梅咖斯托克斯氨基-三唑基-bodipy化合物及用于活神經(jīng)元染色和人血清白蛋白fa1藥物 ...的制作方法
【專利說明】梅咖斯托克斯氨基-三唑基-BODIPY化合物及用于活神經(jīng) 元染色和人血清白蛋白FA1藥物位點探測的應(yīng)用
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求于2012年12月26日提交的美國臨時申請No. 61/745,916的權(quán)益。
[0003] 上述申請的全部教導通過引用并入本文。
【背景技術(shù)】
[0004] 對了解化學和生物學中基本識別事件的需求已經(jīng)做出了相當大的努力來開發(fā)化 學探針。由于高靈敏度、快速響應(yīng)時間以及技術(shù)簡單，熒光探針是用于分析傳感和光學成像 兩者的有吸引力的和通用的工具。然而，調(diào)節(jié)熒光探針與其靶標之間相互作用的機制往往 知之甚少；因此，使用理論計算來預(yù)測結(jié)構(gòu)要求并設(shè)計新的探針的能力是有限的。最近，組 合的方法推進了熒光探針的生成和優(yōu)化，尤其是用于在分子識別水平上仍然不確定的復雜 科學問題。利用常規(guī)的合成方法由市售結(jié)構(gòu)單元得到已知熒光支架之組合策略的開發(fā)將使 得能夠獲取更廣范圍的熒光探針。
[0005] 基于BODIPY支架的熒光探針和分子成像探針的開發(fā)已被廣泛利用，原因是其 顯著的熒光特性（例如高的光穩(wěn)定性、消光系數(shù)和量子產(chǎn)率，可調(diào)的激發(fā)光譜和發(fā)射光 譜）（1-7)以及容易轉(zhuǎn)化成用于正電子發(fā)射斷層掃描（PositronEmissionTomography， PET)成像的探針（8,9)。大多數(shù)對4,4_二氟-4-硼雜3a，4a二氮雜-s-吲噠?。?， 4_difluor〇-4-bora_3a，4a-diaza-s_indacene，B0DIPY)支架進行衍生化的方法都涉及液 相化學，這通常需要繁瑣的純化步驟（10)。在固相上進行BODIPY衍生化的嘗試由于其在酸 性和堿性條件二者下的不穩(wěn)定性而受阻（11)。
[0006] 需要開發(fā)基于可用的熒光支架（例如基于BODIPY的支架）以迅速獲得新的化合 物文庫的方法。此外，在這些文庫中，需要開發(fā)對具有關(guān)鍵生物學功能的多種分析物具有選 擇性和特異性的探針。
[0007]發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明是基于對用于檢測人血清白蛋白的生物分析物的選擇性熒光探針的發(fā)現(xiàn) 以及對使活神經(jīng)元可視化具有選擇性的熒光探針的相關(guān)發(fā)現(xiàn)。因此，在一個實施方案中，本 發(fā)明是一類新的氨基-三唑基BODIPY化合物。本發(fā)明的化合物可通過高通量合成的方法 迅速地合成并且包含3個可衍生的部分。本發(fā)明還涉及氨基-三唑基BODIPY化合物的合 成方法。具體而言，描述了固相合成法和溶液相合成法兩者。在另一個實施方案中，本發(fā)明 是用于人血清白蛋白的熒光探針。在又一個實施方案中，本發(fā)明是用于原代神經(jīng)元的選擇 性染色的熒光染料。本發(fā)明還涉及用于檢測生物流體樣品中人血清白蛋白的方法。在一些 實施方案中，熒光強度的測量值與人血清白蛋白的濃度成比例。本文中還描述了用于使活 神經(jīng)元可視化的方法，其可用于體外或體內(nèi)應(yīng)用。
[0009]附圖簡述
[0010] 通過下面如附圖中舉例說明的對本發(fā)明之示例性實施方案的更具體的描述，上述 內(nèi)容將變得明顯。
[0011] 圖1示出了基于BODIPY的BDC和MK文庫設(shè)計，并且還指出了結(jié)構(gòu)和光譜性質(zhì)之 間的關(guān)系。
[0012] 圖2示出了代表性的氨基-三唑基-BODIPY的歸一化吸光度和熒光發(fā)射光譜。 BDC-8(藍色）：吸收Amax=473nm，發(fā)射Amax= 585nm;MK101-8(綠色）：吸收Amax=474nm， 發(fā)射Xmax= 563nm;MKHA374-48(黃色）：吸收X_= 468nm，X_= 557nm。還包括報道 的BODIPY的相應(yīng)光譜（BD-27 ;紅色）以用于比較：吸收Anax= 551nm，發(fā)射A_=568nm〇 還描述了BDC-8、MK101-8、MKHA374-48 和BD-27 的結(jié)構(gòu)。
[0013] 圖3示出了在室溫（rt)下溶劑黏度對BDC-9 (IOOyM)的熒光強度的影響。在更 黏稠的醇類中，當在正辛醇和正己醇中時BDC-9的強度系統(tǒng)地增強。
[0014] 圖4示出了BDC-9 (10yM)對IOmM的HEPES緩沖液（pH7. 4)中的16種不同濃度 (0.13、0.25、0.50、1.00mg/mL)的蛋白質(zhì)的熒光響應(yīng)（F);(人exc.:460nm，人eni.:575nm)。F0 為在HEPES緩沖液中BDC-9的熒光強度。數(shù)值表示為平均值（n= 4)。
[0015] 圖5示出了在用磷酸鹽緩沖液中的HSA的系列稀釋液（I. 2X10 4至4mg/mL)孵育 后的BDC-9(10yM)的熒光光譜，Aex。:460nm。數(shù)值表示為平均值（n= 3)。
[0016] 圖6示出了BDC-9 (10yM)在用HSA的系列稀釋液孵育后的熒光發(fā)射響應(yīng)；Aexc : 460nm，Aen :575nm;數(shù)值表示為平均值且誤差條為標準差（n= 3) ;L0D= 0. 3yg/mL;線性 范圍=0? 37 至 31yg/mL，R2= 0? 999。
[0017] 圖7a和7b示出了BDC-9的物種選擇性。具體而言，圖7a示出了BDC-9 (IOyM)在 與各自的白蛋白的系列稀釋液（1. 2X10 4至4mg/mL)相互作用后的熒光發(fā)射響應(yīng)；AM。： 460nm，Aen :575nm;數(shù)值表示為平均值且誤差條為標準差（n= 3)。圖7b是BDC-9 (10yM) 與各自的白蛋白混合后的拍攝圖像。用手持式UV燈在365nm處進行輻照。
[0018] 圖8示出了與位點選擇性HSA結(jié)合藥物的競爭。用磷酸鹽緩沖液中不同濃度 的藥物（高達200yM)將HSA(無脂肪酸）（0.34mg/mL，5yM)預(yù)孵育2小時，之后添加 BDC-9(10yM)。F是在所指定的藥物濃度下的熒光強度，F(xiàn)。是未添加藥物的熒光強度； 入exc.:460nm，Aen :575nm;數(shù)值表示為平均值且誤差條為標準差（n= 3) 〇
[0019] 圖9示出了工作作圖分析（jobplotanalysis)。具體而言，在磷酸鹽緩沖液中將 BDC-9與HSA(無脂肪酸）以不同的比例混合，同時保持總濃度在20yM;Aexc :460nm，人eni.: 575nm;數(shù)值表示為平均值且誤差條為標準差（n= 3)。
[0020] 圖10是顯示在用磷酸鹽緩沖液中的HSA(IOyM)孵育后BDC-9的系列稀釋液 (0_、0.47_至60_)的熒光發(fā)射的熒光光譜；人_:46011111，1 111:57511111;數(shù)值表示為 平均值且誤差條為標準差（n= 3) ;KD= 12. 7±0. 4yM(-個位點特異性結(jié)合模型）。
[0021] 圖11示出了尿樣中BDC-9的熒光響應(yīng)。將HSA(0至lmg/mL)添加至磷酸鹽緩沖液 (pH= 7. 3)中的來自健康個體的10%尿液中。在10yM濃度時添加BDC-9 ;Xexc :460nm， 入eni.:575nm;數(shù)值表示為平均值且誤差條為標準差（n= 3);線性回歸：R2= 0. 998。
[0022] 圖 12a示出了MKCA101-3(左），MKHA101-3(中）和MKAA101-3(右）染色的混合 原代神經(jīng)細胞群的流式細胞術(shù)圖，示出了基于化合物熒光從主群體中分離出神經(jīng)元群（約 2G多至約3. 5G)。在各光譜中約0至約IG示出了未染色的對照。
[0023] 圖12b是來自已分化的神經(jīng)球的神經(jīng)元的圖像。MKHA101-3相對于MKCA101-3顯 示出顯著提高的特異性。
[0024] 圖13示出了MKHA101-3及其衍生物的化學結(jié)構(gòu)。
[0025] 圖14示出了MKHA374-48親和類似物的化學結(jié)構(gòu)。
[0026] 圖15示出了用于識別神經(jīng)元特異性探針MKHA101-3的原代神經(jīng)元篩選的示意圖。 左邊的圖像顯示明亮染色的神經(jīng)元，與它們的其他的膠質(zhì)細胞對照物截然相反。
[0027] 圖 16a示出了MKHA101_3(左）和MKHA374_48/Neu0(右）的結(jié)構(gòu)。
[0028] 圖16b是MKHAlO1-3 (左）和NeuO(右）染色的混合活神經(jīng)元細胞群的流式細胞 圖，示出了基于化合物熒光從主群體中分離出的神經(jīng)元群。
[0029] 圖17示出了在放大100倍，比例尺為20ym時，MKHA101-3染色的神經(jīng)元的活細胞 共聚焦圖像以及混合的原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物的活細胞化合物染色和免疫染色。用500nM 的MKHA101-3 (綠色）對細胞進行染色并在放大10倍時進行成像，之后用4%PFA固定。然 后，用〇? 1 %的Triton-X進行透化處理并用GFAP(紅色）和神經(jīng)元（綠色）進行免疫染色。
[0030] 圖18示出了活細胞化合物染色和混合的原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)物的免疫染色。用 500nM的NeuO(綠色）對細胞進行染色并在放大10倍時進行成像，之后用4%PFA固定。然 后，用0.1 %的Triton-X進行透化處理并用(6-111微管蛋白（Tuji，黃色），GFAP(紅色） 和04進行免疫染色。
[0031] 圖19a示出了來自用500nM的NeuO染色的來自新生和成年小鼠腦之混合原代神 經(jīng)細胞的流式細胞術(shù)散點圖。
[0032] 圖19b是示出了從分選自新生和成年腦的整體（未分選的）、明亮級分和暗淡級分 之細胞所測量的(6-111微管蛋白的基因表達的柱狀圖。
[0033] 圖19c示出了用500nM的MKHA101-3染色的混合原代神經(jīng)元細胞的流式細胞術(shù)散 點圖。右邊的直方圖示出了化合物陽性的細胞占整個細胞群體的20%。
[0034] 圖20a示出了從化合物陽性級分再培養(yǎng)的具有神經(jīng)元形態(tài)的活細胞。
[0035] 圖20b和20c示出了認為對P-III微管蛋白（綠色），核染色（藍色）為陽性的 免疫染色細胞；比例尺：50ym。
[0036] 圖21是顯示經(jīng)MKHA101-3染色的混合原代神經(jīng)細胞的整體（未分選的）、明亮級 分和暗淡級分的P-III微管蛋白的表達的柱狀圖。明亮級分與整體和暗淡級分相比，明顯 地顯示出了 (6-111微管蛋白的更高表達。
[0037] 圖22是顯示神經(jīng)元生存力的柱狀圖。通過優(yōu)先黏附到聚D-賴氨酸涂層上來分離 來自P1-3小鼠幼仔的原代神經(jīng)元。將它們熟化5天，之后以規(guī)定的濃度添加化合物，經(jīng)歷 24個小時。根據(jù)制造商的說明使用MTS測定（Promega)來評估生存力。
[0038] 圖23,在上部圖形中，示出了用500nM的NeuO染色以及使用時間推移成像進行成 像以使神經(jīng)元樹突的形成可視化的DIVl神經(jīng)元培養(yǎng)物的視頻照片。圖23的下部圖形示出 了來自神經(jīng)前體細胞的神經(jīng)元發(fā)育/分化的時間推移成像?？梢钥闯雒髁恋腘euO染色的 神經(jīng)元從球體的內(nèi)部迀移出來。
[0039] 圖24描述了設(shè)計用于共價地結(jié)合神經(jīng)元靶標以及親和富集的親和分子。
[0040] 圖25描述了使用AffiNeu07和AffiNeu05系列進行親和富集的代表性方案。
[0041] 圖26描述了NeuO-PET，其可在一些實施方案中用于PET成像。
[0042] 圖27描述了用于活神經(jīng)元的NeuR和NeuIR紅色熒光探針。
[0043] 圖28示出了用MKHA101-3染色的胚胎腦切片和在放大10倍時的成像。捕捉的圖 像顯示了染料特別地加亮了具有長樹枝狀突起的細胞，使人聯(lián)想起神經(jīng)元染色。
[0044] 發(fā)明詳述
[0045] 本發(fā)明的示例性實施方案描述如下。
[0046] 公開了 一類新的三唑衍生的4,4-二氟-4-硼雜-3a，4a_二氮雜-S-吲噠省 (BODIPY)化合物。這類化合物包括兩種新的熒光探針，包括首次獨立地與脂肪酸位點1結(jié) 合的人血清白蛋白（HSA)探針，并且還包括特異性地且獨特地對原代神經(jīng)元進行染色的神 經(jīng)元細胞探針。
[0047] 文庫設(shè)計-梅咖斯托克斯（MegaStokes)氨基-三唑基-BODIPY化合物
[0048] 最近報道了采用Knoevenagel反應(yīng)和保持熒光團完整性的溫和的酸性裂解條 件的第一種固相BODIPY文庫（12)。本發(fā)明涉及采用銅-催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng) (Copper-CatalyzedAzide-AlkyneCycloaddition，CuAAC)來制備氨基-三唑基-BODIPY 化合物（BDC和MK)以及它們相應(yīng)的乙?；ˋC)、氯乙?；–A)和羥乙?；℉A)衍生物的 第一文庫（13)的替代的固相組合衍生策略。值得注意的是，在BODIPY核心的位置3和位置 5處引入與氨基取代基配對的三唑部分導致了熒光化合物非常大的斯托克斯位移（74nm至 160nm)。最小化其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的重疊的梅咖斯托克斯染料提供了超過其他熒 光團的增強的靈敏度和作為用于體外應(yīng)用的傳感器的特殊潛力。盡管其他熒光結(jié)構(gòu)（例如 香豆素，苯乙烯基）已被修飾以增強其斯托克斯位移，本文中所公開的BDC和MK文庫的化 合物代表了首次系統(tǒng)地產(chǎn)生的基于BODIPY支架的梅咖斯托克斯染料。此外，這些氨基-三 唑基-BODIPY化合物顯示出對環(huán)境變化的敏感性。本文中鑒定的是表現(xiàn)為環(huán)境敏感性熒光 開啟型傳感器的化合物。這樣的BODIPY核心結(jié)構(gòu)的固有熒光在特定的環(huán)境中被回收。
[0049] 設(shè)計，合成和光物理學性質(zhì)
[0050] 由于CuAAC的高效率、穩(wěn)健性以及其在溫和反應(yīng)條件中的成功，其對于組合的目 的而言是非常有利的（13,14)。所得的三唑環(huán)是化學上穩(wěn)定的且在熒光核心內(nèi)的某些位置 上，可調(diào)節(jié)所得到的熒光衍生物的光譜波長（15，16)。文獻調(diào)查顯示，在BODIPY支架位置3 和位置5處引入供電子基和吸電子基可有效地改變其斯托克斯位移（17-19)?；谶@些報 告，設(shè)計三官能的BODIPY苯胺（4,方案1)來用于BODIPY文庫的合成。該支架具有3個用 于多樣化的點，位置3和位置5處的兩個親電子位點，其可被例如分別通過CuAAC和親核取 代修飾（20-24)，和在內(nèi)消旋位置的一個苯胺位點，其可被乙酰化修飾。
[0051] 開發(fā)了兩種用于合成氨基-三唑基BODIPY化合物的方法，S卩，固相法和溶液相法。 溶液相法允許較大規(guī)模的生產(chǎn)BODIPY化合物，而固相法提供了大的化合物文庫的實際路 線。這兩種方法都詳述如下。
[0052] 固相合成
[0053] 固相法允許小規(guī)模地迅速合成較大的氨基-三唑基BODIPY化合物的文庫。4上的 苯胺官能團能夠?qū)⒅Ъ茇撦d到氯代三苯甲基氯聚苯乙烯（CTC-PS)樹脂上。隨后在弱酸性 的條件下的切割保持了熒光團的完整性（方案1) (12)。在某些實施方案中，可使用其他的 氯化的或溴化的固體支持物支架。
[0054] 在一個示例性實施方案中，4的合成由四個步驟組成，具有37%的總產(chǎn)率。按照報 道的方法很容易地由對硝基苯甲醛和吡咯制備1 (25, 26)。用N-氯代琥珀酰亞胺（NCS)進 行氯化，隨后用2, 3-二氯-5,6-二氛基-1，4-苯醌（DDQ)進行氧化從而提供2,隨后用BF3. OEtJ# 2進行處理以得到高度穩(wěn)定的BODIPY類似物3 (26, 27)。用活性鐵進行還原提供了 定量產(chǎn)率的4。然后用標準的偶聯(lián)條件將苯胺負載到CTC-PS樹脂上。用疊氮化鈉處理產(chǎn)生 了雙取代的疊氮化物中間體，在所述中間體上，首先通過胺結(jié)構(gòu)單元的單取代（方案3)以 及隨后通過炔結(jié)構(gòu)單元的CuAAC(方案4)引入多樣性。最后用CH2Cl2中的0. 5%三氟乙酸 (TFA)切割產(chǎn)生BDC和MK文庫的相應(yīng)氨基三唑基BODIPY化合物，在最少的純化步驟中具 有95%的平均純度。這些化合物具有游離的苯胺，其可進一步經(jīng)酰基氯結(jié)構(gòu)單元乙?；?添加官能性，生成相應(yīng)的乙?；ˋC)、氯乙?；–A)、乙酰氧基乙酰氯（AA)和羥基乙酰基 (HA)衍生物（方案5)。在某些實施方案中，CA標簽對于蛋白標記是有用的，而與一些MK化 合物偶聯(lián)的HA標簽具有對原代神經(jīng)元的特定熒光響應(yīng)。在某些實施方案中，AA標簽以及 其他類似的衍生物可以是有用的對完整活細胞具有改進滲透性的疏水性HA前體。隨后通 過細胞酯酶的水解釋放活性HA化合物。
[0055] 方案1.氨基-三唑基BODIPY化合物的固相合成
[0056]
[0057]試劑和條件：（a)吡咯，TFA，室溫，3小時；(b)NCS，干燥的THF，-78 °C至室溫， 3小時；（c)DDQ，干燥的CH2Cl2,室溫，1小時；（d)BF3OEt2,干燥的CH2Cl2,室溫，2小時；（e) 活性Fe，CH3OH:CH3COOH(K) : 1)，回流，15 分鐘；（f)CTC-PS樹脂，DIEA，CH2C12/DMF， 室溫，24小時；（g)NaN3,DMF，室溫，30分鐘；(h)DMF:哌啶（4 : 1)，室溫，45分鐘；⑴ DMF:R2R3NH(4 : 1)，室溫，1 小時；（j)R1-C三CH，CuI，抗壞血酸，室溫，30 分鐘；（k)CH2Cl2 中 0. 5 % 的TFA; (I)R4COCl，飽和NaHCO3,室溫，10 分鐘；(m)CH3C00CH2C0C1，飽和NaHCO3，室 溫，10分鐘；(n)K2CO3,MeOH，H2O,室溫，1小時?；衔?中的暗色球體代表氯代三苯甲基聚 苯乙烯樹脂。
[0058] 溶液相合成
[0059] 在一些作為替代的實施方案中，將產(chǎn)生BDC和MK化合物的溶液相法用于染料的大 規(guī)模合成（方案2)。在一個示例性實施方案中，如在固相法中所描述的來合成化合物1、2 和3。隨后將氨基和三唑基官能團添加到3上。首先用二甲基甲酰胺（DMF)溶劑中約2. 2 當量的疊氮化鈉處理化合物3以產(chǎn)生雙取代的疊氮化物中間體。緊接其后是用1當量未經(jīng) 純化的相應(yīng)的胺結(jié)構(gòu)單元進行親核取代（方案3)。反應(yīng)完成后，除去DMF，并且將粗制混合 物重新溶解于叔丁醇溶劑中，之后用合適的炔結(jié)構(gòu)單元進行CuAAC(方案4)。最后用活性鐵 對硝基苯部分進行還原，得到相應(yīng)的BDC和MK化合物，任選地使用在固相合成中描述的步 驟對其進一步乙?；援a(chǎn)生相應(yīng)的乙酰基（AC)、氯乙酰基（CA)、乙酰氧基乙酰氯（AA)和羥 乙酰基（HA)衍生物（方案5)。
[0060] 方案2.氨基-三唑基BODIPY化合物的溶液相合成。
[0061]
[0062] 試劑和條件：（a)吡咯，TFA，室溫，3小時；(b)NCS，干燥的THF，-78 °C至室溫， 3小時；（c)DDQ，干燥的CH2Cl2,室溫，1小時；（d)BF3OEt