgtc tccgaccatc4020aggcacctga gtcgctgtct ttttcgtgac attcagttcg ctgcgctcac ggctctggca4080gtgaatgggg gtaaatggca ctacaggcgc cttttatgga ttcatgcaag gaaactaccc4140ataatacaag aaaagcccgt cacgggcttc tcagggcgtt ttatggcggg tctgctatgt4200ggtgctatct gactttttgc tgttcagcag ttcctgccct ctgattttcc agtctgacca4260cttcggatta tcccgtgaca ggtcattcag actggctaat gcacccagta aggcagcggt4320atcatcaaca ggcttacccg tcttactgtc gaagacgtgc gtaacgtatg catggtctcc4380ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact4440gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc4500cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc4560cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt4620ttctacaaac tcttttgttt atttttctaa atacattcaa atatggacgt cgtacttaac4680ttttaaagta tgggcaatca attgctcctg ttaaaattgc tttagaaata ctttggcagc4740ggtttgttgt attgagtttc atttgcgcat tggttaaatg gaaagtgacc gtgcgcttac4800
tacagcctaa tatttttgaa atatcccaag agctttttcc ttcgcatgcc cacgctaaac4860attctttttc tcttttggtt aaatcgttgt ttgatttatt atttgctata tttatttttc4920gataattatc aactagagaa ggaacaatta atggtatgtt catacacgca tgtaaaaata4980aactatctat atagttgtct ttctctgaat gtgcaaaact aagcattccg aagccattat5040tagcagtatg aatagggaaa ctaaacccag tgataagacc tgatgatttc gcttctttaa5100ttacatttgg agatttttta tttacagcat tgttttcaaa tatattccaa ttaatcggtg5160aatgattgga gttagaataa tctactatag gatcatattt tattaaatta gcgtcatcat5220aatattgcct ccatttttta gggtaattat ccagaattga aatatcagat ttaaccatag5280aatgaggata aatgatcgcg agtaaataat attcacaatg taccatttta gtcatatcag5340ataagcattg attaatatca ttattgcttc tacaggcttt aattttatta attattctgt5400aagtgtcgtc ggcatttatg tctttcatac ccatctcttt atccttacct attgtttgtc5460gcaagttttg cgtgttatat atcattaaaa cggtaataga ttgacatttg attctaataa5520attggatttt tgtcacacta ttatatcgct tgaaatacaa ttgtttaaca taagtacctg5580taggatcgta caggtttacg caagaaaatg gtttgttata gtcgattaat cgatttgatt5640ctagatttgt tttaactaat taaaggagga ataacatatg atcgctccac catgcaccag5700tgagaagcat tatgagcatc tgggacggtg ctgtaacaaa tgtgaaccag gaaagtacat5760gtcttctaaa tgcactacta cctctgacag tgtatgtctg ccctgtggcc cggatgaata5820cttggatagc tggaatgaag aagataaatg cttgctgcat aaagtttgtg atacaggcaa5880ggccctggtg gccgtggtcg ccggcaacag tacgaccccc cggcgctgcg cgtgcacggc5940tgggtaccac tggagccagg actgcgagtg ctgccgccgc aacaccgagt gcgcgccggg6000cctgggcgcc cagcacccgt tgcagctcaa caaggacaca gtgtgcaaac cttgccttgc6060aggctacttc tctgatgcct tttcctccac ggacaaatgc agaccctgga ccaactgtac6120cttccttgga aagagagtag aacatcatgg gacagagaaa tccgatgtgg tttgcagttc6180ttctctgcca gctagaaaac caccaaatga accccatgtt tacgtcgaca aaactcacac6240atgtccacct tgtccagctc cggaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc6300
aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga6360cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca6420taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt6480cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa6540caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga6600accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct6660gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg6720gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt6780cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg6840ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc6900gggtaaataa tggatccgcg gaaagaagaa gaagaagaag aaagcccgaa aggaagctga6960gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt7020cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac cgctcttcac gctcttcacg cggataaata7080agtaacgatc cggtccagta atgacctcag aactccatct ggatttgttc agaacgctcg7140gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga atcgcagcaa cttgtcgcgc caatcgagcc7200atgtcgtcgt caacgacccc ccattcaaga acagcaagca gcattgagaa ctttggaatc7260cagtccctct tccacctgct gaccg 7285<210>28<211>7285<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>pAMG21-RANK-Fc載體<220>
<221>misc_特征<223>Xaa(Pos1，2，3，15，16，17)各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；Xaa(Pos5，6，7，9，13)各自獨立地是氨基酸殘基。
<400>28
Gly Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Cys Cys Cys Gly Gly1 5 10 15Ala Ala Cys Ala Thr Cys Gly Thr Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Gly20 25 30Cys Cys Thr Thr Cys Gly Cys Gly Thr Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly35 40 45Thr Thr Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala50 55 60Ala Cys Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Gly Thr65 70 75 80Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Cys85 90 95Gly Thr Thr Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala100 105 110Ala Cys Cys Ala Thr Ala Cys Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Ala115 120 125Gly Thr Thr Thr Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ala Ala130 135 140Ala Cys Gly Ala Cys Ala Gly Thr Ala Ala Thr Cys Cys Cys Cys Gly145 150 155 160Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala Ala165 170 175Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Thr Cys Gly Thr Cys Ala Cys180 185 190Ala Ala Thr Thr Cys Thr Cys Ala Ala Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly195 200 205
Ala Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Thr Ala210 215 220Gly Thr Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Cys Gly Ala Ala Ala Cys225 230 235 240Gly Ala Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Gly Thr Ala245 250 255Thr Thr Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Gly260 265 270Thr Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly275 280 285Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Thr290 295 300Gly Ala Gly Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr305 310 315 320Gly Thr Gly Cys Gly Cys Ala Gly Ala Gly Gly Thr Ala Ala Gly Cys325 330 335Cys Thr Ala Thr Gly Ala Cys Thr Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala340 345 350Gly Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr Thr355 360 365Gly Thr Thr Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Thr Cys370 375 380Thr Thr Ala Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr385 390 395 400Ala Ala Ala Ala Gly Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Ala405 410 415
Ala Ala Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Thr Cys420 425 430Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr Thr Gly Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly435 440 445Cys Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Thr Ala450 455 460Ala Cys Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly465 470 475 480Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Ala485 490 495Ala Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Ala500 505 510Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ala Cys Thr Ala Ala Ala Gly Thr515 520 525Ala Ala Ala Gly Ala Cys Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Thr530 535 540Gly Gly Cys Gly Thr Ala Gly Cys Ala Thr Gly Cys Thr Ala Gly Ala545 550 555 560Thr Thr Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Thr Thr Thr Ala Ala Gly565 570 575Gly Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys580 585 590Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys595 600 605Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala
610 615 620Thr Gly Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Ala Gly625 630 635 640Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Cys645 650 655Cys Cys Cys Gly Ala Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys660 665 670Ala Ala Cys Thr Thr Thr Thr Gly Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly675 680 685Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Ala Cys Cys Gly Gly Gly Gly Cys690 695 700Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Ala Ala Cys Cys Gly Thr Ala Thr Ala705 710 715 720Gly Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Ala725 730 735Thr Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Thr Ala Thr Ala Gly Thr Thr740 745 750Ala Thr Ala Thr Gly Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Gly Thr755 760 765Thr Cys Ala Ala Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr Cys Thr Gly770 775 780Thr Gly Cys Thr Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys785 790 795 800Gly Cys Ala Thr Thr Gly Thr Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Gly805 810 815
Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr820 825 830Thr Cys Ala Cys Cys Ala Ala Ala Cys Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys835 840 845Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys850 855 860Cys Gly Ala Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Thr Thr Thr Ala Cys865 870 875 880Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala885 890 895Gly Gly Ala Ala Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Thr Cys Thr900 905 910Gly Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Ala915 920 925Ala Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys930 935 940Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Thr Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr945 950 955 960Thr Cys Gly Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Thr Gly Thr Gly Gly Cys965 970 975Gly Cys Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Thr Thr Cys Gly Cys Gly Thr980 985 990Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Ala995 10001005Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys101010151020
Gly Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly102510301035Ala Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly104010451050Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ala Cys Thr105510601065Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala107010751080Ala Cys Cys Gly Cys Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr108510901095Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Gly110011051110Cys Cys Ala Thr Thr Gly Ala Gly Thr Gly Cys Gly Gly Ala Cys111511201125Thr Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly113011351140Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr114511501155Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Ala116011651170Cys Cys Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly Thr117511801185Thr Cys Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Gly119011951200Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Thr Ala Cys Cys Thr Ala Cys Cys120512101215
Ala Gly Ala Cys Gly Gly Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala Cys Cys122012251230Cys Gly Cys Thr Thr Ala Thr Cys Gly Gly Gly Thr Gly Cys Thr123512401245Ala Cys Ala Thr Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Ala Thr Ala125012551260Thr Cys Ala Cys Gly Thr Thr Cys Ala Cys Ala Thr Cys Thr Gly126512701275Cys Ala Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys128012851290Thr Cys Gly Ala Thr Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Ala Gly Gly129513001305Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly131013151320Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Thr Gly132513301335Thr Gly Gly Thr Ala Thr Gly Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala134013451350Ala Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys135513601365Ala Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Ala Thr Ala Cys Cys Cys137013751380Thr Gly Gly Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Cys138513901395Thr Gly Ala Thr Ala Gly Cys Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys Thr
140014051410Gly Gly Cys Gly Thr Thr Thr Thr Gly Thr Thr Cys Gly Thr Gly141514201425Ala Gly Cys Gly Thr Thr Thr Thr Cys Gly Cys Ala Gly Thr Thr143014351440Ala Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Thr Ala144514501455Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Ala Ala146014651470Ala Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys147514801485Gly Thr Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Gly Gly Ala Cys Ala149014951500Gly Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Thr Ala150515101515Thr Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Ala152015251530Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Gly Cys153515401545Gly Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly155015551560Gly Gly Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala156515701575Ala Thr Cys Gly Thr Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Ala Ala158015851590
Ala Ala Cys Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Thr Gly Ala Gly Cys159516001605Gly Thr Cys Gly Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys161016151620Gly Cys Ala Thr Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Thr Cys Ala Cys162516301635Gly Thr Ala Ala Cys Cys Gly Thr Ala Ala Thr Thr Ala Cys Ala164016451650Gly Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala Gly165516601665Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Thr167016751680Gly Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala Thr Ala168516901695Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Gly170017051710Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Gly Cys Ala Cys Gly Thr171517201725Cys Thr Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Ala Gly Cys173017351740Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Cys Ala Gly Cys174517501755Ala Cys Cys Ala Cys Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala176017651770Cys Ala Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala177517801785
Gly Cys Thr Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Cys Cys179017951800Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Thr180518101815Cys Gly Ala Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys182018251830Cys Thr Cys Ala Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ala Ala183518401845Thr Thr Thr Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr Cys Cys Ala Cys Ala185018551860Thr Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala186518701875Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Ala Thr Ala Ala Gly Gly Thr Thr188018851890Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Thr Thr Cys Ala Thr Gly Thr Cys189519001905Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Gly191019151920Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr192519301935Gly Cys Ala Ala Thr Gly Thr Ala Thr Cys Thr Thr Thr Thr Ala194019451950Ala Ala Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr195519601965Cys Thr Cys Cys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr197019751980
Thr Ala Ala Thr Thr Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Thr Thr Thr198519901995Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Thr Ala Thr200020052010Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Thr Cys Cys Thr Thr201520202025Gly Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Ala Thr Ala Thr Gly203020352040Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala204520502055Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Ala Cys206020652070Cys Gly Gly Ala Gly Cys Cys Gly Cys Thr Thr Thr Ala Gly Thr207520802085Thr Ala Cys Ala Ala Cys Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Cys Ala209020952100Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala210521102115Cys Cys Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala212021252130Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Cys Ala Ala213521402145Ala Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Ala Thr Ala215021552160Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys
216521702175Cys Gly Cys Cys Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Ala Ala Gly218021852190Gly Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys219522002205Gly Cys Thr Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Ala221022152220Thr Gly Thr Thr Gly Thr Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys222522302235Ala Thr Cys Ala Thr Cys Gly Cys Thr Gly Thr Cys Ala Gly Thr224022452250Cys Thr Thr Cys Thr Cys Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr225522602265Thr Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Cys227022752280Gly Thr Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Cys228522902295Gly Gly Cys Cys Cys Gly Cys Thr Ala Ala Cys Gly Cys Gly Gly230023052310Ala Gly Ala Thr Ala Cys Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Thr231523202325Thr Cys Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Cys Cys Cys Thr Cys Gly233023352340Thr Cys Gly Gly Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala234523502355
Cys Cys Gly Cys Gly Cys Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Thr236023652370Cys Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala237523802385Gly Cys Gly Gly Gly Thr Ala Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly239023952400Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Gly Gly240524102415Gly Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Ala242024252430Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Gly Gly Cys243524402445Thr Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly245024552460Gly Cys Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Cys Thr Cys Cys Thr Gly246524702475Thr Thr Thr Cys Ala Thr Ala Thr Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys248024852490Ala Ala Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Thr249525002505Thr Cys Cys Ala Thr Gly Cys Cys Gly Cys Thr Gly Ala Thr Gly251025152520Cys Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala252525302535Ala Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly254025452550
Thr Thr Ala Thr Ala Cys Ala Thr Gly Thr Gly Thr Ala Thr Ala255525602565Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Thr Ala Ala Thr Gly Ala Cys Ala257025752580Ala Ala Ala Ala Thr Ala Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Thr258525902595Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Gly Gly Cys Gly260026052610Ala Thr Gly Cys Ala Ala Thr Gly Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala261526202625Cys Ala Cys Gly Thr Ala Ala Thr Cys Ala Ala Thr Ala Thr Cys263026352640Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Ala Ala Gly Ala264526502655Ala Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Ala Thr266026652670Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala267526802685Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr269026952700Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala Cys Gly Ala Thr Thr Cys270527102715Cys Gly Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Thr272027252730Cys Ala Thr Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly273527402745
Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Gly Ala Ala Ala Thr Cys Thr Cys275027552760Gly Thr Gly Ala Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly Thr Thr Gly Gly276527702775Gly Cys Gly Thr Cys Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys Gly Gly278027852790Thr Cys Ala Thr Thr Thr Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala279528002805Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Gly Cys Thr Cys Ala Gly Ala Ala281028152820Gly Ala Ala Cys Thr Cys Gly Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly282528302835Gly Cys Gly Ala Thr Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Thr284028452850Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Gly Ala Ala Thr Cys Gly Gly Gly285528602865Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Thr Ala Cys Cys Gly Thr Ala287028752880Ala Ala Gly Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Gly288528902895Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Cys Ala Thr Thr Cys Gly Cys Cys290029052910Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys291529202925Ala Ala Thr Ala Thr Cys Ala Cys Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys
293029352940Cys Ala Ala Cys Gly Cys Thr Ala Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly294529502955Ala Thr Ala Gly Cys Gly Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys296029652970Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Ala297529802985Gly Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala299029953000Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Ala Thr Thr Thr Thr Cys300530103015Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Cys Gly Gly302030253030Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys303530403045Ala Thr Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly305030553060Ala Thr Cys Cys Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Cys Gly Gly Gly306530703075Cys Ala Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly308030853090Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Thr Cys309531003105Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys311031153120
Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys Gly Thr Cys312531303135Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys314031453150Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys315531603165Cys Ala Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Cys317031753180Thr Cys Gly Cys Thr Cys Gly Ala Thr Gly Cys Gly Ala Thr Gly318531903195Thr Thr Thr Cys Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys320032053210Gly Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Gly Gly Thr Ala Gly Cys321532203225Cys Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Gly Thr Ala Thr Gly323032353240Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Ala Thr Thr Gly Cys324532503255Ala Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Ala326032653270Thr Ala Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Gly Gly Cys Ala Gly Gly327532803285Ala Gly Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala329032953300Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys330533103315
Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys Gly Cys Cys Cys Ala Ala332033253330Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Cys Cys Thr333533403345Thr Cys Cys Cys Gly Cys Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Ala Cys335033553360Ala Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Cys336533703375Thr Gly Cys Gly Cys Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Gly Cys Cys338033853390Cys Gly Thr Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala339534003405Cys Gly Ala Thr Ala Gly Cys Cys Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys341034153420Cys Thr Cys Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Thr Thr Cys342534303435Ala Thr Thr Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala344034453450Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ala Cys345534603465Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly347034753480Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Cys Ala Gly348534903495Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys350035053510
Ala Thr Cys Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Gly Ala Thr351535203525Thr Gly Thr Cys Thr Gly Thr Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala353035353540Gly Thr Cys Ala Thr Ala Gly Cys Cys Gly Ala Ala Thr Ala Gly354535503555Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys356035653570Gly Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys357535803585Gly Thr Gly Cys Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Gly359035953600Thr Thr Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr Gly Cys Gly Ala Ala Ala360536103615Cys Gly Ala Thr Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Thr362036253630Cys Thr Cys Thr Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr363536403645Thr Gly Ala Thr Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala365036553660Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly366536703675Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala368036853690Gly Thr Thr Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly Gly
369537003705Cys Thr Thr Cys Cys Cys Ala Ala Cys Cys Thr Thr Ala Cys Cys371037153720Ala Gly Ala Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys372537303735Thr Gly Gly Cys Ala Ala Thr Thr Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys374037453750Gly Cys Thr Thr Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Ala Thr Ala Ala375537603765Ala Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Ala Gly377037753780Cys Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Ala Thr Gly Thr Ala Ala Gly378537903795Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Ala Cys380038053810Cys Thr Gly Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Thr Gly Cys381538203825Gly Cys Thr Thr Gly Cys Gly Thr Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr383038353840Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Ala Gly Cys Cys Cys Ala384538503855Gly Thr Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Ala Thr Thr Cys Ala Thr386038653870Cys Cys Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly387538803885
Thr Thr Thr Cys Thr Gly Cys Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys389038953900Thr Thr Thr Cys Thr Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly390539103915Cys Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys392039253930Cys Thr Thr Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Thr Gly393539403945Cys Thr Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala395039553960Ala Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Ala Thr Ala Thr Gly Thr Gly396539703975Ala Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Ala Thr Cys Gly Cys398039853990Thr Gly Ala Ala Thr Ala Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Thr Gly399540004005Thr Cys Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Gly401040154020Cys Ala Cys Cys Thr Gly Ala Gly Thr Cys Gly Cys Thr Gly Thr402540304035Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Thr Thr404040454050Cys Ala Gly Thr Thr Cys Gly Cys Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys405540604065Ala Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Ala Gly Thr Gly407040754080
Ala Ala Thr Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala Thr Gly Gly408540904095Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Thr410041054110Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys Ala411541204125Ala Gly Gly Ala Ala Ala Cys Thr Ala Cys Cys Cys Ala Thr Ala413041354140Ala Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys414541504155Gly Thr Cys Ala Cys Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala416041654170Gly Gly Gly Cys Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys Gly417541804185Gly Gly Thr Cys Thr Gly Cys Thr Ala Thr Gly Thr Gly Gly Thr419041954200Gly Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Ala Cys Thr Thr Thr Thr Thr420542104215Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys422042254230Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Thr423542404245Cys Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Thr Thr425042554260Cys Gly Gly Ala Thr Thr Ala Thr Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala426542704275
Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Thr Cys Ala Gly Ala Cys Thr428042854290Gly Gly Cys Thr Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly429543004305Thr Ala Ala Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala Thr Cys431043154320Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Thr Thr Ala Cys Cys432543304335Cys Gly Thr Cys Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Gly Ala Ala434043454350Gly Ala Cys Gly Thr Gly Cys Gly Thr Ala Ala Cys Gly Thr Ala435543604365Thr Gly Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Cys Cys Ala437043754380Thr Gly Cys Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ala Gly Gly Gly Ala Ala438543904395Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Ala Ala440044054410Thr Ala Ala Ala Ala Cys Gly Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Cys441544204425Ala Gly Thr Cys Gly Ala Ala Ala Gly Ala Cys Thr Gly Gly Gly443044354440Cys Cys Thr Thr Thr Cys Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Cys Thr444544504455Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Cys Gly Gly Thr Gly Ala
446044654470Ala Cys Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Gly Thr Ala447544804485Gly Gly Ala Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly449044954500Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr Gly Ala Ala Cys Gly450545104515Thr Thr Gly Cys Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys452045254530Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly453545404545Cys Ala Gly Gly Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Ala Thr455045554560Ala Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys456545704575Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly458045854590Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Gly Ala Cys Gly Gly Ala Thr Gly459546004605Gly Cys Cys Thr Thr Thr Thr Thr Gly Cys Gly Thr Thr Thr Cys461046154620Thr Ala Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr Thr Thr Thr Gly Thr462546304635Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ala Ala Ala Thr Ala464046454650
Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys465546604665Gly Thr Cys Gly Thr Ala Cys Thr Thr Ala Ala Cys Thr Thr Thr467046754680Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala Ala Thr468546904695Cys Ala Ala Thr Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Thr Thr Ala470047054710Ala Ala Ala Thr Thr Gly Cys Thr Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala471547204725Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Thr473047354740Thr Thr Gly Thr Thr Gly Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly Thr Thr474547504755Thr Cys Ala Thr Thr Thr Gly Cys Gly Cys Ala Thr Thr Gly Gly476047654770Thr Thr Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala477547804785Cys Cys Gly Thr Gly Cys Gly Cys Thr Thr Ala Cys Thr Ala Cys479047954800Ala Gly Cys Cys Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly480548104815Ala Ala Ala Thr Ala Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys482048254830Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Cys Gly Cys Ala Thr Gly483548404845
Cys Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Ala Ala Ala Cys Ala Thr Thr485048554860Cys Thr Thr Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Thr Thr Thr Gly Gly486548704875Thr Thr Ala Ala Ala Thr Cys Gly Thr Thr Gly Thr Thr Thr Gly488048854890Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Thr Thr Thr Gly Cys Thr Ala489549004905Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Thr Cys Gly Ala Thr491049154920Ala Ala Thr Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Gly Ala Gly492549304935Ala Ala Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Gly494049454950Gly Thr Ala Thr Gly Thr Thr Cys Ala Thr Ala Cys Ala Cys Gly495549604965Cys Ala Thr Gly Thr Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Cys497049754980Thr Ala Thr Cys Thr Ala Thr Ala Thr Ala Gly Thr Thr Gly Thr498549904995Cys Thr Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Thr Gly500050055010Cys Ala Ala Ala Ala Cys Thr Ala Ala Gly Cys Ala Thr Thr Cys501550205025Cys Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala Thr Thr Ala Thr Thr Ala Gly503050355040
Cys Ala Gly Thr Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Gly Gly Gly Ala504550505055Ala Ala Cys Thr Ala Ala Ala Cys Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala506050655070Thr Ala Ala Gly Ala Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Thr507550805085Thr Cys Gly Cys Thr Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala509050955100Cys Ala Thr Thr Thr Gly Gly Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr510551105115Thr Ala Thr Thr Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Thr Thr Gly Thr512051255130Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Thr Cys Cys513551405145Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Cys Gly Gly Thr Gly Ala Ala Thr515051555160Gly Ala Thr Thr Gly Gly Ala Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala Thr516551705175Ala Ala Thr Cys Thr Ala Cys Thr Ala Thr Ala Gly Gly Ala Thr518051855190Cys Ala Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Ala Ala Ala Thr519552005205Thr Ala Gly Cys Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Ala Ala Thr521052155220Ala Thr Thr Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr
522552305235Thr Ala Gly Gly Gly Thr Ala Ala Thr Thr Ala Thr Cys Cys Ala524052455250Gly Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Ala Thr Ala Thr Cys Ala Gly525552605265Ala Thr Thr Thr Ala Ala Cys Cys Ala Thr Ala Gly Ala Ala Thr527052755280Gly Ala Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Gly Ala Thr Cys Gly528552905295Cys Gly Ala Gly Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr530053055310Cys Ala Cys Ala Ala Thr Gly Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Thr531553205325Thr Ala Gly Thr Cys Ala Thr Ala Thr Cys Ala Gly Ala Thr Ala533053355340Ala Gly Cys Ala Thr Thr Gly Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Thr534553505355Cys Ala Thr Thr Ala Thr Thr Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys536053655370Ala Gly Gly Cys Thr Thr Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr537553805385Thr Ala Ala Thr Thr Ala Thr Thr Cys Thr Gly Thr Ala Ala Gly539053955400Thr Gly Thr Cys Gly Thr Cys Gly Gly Cys Ala Thr Thr Thr Ala540554105415
Thr Gly Thr Cys Thr Thr Thr Cys Ala Thr Ala Gys Cys Cys Ala542054255430Thr Cys Thr Cys Thr Thr Thr Ala Thr Cys Cys Thr Thr Ala Cys543554405445Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Gly Thr Cys Gly Cys Ala545054555460Ala Gly Thr Thr Thr Thr Gly Cys Gly Thr Gly Thr Thr Ala Thr546554705475Ala Thr Ala Thr Cys Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly548054855490Thr Ala Ala Thr Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ala Cys Ala Thr Thr549555005505Thr Gly Ala Thr Thr Cys Thr Ala Ala Thr Ala Ala Ala Thr Thr551055155520Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Cys Ala Cys552555305535Thr Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Thr Thr Gly Ala554055455550Ala Ala Thr Ala Cys Ala Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Ala Ala555555605565Cys Ala Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr Gly Thr Ala Gly557055755580Gly Ala Thr Cys Gly Thr Ala Cys Ala Gly Gly Thr Thr Thr Ala558555905595Cys Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr560056055610
Thr Gly Thr Thr Ala Thr Ala Gly Thr Cys Gly Ala Thr Thr Ala561556205625Ala Thr Cys Gly Ala Thr Thr Thr Gly Ala Thr Thr Cys Thr Ala563056355640Gly Ala Thr Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr Ala Ala Cys Thr Ala564556505655Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala566056655670Ala Cys Ala Thr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Gly Cys Thr Cys Cys567556805685Ala Cys Cys Ala Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr Gly Ala569056955700Gly Ala Ala Gly Cys Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala570557105715Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Gly572057255730Thr Ala Ala Cys Ala Ala Ala Thr Gly Thr Gly Ala Ala Cys Cys573557405745Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Gly Thr Cys575057555760Thr Thr Cys Thr Ala Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Thr Ala Cys576557705775Thr Ala Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Thr578057855790Ala Thr Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly579558005805
Cys Cys Cys Gly Gly Ala Thr Gly Ala Ala Thr Ala Cys Thr Thr581058155820Gly Gly Ala Thr Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Ala582558305835Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Thr584058455850Gly Cys Thr Gly Cys Ala Thr Ala Ala Ala Gly Thr Thr Thr Gly585558605865Thr Gly Ala Thr Ala Cys Ala Gly Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys587058755880Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Thr588558905895Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala Cys590059055910Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly591559205925Cys Gly Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly593059355940Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Ala Gly Cys Cys Ala594559505955Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Gly Ala Gly Thr Gly Cys Thr Gly596059655970Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Ala Cys Cys Gly Ala597559805985Gly Thr Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Thr
599059956000Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys600560106015Gly Thr Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Cys Ala Ala Cys Ala Ala602060256030Gly Gly Ala Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Thr Gly Cys Ala Ala603560406045Ala Cys Cys Thr Thr Gly Cys Cys Thr Thr Gly Cys Ala Gly Gly605060556060Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Cys606560706075Cys Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Gly Gly Ala608060856090Cys Ala Ala Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly609561006105Gly Ala Cys Cys Ala Ala Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Thr611061156120Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr612561306135Ala Gly Ala Ala Cys Ala Thr Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys614061456150Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys Gly Ala Thr Gly Thr615561606165Gly Gly Thr Thr Thr Gly Cys Ala Gly Thr Thr Cys Thr Thr Cys617061756180
Thr Cys Thr Gly Cys Cys Ala Gly Cys Thr Ala Gly Ala Ala Ala618561906195Ala Cys Cys Ala Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Cys620062056210Cys Cys Ala Thr Gly Thr Thr Thr Ala Cys Gly Thr Cys Gly Ala621562206225Cys Ala Ala Ala Ala Cys Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Thr Gly623062356240Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys624562506255Thr Cys Cys Gly Gly Ala Ala Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Gly626062656270Gly Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Cys Ala Gly Thr Cys Thr Thr627562806285Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala629062956300Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr630563106315Cys Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys632063256330Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Cys Ala Thr Gly633563406345Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr635063556360Gly Ala Gly Cys Cys Ala Cys Gly Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys636563706375
Thr Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala638063856390Cys Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Gly639564006405Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Thr Ala Ala641064156420Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys642564306435Gly Cys Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Cys Ala Gly Thr Ala644064456450Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Cys Gly645564606465Thr Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Thr647064756480Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala648564906495Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Gly650065056510Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly651565206525Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala653065356540Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys654565506555Cys Ala Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr656065656570
Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys Ala Ala Ala Gly Gly657565806585Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Cys659065956600Ala Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr660566106615Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala662066256630Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala663566406645Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys665066556660Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly666566706675Cys Thr Thr Cys Thr Ala Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala668066856690Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly669567006705Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Ala671067156720Gly Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ala672567306735Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Gly Cys Cys Thr Cys Cys674067456750Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala
675567606765Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr677067756780Cys Thr Ala Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala Cys678567906795Cys Gly Thr Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Gly680068056810Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ala68l568206825Cys Gly Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala Thr Gly Cys Thr Cys683068356840Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Gly Cys684568506855Thr Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala686068656870Cys Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr687568806885Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly689068956900Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly690569106915Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala692069256930Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Cys Cys Cys Gly693569406945
Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Thr Thr695069556960Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys696569706975Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Thr Ala Ala Cys Thr Ala Gly Cys698069856990Ala Thr Ala Ala Cys Cys Cys Cys Thr Thr Gly Gly Gly Gly Cys699570007005Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala Cys Gly Gly Gly Thr Cys Thr Thr701070157020Gly Ala Gly Gly Gly Gly Thr Thr Thr Thr Thr Thr Gly Cys Thr702570307035Gly Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Cys704070457050Thr Cys Thr Thr Cys Ala Cys Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys Ala705570607065Cys Gly Cys Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala Gly Thr707070757080Ala Ala Cys Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly708570907095Thr Ala Ala Thr Gly Ala Cys Cys Thr Cys Ala Gly Ala Ala Cys710071057110Thr Cys Cys Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Gly Thr711571207125Thr Cys Ala Gly Ala Ala Cys Gly Cys Thr Cys Gly Gly Thr Thr713071357140
Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Thr Thr Thr Thr714571507155Thr Thr Ala Thr Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Thr Cys716071657170Gly Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Gly Thr Cys Gly Cys717571807185Gly Cys Cys Ala Ala Thr Cys Gly Ala Gly Cys Cys Ala Thr Gly719071957200Thr Cys Gly Thr Cys Gly Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala Cys Cys720572107215Cys Cys Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala722072257230Gly Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Thr Thr Gly Ala Gly723572407245Ala Ala Cys Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Cys Ala Gly725072557260Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly726572707275Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly72807285<210>29<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>29
Pro Gly Thr Cys Phe Pro Phe Pro Trp Glu Cys Thr His Ala1 5 10<210>30<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>30Trp Gly Ala Cys Trp Pro Phe Pro Trp Glu Cys Phe Lys Glu1 5 10<210>31<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>31Val Pro Phe Cys Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Phe Glu Ala1 5 10<210>32<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>32Gly Ser Arg Cys Lys Tyr Lys Trp Asp Val Leu Thr Lys Gln Cys Phe1 5 10 15His His<210>33
<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>33Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys Asp1 5 10 15Pro Leu<210>34<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>34Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys Thr1 5 10 15Ser Ser<210>35<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>35Ser Asp Asp Cys Met Tyr Asp Gln Leu Thr Arg Met Phe Ile Cys Ser1 5 10 15Asn Leu
<210>36<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>36Asp Leu Asn Cys Lys Tyr Asp Glu Leu Thr Tyr Lys Glu Trp Cys Gln1 5 10 15Phe Asn<210>37<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>37Phe His Asp Cys Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Arg Gln Met Val Cys His1 5 10 15Gly Leu<210>38<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>38Arg Asn His Cys Phe Trp Asp His Leu Leu Lys Gln Asp Ile Cys Pro1 5 10 15
Ser Pro<210>39<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>39Ala Asn Gln Cys Trp Trp Asp Ser Leu Thr Lys Lys Asn Val Cys Glu1 5 10 15Phe Phe<210>40<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>聚甘氨酸接頭<400>40gggkgggg8<210>41<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>聚甘氨酸接頭<220>
<221>misc_特征<222>(4)..(4)<223>N是天冬酰胺<400>41gggngsgg8
<210>42<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>聚甘氨酸接頭<400>42gggcgggg8<210>43<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>聚甘氨酸接頭<400>43Gly Pro Asn Gly Gly1 5<210>44<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(19)..(19)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第19位與C末端連接<400>44Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys Asp1 5 10 15Pro Leu Xaa
<210>45<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第1位與N末端連接<400>45Xaa Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15Asp Pro Leu<210>46<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(19)..(19)<223>Xaa＝肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(38)..(38)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第38位與C末端連接<400>46Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys Asp1 5 10 15
Pro Leu Xaa Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp20 25 30Val Cys Asp Pro Leu Xaa35<210>47<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第1位與N末端連接<220>
<221>misc_特征<222>(20)..(20)<223>Xaa＝肽鍵<400>47Xaa Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15Asp Pro Leu Xaa Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln20 25 30Trp Val Cys Asp Pro Leu35<210>48<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵
<220>
<221>misc_特征<222>(19)..(19)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第19位與C末端連接<400>48Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys Thr1 5 10 15Ser Ser Xaa<210>49<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第1位與N末端連接<400>49Xaa Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys1 5 10 15Thr Ser Ser<210>50<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵
<220>
<221>misc_特征<222>(18)..(18)<223>Xaa＝肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(36)..(36)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第36位與C末端連接<400>50Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Thr Ser1 5 10 15Ser Xaa Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val20 25 30Thr Ser Ser Xaa35<210>51<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第1位與N末端連接<220>
<221>misc_特征<222>(19)..(19)<223>Xaa＝肽鍵<400>51Xaa Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Thr1 5 10 15
Ser Ser Xaa Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp20 25 30Val Thr Ser Ser35<210>52<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(19)..(19)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第19位與C末端連接<400>52Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys His1 5 10 15Gly Leu Xaa<210>53<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第1位與N末端連接<400>53
Xaa Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15His Gly Leu<210>54<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(19)..(19)<223>Xaa＝肽鍵<220>
<221>misc_特征<222>(38)..(38)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第38位與C末端連接<400>54Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys His1 5 10 15Gly Leu Xaa Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp20 25 30Val Cys His Gly Leu Xaa35<210>55<211>38<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽鍵
<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>Xaa＝肽鍵Fc結(jié)構(gòu)域在第1位與N末端連接<220>
<221>misc_特征<222>(20)..(20)<223>Xaa＝肽鍵<400>55Xaa Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15His Gly Leu Xaa Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln20 25 30Trp Val Cys His Gly Leu35<210>56<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>56cggcgcaact atcggtatca agctg 25<210>57<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>57catgtaccgt aacactgagt ttcgtc 26<210>58<211>18
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>共有肽<400>58Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys His1 5 10 15Gly Leu<210>59<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的接頭序列<400>59Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly1 5 10 15Ser Gly Ser Ala Thr His Met20<210>60<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>60Asn Gln Thr Leu Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Phe Ile Thr1 5 10 15Tyr Met
<210>61<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>61Pro Val Tyr Gln Gly Trp Trp Asp Thr Leu Thr Lys Leu Tyr Ile Trp1 5 10 15Asp Gly<210>62<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>62Trp Leu Asp Gly Gly Trp Arg Asp Pro Leu Ile Lys Arg Ser Val Gln1 5 10 15Leu Gly<210>63<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>63Gly His Gln Gln Phe Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Gln1 5 10 15
Ser Asn<210>64<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>64Gln Arg Val Gly Gln Phe Trp Asp Val Leu Thr Lys Met Phe Ile Thr1 5 10 15Gly Ser<210>65<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>65Gln Ala Gln Gly Trp Ser Tyr Asp Ala Leu Ile Lys Thr Trp Ile Arg1 5 10 15Trp Pro<210>66<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>66Gly Trp Met His Trp Lys Trp Asp Pro Leu Thr Lys Gln Ala Leu Pro
1 5 10 15Trp Met<210>67<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>67Gly His Pro Thr Tyr Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Ile Leu1 5 10 15Gln Met<210>68<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>68Trp Asn Asn Trp Ser Leu Trp Asp Pro Leu Thr Lys Leu Trp Leu Gln1 5 10 15Gln Asn<210>69<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域
<400>69Trp Gln Trp Gly Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Gln1 5 10 15Gln Gln<210>70<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>70Gly Gln Met Gly Trp Arg Trp Asp Pro Leu Thr Lys Met Trp Leu Gly1 5 10 15Thr Ser<210>71<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>71tatgccgggt acttgtttcc cgttcccgtg ggaatgcact cacgctggtg gaggcggtgg60gg 62<210>72<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>72
tcgaccccac cgcctcctgg agcgtgagtg cattcccacg ggaagccgaa acaagtaccc60ggca 64<210>73<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>73tatgtggggt gcttgttggc cgttcccgtg ggaatgtttc aaagaaggtg gaggcggtgg60gg 62<210>74<211>64<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>74tcgaccccac cgcctccacc ttctttgaaa cattcccacg ggaacggcca acaagcaccc60caca 64<210>75<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>75tatggttccg ttctgtgacc tgctgactaa acactgtttc gaagctggtg gaggcggtgg60gg 62<210>76<211>64<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸<400>76tcgaccccac cgcctccacc agcttcgaaa cagtgtttag tcagcaggtc acagaacgga60acca 64<210>77<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>77tatgggttct cgttgtaaat acaaatggga cgttctgact aaacagtgtt tccaccacgg60tggaggcggt gggg 74<210>78<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>78tcgaccccac cgcctccacc gtggtggaaa cactgtttag tcagaacgtc ccatttgtat60ttacaacgag aaccca76<210>79<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>79tatgctgccg ggttgtaaat gggacctgct gatcaaacag tgggtttgtg acccgctggg60tggaggcggt gggg 74
<210>80<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>80tcgaccccac cgcctccacc cagcgggtca caaacccact gtttgatcag caggtcccat60ttacaacccg gcagca76<210>81<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>81tatgtctgct gactgttact tcgacatcct gactaaatct gacgtttgta cttcttctgg60tggaggcggt gggg 74<210>82<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>82tcgaccccac cgcctccacc agaagaagta caaacgtcag atttagtcag gatgtcgaag60taacagtcag cagaca76<210>83<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸
<400>83tatgtctgac gactgtatgt acgaccagct gactcgtatg ttcatctgtt ctaacctggg60tggaggcggt gggg 74<210>84<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>84tcgaccccac cgcctccacc caggttagaa cagatgaaca tacgagtcag ctggtcgtac60atacagtcgt cagaca76<210>85<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>85tatggacctg aactgtaaat acgacgaact gacttacaaa gaatggtgtc agttcaacgg60tggaggcggt gggg 74<210>86<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>86tcgaccccac cgcctccacc gttgaactga caccattctt tgtaagtcag ttcgtcgtat60ttacagttca ggtcca76<210>87<211>74<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>87tatgttccac gactgtaaat acgacctgct gactcgtcag atggtttgtc acggtctggg60tggaggcggt gggg 74<210>88<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>88tcgaccccac cgcctccacc cagaccgtga caaaccatct gacgagtcag caggtcgtat60ttacagtcgt ggaaca76<210>89<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>89tatgcgtaac cactgtttct gggaccacct gctgaaacag gacatctgtc cgtctccggg60tggaggcggt gggg 74<210>90<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>90tcgaccccac cgcctccacc cggagacgga cagatgtcct gtttcagcag gtggtcccag60aaacagtggt tacgca76
<210>91<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>91tatggctaac cagtgttggt gggactctct gctgaaaaaa aacgtttgtg aattcttcgg60tggaggcggt gggg 74<210>92<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>92tcgaccccac cgcctccacc gaagaattca caaacgtttt ttttcagcag agagtcccac60caacactggt tagcca76<210>93<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>93tatgttccac gactgcaaat gggacctgct gaccaaacag tgggtttgcc acggtctggg60tggaggcggt gggg 74<210>94<211>76<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸
<400>94tcgaccccac cgcctccacc cagaccgtgg caaacccact gtttggtcag caggtcccat60ttgcagtcgt ggaaca76<210>95<211>141<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pAMG21-RANK-Fc載體<400>95ctaattccgc tctcacctac caaacaatgc ccccctgcaa aaaataaatt catataaaaa60acatacagat aaccatctgc ggtgataaat tatctctggc ggtgttgaca taaataccac120tggcggtgat actgagcaca t 141<210>96<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pAMG21-RANK-Fc載體<400>96cgatttgatt ctagaaggag gaataacata tggttaacgc gttggaattc ggtac 55<210>97<211>1546<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pAMG21<400>97gcgtaacgta tgcatggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa60cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct120ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga180gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc240
ctgacggatg gcctttttgc gtttctacaa actcttttgt ttatttttct aaatacattc300aaatatggac gtcgtactta acttttaaag tatgggcaat caattgctcc tgttaaaatt360gctttagaaa tactttggca gcggtttgtt gtattgagtt tcatttgcgc attggttaaa420tggaaagtga ccgtgcgctt actacagcct aatatttttg aaatatccca agagcttttt480ccttcgcatg cccacgctaa acattctttt tctcttttgg ttaaatcgtt gtttgattta540ttatttgcta tatttatttt tcgataatta tcaactagag aaggaacaat taatggtatg600ttcatacacg catgtaaaaa taaactatct atatagttgt ctttctctga atgtgcaaaa660ctaagcattc cgaagccatt attagcagta tgaataggga aactaaaccc agtgataaga720cctgatgatt tcgcttcttt aattacattt ggagattttt tatttacagc attgttttca780aatatattcc aattaatcgg tgaatgattg gagttagaat aatctactat aggatcatat840tttattaaat tagcgtcatc ataatattgc ctccattttt tagggtaatt atccagaatt900gaaatatcag atttaaccat agaatgagga taaatgatcg cgagtaaata atattcacaa960tgtaccattt tagtcatatc agataagcat tgattaatat cattattgct tctacaggct1020ttaattttat taattattct gtaagtgtcg tcggcattta tgtctttcat acccatctct1080ttatccttac ctattgtttg tcgcaagttt tgcgtgttat atatcattaa aacggtaata1140gattgacatt tgattctaat aaattggatt tttgtcacac tattatatcg cttgaaatac1200aattgtttaa cataagtacc tgtaggatcg tacaggttta cgcaagaaaa tggtttgtta1260tagtcgatta atcgatttga ttctagattt gttttaacta attaaaggag gaataacata1320tggttaacgc gttggaattc gagctcacta gtgtcgacct gcagggtacc atggaagctt1380actcgaggat ccgcggaaag aagaagaaga agaagaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg1440ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga1500ggggtttttt gctgaaagga ggaaccgctc ttcacgctct tcacgc 1546<210>98<211>872<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>GM221<400>98ttattttcgt gcggccgcac cattatcacc gccagaggta aactagtcaa cacgcacggt60gttagatatt tatcccttgc ggtgatagat tgagcacatc gatttgattc tagaaggagg120gataatatat gagcacaaaa aagaaaccat taacacaaga gcagcttgag gacgcacgtc180gccttaaagc aatttatgaa aaaaagaaaa atgaacttgg cttatcccag gaatctgtcg240cagacaagat ggggatgggg cagtcaggcg ttggtgcttt atttaatggc atcaatgcat300taaatgctta taacgccgca ttgcttacaa aaattctcaa agttagcgtt gaagaattta360gcccttcaat cgccagagaa tctacgagat gtatgaagcg gttagtatgc agccgtcact420tagaagtgag tatgagtacc ctgttttttc tcatgttcag gcagggatgt tctcacctaa480gcttagaacc tttaccaaag gtgatgcgga gagatgggta agcacaacca aaaaagccag540tgattctgca ttctggcttg aggttgaagg taattccatg accgcaccaa caggctccaa600gccaagcttt cctgacggaa tgttaattct cgttgaccct gagcaggctg ttgagccagg660tgatttctgc atagccagac ttgggggtga tgagtttacc ttcaagaaac tgatcaggga720tagcggtcag gtgtttttac aaccactaaa cccacagtac ccaatgatcc catgcaatga780gagttgttcc gttgtgggga aagttatcgc tagtcagtgg cctgaagaga cgtttggctg840atagactagt ggatccacta gtgtttctgc cc 872<210>99<211>1197<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>GM221<400>99ggcggaaacc gacgtccatc gaatggtgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc60cggaagagag tcaattcagg gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag120agtatgccgg tgtctcttat cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt180ctgcgaaaac gcgggaaaaa gtcgaagcgg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc240
gcgtggcaca acaactggcg ggcaaacagt cgctcctgat tggcgttgcc acctccagtc300tggccctgca cgcgccgtcg caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg360gtgccagcgt ggtggtgtcg atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg420tgcacaatct tctcgcgcaa cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg ctggatgacc480aggatgccat tgctgtggaa gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct540ctgaccagac acccatcaac agtattattt tctcccatga agacggtacg cgactgggcg600tggagcatct ggtcgcattg ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt660ctgtctcggc gcgtctgcgt ctggctggct ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc720agccgatagc ggaacgggaa ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc780aaatgctgaa tgagggcatc gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc840tgggcgcaat gcgcgccatt accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat atctcggtag900tgggatacga cgataccgaa gacagctcat gttatatccc gccgttaacc accatcaaac960aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc1020aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg1080cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac1140gacaggtttc ccgactggaa agcggacagt aaggtaccat aggatccagg cacagga 1197<210>100<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<220>
<221>misc_特征<222>(1，2，3，13)..(14)<223>Xaa(Pos1，2，3，13，14)各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(6)..(6)
<223>Xaa(Pos6)是氨基酸殘基；Xaa(Pos9)是堿性或疏水殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(12)..(12)<223>Xaa(Pos12)是中性疏水殘基。
<400>100Xaa Xaa Xaa Cys Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>101<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<220>
<221>misc_特征<222>(1，2，3，12和)..(13)<223>Xaa(Pos1，2，3，12，13)各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(5 and)..(8)<223>Xaa(Pos5，8)是中性疏水殘基；Xaa(Pos 10)是酸性殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(14)..(14)<223>Xaa(Pos14)是缺失的或是氨基酸殘基。
<400>101Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Pro Phe Xaa Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>102<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑
<220>
<221>misc_特征<222>(1，2，3，12，13和)..(14)<223>Xaa(Pos1，2，3，12，13，14)各自獨立地是缺失的和是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(6和)..(7)<223>Xaa(Pos6，7)是疏水殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(10)..(10)<223>Xaa(Pos10)是酸性和極性疏水殘基。
<400>102Xaa Xaa Xaa Cys Trp Xaa Xaa Trp Gly Xaa Cys Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>103<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(1)<223>Xaa(Pos1)是缺失的或是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(2和)..(14)<223>Xaa(Pos2，14)是中性的疏水殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(3和)..(10)<223>Xaa(Pos3，10)是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(5，6，7，8，12和)..(13)<223>Xaa(Pos5，6，7，8，12，13)各自獨立地是氨基酸殘基；
<220>
<221>misc_特征<222>(9)..(9)<223>Xaa(Pos9)是酸性殘基。
<400>103Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>104<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<220>
<221>misc_特征<222>(1，2，12，13，16，17和)..(18)<223>Xaa(Pos1，2，12，13，16，17，18)各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(3)..(3)<223>Xaa(Pos3)是酸性或酰胺殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(5 and)..(8)<223>Xaa(Pos5，8)是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(6)..(6)<223>Xaa(Pos6)是芳族殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(11)..(11)<223>Xaa(Pos11)是堿基殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(14)..(14)<223>Xaa(Pos14)是中性疏水殘基。
<400>104
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa1 5 10 15Xaa Xaa<210>105<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<220>
<221>misc_特征<222>(1，2和)..(3)<223>Xaa(Pos1，2，3)各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(5，7，14和)..(16)<223>Xaa(Pos5，7，14，16)是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(10)..(10)<223>Xaa(Pos10)是堿性殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(11和)..(12)<223>Xaa(Pos11，12)各自獨立地是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(13和)..(17)<223>Xaa(Pos13，17)是中性疏水殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(18)..(18)<223>Xaa(Pos18)是氨基酸殘基和是缺失的。
<400>105Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa
1 5 10 15Xaa Xaa<210>106<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<220>
<221>misc_特征<222>(1，2，3，16，17和)..(18)<223>Xaa(Pos1，2，3，16，17，18)各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(5，6，7，10和)..(14)<223>Xaa(Pos5，6，7，10，14)各自獨立地是氨基酸殘基。
<400>106Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Trp Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Cys Xaa1 5 10 15Xaa Xaa<210>107<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<220>
<221>misc_特征<222>(1，2，3，15，16，17)..(18)<223>Xaa(Pos1，2，3，15，16，17，18)各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(5，6，7，9和)..(13)<223>Xaa(Pos5，6，7，9 13)各自獨立地是氨基酸殘基；<220>
<221>misc_特征<222>(11)..(11)<223>Xaa(Pos 11)是T或I；和<400>107Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Leu Xaa Lys Xaa Cys Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa<210>108<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<220>
<221>misc_特征<222>(2)..(2)<223>(Pos 2)的X是氨基酸殘基<220>
<221>misc_特征<222>(4)..(4)<223>(Pos 4)的X是蘇氨?；虍惲涟滨?amp;lt;400>108Asp Xaa Leu Xaa1<210>109<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑
<220>
<221>misc_特征<222>(1，2和)..(3)<223>X at(Pos 1，2，3)是缺失的或是氨基酸殘基(當(dāng)X12、X13和X14中的一個是C時，X1、X2和X3中的一個優(yōu)選是C)；<220>
<221>misc_特征<222>(5)..(5)<223>(Pos 5)的X是W，Y，或F(優(yōu)選W)；<220>
<221>misc_特征<222>(7)..(7)<223>(Pos 7)的X是氨基酸殘基(優(yōu)選L)；<220>
<221>misc_特征<222>(9)..(9)<223>(Pos 9)的X是T或I(優(yōu)選T)；<220>
<221>misc_特征<222>(10)..(10)<223>(Pos 10)的X是K，R，或H(優(yōu)選K).
<220>
<221>misc_特征<222>(12)..(12)<223>at(Pos 12)的X是C，中性疏水殘基或堿基殘基(優(yōu)選W，C，或R)；<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(13)<223>(Post 13)的X是C，中性疏水殘基或是缺失的(優(yōu)選V)；<220>
<221>misc_特征<222>(14)..(14)<223>(Pos 14)是X是任意氨基酸殘基或是缺失的。
<400>109Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>110<211>5
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1調(diào)節(jié)劑<400>110Pro Phe Pro Trp Glu1 5<210>111<211>248<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>111Met Pro Gly Thr Cys Phe Pro Phe Pro Trp Glu Cys Thr His Ala Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala20 25 30Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro35 40 45Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val50 55 60Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val65 70 75 80Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln85 90 95Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln100 105 110Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
115 120 125Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro130 135 140Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr145 150 155 160Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser165 170 175Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr180 185 190Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr195 200 205Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe210 215 220Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys225 230 235 240Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245<210>112<211>248<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>112Met Trp Gly Ala Cys Trp Pro Phe Pro Trp Glu Cys Phe Lys Glu Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala20 25 30
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro35 40 45Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val50 55 60Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val65 70 75 80Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln85 90 95Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln100 105 110Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala115 120 125Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro130 135 140Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr145 150 155 160Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser165 170 175Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr180 185 190Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr195 200 205Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe210 215 220Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
225 230 235 240Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245<210>113<211>248<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>113Met Val Pro Phe Cys Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Phe Glu Ala Gly1 5 10 15Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala20 25 30Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro35 40 45Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val50 55 60Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val65 70 75 80Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln85 90 95Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln100 105 110Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala115 120 125Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro130 135 140
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr145 150 155 160Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser165 170 175Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr180 185 190Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr195 200 205Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe210 215 220Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys225 230 235 240Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245<210>114<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>114Met Gly Ser Arg Cys Lys Tyr Lys Trp Asp Val Leu Thr Lys Gln Cys1 5 10 15Phe His His Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250
<210>115<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>115Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250<210>116<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>116Met Ser Ala Asp Cys Tyr Phe Asp Ile Leu Thr Lys Ser Asp Val Cys1 5 10 15Thr Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250<210>117<211>252<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>117Met Ser Asp Asp Cys Met Tyr Asp Gln Leu Thr Arg Met Phe Ile Cys1 5 10 15Ser Asn Leu Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250<210>118<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>118Met Asp Leu Asn Cys Lys Tyr Asp Glu Leu Thr Tyr Lys Glu Trp Cys1 5 10 15Gln Phe Asn Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250<210>119<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體
<400>119Met Phe His Asp Cys Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Arg Gln Met Val Cys1 5 10 15His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250<210>120<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>120Met Arg Asn His Cys Phe Trp Asp His Leu Leu Lys Gln Asp Ile Cys1 5 10 15Pro Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250<210>121<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>121Met Ala Asn Gln Cys Trp Trp Asp Ser Leu Thr Lys Lys Asn Val Cys1 5 10 15
Glu Phe Phe Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250<210>122<211>252<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>122Met Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15His Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro20 25 30Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe35 40 45Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val50 55 60Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe65 70 75 80Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro85 90 95Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr100 105 110Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val115 120 125
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala130 135 140Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg145 150 155 160Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly165 170 175Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro180 185 190Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser195 200 205Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln210 215 220Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His225 230 235 240Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys245 250<210>123<211>293<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>123Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15Asp Pro Leu Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala20 25 30
Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Met Leu Pro Gly Cys Lys Trp35 40 45Asp Leu Leu Ile Lys Gln Trp Val Cys Asp Pro Leu Gly Gly Gly Gly50 55 60Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu65 70 75 80Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr85 90 95Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val100 105 110Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val115 120 125Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser130 135 140Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu145 150 155 160Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala165 170 175Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro180 185 190Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln195 200 205Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala210 215 220Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr225 230 235 240
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu245 250 255Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser260 265 270Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser275 280 285Leu Ser Pro Gly Lys290<210>124<211>293<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>TALL-1抑制性肽體<400>124Met Phe His Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys1 5 10 15His Gly Leu Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala20 25 30Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Met Phe His Asp Cys Lys Trp35 40 45Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Cys His Gly Leu Gly Gly Gly Gly50 55 60Gly Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu65 70 75 80Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr85 90 95
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val100 105 110Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val115 120 125Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser130 135 140Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu145 150 155 160Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala165 170 175Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro180 185 190Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln195 200 205Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala210 215 220Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr225 230 235 240Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu245 250 255Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser260 265 270Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser275 280 285Leu Ser Pro Gly Lys290
<210>125<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>共有序列<220>
<221>misc_特征<222>(1，2和)..(3)<223>(Pos 1，2，3)的X是缺失的或是氨基酸殘基(當(dāng)X12、X13和X14中的一個是C時，X1、X2和X3中的一個是C)；<220>
<221>misc_特征<222>(7)..(7)<223>(Pos 7)的X是氨基酸殘基(優(yōu)選L)；<220>
<221>misc_特征<222>(9)..(9)<223>(Pos 9)的X是T或I(優(yōu)選T)；<220>
<221>misc_特征<222>(12)..(12)<223>(Pos 12)的X是C，中性疏水殘基，或堿性殘基(優(yōu)選W，C，或R)；<220>
<221>misc_特征<222>(13)..(13)<223>(Pos 13)的X是C，中性疏水殘基或是缺失的(優(yōu)選V)；<220>
<221>misc_特征<222>(14)..(14)<223>(Pos 14)的X是任意氨基酸殘基或是缺失的。
<400>125Xaa Xaa Xaa Lys Trp Asp Xaa Leu Xaa Lys Gln Xaa Xaa Xaa1 5 10<210>126<211>18<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>126Tyr Lys Gly Arg Gln Met Trp Asp Ile Leu Thr Arg Ser Trp Val Val1 5 10 15Ser Leu<210>127<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>127Gln Asp Val Gly Leu Trp Trp Asp Ile Leu Thr Arg Ala Trp Met Pro1 5 10 15Asn Ile<210>128<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>128Gln Asn Ala Gln Arg Val Trp Asp Leu Leu Ile Arg Thr Trp Val Tyr1 5 10 15Pro Gln<210>129
<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>129Gly Trp Asn Glu Ala Trp Trp Asp Glu Leu Thr Lys Ile Trp Val Leu1 5 10 15Glu Gln<210>130<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>130Arg Ile Thr Cys Asp Thr Trp Asp Ser Leu Ile Lys Lys Cys Val Pro1 5 10 15Gln Ser<210>131<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>131Gly Ala Ile Met Gln Phe Trp Asp Ser Leu Thr Lys Thr Trp Leu Arg1 5 10 15Gln Ser
<210>132<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>132Trp Leu His Ser Gly Trp Trp Asp Pro Leu Thr Lys His Trp Leu Gln1 5 10 15Lys Val<210>133<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>133Ser Glu Trp Phe Phe Trp Phe Asp Pro Leu Thr Arg Ala Gln Leu Lys1 5 10 15Phe Arg<210>134<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>134Gly Val Trp Phe Trp Trp Phe Asp Pro Leu Thr Lys Gln Trp Thr Gln1 5 10 15
Ala Gly<210>135<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>135Met Gln Cys Lys Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Lys Trp Cys Val Thr1 5 10 15Asn Gly<210>136<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>136Leu Trp Ser Lys Glu Val Trp Asp Ile Leu Thr Lys Ser Trp Val Ser1 5 10 15Gln Ala<210>137<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>137
Lys Ala Ala Gly Trp Trp Phe Asp Trp Leu Thr Lys Val Trp Val Pro1 5 10 15Ala Pro<210>138<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>138Ala Tyr Gln Thr Trp Phe Trp Asp Ser Leu Thr Arg Leu Trp Leu Ser1 5 10 15Thr Thr<210>139<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>139Ser Gly Gln His Phe Trp Trp Asp Leu Leu Thr Arg Ser Trp Thr Pro1 5 10 15Ser Thr<210>140<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域
<400>140Leu Gly Val Gly Gln Lys Trp Asp Pro Leu Thr Lys Gln Trp Val Ser1 5 10 15Arg Gly<210>141<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>141Val Gly Lys Met Cys Gln Trp Asp Pro Leu Ile Lys Arg Thr Val Cys1 5 10 15Val Gly<210>142<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>142Cys Arg Gln Gly Ala Lys Phe Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Leu Leu1 5 10 15Gly Arg<210>143<211>18<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>143Gly Gln Ala Ile Arg His Trp Asp Val Leu Thr Lys Gln Trp Val Asp1 5 10 15Ser Gln<210>144<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>144Arg Gly Pro Cys Gly Ser Trp Asp Leu Leu Thr Lys His Cys Leu Asp1 5 10 15Ser Gln<210>145<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>145Trp Gln Trp Lys Gln Gln Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Met Val Trp1 5 10 15Val Gly<210>146
<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>146Pro Ile Thr Ile Cys Arg Lys Asp Leu Leu Thr Lys Gln Val Val Cys1 5 10 15Leu Asp<210>147<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>147Lys Thr Cys Asn Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Leu Gln1 5 10 15Gln Ala<210>148<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>148Lys Cys Leu Lys Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Val Thr1 5 10 15Glu Val
<210>149<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>149Arg Cys Trp Asn Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Ile His1 5 10 15Pro Trp<210>150<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>150Asn Arg Asp Met Arg Lys Trp Asp Pro Leu Ile Lys Gln Trp Ile Val1 5 10 15Arg Pro<210>151<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>151Gln Ala Ala Ala Ala Thr Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Leu Val1 5 10 15
Pro Pro<210>152<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>152Pro Glu Gly Gly Pro Lys Trp Asp Pro Leu Thr Lys Gln Phe Leu Pro1 5 10 15Pro Val<210>153<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>153Gln Thr Pro Gln Lys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Phe Thr1 5 10 15Arg Asn<210>154<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>154
Ile Gly Ser Pro Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Met Ile Cys1 5 10 15Gln Thr<210>155<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>155Cys Thr Ala Ala Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Ile Gln1 5 10 15Glu Lys<210>156<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>156Val Ser Gln Cys Met Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Leu Gln1 5 10 15Gly Trp<210>157<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域
<400>157Val Trp Gly Thr Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Tyr Leu Pro1 5 10 15Pro Gln<210>158<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>158Gly Trp Trp Glu Met Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Tyr Arg1 5 10 15Pro Gln<210>159<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>159Thr Ala Gln Val Ser Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Leu Pro1 5 10 15Leu Ala<210>160<211>18<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>160Gln Leu Trp Gly Thr Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Tyr Ile Gln1 5 10 15Ile Met<210>161<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>161Trp Ala Thr Ser Gln Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Gln1 5 10 15Asn Met<210>162<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>162Gln Arg Gln Cys Ala Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Val Leu1 5 10 15Phe Tyr<210>163
<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>163Lys Thr Thr Asp Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Arg Ile Cys1 5 10 15Gln Val<210>164<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>164Leu Leu Cys Gln Gly Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Leu Lys1 5 10 15Leu Arg<210>165<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>165Leu Met Trp Phe Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Leu Val Pro1 5 10 15Thr Phe
<210>166<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>166Gln Thr Trp Ala Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Ile Gly1 5 10 15Pro Met<210>167<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>167Asn Lys Glu Leu Leu Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Ser<210>168<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>168Gly Gln Lys Asp Leu Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Tyr Val Arg1 5 10 15
Gln Ser<210>169<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>169Pro Lys Pro Cys Gln Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Leu Gly1 5 10 15Ser Val<210>170<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>170Gly Gln Ile Gly Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Ile Gln1 5 10 15Thr Arg<210>171<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>171
Val Trp Leu Asp Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Ile His1 5 10 15Pro Gln<210>172<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>172Gln Glu Trp Glu Tyr Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Gly Trp1 5 10 15Leu Arg<210>173<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>173His Trp Asp Ser Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Val1 5 10 15Gln Ala<210>174<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域
<400>174Thr Arg Pro Leu Gln Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Leu Arg1 5 10 15Val Gly<210>175<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>175Ser Asp Gln Trp Gln Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Phe Trp1 5 10 15Asp Val<210>176<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>176Gln Gln Thr Phe Met Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Ile Arg1 5 10 15Arg His<210>177<211>18<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>177Gln Gly Glu Cys Arg Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Phe Pro1 5 10 15Gly Gln<210>178<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>178Gly Gln Met Gly Trp Arg Trp Asp Pro Leu Ile Lys Met Cys Leu Gly1 5 10 15Pro Ser<210>179<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>179Gln Leu Asp Gly Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Lys Val Cys1 5 10 15Ile Pro<210>180
<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>180His Gly Tyr Trp Gln Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Trp Val Ser1 5 10 15Ser Glu<210>181<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>181His Gln Gly Gln Cys Gly Trp Asp Leu Leu Thr Arg Ile Tyr Leu Pro1 5 10 15Cys His<210>182<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>182Leu His Lys Ala Cys Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Cys Trp Pro1 5 10 15Met Gln
<210>183<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>183Gly Pro Pro Gly Ser Val Trp Asp Leu Leu Thr Lys Ile Trp Ile Gln1 5 10 15Thr Gly<210>184<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>184Ile Thr Gln Asp Trp Arg Phe Asp Thr Leu Thr Arg Leu Trp Leu Pro1 5 10 15Leu Arg<210>185<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>185Gln Gly Gly Phe Ala Ala Trp Asp Val Leu Thr Lys Met Trp Ile Thr1 5 10 15
Val Pro<210>186<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>186Gly His Gly Thr Pro Trp Trp Asp Ala Leu Thr Arg Ile Trp Ile Leu1 5 10 15Gly Val<210>187<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>187Val Trp Pro Trp Gln Lys Trp Asp Leu Leu Thr Lys Gln Phe Val Phe1 5 10 15Gln Asp<210>188<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的TALL-1調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域<400>188
Trp Gln Gln Trp Ser Trp Lys Trp Asp Leu Leu Thr Arg Gln Tyr Ile1 5 10 15Ser Ser Ser<210>189<211>882<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>TALL-1 12-3串聯(lián)二聚體<400>189atgcttccag gctgcaagtg ggatcttctt attaagcaat gggtatgcga tccacttgga60tccggttctg ctactggtgg ttccggctcc accgcaagct ctggttcagg cagtgcgact120catatgctgc cgggttgtaa atgggacctg ctgatcaaac agtgggtttg tgacccgctg180ggtggaggcg gtggggtcga caaaactcac acatgtccac cttgtccagc tccggaactc240ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc300cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag360ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag420cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg480aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa540accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc600cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc660agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg720cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag780agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac840cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat aa 882<210>190<211>23<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的接頭<400>190Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly1 5 10 15Ser Gly Ser Ala Thr Gly Met20<210>191<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的接頭<400>191Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly1 5 10 15Ser Gly Ser Ala Thr Gly Ser20<210>192<211>46<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的接頭<400>192Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly1 5 10 15Ser Gly Ser Ala Thr His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser20 25 30
Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Met35 40 45<210>193<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的接頭<220>
<221>misc_特征<222>(22)..(23)<223>(Pos 22)的X獨立地是堿性或疏水殘基，(Pos 23)的X獨立地是疏水殘基。
<400>193Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly1 5 10 15Ser Gly Ser Ala Thr Xaa Xaa20<210>194<211>46<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>優(yōu)選的接頭<220>
<221>misc_特征<222>(22，23，45和)..(46)<223>(Pos 22)和(Pos 45)的X各自獨立地是堿性或疏水殘基，(Pos 23)和(Pos 46)的X各自獨立地是疏水殘基<400>194Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly1 5 10 15Ser Gly Ser Ala Thr Xaa Xaa Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser
20 25 30Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Xaa Xaa35 40 45<210>195<211>38<212>PRT<213>人<400>195Met Arg Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Gly Arg Asp Ala Pro Val Pro1 5 10 15Thr Pro Cys Val Pro Thr Glu Cys Tyr Asp Leu Leu Val Arg Lys Cys20 25 30Val Asp Cys Arg Leu Leu35<210>196<211>41<212>PRT<213>人<400>196Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg1 5 10 15Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu20 25 30Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile35 40<210>197<211>42<212>PRT<213>人<400>197
Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile Arg Gly Arg Phe Arg Arg Met Leu1 5 10 15Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu20 25 30His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys35 40110
權(quán)利要求
1.一種含有氨基酸序列Dz2Lz4的TALL-1結(jié)合組合物，其中z2是氨基酸殘基，而z4是T或I，并且其中所述組合物不包括TACI、BCMA或BAFFR片段(SEQ ID NOS195、196、197)。
2.如權(quán)利要求1的組合物，其中z4是T。
3.一種含有氨基酸序列Dz2LI的TALL-1結(jié)合組合物，其中z2是氨基酸殘基。
4.如權(quán)利要求1的組合物，包括具有下式的氨基酸序列a1a2a3CDa6La8a9a10Ca12a13a14(SEQ.ID.NO100)其中a1，a2，a3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；a6是氨基酸殘基；a8是T或I；a9是堿性或疏水性殘基；a12是中性極性殘基；a13和a14各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基。
5.如權(quán)利要求4的組合物，其中a8是T，而a9是堿性殘基。
6.如權(quán)利要求4的組合物，其中a9是K，而a12是F。
7.如權(quán)利要求1的組合物，包括具有下式的氨基酸序列b1b2b3Cb5b6Db8Lb10b11b12b13b14Cb16b17b18(SEQ.ID.NO104)其中b1和b2各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；b3是酸性或酰胺殘基；b5是氨基酸殘基；b6是芳族殘基；b8是氨基酸殘基；b10是T或I；b11是堿性殘基；b12和b13各自獨立地是氨基酸殘基；b14是中性極性殘基；和b16，b17和b18各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基。
8.如權(quán)利要求7的組合物，其中b3是D，Q或E；b6是W或Y；b10是T；b11是K或R；和b14是V或L。
9.如權(quán)利要求1的組合物，包括具有下式的氨基酸序列c1c2c3Cc5Dc7Lc9c10c11c12c13c14Cc16c17c18(SEQ.ID.NO105)其中c1，c2和c3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；c5是氨基酸殘基；c7是氨基酸殘基；c9是T或I；c10是堿性殘基；c11和c12各自獨立地是氨基酸殘基；c13是中性極性殘基；c14是氨基酸殘基；c16是氨基酸殘基；c17是中性極性殘基；和c18是氨基酸殘基或者是缺失的。
10.如權(quán)利要求9的組合物，其中c9是T；c10是K或R；c13是I，L或V；和c17是A或L。
11.如權(quán)利要求1的組合物，包括具有下式的氨基酸序列d1d2d3Cd5d6d7WDd10Ld12d13d14Cd15d16d17(SEQ.ID.NO106)其中d1，d2和d3各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；d5，d6和d7各自獨立地是氨基酸殘基；d10是氨基酸殘基；d13是T或I；d14是氨基酸殘基；而d16，d17和d18各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基。
12.如權(quán)利要求1的組合物，包括具有下式的氨基酸序列e1e2e3Ce5e6e7De9Le11Ke13Ce15e16e17e18(SEQ.ID.NO107)其中e1，e2和e3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；e5，e6，e7，e9和e13各自獨立地是氨基酸殘基；e11是T或I；和e15，e16和e17各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基。
13.如權(quán)利要求1的組合物，包括具有下式的氨基酸序列f1f2f3Kf5Df7Lf9f10Qf12f13f14(SEQ.ID NO109)其中f1，f2和f3是缺失的或者是氨基酸殘基；f5是W，Y或F；f7是氨基酸殘基；f9是T或I；f10是K，R或H；f12是C，中性極性殘基，或者堿性殘基(優(yōu)選W，C或R)；f13是C，中性極性殘基，或者是缺失的；和f14是任何氨基酸殘基或者是缺失的；其前提是，f1，f2和f3中只有一個可以是C，并且f12，f13和f14中只有一個可以是C。
14.如權(quán)利要求13的組合物，其中f5是W。
15.如權(quán)利要求13的組合物，其中f7是L。
16.如權(quán)利要求13的組合物，其中f9是T。
17.如權(quán)利要求13的組合物，其中f10是K。
18.如權(quán)利要求13的組合物，其中f12是C，而f1，f2和f3中的一個是C。
19.如權(quán)利要求13的組合物，其中f13是V。
20.如權(quán)利要求13的組合物，包括具有下式的氨基酸序列f1f2f3KWDf7Lf9KQf12f13f14(SEQ ID NO125)。
21.如權(quán)利要求20的組合物，包括選自下列的氨基酸序列SEQID NOS32，33，58，60，63，66，67，69，114，115，122，123，124，147-150，152-177，179，180，和187。
22.如權(quán)利要求20的組合物，包括具有下式的氨基酸序列LPGCKWDLLIKQWVCDPL(SEQ ID NO33)。
23.一種組合物，包括具有下式的氨基酸序列g(shù)1g2g3Cg5PFg8Wg10Cg11g12g13(SEQ.ID.NO.101)其中g(shù)1，g2和g3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；g5是中性極性殘基；g8是中性極性殘基；g10是酸性殘基；g12和g13各自獨立地是氨基酸殘基；和g14是缺失的或者是氨基酸殘基。
24.如權(quán)利要求23的組合物，其中g(shù)2是G；g5是W；g8是P；g10是E；和g13是堿性殘基。
25.一種組合物，包括具有下式的氨基酸序列h1h2h3CWh6h7WGh10Ch12h13h14(SEQ.ID.NO102)其中h1，h2，和h3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；h6是疏水性殘基；h7是疏水性殘基；h10是酸性或極性疏水性殘基；和h12，h13和h14各自獨立地是缺失或者是氨基酸殘基。
26.如權(quán)利要求25的組合物，其中h1是G；h6是A；h7是中性極性殘基；和h10是酸性殘基。
27.一種組合物，包括具有下式的氨基酸序列i1i2i3Ci5i6i7i8i9i10Ci12i13i14(SEQ.ID.NO103)其中i1是缺失的或者是氨基酸殘基；i2是中性極性殘基；i3是氨基酸殘基；i5，i6，i7和i8各自獨立地是氨基酸殘基；i9是酸性殘基；i10是氨基酸殘基；i12和i13各自獨立地是氨基酸殘基；和i14是中性極性殘基。
28.如權(quán)利要求27的組合物，其中i2是W；和i14是W。
29.一種TALL-1結(jié)合組合物，包括式為PFPWE(SEQ ID NO110)的氨基酸序列。
30.如權(quán)利要求11的組合物，具有下式(X1)a-V1-(X2)b以及它的多聚體，其中V1是媒介物；X1和X2各自獨立地選自-(L1)c-P1，-(L1)c-P1-(L2)d-P2，-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3，和-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4P1，P2，P3和P4中的一個或多個各自獨立地包括Dz2Lz4；L1，L2，L3和L4各自獨立是接頭；而a，b，c，d，e和f各自獨立地是0或1，其前提是a和b中的至少一個是1。
31.如權(quán)利要求30的組合物，具有下式P1-(L1)c-P2-(L2)d-V1。
32.如權(quán)利要求30的組合物，具有下式V1-(L1)c-P1-(L2)d-P2。
33.如權(quán)利要求30的組合物，其中V1是Fc結(jié)構(gòu)域。
34.如權(quán)利要求30的組合物，其中V1是IgG Fc結(jié)構(gòu)域。
35.如權(quán)利要求30的組合物，其中V1是IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域。
36.如權(quán)利要求30的組合物，其中V1包括SEQ ID NO2的序列。
37.如權(quán)利要求30的組合物，其中P1，P2，P3和P4中的一個或多個各自獨立地包括選自下列的序列a1a2a3CDa6La8a9a10Ca12a13a14(SEQ.ID.NO100)b1b2b3Cb5b6Db8Lb10b11b12b13b14Cb16b17b18(SEQ.ID.NO104)c1c2c3Cc5Dc7Lc9c10c11c12c13c14Cc16c17c18(SEQ.ID.NO105)d1d2d3Cd5d6d7WDd10Ld13d14d15Cd16d17d18(SEQ.ID.NO106)e1e2e3Ce5e6e7De9Le11Ke13Ce15e16e17e18(SEQ.ID.NO107)f1f2f3Kf5Df7Lf9f10Qf12f13f14(SEQ.ID NO109)g1g2g3Cg5PFg8Wg10Cg11g12g13(SEQ.ID.NO.101)h1h2h3CWh6h7WGh10Ch12h13h14(SEQ.ID.NO102)，和i1i2i3Ci5i6i7i8i9i10Ci12i13i14(SEQ.ID.NO103)其中a1，a2，a3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；a6是氨基酸殘基；a9是堿性或疏水性殘基；a8是蘇氨?；虍惲涟滨＃籥12是中性極性殘基；a13和a14各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；b1和b2各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；b3是酸性或酰胺殘基；b5是氨基酸殘基；b6是芳族殘基；b8是氨基酸殘基；b10是T或I；b11是堿性殘基；b12和b13各自獨立地是氨基酸殘基；b14是中性極性殘基；和b16，b17和b18各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；c1，c2和c3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；c5是氨基酸殘基；c7是氨基酸殘基；c9是T或I；c10是堿性殘基；c11和c12各自獨立地是氨基酸殘基；c13是中性極性殘基；c14是氨基酸殘基；c16是氨基酸殘基；c17是中性極性殘基；和c18是氨基酸殘基或者是缺失的；d1，d2和d3各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；d5，d6和d7各自獨立地是氨基酸殘基；d10是氨基酸殘基；d12是T或I；d13是氨基酸殘基；而d15，d16和d17各自獨立地是缺失的或是氨基酸殘基；e1，e2和e3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；e5，e6，e7，e9和e13各自獨立地是氨基酸殘基；e11是T或I；和e15，e16和e17各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；f1，f2和f3是缺失的或者是氨基酸殘基；f5是W，Y或F；f7是氨基酸殘基；f9是T或I；f10是K，R或H；f12是C，中性極性殘基，或者堿性殘基；f13是C，中性極性殘基，或者是缺失的；和f14是任何氨基酸殘基或者是缺失的；其前提是，f1，f2和f3中的一個可以是C，并且f12，f13和f14中的一個可以是C；g1，g2和g3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；g5是中性極性殘基；g8是中性極性殘基；g10是酸性殘基；g12和g13各自獨立地是氨基酸殘基；和g14是缺失的或者是氨基酸殘基；h1，h2和h3各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；h6是疏水性殘基；h7是疏水性殘基；h10是酸性或極性疏水性殘基；和h12，h13和h14各自獨立地是缺失的或者是氨基酸殘基；i1是缺失的或者是氨基酸殘基；i2是中性極性殘基；i3是氨基酸殘基；i5，i6，i7和i8各自獨立地是氨基酸殘基；i9是酸性殘基；i10是氨基酸殘基；i12和i13各自獨立地是氨基酸殘基；和i14是中性極性殘基。
38.如權(quán)利要求37的組合物，其中a9是堿性殘基；b3是D，Q，或E；b6是W或Y；b11是K或R；和b14是V或L；c10是K或R；c13是I，L，或V；c17是A或L；f5是W；f7是L；f7是K；和f10是V。
39.如權(quán)利要求37的組合物，其中P1，P2，P3和P4中的一個或多個各自獨立地包括f1f2f3KWDf7Lf9KQf12f13f14(SEQ ID NO125)。
40.如權(quán)利要求39的組合物，具有下式P1-(L1)c-P2-(L2)d-V1。
41.如權(quán)利要求39的組合物，具有下式V1-(L1)c-P1-(L2)d-P2。
42.如權(quán)利要求39的組合物，具有選自SEQ ID NOS122，123，和124的氨基酸序列。
43.如權(quán)利要求40的組合物，其中L2大于5個氨基酸。
44.如權(quán)利要求43的組合物，其中L2選自GSGSATGGSGSTASSGSGSATx1x2(SEQ ID NO193)和GSGSATGGSGSTASSGSGSATx1x2GSGSATGGSGSTASSGSGSATx3x4(SEQ ID NO194)其中，x1和x3各自獨立地是堿性或疏水性殘基，而x2和X4各自獨立地是疏水性殘基。
45.如權(quán)利要求41的組合物，其中L2選自GSGSATGGSGSTASSGSGSATH(SEQ ID NO59)，GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM(SEQ ID NO190)GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS(SEQ ID NO191)，和GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM(SEQ ID NO192)。
46.如權(quán)利要求28的組合物，包括選自表2的序列(SEQ ID NOS29-39，60-70和126-188)。
47.如權(quán)利要求30的組合物，包括選自表4的序列(SEQ ID NOS44-55)。
48.如權(quán)利要求46的組合物，其中V1是Fc結(jié)構(gòu)域。
49.如權(quán)利要求46的組合物，其中V1是IgG Fc結(jié)構(gòu)域。
50.如權(quán)利要求46的組合物，其中V1是IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域。
51.一種編碼權(quán)利要求34的組合物的DNA。
52.一種包括權(quán)利要求51的DNA的表達載體。
53.一種包括權(quán)利要求52的表達載體的宿主細胞。
54.如權(quán)利要求53的細胞，其中所述細胞是大腸桿菌細胞。
55.一種治療B細胞介導(dǎo)的自身免疫病的方法，它包括施用權(quán)利要求1的組合物。
56.一種治療B細胞介導(dǎo)的自身免疫病的方法，它包括施用權(quán)利要求13的組合物。
57.一種治療狼瘡的方法，它包括施用權(quán)利要求1的組合物。
58.一種治療狼瘡的方法，它包括施用權(quán)利要求13的組合物。
59.一種治療B細胞介導(dǎo)的癌癥的方法，它包括施用權(quán)利要求1的組合物。
60.一種治療B細胞介導(dǎo)的癌癥的方法，它包括施用權(quán)利要求13的組合物。
61.一種治療B細胞淋巴瘤的方法，它包括施用權(quán)利要求1的組合物。
62.一種治療B細胞淋巴瘤的方法，它包括施用權(quán)利要求13的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及能調(diào)節(jié)TALL－1活性的治療劑。根據(jù)本發(fā)明，TALL－1的調(diào)節(jié)劑可以包括氨基酸序列Dz
文檔編號A61P17/02GK1535281SQ02814009
公開日2004年10月6日 申請日期2002年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月11日
發(fā)明者閔湖盛, 許海琳, 熊非 申請人:安姆根有限公司