肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及來(lái)自蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP)的肽。具體地，本發(fā)明涉及包含衍生自PLP 的一個(gè)親水區(qū)段的肽，其能夠與MHC分子體外結(jié)合并被呈遞給T細(xì)胞而無(wú)須抗原加工。本 申請(qǐng)還涉及該肽在治療和/或預(yù)防疾病中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 多發(fā)性硬化（MS)是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性退行性疾病，特征在于神經(jīng)軸突的 脫髓鞘。MS會(huì)造成眾多生理和精神癥狀，并且通常發(fā)展為生理缺陷和認(rèn)知功能障礙。疾病 通常在年輕人（20至40歲）中發(fā)病，在女性中更常見(jiàn)，并且在世界范圍內(nèi)影響超過(guò)一百萬(wàn) 人。
[0003] MS的病程各不相同，并且會(huì)潛伏或隨時(shí)間穩(wěn)步發(fā)展。已根據(jù)進(jìn)展模式描述了MS的 幾種亞型?；加蠱S的人會(huì)患有幾乎任何神經(jīng)癥狀或跡象，包括知覺(jué)變化，如喪失敏感度或 發(fā)麻、刺痛或麻痹（感覺(jué)遲鈍和感覺(jué)異常）、肌肉虛弱、陣攣、肌肉痙攣或移動(dòng)困難；協(xié)調(diào)和 平衡困難（共濟(jì)失調(diào)）；語(yǔ)言問(wèn)題（構(gòu)音障礙）或吞咽問(wèn)題（吞咽困難）、視覺(jué)問(wèn)題（眼球 震顫、視神經(jīng)炎（包括光幻視）或復(fù)視）、疲勞、急性或慢性疼痛以及膀胱和腸困難。
[0004] 目前MS被認(rèn)為是免疫介導(dǎo)性病癥，其中人體自身的免疫系統(tǒng)攻擊并損傷了髓鞘 質(zhì)。
[0005] 沒(méi)有已知的針對(duì)MS的治愈方法。已證明，幾種現(xiàn)有療法在疾病侵襲（復(fù)發(fā)）后的 功能恢復(fù)中、在預(yù)防或降低新的疾病侵襲（復(fù)發(fā)）的程度或頻率中、或者在預(yù)防或降低殘疾 程度中是有效的。然而，很多現(xiàn)有MS療法有副作用或耐受不良。因而需要對(duì)能有效治療MS 并有效緩解或減少M(fèi)S的癥狀的MS替代療法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明人已確定了一系列衍生自蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP)的肽，所述肽可以通過(guò)固定 的抗原呈遞細(xì)胞呈遞給T細(xì)胞。這些肽可有效預(yù)防和/或治療脫髓鞘疾病，如多發(fā)性硬化。
[0007] 因此，在第一方面，本發(fā)明提供了能夠與MHC分子體外結(jié)合并被呈遞給T細(xì)胞而無(wú) 需抗原加工的肽，且所述肽包含以下蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP)區(qū)段的全部或一部分：

[0028] 在第二方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽，其用于治療和/或預(yù)防 脫髓鞘疾病。
[0029] 在第三方面，本發(fā)明提供了包含一種或多種根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽的藥物組 合物。
[0030] 在第四方面，本發(fā)明提供了治療和/或預(yù)防有此需要的受試者中的脫髓鞘疾病的 方法，所述方法包含向所述受試者給藥根據(jù)本發(fā)明的第一方面所述的肽的步驟。
[0031] 在第五方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的第一方面的肽在制造用于預(yù)防和/或治療 脫髓鞘疾病的藥物中的用途。
[0032] 與本發(fā)明的第二、第四和第五方面有關(guān)，所述疾病可為多發(fā)性硬化。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1 _圖1 :三種PLP肽區(qū)段在體外和體內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)答，以及所述應(yīng)答與DR結(jié)合預(yù)測(cè) 相關(guān)。A，大體上代表計(jì)算機(jī)模擬的PLP肽與HLA-DRB1*1501的結(jié)合預(yù)測(cè)（IEDB和NetMHCII 法），以及這些肽在這些小鼠中誘導(dǎo)增殖應(yīng)答的能力。B和C代表這些長(zhǎng)肽中的4種誘導(dǎo) EAE的能力（2組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)）。
[0034]圖2-確定HEAL-26中的apitope。
[0035]圖3-確定TWTT-28中的apitope。
[0036]圖4-確定GVLP-28中的apitope。
[0037] 圖5 -誘導(dǎo)耐受性（tolerisation)方案。
[0038] 圖6-來(lái)自用HEAL-26或P0P-4預(yù)處理的小鼠的LNC的增殖和細(xì)胞因子生成。A， 代表來(lái)自用HEAL-26或P0P-4apitope預(yù)處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-標(biāo) 準(zhǔn)誤差（SM)。
[0039] 圖7-來(lái)自用HEAL-26或P0P-4預(yù)處理的小鼠的SPL的增殖和細(xì)胞因子生成。A，代 表來(lái)自用HEAL-26或P0P-4apitope預(yù)處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0040] 圖8 -來(lái)自用TWTT-28預(yù)處理的小鼠的LNC的增殖和細(xì)胞因子生成。A，代表來(lái)自 用TWTT-28apitope預(yù)處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0041] 圖9 -來(lái)自用TWTT-28預(yù)處理的小鼠的SPL的增殖和細(xì)胞因子生成。A，代表來(lái)自 用TWTT-28apitope預(yù)處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0042] 圖10_來(lái)自用POP-15預(yù)處理的小鼠的LNC的增殖和細(xì)胞因子生成。A，代表來(lái)自 用P0P-15apitope預(yù)處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0043] 圖11_來(lái)自用P0P-15預(yù)處理的小鼠的SPL的增殖和細(xì)胞因子生成。A，代表來(lái)自 用P0P-15apitope預(yù)處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0044] 圖12-來(lái)自用P0P-22預(yù)處理的小鼠的LNC的增殖和細(xì)胞因子生成。A，代表來(lái)自 用P0P-22apitope預(yù)處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0045] 圖13-來(lái)自用P0P-22預(yù)處理的小鼠的SPL的增殖。A，代表來(lái)自用P0P-22apitope 預(yù)處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0046] 圖14 -來(lái)自用P0P-22或GVLP-28預(yù)處理的小鼠的LNC的增殖和細(xì)胞因子生成。 A，代表來(lái)自用P0P-22(左圖）或GVLP-28(右圖）apitope預(yù)處理小鼠的LNC的胸腺嘧啶核 苷摻入的均值+/-SEM。
[0047] 圖15-用P0P-22或GVLP-28預(yù)處理的小鼠的SPL的增殖和細(xì)胞因子生成。A，代表 來(lái)自用P0P-22或GVLP-28apitope預(yù)處理小鼠的SPL的胸腺嘧啶核苷摻入的均值+/-SEM。
[0048] 對(duì)于圖6至15的每張圖，B，表示胸腺嘧啶核苷摻入的刺激指數(shù)。C，表示在培養(yǎng)物 上清液中分泌的細(xì)胞因子的量。在B和C中，每劑量的每個(gè)點(diǎn)表示單只小鼠，而帶橫杜的表 示中值。P是用Mann-Whitney檢驗(yàn)計(jì)算的。僅顯示了低p值。小于0. 05的p值被認(rèn)為是 顯著的。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 在第一方面，本發(fā)明涉及肽。
[0050]肽
[0051] 術(shù)語(yǔ)"肽"根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)含義是用來(lái)指一系列殘基（通常為L(zhǎng)-氨基酸），通常通過(guò) a_氨基和相鄰氨基酸的羧基之間的肽鍵彼此相連。該術(shù)語(yǔ)包括修飾的肽和合成的肽類似 物。
[0052] 本發(fā)明的肽的長(zhǎng)度為能夠與主要組織相容性復(fù)合體（MHC)I類或II類分子體外結(jié) 合并被呈遞給T細(xì)胞而無(wú)需抗原加工。換句話說(shuō)，該肽能夠直接與MHC分子的肽結(jié)合槽結(jié) 合而無(wú)需在一個(gè)端點(diǎn)或兩個(gè)端點(diǎn)進(jìn)行任何修剪。
[0053] 與MHCI類分子結(jié)合的肽通常為7至13個(gè)氨基酸、更通常地為8至10個(gè)氨基酸 的長(zhǎng)度。該肽的結(jié)合通過(guò)以下方式在其兩個(gè)端點(diǎn)得到穩(wěn)定，所述方式為肽的主鏈原子與所 有MHCI類分子的肽結(jié)合槽內(nèi)的非可變位點(diǎn)之間的接觸。在所述槽的兩個(gè)端點(diǎn)處都具有非 可變位點(diǎn)，其與肽的氨基和羧基末端結(jié)合。肽長(zhǎng)度的變化通過(guò)肽主鏈的卷曲來(lái)調(diào)節(jié)，通常在 允許所需柔性的脯氨酸或甘氨酸殘基處發(fā)生。
[0054] 與MHCII類分子結(jié)合的肽通常為8至20個(gè)氨基酸之間的長(zhǎng)度，更通常地為10至 17個(gè)氨基酸之間的長(zhǎng)度，并且可以更長(zhǎng)。這些肽以沿著兩端開(kāi)放的MHCII肽結(jié)合槽（與 MHCI類肽結(jié)合槽不同）伸展的構(gòu)象存在。主要通過(guò)主鏈原子與排列形成肽結(jié)合槽的保守 殘基接觸而使肽維持在合適的位置。
[0055] 本發(fā)明的肽可以通過(guò)化學(xué)方法制備（PeptideChemistry,Apractical Textbook.MikosBodansky,Springer-Verlag,Berlin.)。例如，可以通過(guò)固相技術(shù)合成 肽（RobergeJY等人（1995)Science269:202-204)，從樹(shù)脂上切除，并通過(guò)制備性高效液 相色譜純化（如Creighton(1983)ProteinsStructuresAndMolecularPrinciples,WH FreemanandCo,NewYorkNY)。例如，根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū)使用ABI431A肽合成儀 (PerkinElmer)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)合成。
[0056] 或者，可通過(guò)重組方式、或通過(guò)從更長(zhǎng)的多肽上切除來(lái)制備所述肽。例如，可以通 過(guò)從髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白上切除來(lái)獲得所述肽。肽的組成可通過(guò)氨基酸分析或測(cè)序來(lái)確定 (如Edman降解法）。
[0057] 髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP)
[0058] 髓鞘質(zhì)是非傳導(dǎo)性（電絕緣）材料，其形成層即髓鞘，該層通常僅環(huán)繞神經(jīng)元的 軸突。其對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮正常功能十分重要。組成髓鞘質(zhì)的一些蛋白為髓鞘堿性蛋白 (MBP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG)和蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP)。
[0059] 髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白（PLP)，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)髓鞘質(zhì)中最豐富的蛋白，是疏水 性完整膜蛋白。
[0060] 人類PLP序列如SEQIDNo. 16中所示。
[0061] SEQIDNo. 16
[0067] 本發(fā)明的肽可衍生自PLP序列的親水區(qū)段。所述肽可衍生自經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗 原天然加工而產(chǎn)生的抗原片段。
[0068] PLP的親水區(qū)段為：

[0099] 所述肽可包含來(lái)自這些肽中的一種的最小表位。
[0100] 具體地，所述肽可包含以下中的一種、由以下中的一種組成或包含以下中的一種 的最小表位：
[0105] 在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，T淋巴細(xì)胞能夠識(shí)別蛋白質(zhì)抗原的內(nèi)在表位?？乖蔬f細(xì) 胞（APC)吸收蛋白抗原并將它們降解成短的肽片段。肽可與細(xì)胞內(nèi)的主要組織相容性復(fù)合 體（MHC)I類或II類分子結(jié)合并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面。當(dāng)與MHC分子一起被呈遞至細(xì)胞表面 時(shí)，該肽可被T細(xì)胞識(shí)別（通過(guò)T細(xì)胞受體（TCR))，在這種情況下該肽為T(mén)細(xì)胞表位。
[0106]T細(xì)胞表位在對(duì)任何抗原（無(wú)論是自身的或外來(lái)的）的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演了 重要的角色。已通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)了T細(xì)胞表位在超敏性疾?。òㄟ^(guò)敏、自身免疫 性疾病和移植排斥）中扮演的重要角色。通過(guò)注射與佐劑組合的合成肽（基于T細(xì)胞表位 的結(jié)構(gòu)）可以誘導(dǎo)炎癥性或過(guò)敏性疾病。
[0107] 相比之下，已顯示可以通過(guò)給藥可溶形式的肽表位來(lái)誘導(dǎo)對(duì)特定肽表位 的免疫耐受。在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎（EAE--種多發(fā)性硬化（MS)的模型） (Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol.5:1159-1165;Liu和Wraith(1995)Int. Immunol. 7:1255-1263;Anderton和Wraith(1998)