專利名稱：肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲狀旁腺激素(PTH)和甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)化合物，它們的制備方法，含有它們的藥物制劑以及將其作為藥物的應(yīng)用。
具體而言，本發(fā)明提供了在PTH/PTHrP受體處具有有效的拮抗活性的PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)一步取代，這些化合物均為本發(fā)明化合物。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中提供了PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第10位上的氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)一步取代。
術(shù)語“PTHrP”指任一天然存在形式的PTHrP，例如人、牛、雞、鼠或小鼠PTHrP。為保持一致性并遵照常規(guī)方式，下述說明書中，對(duì)PTHrP序列中的氨基酸殘基使用同一編號(hào)體系，而不考慮本發(fā)明PTHrP序列中任一α-氨基酸殘基是否被取代或缺失。
術(shù)語“PTH”指任一天然存在形式的PTH，例如人、牛、雞、鼠或小鼠PTH。為保持一致性并遵照常規(guī)方式，下述說明書中，對(duì)PTH序列中的氨基酸殘基使用同一編號(hào)體系，而不考慮本發(fā)明PTH序列中的任一α-氨基酸殘基是否被取代或缺失。
“PTHrP化合物”或“PTH化合物”分別指包含基于PTHrP或PTHN-末端片段的氨基酸序列的肽，優(yōu)選所基于的PTHrP或PTH片段始于第1-7位的任一殘基，終止于第27-38位的任一殘基，例如其為包含達(dá)31、34、35、36、37或38位氨基酸殘基的PTHrP或PTHN-末端片段。由此認(rèn)為術(shù)語“PTHrP或PTH”包括這樣的肽，其中所述N-末端片段的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失，優(yōu)選在N末端缺失。根據(jù)本發(fā)明，我們認(rèn)為這些術(shù)語還包括這樣的肽，其中除了第2位和/或第10位上的取代以及任意地在第3和/或第6位上的取代外，天然存在序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被一個(gè)或多個(gè)其它氨基酸殘基(天然或非天然的)取代。人PTHrP1-38、1-34和1-31N-末端片段序列分別示于SEQ IDNo1、2或3。
人PTH1-38、1-34和1-31N-末端片段序列分別示于SEQID No4、5或6。
PTHrP或PTH化合物的N-末端可以是游離的或被保護(hù)的氨基，例如具有《有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)》，T.W.Greene，J.Wiley&Sons，NY(1981)，219-287中公開的N-保護(hù)基，該文在這里引為參考文獻(xiàn)，優(yōu)選以R″-CO-、R″-O-CO、R″-O-CH2-CO-或R″-SO2保護(hù)，或N-末端帶有如下定義的R″、R-NH-CO-或R-NH-CS-的氨基。
本發(fā)明化合物C-末端可以是COOH、CONH2或單一取代或雙取代的酰胺，如-CONRcRd，其中Rc和Rd之一為H，另一個(gè)為脂族殘基，如C1-6烷基，或兩者均為脂族殘基，或Rc和Rd與其相連的氮原子一起形成雜環(huán)基，如吡咯烷基或哌啶基。
根據(jù)本發(fā)明，PTHrP或PTH化合物在PTH/PTHrP受體處具有有效的拮抗活性，如與PTH/PTHrP受體結(jié)合，其在功能生物測(cè)定中具有的使PTH/PTHrP受體活化的固有活性(i.a)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，如i.a最大為0.3，在功能生物測(cè)定中拮抗PTHrP或PTH或其片斷如PTHrP(1-34)或PTH(1-34)，具有pA2值至少為6.5。本發(fā)明優(yōu)選化合物i.a為0.03或更低甚至在某些測(cè)定中不可測(cè)出。功能生物測(cè)定的例子是現(xiàn)有技術(shù)常用的基于骨肉瘤的腺苷酸環(huán)化酶測(cè)定。這一分析結(jié)果提供了體外測(cè)定的范圍，根據(jù)下文所述的Marcus和Aurbach在內(nèi)分泌學(xué)，85，801-810(1969)中公開的方法，該范圍內(nèi)的被測(cè)化合物在UMR細(xì)胞系如UMR-106-06的鼠骨肉瘤細(xì)胞中能刺激腺苷酸環(huán)化酶活性或拮抗PTHrP、PTH或其片段的作用。
氨基酸指天然存在的或可購買的或非天然的氨基酸或者其光學(xué)異構(gòu)體。非天然氨基酸是指未在mRNA指導(dǎo)下插入蛋白質(zhì)的氨基酸，如β-Nal，氟代-α-氨基酸如氟丙氨酸，環(huán)己基丙氨酸或三甲硅烷基丙氨酸。
“天然氨基酸”指本領(lǐng)域熟知的那些氨基酸。U.S.P.T.O出版的1990年5月15日公開的商標(biāo)公報(bào)第33頁46行列出這些氨基酸及其標(biāo)準(zhǔn)縮寫。此處將這些氨基酸和縮寫符號(hào)具體列出。
天然氨基酸如下所示A Ala 丙氨酸D Asp 天冬氨酸E Glu 谷氨酸F Phe 苯丙氨酸G Gly 甘氨酸H His 組氨酸I Ile 異亮氨酸K Lys 賴氨酸L Leu 亮氨酸M Met 蛋氨酸N Asn 天冬酰胺Q Gln 谷氨酰胺R Arg 精氨酸S Ser 絲氨酸T Thr 蘇氨酸V Val 纈氨酸W Trp 色氨酸Y Tyr 酪氨酸側(cè)鏈帶有芳基或雜芳基的氨基酸殘基是指氨基酸殘基側(cè)鏈為任意進(jìn)行環(huán)取代的苯基甲基、1-或2-萘基甲基、1-或2-萘基乙基、3-或4-吡啶基甲基、3-吲哚基甲基或3-吲唑基甲基；優(yōu)選定義如下的式-NH-CHR′-CO-的氨基酸殘基。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案提供了式I所示的化合物R-[(X2)p′(X3)q′(X6)s′R10]-D-(y-x)RaI其中x是選自31、34、35、36、37或38的殘基編號(hào)，y是選自1、2、3、4、5、6或7的殘基編號(hào)，X2為Val或獨(dú)立地具有X10的含義之一，X3是Ser或獨(dú)立地具有X10的含義之一，X6是Gln或獨(dú)立地具有X10含義之一，
R10是Asp或X10，X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′為式(a)、(b)、(c)或(d)基團(tuán)
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，環(huán)A被一個(gè)或多個(gè)選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代，其中兩個(gè)烷基或兩個(gè)烷氧基取代基也可一起形成一個(gè)與環(huán)A稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)，每個(gè)環(huán)B和C可獨(dú)立地被取代，與上述環(huán)A所示的取代情況相同，Ya是一個(gè)鍵、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基，D是由PTHrP或PTHN-末端片段衍生的氨基酸序列，每個(gè)p、q和s為1，條件是當(dāng)y＞2時(shí)，p是0，當(dāng)y＞3時(shí)，q是0，且當(dāng)y＞6時(shí)，s是0，R是H、R″-CO-、R″-O-CO-、R″-O-CH2-CO-、R″-SO2-、R、R-NH-CO-、R-NH-CS-或NH2-C1 -6亞烷基-CO-，其中R″是C1-8烷基；ω-羧基-C1-6烷基；ω-[(C1-4烷氧基)羰基]C1 -6烷基；C2-8鏈烯基；C5-7環(huán)烷基；C5-7環(huán)烷基C1-4烷基；或苯基、苯基C1-4烷基、1-萘基、2-萘基、1-萘基C1-2烷基或2-萘基C1-2烷基，每個(gè)基團(tuán)中的環(huán)被一個(gè)或多個(gè)選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代；雜芳基；
R獨(dú)立地具有所給出的R″含義之一，但除去ω-羧基C1-6烷基和ω-[(C1-4烷氧基)羰基]C1-6烷基的含義；和Ra是OH或NH2，條件為X2和R10中至少一個(gè)具有X10的含義。
當(dāng)環(huán)A、B或C的取代基一起形成環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，它可以是如-O-CH2-CH2-O-。多環(huán)環(huán)烷基的例子是如金剛烷基。
作為R″的雜芳基為5、6或7元不飽和雜環(huán)基，環(huán)中含有至少一個(gè)氮原子，并可任意地再含如N、O或S雜原子，且任意地與苯環(huán)稠合。優(yōu)選的雜芳基為吲哚基、喹啉基或異喹啉基。
本發(fā)明化合物可以例如游離形式、鹽或其配合物形式存在，如可與有機(jī)酸、聚合酸和無機(jī)酸形成酸加成鹽。這種酸加成鹽形式包括鹽酸鹽和乙酸鹽。例如通過加入無機(jī)物如Ca和Zn鹽這種無機(jī)鹽或氫氧化物，和/或加入聚合有機(jī)物，由本發(fā)明PTHrP或PTH化合物形成配合物。
式I化合物中，優(yōu)選使用下列含義，無論是單獨(dú)使用或任意結(jié)合或再結(jié)合使用1.D是hPTHrP的N-末端片段。
2.D是hPTH的N-末端片段。
3.X10是Trp。
4.X10是-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團(tuán)，優(yōu)選(a)或(c)，更優(yōu)選(a)。
5.X2是Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團(tuán)。
6.每個(gè)X2和X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團(tuán)。
7.每個(gè)X3和X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團(tuán)。
8.每個(gè)X6和X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團(tuán)。
9.每個(gè)X2、X6和X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基團(tuán)。
10.n是1。
11.y是選自3、4、5、6或7的殘基編號(hào)，優(yōu)選為3或5。
12.x選自31或34的殘基編號(hào)。
13.R是R″CO-、R″-SO2、R或H2N-C1-6亞烷基-CO-。
14.R″是C1-8烷基、苯基C1-4烷基、1-或2-萘基、1-或2-萘基C1-2烷基。
15.R是ω-羧基C1-6烷基。
正如已經(jīng)述及的，除第2和/或10位之外的位置上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以進(jìn)一步被上述的天然或非天然氨基酸殘基取代，或者這些位置上的氨基酸缺失。當(dāng)本發(fā)明化合物為hPTHrP衍生物時(shí)，它們可能包含其它的氨基酸取代，比如第3位為Ala，第4位為Trp，第5位為任意地環(huán)被取代的Phe，第11和/或13位為L(zhǎng)eu，或第34位為D-Ala，還可在N-末端缺失1-7個(gè)氨基酸殘基而成為任意被截短的氨基酸序列。當(dāng)本發(fā)明化合物是hPTH衍生物時(shí)，例如在選自8、16、18、33和34的至少一個(gè)位置上氨基酸殘基如Leu8、Ala16、Gln18、Thr33、Ala34或其D-型異構(gòu)體可進(jìn)一步被取代。
本發(fā)明還提供了用于制備PTHrP或PTH化合物的方法?？芍鸩竭M(jìn)行液相合成或固相合成，或使用基因工程手段或?qū)⑦@些方法結(jié)合使用，來制備這些化合物。
例如，可按下述方法制備本發(fā)明化合物a)將存在于本發(fā)明PTHrP或PTH化合物上的至少一個(gè)保護(hù)基除去，例如呈被保護(hù)形式的式I化合物；或b)通過酰胺鍵將兩個(gè)肽片段連接起來，這兩個(gè)肽片段可以是被保護(hù)的、部分被保護(hù)的或未被保護(hù)的形式，由此獲得式I所需的PTHrP或PTH化合物氨基酸序列的肽片段，然后可任意地進(jìn)行該方法的步驟a)，或者c)在所需序列的N-末端殘基或其N-末端片段的氨基上用選擇法以被保護(hù)的形式或未被保護(hù)的形式加入保護(hù)基或取代基，然后任意進(jìn)行步驟a)，并回收由此得到的呈游離形式、鹽形式或配合物形式的PTHrP或PTH化合物。
可使用與已知方法相似的方法進(jìn)行步驟a)、b)和c)，如本領(lǐng)域所知的肽化學(xué)方法或下面實(shí)施例中所述的方法。在這些反應(yīng)中，當(dāng)需要時(shí)，適用于肽的保護(hù)基可用來保護(hù)不參加反應(yīng)的官能團(tuán)。術(shù)語保護(hù)基還包括具有官能團(tuán)的聚合物樹脂。
當(dāng)本發(fā)明化合物中包含非天然或天然殘基時(shí)，可將化學(xué)逐步合成法與基因工程方法相結(jié)合來制備這些化合物；可使用重組技術(shù)制備由可基因編碼的氨基酸殘基組成的肽序列(無論是全序列或片段)，并且可使用化學(xué)合成法來引入所需非天然氨基酸或末端氨基取代基，當(dāng)需要時(shí)，可將這些片段連結(jié)并除去存在的保護(hù)基。
下述實(shí)施例中，溫度均以℃表示。采用下面的縮寫符號(hào)DMF＝二甲基甲酰胺，DMA＝N，N-二甲基乙酰胺-6-磺?；琍mc＝2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃，tBu＝叔丁基，PyBOP＝苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸鹽，Nal(2)＝L-3-(2-萘基)丙氨酸，DIEA＝N，N-二異丙基-N-乙胺，F(xiàn)moc＝9-芴甲氧基羰基，RT＝室溫，MS＝電噴射譜測(cè)定的M+。實(shí)施例1[Trp4，10]hPTHrP(1-34)OH在基于樹脂支持物的聚苯乙烯上，逐步合成此肽，通過Fmoc保護(hù)α-氨基，側(cè)鏈官能團(tuán)保護(hù)情況如下Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Arg(Pmc)、Ser(tBu)、Trp(Boc)和Thr(tBu)。
約0.5mmol/g的Fmoc-Ala-氧甲基-4-苯氧甲基-共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)用作肽逐步固相合成中的起始原料，固相肽合成包括反復(fù)進(jìn)行α-氨基脫保護(hù)、洗滌、偶聯(lián)(即將下一個(gè)氨基酸殘基接到生長(zhǎng)的肽鏈上)和洗滌。使用在DMA中的20％哌啶，將N-αFmoc基團(tuán)切下。偶聯(lián)反應(yīng)中每個(gè)氨基使用4當(dāng)量的Fmoc-氨基酸和PyBOP-試劑以及DMA中的8當(dāng)量的DIEA。肽鏈的組合完成后，按前述相同方法使用DMA中的哌啶除去末端Fmoc-保護(hù)基。在RT下使用TFA中由5％十二烷基甲基硫和5％水組成的試劑將肽從樹脂支持物上切下，并同時(shí)除去所有側(cè)鏈保護(hù)基，反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)。濾去樹脂顆粒，用一些TFA洗滌，向合并的濾液中加入10至20體積的乙醚，使產(chǎn)物沉淀，并用乙醚洗滌，并干燥。將產(chǎn)物在C-18大孔硅膠柱上使用2％磷酸水溶液的乙腈梯度洗脫進(jìn)行色譜提純。收集含純化合物的級(jí)分，通過離子交換樹脂(Biorad，AG4-X4乙酸鹽形式)過濾，冷凍干燥得標(biāo)題化合物。MS4146用與實(shí)施例1相似的方法，使用適當(dāng)?shù)陌被峥芍苽湎铝谢衔飳?shí)施例2[Trp10，Leu11，Leu13]hPTHrP(1-34)OH MS4059實(shí)施例3[Trp10，Leu11]hPTHrP(1-34)OH MS4073實(shí)施例4[Trp3，10]hPTHrP(1-34)OH MS4188實(shí)施例5[Trp2，10]hPTHrP(1-34)OH MS4176實(shí)施例6[Trp10]hPTHrP(2-34)OH MS4018.3實(shí)施例7[Trp10]hPTHrP(3-34)OH MS3919.2實(shí)施例8[Trp2]hPTHrP(1-34)OH MS4104.9實(shí)施例9[Trp10]hPTH(1-34)OH MS4189實(shí)施例10[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4036實(shí)施例11[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(2-34)OHMS3949實(shí)施例12[Leu8，Trp10，DLeu11，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4079實(shí)施例13[Phe2，Trp10]hPTHrP(1-34)-OHMS4137.1實(shí)施例14[Trp2，Trp10]hPTHrP(2-34)-OHMS4105.1實(shí)施例15[Trp6，Trp10]hPTHrP(1-34)-OHMS4146.8實(shí)施例16[Trp6，Trp10]hPTHrP(6-34)-OHMS3623.3實(shí)施例17[Trp10]hPTHrP(7-34)-OH MS3437.6實(shí)施例18[Trp3，Trp10]hPTHrP(3-34)-OHMS4018.0實(shí)施例19[Trp10]hPTHrP(1-34)OHMS4088.7實(shí)施例20[Trp6，Trp10]hPTHrP(3-34)NH2MS3976.8實(shí)施例21[Phe6，Trp10]hPTHrP(1-34)OH MS3546.1實(shí)施例22[Phe2，Phe6，Trp10]hPTHrP(1-34)OH MS4155.1實(shí)施例23N-3-氨基丙?；?[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS3932.0實(shí)施例24Nα-芐氧羰基[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)-NH2
用與實(shí)施例1相似的方法制備這些肽，但所用的起始原料是約0.4mmol/g的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基-甲基)-苯氧基共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)，其可根據(jù)如Tetrah.Letters，283787-3790(1987)中所述的方法來制備。在合成后期，將Z-Ser-OH加到肽鏈上，按實(shí)施例1的方法將肽切下并提純。MS3975.3實(shí)施例25Nα-乙?；?[Trp10]hPTHrP(3-34)OH用與實(shí)施例1相似的方法合成該肽，在Fmoc-脫保護(hù)后期結(jié)束時(shí)，使用1∶1的乙酸酐和DMF的混合物進(jìn)行乙?；?。根據(jù)前述方法將肽從樹脂上切下并提純。MS3961.1用與實(shí)施例1、24或25相似的方法制備下列化合物。實(shí)施例26Nα-乙酰基-[Trp10]hPTHrP(2-34)OHMS4060.4實(shí)施例271-異己酰-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)OHMS4091實(shí)施例28Nα-2-萘基乙?；?[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4097.1實(shí)施例29Nα-2-萘基乙?；?[Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS4009.7實(shí)施例30Nα-2-萘基磺?；?[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4119.2實(shí)施例31Nα-2-萘氧基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4111.5實(shí)施例32Nα-2-萘乙?；?[Ala3，Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4080.8實(shí)施例33Nα-芐氧羰基-[Trp2，Nal(2)10]hPTHrP(2-34)NH2MS4248.3實(shí)施例343-萘-2-基丙?；?[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4110.8實(shí)施例353-萘-2-基丙?；?[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4110.9實(shí)施例36Nα-2-萘基乙?；?[Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(3-34)NH2MS4095.9實(shí)施例37Nα-2-萘基乙?；?[Nal(2)10]hPTHrP(3-31)NH2MS3788.0實(shí)施例38Nα-3-萘-2-基丙?；?-[Nal(2)10]hPTHrP(7-34)NH2MS3630.0實(shí)施例E39Nα-乙酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(6-34)NH2MS3637.0實(shí)施例40Nα-乙?；?[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS3903.1實(shí)施例411-(1-氨基-1-環(huán)戊基羰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4104例如，根據(jù)G.Valle等人在Can.J.Chem.662575-2582(1988)中所述的方法可制備在制備肽樹脂中間體中所用的Fmoc-1-氨基環(huán)戊烷-1-羧酸。實(shí)施例E421-金剛烷基羰基-[Leue，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4155實(shí)施例43 1-(3-吲哚基羰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4150實(shí)施例44 1-(3-喹啉基羰基)-，[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4104實(shí)施例451-(2-萘酰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)OHMS4147實(shí)施例46Nα-(2-萘基)甲基-[Trp10]hPTHrP(2-34)-OH使用S-O.Lawesson等人在Tetrahedron 373635(1981)中所述的Lawesson試劑處理N-萘?；?2)纈氨酸甲酯，并采用F.S.Guziec等人在Tetrah.Letters 23-26(1990)中所述用于內(nèi)硫肽(endothiopeptides)的方法來還原得到的N-硫萘?；?2)纈氨酸甲酯。使用LiOH使該甲酯水解，得到N-α-(萘基(2)甲基)纈氨酸鹽酸鹽，呈結(jié)晶固體，mp＝205-210°(dec.)。使用PyBOP試劑將其與預(yù)先制備出的被保護(hù)的[Trp10]hPTHrP-(3-34)-O-肽樹脂偶聯(lián)，該肽樹脂的N-αFmoc基已被除去。按實(shí)施例1的方法將肽從樹脂上切下并提純。MS4158.2實(shí)施例47Nα-2-萘-2-基乙基-[Trp10]hPTHrP(2-34)OHMS4171.9實(shí)施例48Nα-2-萘-2-基乙基-[Ala3，Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4066.7實(shí)施例49Nα-琥珀?；?[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2用與實(shí)施例1相似的方法制備該肽，但使用0.63g4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)(裝載量約0.4mmol/g)作為起始原料，其可按Tetrah.Letters，283787-3790(1987)中所述的方法制備。偶聯(lián)最后一個(gè)氨基酸Fmoc-His(Trt)OH后，根據(jù)常規(guī)方法選擇性除去Fmoc-基，并將肽樹脂與DMF中的琥珀酐(0.5g)和DIPEA(0.86ml)反應(yīng)。按實(shí)施例1的方法以乙酸酯形式從樹脂上切下肽、提純并凍干，得到標(biāo)題化合物。MS3832.0根據(jù)實(shí)施例49的方法，可制備下列化合物實(shí)施例50Nα-琥珀?；?[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-31)NH2MS3522.1實(shí)施例51Nα-琥珀?；?[Nal(2)6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3881.7實(shí)施例52Nα-戊二?；?[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3845.6實(shí)施例53Nα-琥珀?；?[Phe6，Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(5-34)NH2MS3832.0實(shí)施例54Nα-琥珀?；?[4-Cl-Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3866.5實(shí)施例55Nα-琥珀?；?[4-Cl-Phe5，4-Cl-Phe6，Nal(2)10]-hPTHrP(5-34)NH2MS3910.2正如動(dòng)物試驗(yàn)所表明的，呈游離形式或可藥用鹽形式及配合物形式的本發(fā)明化合物顯示出有價(jià)值的藥理活性，由此其可用于治療疾病。
根據(jù)Marcus和Aurbach在內(nèi)分泌學(xué)，85，801-810(1969)中所述方法，體外評(píng)估本發(fā)明化合物的生物活性，通過測(cè)試它們?cè)赨MR106-06鼠骨肉瘤細(xì)胞中刺激(促效作用)或抑制(拮抗作用)刺激PTH的環(huán)AMP合成的能力。在12孔板上在DMEM-HAM′s F12培養(yǎng)基(1∶1)-10％FCS中，鼠骨肉瘤UMR106細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合。然后將該培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至含有2％FCS的培養(yǎng)基中，并向每孔加入1-5μCi[3H]-腺嘌呤。兩小時(shí)后，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，并將細(xì)胞在DMEM-0.1％BSA中溫育，其中含1mm3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，以排除磷酸二酯酶的作用。20分鐘后，單獨(dú)加入測(cè)試物質(zhì)或與PTH一起加入(拮抗作用實(shí)驗(yàn))。15分鐘后，除去培養(yǎng)基，終止反應(yīng)，加入0.5ml冰冷的5％三氯乙酸萃取cAMP。加入載體溶液(0.5ml/孔)，其含有0.2mm的未標(biāo)記腺嘌呤、腺苷、AMP、ADP、ATP和cAMP以及用于測(cè)定回收率的0.4μCi[14C]-腺苷。使用系列Dowex AG 50W-X4(200-400目)和氧化鋁色譜來分離[3H]-cAMP，并根據(jù)Salomon Y.在Advances in Cyclic NucleotideResearch，Vol.10，Raven Press，35-55，1979中所述方法計(jì)數(shù)。計(jì)算結(jié)果，以對(duì)照溶劑的％表示，由DRC曲線測(cè)定EC50值。根據(jù)PTHrP或PTH的DRC曲線的右移值計(jì)算拮抗效力并以pA2值表示。本發(fā)明化合物在濃度為10-9至10-5M時(shí)具有拮抗活性。實(shí)施例36、37和49的化合物在UMR 106-06細(xì)胞中的pA2值分別為10.3、9.7和9.3。
本發(fā)明化合物對(duì)PTH受體還具有結(jié)合親和性，舉例如下使用乳過氧化物酶法(Anawa Lab.AG，Wangen)來碘化雞[Tyr36]PTHrP(1-36)酰胺，特異活性為2200Ci/mmol。用200μlDMEM和含1％BSA的HAM′sF12(1∶1)洗滌單層負(fù)鼠腎細(xì)胞(OK1)，并在1μM[Tyr36]chPTHrP(1-36)酰胺存在或不存在時(shí)，與每孔50.000cpm[125I-Tyr36]chPTHrP(1-36)酰胺一起在16℃下溫育。溫育后，用0.5ml培養(yǎng)基(4℃)洗滌細(xì)胞，用0.5ml1NNaOH溶解并測(cè)定放射性。特異性結(jié)合為全部結(jié)合量減去非特異結(jié)合量。使用SCTFIT一種非線性回歸計(jì)算機(jī)程序(Feyen等人，1992，生物化學(xué)和生物物理研究通訊1878-13)分析競(jìng)爭(zhēng)曲線，數(shù)據(jù)以平均pKD值(n＝2至3)表示。實(shí)施例36、37和49的化合物的pKD值分別為8.3、7.9和8.4。
此外，正如由甲狀腺甲狀旁腺切除的鼠所測(cè)定的，靜脈注射本發(fā)明化合物后，其具有拮抗PTH的效果。甲狀腺甲狀旁腺切除后24小時(shí)，用PTH(1-34)注射被麻醉的鼠，通過離體的頸靜脈測(cè)試該化合物。由腹側(cè)插入套管，從尿膀胱中收集尿。使用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定尿中磷酸鹽和cAMP含量及血清中鈣和磷酸鹽含量。這些參數(shù)用于定量體內(nèi)抗PTH效果的拮抗物的效力。在此試驗(yàn)中，當(dāng)通過靜脈注射以1μg/kg/h至1mg/kg/h劑量施用本發(fā)明化合物時(shí)，其拮抗PTH效果。當(dāng)靜脈注射190g/kg/h實(shí)施例49的化合物，且PTH(1-34)靜脈注射量為4μg/kg/h時(shí)，其能完全抑制PTH誘導(dǎo)的磷酸鹽尿達(dá)90分鐘。
因此，本發(fā)明化合物能用來預(yù)防或治療下述的所有疾病與由PTH或PTHrP過量釋放引起的血鈣增多相關(guān)的疾病，如甲狀旁腺機(jī)能亢進(jìn)、血鈣過多，與惡性腫瘤相關(guān)的疾病，如乳-腺癌，肺、食管、頭、頸部的鱗狀細(xì)胞癌，以及轉(zhuǎn)移至骨或未轉(zhuǎn)移至骨的血癌。此外，本發(fā)明化合物還可用于預(yù)防或治療PTHrP促發(fā)的腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤穿透以及向骨內(nèi)生長(zhǎng)，用于治療皮膚病，如組織修復(fù)治療，如治療燒傷、潰瘍、創(chuàng)傷以及促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)。
對(duì)于這些適應(yīng)癥，當(dāng)然將使用不同的合適劑量，例如其依賴于所治療的對(duì)象、給藥方式以及疾病的嚴(yán)重程度。但通常來說，對(duì)于動(dòng)物日劑量約為0.1至約100mg/kg動(dòng)物體重會(huì)得到滿意的結(jié)果。對(duì)于較大的哺乳動(dòng)物，例如人，日劑量范圍約為0.1至500mg本發(fā)明化合物。
本發(fā)明化合物可以游離形式或可藥用鹽形式或配合物形式給藥?？墒褂贸Ｒ?guī)方法制備這類鹽及配合物，并且其具有與游離化合物同樣級(jí)別的活性。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包括呈游離堿形式的或可藥用鹽形式的或配合物形式的本發(fā)明化合物以及藥用稀釋劑或載體。該組合物可按常規(guī)方式配制。適宜的單位劑量形式包含約0.025至250mg的本發(fā)明化合物及其藥用稀釋劑或載體。
本發(fā)明化合物可按任一常規(guī)途徑給藥，例如可以注射溶液形式或懸浮液形式，或以鼻內(nèi)或栓劑形式非腸道給藥。另外的方法是，本發(fā)明化合物還可以膏體、膠狀物等形式局部給藥，例如如前所述的用于治療皮膚病或使毛發(fā)生長(zhǎng)。
根據(jù)前述內(nèi)容，本發(fā)明還提供了a)用作藥物的本發(fā)明化合物或其藥用鹽或配合物；b)對(duì)需要治療的受治療者預(yù)防或治療上述疾病的方法，該方法包括對(duì)所述受治療者施用有效量的本發(fā)明化合物或其藥用鹽或配合物；c)本發(fā)明化合物或其藥用鹽或配合物，它被用于制備上述方法b)中應(yīng)用的藥物組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，本發(fā)明化合物可用作其它治療中的助劑或佐劑，例如用于使用骨吸收抑制劑治療血鈣過多，特別是使用降鈣素或其類似物或衍生物，如鮭、鰻或人降鈣素，膦酸氫鹽，利尿劑或?qū)⑵浣Y(jié)合使用，或用于使用細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑或其任一組合的腫瘤治療中。
根據(jù)前述內(nèi)容，本發(fā)明還包括下述方面d)預(yù)防或治療血鈣過多的方法，例如針對(duì)需要這種治療的受治療者預(yù)防或治療前述的特定的疾病，該方法包括對(duì)所述受治療者施用有效量的a)本發(fā)明化合物及b)另一種藥物，所述的另一種藥物為上述的治療劑。
實(shí)施例36、37和49的化合物為優(yōu)選化合物，用于治療或預(yù)防與由PTH或PTHrP過量釋放引起的血鈣增高有關(guān)的所有疾病。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名SANDOZ LTD.
(B)街道Lichtstrasse35，(C)城市BASLE(E)國(guó)家SWITZERLAND(F)郵政編碼(ZIP)CH-4002(A)姓名SANDOZ PATENT GMBH(B)街道Humboldtstrasse 3(C)城市LOERRACH(E)國(guó)家GERMANY(F)郵政編碼(ZIP)D-79539(A)姓名SANDOZ ERFINDUNGENVERWALTUNGSGESELLSCHAFT M.B.H.
(B)街道Brunner Strasse 59(C)城市VIENNA(E)國(guó)家AUSTRIA(F)郵政編碼(ZIP)A-1230(ii)發(fā)明名稱肽(iii)序列數(shù)6(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala Glu Ile Arg Ala35(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列特征SEQ ID NO2Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala(2)SEQ ID NO3信息(I)序列特征
(A)長(zhǎng)度31氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln15 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile20 25 30(2)SEQ ID NO 4信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO 4Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Mer His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 16Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe Val Ala Leu Gly35(2)SEQ ID NO5信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度34氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述 SEQ ID NO 5Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe(2)SEQ ID NO6信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度31氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類型蛋白質(zhì)(iii)假擬結(jié)構(gòu)無(iii)反義無(v)片段類型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO6Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val20 25 30
權(quán)利要求
1.一種PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)一步取代，該化合物呈游離形式或鹽形式或配合物形式。
2.一種PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第10位上的氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)一步取代，該化合物呈游離形式或鹽形式或配合物形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的氨基酸殘基是其側(cè)鏈任意進(jìn)行環(huán)取代的3或4-吡啶基甲基、3-吲哚基甲基或3-吲唑基甲基或式(a)、(b)、(c)或(d)基團(tuán)
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，環(huán)A被一個(gè)或多個(gè)選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代，由此兩個(gè)烷基或兩個(gè)烷氧基取代基也可一起形成與環(huán)A稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)，每個(gè)環(huán)B和環(huán)C可獨(dú)立地被取代，與上述環(huán)A的取代情況相同，并且Ya為直連鍵、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其為式I化合物R-[(X2)p，(X3)q，(X6)s，R10]-D-(y-x)RaI其中x是選自31、34、35、36、37或38的殘基編號(hào)，y是選自1、2、3、4、5、6或7的殘基編號(hào)，X2是Val或獨(dú)立地為X10含義之一，X3是Ser或獨(dú)立地為X10含義之一，X6是Gln或獨(dú)立地為X10含義之一，R10是Asp或X10，X10為Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)、(c)或(d)基團(tuán)
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，環(huán)A被一個(gè)或多個(gè)選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基取代基任意取代，由此兩個(gè)烷基或兩個(gè)烷氧基取代基也可一起形成與環(huán)A稠合的環(huán)結(jié)構(gòu)，每個(gè)環(huán)B和C可獨(dú)立地被取代，與上述環(huán)A的取代情況相同，Ya是直連鍵、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基，D是由PTHrP或PTH的N-末端片段衍生的氨基酸序列，每個(gè)p、q和s為1，條件是當(dāng)y＞2時(shí)，p為0，當(dāng)y＞3時(shí)，q是0，且當(dāng)y＞6時(shí)，s是0，R是H、R″-CO-、R″-O-CO-、R″-O-CH2-CO-、R″-SO2-、R、R-NH-CO-、R-NH-CS或NH2-C1- 6亞烷基-CO-，其中R″是C1-8烷基；ω-羧基C1-6烷基；ω-[(C1 -4烷氧基)羰基]C1-6烷基；C2-8鏈烯基；C5-7環(huán)烷基；C5-7環(huán)烷基C1 -4烷基；或苯基、苯基C1-4烷基、1-萘基、2-萘基、1-萘基C1- 2烷基或2-萘基C1-2烷基，其中每個(gè)基團(tuán)的環(huán)被一個(gè)或多個(gè)選自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意進(jìn)行環(huán)取代；雜芳基；R獨(dú)立地具有R″的含義之一，但除去ω-羧基C1-6烷基和ω-[(C1 -4烷氧基)羰基]C1-6烷基的含義；和Ra是OH或NH2，條件是X2和R10中的至少一個(gè)具有X10的含義。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4的化合物，其衍生自hPTH或hPTHrP的N-末端片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其選自Nα-2-萘基乙?；?[Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(3-34)NH2Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-31)NH2Nα-琥珀?；?[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2。
7.用于制備權(quán)利要求1的化合物的方法，所述化合物呈游離形式或鹽形式或配合物形式，該方法包括a)將存在于本發(fā)明PTHrP或PTH化合物如呈保護(hù)形式的式I化合物上的至少一個(gè)保護(hù)基脫除；或b)將呈保護(hù)形式、部分保護(hù)形式或末保護(hù)形式的兩個(gè)肽片段以酰胺鍵連接起來，由此獲得的肽片段具有所需PTHrP或PTH化合物如式I化合物的氨基酸序列，然后任意地進(jìn)行該方法的步驟a)，或者c)在呈保護(hù)形式或未保護(hù)形式的所需序列的N-末端殘基或其N-末端片段的氨基上用選擇法加入保護(hù)基或取代基，然后任意進(jìn)行步驟a)，并回收由此得到的呈游離形式、鹽形式或配合物形式的PTHrP或PTH化合物。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1的用作藥物的呈游離形式或藥用鹽形式的化合物。
9.一種藥物組合物，其包括權(quán)利要求1的呈游離形式或藥用鹽形式的化合物以及藥用稀釋劑或載體。
10.呈游離形式或藥用鹽形式的用作藥物的權(quán)利要求1的化合物，其進(jìn)一步與選自骨再吸收抑制劑和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑的治療劑結(jié)合。
11.一種對(duì)需要治療的受治療者預(yù)防或治療與由PTH或PTHrP過量釋放引起的血鈣增多有關(guān)的疾病、預(yù)防或治療由PTHrP促發(fā)的腫瘤生長(zhǎng)、治療皮膚病和促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)的方法，該方法包括對(duì)所述受治療者施用有效量的呈游離形式或藥用鹽形式的權(quán)利要求1的化合物。
全文摘要
在PTH/PTHrP受體處具有有效拮抗活性的PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一個(gè)氨基酸殘基被色氨酸或被在其側(cè)鏈上帶有芳基或雜芳基的另一個(gè)氨基酸殘基進(jìn)一步取代，其具有藥物活性，例如預(yù)防或治療與由PTH或PTHrP過量釋放引起的血鈣增多有關(guān)的疾病。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1154116SQ95194365
公開日1997年7月9日 申請(qǐng)日期1995年7月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月27日
發(fā)明者F·卡丁諾斯, J·H·M·費(fèi)恩, R·甘澤, F·O·岡伯特 申請(qǐng)人:山道士有限公司