專利名稱：低分子量透明質(zhì)酸與多肽毒素的免疫原性偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸/多肽偶聯(lián)物分子，及包含它們的藥物組合物。本發(fā)明特別涉及透明質(zhì)酸，和更為優(yōu)選的低分子量透明質(zhì)酸(LMW-HA)，以及激發(fā)針對(duì)透明質(zhì)酸的抗體的LMW-HA/多肽偶聯(lián)物分子，該抗體具有與A族和C族鏈球菌的交叉反應(yīng)性。本發(fā)明的分子和包含它們的藥物組合物在治療與預(yù)防因A族和C族鏈球菌引起的感染方面，以及診斷因A族和C族鏈球菌引起的疾病方面是有用的。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(HA)是一種天然存在的糖胺聚糖，由N-乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸的重復(fù)單位組成。見

圖1。HA存在于動(dòng)物組織，如脊髓液、眼液、滑液、皮膚中，也存在于一些鏈球菌，如A族和C族鏈球菌的莢膜中。A族鏈球菌的這種具粘液或高度被有莢膜的菌株與罕有的嚴(yán)重感染和急性風(fēng)濕熱有關(guān)(Johnson et al.，1992，J.Infect.Dis.166374-382)。由A族和C族鏈球菌引起的人類侵襲性軟組織感染伴隨顯著的發(fā)病率和死亡率。C族鏈球菌也與咽炎和反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎有關(guān)。此外，C族鏈球菌感染在馬群中普遍流行。
A族和C族鏈球菌的粘液狀菌落形態(tài)是由透明質(zhì)酸組成的莢膜多糖大量產(chǎn)生的結(jié)果。最近有結(jié)果表明A族鏈球菌的透明質(zhì)酸莢膜在這些生物的致病性方面表現(xiàn)出許多重要的作用。在其它情況中，HA莢膜保護(hù)粘液狀A(yù)族鏈球菌不被吞噬，并且在致病力方面起重要作用(Wessels el al.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888317-21；Dale et al.1996，Infect.Immunol.641495-501；and Moses et al.1997 Infect.Immumol.65；64-71)。另外，HA莢膜調(diào)節(jié)M蛋白質(zhì)介導(dǎo)的附著，并在A族鏈球菌對(duì)人類角質(zhì)形成細(xì)胞上CD44的粘附中充當(dāng)配體。A族鏈球菌的HA莢膜既是被高度保守的，又是表面暴露的，這表明在其它菌株細(xì)菌對(duì)咽部黏膜和皮膚的粘附中，HA可充當(dāng)通用粘附位點(diǎn)(Schrager et al 1998，J.Clin.Invest.1011708-16)。
由于一旦建立就既難以治療，又難以根治的抗性菌株的發(fā)展，使得對(duì)革蘭氏陽性病原體，如鏈球菌感染的預(yù)防和治療是尤其重要的。盡管多糖抗原、或免疫學(xué)無活性碳水化合物半抗原與胸腺依賴性(TD)抗原，如蛋白質(zhì)的結(jié)合可增強(qiáng)它們的免疫原性，不過還不清楚這種免疫原性應(yīng)答，如果是由HA激發(fā)，是否可以提供保護(hù)以防御含HA的細(xì)菌，如A族或C族鏈球菌。此外，在哺乳動(dòng)物組織和鏈球菌中均存在HA的事實(shí)，使得以HA為碳水化合物抗原治療或預(yù)防鏈球菌感染的進(jìn)展復(fù)雜化，因?yàn)橛锌赡芤疳槍?duì)宿主組織的自身免疫應(yīng)答。
直至最近，HA仍被認(rèn)為是一種非免疫原性分子(Meyer，1936，J.Biol Chem.114689 and Humphreys，1943，Biochem J.37460)。不過，更新的研究表明一些物種中天然存在HA的抗體(Underhill，1982，Biophys.Res.Commun.1081488)。Fillit等人采用與脂質(zhì)體結(jié)合的HA在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出HA抗體。他們報(bào)導(dǎo)HA是免疫原性的，并且確定了分子的兩個(gè)抗原決定簇。Fillit等人也指出HA在脂質(zhì)體上的呈遞模式對(duì)其免疫原性而言是重要的。最后，F(xiàn)illit等人報(bào)導(dǎo)HA抗體與硫酸乙酰肝素具有交叉反應(yīng)，并且這種交叉反應(yīng)可以參與自身免疫血管疾病的發(fā)病機(jī)理(Fillit et al.，1988，J.Exp.Med.168971-982)?；谏衔目偨Y(jié)的報(bào)導(dǎo)，仍然不可預(yù)測HA或HA偶聯(lián)物是否能激發(fā)對(duì)抑制或治療含HA的細(xì)菌，如A族或C族鏈球菌引起的感染有用的免疫應(yīng)答。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含HA和與多肽或蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)的LMW-HA的免疫原性組合物。本發(fā)明的偶聯(lián)物(conjugate)分子對(duì)于激發(fā)抗體是有用的，該抗體與含HA的細(xì)菌，如A族和C族鏈球菌具有交叉反應(yīng)性。在治療與診斷由這種細(xì)菌，包括A族和C族鏈球菌引起的感染和疾病的方法中，本發(fā)明的偶聯(lián)物分子及包含它們的藥物組合物是有用的。
申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物中LMW-HA偶聯(lián)物是具有免疫原性的。還要令人驚奇地是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)發(fā)明的偶聯(lián)物激發(fā)的抗體與A族和C族鏈球菌發(fā)生交叉反應(yīng)，卻和與哺乳動(dòng)物組織相關(guān)的天然HA僅發(fā)生最低的交叉反應(yīng)。
將LMW-HA偶聯(lián)于多肽的方法包括還原胺化作用、溴化氰處理、在載體上的自由氨基與LMW-HA上羧化物部分之間形成酰胺鍵、或利用接頭分子。發(fā)明提供了包含LMW-HA偶聯(lián)物分子的藥物組合物，以及在治療和診斷因含HA細(xì)菌，如A族和C族鏈球菌引起的感染方面，這些組合物作為疫苗激發(fā)抗體的用途。任何將碳水化合物T細(xì)胞非依賴性應(yīng)答轉(zhuǎn)化為T細(xì)胞依賴性應(yīng)答的多肽都適于被用作載體。毒素或類毒素的實(shí)例如破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳毒素或類毒素、奈瑟球菌膜孔蛋白，如淋球菌的PorA、腦膜炎球菌的PorB。
本發(fā)明也提供了來源自免疫原性LMW-HA-多肽偶聯(lián)物的藥物組合物、疫苗和其它免疫學(xué)試劑。
發(fā)明進(jìn)一步地涉及針對(duì)細(xì)菌感染而免疫哺乳動(dòng)物的方法。該方法包括將有效量的發(fā)明藥物組合物給予哺乳動(dòng)物，以阻止來自引起疾病生物體的感染。該方法在預(yù)防或治療因含HA的細(xì)菌，如A族和C族鏈球菌引起的感染方面是有用的。
發(fā)明也提供了一種利用發(fā)明的LMW-HA-多肽偶聯(lián)物在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類體內(nèi)激發(fā)抗體的方法。發(fā)明也提供了在應(yīng)答于采用發(fā)明的多糖-多肽偶聯(lián)物免疫哺乳動(dòng)物的過程中激發(fā)的免疫球蛋白組合物和分離的抗體。作為治療劑和診斷試劑，這種免疫球蛋白和分離的抗體是有用的。
制得的免疫球蛋白和抗體對(duì)LMW-HA是特異的。本發(fā)明的偶聯(lián)物分子在根據(jù)眾所周知的方法產(chǎn)生單克隆抗體和抗獨(dú)特型抗體方面也是有用的。
附圖簡述圖1透明質(zhì)酸(HA)的結(jié)構(gòu)。
圖2通過超聲和/或酸處理產(chǎn)生抗原性低分子量LMW-HA。
圖3鏈球菌HA保護(hù)性表位的結(jié)構(gòu)；a)超聲處理HA的四糖；b)透明質(zhì)酸酶作用后產(chǎn)生的四糖。
圖4兔抗血清對(duì)超聲處理的HA-TT偶聯(lián)物的ELISA滴度。
圖5兔抗血清對(duì)酸水解的LMW-HA/TT偶聯(lián)物的ELISA滴度圖6兔抗血清對(duì)超聲處理的LMW-HA/TT偶聯(lián)物的滴度測定圖7兔抗血清對(duì)酸水解的LMW-HA/TT偶聯(lián)物的滴度測定圖8在LMW-HA/HAS包被的板上，用酸水解的HA、超聲處理的HA、超聲處理的HA偶聯(lián)物對(duì)兔抗血清#75295的抑制圖9在LMW-HA/HAS包被的板上，用超聲處理的HA、天然HA、D-葡糖醛酸、HA二糖和HA四糖對(duì)兔抗血清#75295的抑制圖10在LMW-HA/HAS包被的板上，用超聲處理的HA、天然HA、D-葡糖醛酸、HA二糖和HA四糖對(duì)兔抗血清#72700的抑制圖11在LMW-HA/HAS包被的板上，用超聲處理的HA、天然HA、HA二糖、HA四糖、和HA六/八糖對(duì)兔抗血清#72700的抑制圖12BALB/c小鼠抗血清對(duì)LMW-HA/rPorB偶聯(lián)物的ELISA滴度圖13CD1小鼠抗血清對(duì)LMW-HA/rPorB偶聯(lián)物的ELISA滴度圖14采用兔抗血清被動(dòng)免疫Balb/c小鼠；采用6型GAS(4,400cfu/mL)侵襲。分別地，針對(duì)PBS/CFA的兔抗血清；○針對(duì)超聲處理的LMW-HA/TT的兔抗血清；●針對(duì)超聲處理的LMW-HA/TT的兔抗血清；針對(duì)超聲處理的LMW-HA/TT的兔抗血清。
圖15采用兔抗血清被動(dòng)免疫Balb/c小鼠；采用GAS type3(2.5×105cfu/mL)侵襲。分別地，針對(duì)PBS/CFA的兔抗血清；○針對(duì)超聲處理的LMW-HA/TT的兔抗血清；●針對(duì)酸水解的LMW-HA/TT的兔抗血清；針對(duì)超聲處理的LMW-HA/TT的兔抗血清。
發(fā)明詳述透明質(zhì)酸被用作免疫原以引起保護(hù)性和/或治療性應(yīng)答。HA尤其可用于產(chǎn)生與表面具有HA的細(xì)菌，如A族和C族鏈球菌交叉反應(yīng)的免疫應(yīng)答。不為理論所限制的情況下，與A族和C族鏈球菌交叉反應(yīng)的表位被認(rèn)為是約3或4個(gè)殘基的長度，并且位于非還原末端。非還原末端葡糖醛酸殘基是飽和或不飽和似乎并沒有什么明顯的差異，因?yàn)槎N表位均是保護(hù)性的。另外，在血液和其它體液中，末端葡糖醛酸似乎被轉(zhuǎn)化為不飽和葡糖醛酸。HA可以以葡糖胺基殘基或葡糖醛酸基殘基終止，當(dāng)位于HA的非還原末端的葡糖醛酸或不飽和葡糖醛酸的比例增至超過N-乙酰葡糖胺的比例時(shí)，免疫應(yīng)答便被增強(qiáng)了。
盡管可采用天然HA制備本發(fā)明的偶聯(lián)物，優(yōu)選地是采用大小為約3或4個(gè)糖到約2000個(gè)糖，或從約600道爾頓到約400Kd的LMW-HA制備偶聯(lián)物。更為優(yōu)選的LMW-HA，是大小從約4個(gè)糖或2個(gè)重復(fù)單位到約100個(gè)重復(fù)單位，或者約800道爾頓到約40Kd。LMW-HA的最為優(yōu)選的大小是約4個(gè)重復(fù)單位到約10或約20個(gè)重復(fù)單位，或者約800道爾頓到約4或8Kd。通過包括超聲處理(Kubo K；et al.GlycoconjJ.，1993，10(6)435)或通過化學(xué)方法(Blatter G，Carbohydr.Res.1996，288109-125 and Halkes K.M.Carbohydr.Res.1998，309161-164)和/或酶方法(De Luca et al.J.Am.Chem.Soc.19951175869-5870)的多種方法，可從典型地具有400Kd到幾百萬道爾頓分子量的天然HA(可獲得自Sigma或根據(jù)U.S Patent No.4,141,973純化而得)中獲得LMW-HA。
發(fā)明也提供了在非還原末端含有葡糖醛酸殘基的LMW-HA分子。一種獲得葡糖醛酸末端HA片段的方法是根據(jù)Kubo K；et al.GlycoconjJ.，1993，10(6)435的方法采用超聲處理天然HA。通過下述處理可增加具有葡糖醛酸末端的分子比例，即采用外-β-N-乙?；被咸擒彰笇?duì)超聲產(chǎn)物進(jìn)行處理，以除去任何非還原末端N-乙酰基葡糖胺基殘基，并提供在分子的非還原末端含有較高比例的葡糖醛酸基殘基的LMW-HA。一種獲得LMW-HA的可選方法包括在溫和酸性條件下處理天然HA，以生成在其非還原末端含有N-乙?；咸前坊推咸侨┧峄幕旌衔锏姆肿印２捎猛?β-N-乙?；被咸擒彰缚蓪⑺峤饩跮MW-HA的末端非還原葡糖胺基去除，從而提供在分子的非還原末端含有葡糖醛酸基殘基的LMW-HA。見圖2。發(fā)明也提供了在非還原末端含有4，5-不飽和葡糖醛酸基殘基的LMW-HA分子。見圖3。一種獲得以4，5-不飽和葡糖醛酸基為末端的HA片段的方法是采用透明質(zhì)酸酶對(duì)天然HA進(jìn)行處理。
用于本發(fā)明的LMW-HA由片段組成，其中至少約90％的LMW-HA片段在其非還原末端含有葡糖醛酸或不飽和葡糖醛酸。優(yōu)選的，用于本發(fā)明至少約95％的LMW-HA片段在其非還原末端含有葡糖醛酸或不飽和葡糖醛酸。
當(dāng)采用超聲處理時(shí)，天然HA可溶解在合適的溶劑中，如磷酸鹽緩沖鹽水，并且超聲處理該溶液直至獲得預(yù)期解聚量為止。見，例如Kubo et al.Glycoconj.J.，1993，10435。經(jīng)過這種處理獲得的LMW-HA優(yōu)選的具有約為10-20Kd的分子量，并且在其非還原末端主要含有葡糖醛酸基殘基，即超過95％。
此外，在溫和酸性條件下對(duì)HA進(jìn)行處理，可獲得在其非還原末端含有N-乙?；咸前坊鶜埢推咸侨┧峄鶜埢幕旌衔锏腖MW-HA片段。通過該方法獲得的LMW-HA片段中約有50％在其非還原末端含有葡糖醛酸。繼酸處理之后，采用外-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶(可獲得自Sigma)可將末端非還原葡糖胺基選擇性地從片段中去除，從而暴露出位于分子末端的葡糖醛酸基殘基。通過改變反應(yīng)條件，可以控制含末端非還原葡糖胺基的片段的比例。例如，通過在不同的完成點(diǎn)采用加熱或pH方法破壞酶以終止反應(yīng)，從而獲得預(yù)期比例的在其非還原末端含有葡糖醛酸的片段。
此外，通過本領(lǐng)域已知的方法可化學(xué)合成在還原末端含有N-乙?；?β-D-葡糖胺或β-D-葡糖醛酸的LMW-HA。見Blatter G，Carbohydr.Res.1996，288109-125和Halkes K.M.Carbohydr.Res.1998，309161-164。例如，從相應(yīng)的單糖可首先制備被合適地保護(hù)的葡糖胺-葡糖醛酸二糖。通過本領(lǐng)域已知的方法，如以α-三氯乙酰胺基吡喃葡糖為糖基供體的方法可將單糖偶聯(lián)。獲得的二糖可接著與其自身重復(fù)偶聯(lián)，從而形成不同大小的LMW-HA。例如，位于二糖的葡糖醛酸部分的端基異構(gòu)保護(hù)基團(tuán)可以被選擇性地去除。該位點(diǎn)優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是4-甲氧苯基。就還原末端二糖，即第一個(gè)糖基受體而言，端基異構(gòu)位點(diǎn)可被轉(zhuǎn)化為甲氧基部分，例如，經(jīng)硝酸高鈰銨處理，首先將4-甲氧苯基轉(zhuǎn)化為端基異構(gòu)羥基。經(jīng)三氯乙腈和DBU處理可將所得的端基異構(gòu)羥基轉(zhuǎn)化為α-trichloroacetimidate部分。經(jīng)無水甲醇處理后，繼而經(jīng)三氟甲磺酸三甲基甲硅烷酯和三乙胺處理，可將α-trichloroacetimidate部分轉(zhuǎn)化為甲氧基部分。就被用作糖基供體的二糖而言，如上述端基異構(gòu)位點(diǎn)可被轉(zhuǎn)化為α-trichloroacetimidate部分。將位于葡糖胺殘基3位的保護(hù)基團(tuán)選擇性地去除后，上述甲氧基保護(hù)的二糖可被用作糖基受體。該位點(diǎn)優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是氯乙酰基，該基團(tuán)可以經(jīng)乙醇中的硫脲和吡啶處理而去除。以交互方式可將二糖供體偶聯(lián)到受體，從而生成LMW-HA，即每一連續(xù)偶聯(lián)步驟生成具有附加重復(fù)單位的LMW-HA。葡糖胺殘基的其它優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是4，6-O-苯亞甲基和2-N-三氯乙酰胺基。葡糖醛酸殘基的附加優(yōu)選的保護(hù)基團(tuán)是6-和4-O-苯甲?；虲6甲酯。這些保護(hù)基團(tuán)的用途和可選的保護(hù)基團(tuán)在“Protective Groups In Organic Synthesis，”2ndEd.，by T.W.Greene and P.G.M.Wuts，1991，John Wiley&Sons，Inc.中有所描述，在此引入作為參考。
采用尿苷二磷酸糖和HA合成酶也可酶促合成HA片段。見，例如，De Luca et al.J.Am.Chem.Soc.1995 1175869-5870。以上兩種方法可以合成在其末端含任意比例葡糖醛酸的LMW-HA。因此，通過酶降解、酶合成或化學(xué)合成形成LMW-HA可以獲得產(chǎn)量超過約98％、或超過約99％的在其非還原末端含有葡糖醛酸或不飽和葡糖醛酸的LMW-HA片段。
通過本領(lǐng)域已知的方法可將LMW-HA偶聯(lián)到載體上。見，例如，Dickand Beurret in Conjugate Vaccines，CruSe et al.eds.，Contrib.Microbiol.Immunol.，Basel，Karger，1989，vol.10，pp 48-114和Jennings and Sood in Neoglycocon jugatesPreparation andApplications，Lee et al.eds.，Chapter 10，pp 325-371，1994，Academic Press，San Diego。這些方法包括還原胺化作用、經(jīng)由羧化物部分偶聯(lián)、利用接頭、利用溴化氰或其衍生物。當(dāng)LMW-HA偶聯(lián)到載體上時(shí)，優(yōu)選的是避免改變位于多糖的非還原末端的表位。將LMW-HA偶聯(lián)到載體的優(yōu)選方法是通過直接偶聯(lián)，如通過在還原末端糖的還原胺化作用。例如，通過采用，如氫硼化物使還原末端殘基還原，繼而通過高碘酸鹽氧化作用和還原胺化作用可將還原末端基團(tuán)選擇性地導(dǎo)入LMW-HA中。見，例如Jennings U.S.Patent No.4,356,170。
也可采用在沿LMW-HA主鏈的不同部位將LMW-HA偶聯(lián)到載體的方法。例如，通過利用高碘酸鹽，在多糖的主鏈殘基中生成醛基，可活化LMW-HA，繼而在還原劑，如氫硼化物的存在下采用一種含游離氨基的載體對(duì)活化的LMW-HA進(jìn)行處理。這些方法也允許超過一個(gè)的載體分子與可交聯(lián)的單個(gè)LMW-HA的偶聯(lián)。
發(fā)明的偶聯(lián)物分子的多肽組分可以是任何在被偶聯(lián)到LMW-HA時(shí)，可激發(fā)T細(xì)胞依賴性應(yīng)答的生理學(xué)耐受性蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語多肽意指一個(gè)通稱，包括肽、多肽和包括天然的、修飾的、或重組蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。用作載體的多肽實(shí)例包括，但不僅限于細(xì)菌毒素、類毒素、膜孔蛋白、外膜蛋白、和交叉反應(yīng)性蛋白質(zhì)物質(zhì)。這種多肽包括，但不僅限于破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素、來源自鏈球菌的免疫原性多肽、來源自流感的免疫原性多肽、來源自腦膜炎球菌的免疫原性多肽、來源自肺炎球菌的免疫原性多肽、來源自大腸桿菌的免疫原性多肽。尤其優(yōu)選的是破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、CRM197、嗜血桿菌的膜孔蛋白多肽、大腸桿菌的膜孔蛋白多肽和奈瑟氏菌的膜孔蛋白多肽，如rPorB。見例如U.S.Patent No.5,439,808。
根據(jù)本發(fā)明制備的偶聯(lián)物分子典型地包含一種至少結(jié)合了一個(gè)低分子量透明質(zhì)酸片段的載體多肽或蛋白質(zhì)，該結(jié)合通過位于多糖片段主鏈末端的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行。因此，如果需要的話，本發(fā)明提供了生成低分子量透明質(zhì)酸偶聯(lián)物分子的能力，其中的多糖組成除了一個(gè)末端外均被載體遮蓋。這些類型的偶聯(lián)物可被稱為新糖蛋白。見，例如Dick and Beurret，supra?？蛇x的，根據(jù)本發(fā)明可形成交聯(lián)的偶聯(lián)物。這類偶聯(lián)物可被稱為網(wǎng)格偶聯(lián)物。見，例如Dick and Beurret，supra。
發(fā)明的偶聯(lián)物分子中，LMW-HA與多肽或蛋白質(zhì)的分子比例優(yōu)選的是每分子多肽或蛋白質(zhì)約1到約100個(gè)分子的LMW-HA。更為優(yōu)選的比例是每分子多肽或蛋白質(zhì)約10到約20個(gè)分子的LMW-HA或表位?？蛇x的，通過重量可測定LMW-HA與多肽或蛋白質(zhì)的比例。例如，發(fā)明的偶聯(lián)物分子中LMW-HA重量與多肽或蛋白質(zhì)重量之比為約10％到約500％。優(yōu)選的，本發(fā)明的偶聯(lián)物中LMW-HA重量與多肽或蛋白質(zhì)重量之比為約30％到約100％。一種實(shí)施方案中，采用極低分子量的透明質(zhì)酸，即低于約20個(gè)重復(fù)單位，形成偶聯(lián)物，這樣可增加表位的密度。通過調(diào)整偶聯(lián)條件，尤其是結(jié)合反應(yīng)中起始組分的比例，可改變LMW-HA/多肽或蛋白質(zhì)比例。
除了提供包含有偶聯(lián)到多肽或蛋白質(zhì)上的低分子量透明質(zhì)酸的偶聯(lián)物分子以外，本發(fā)明也包括多價(jià)偶聯(lián)物和包含多價(jià)偶聯(lián)物的藥物組合物和疫苗，其中不同多糖被偶聯(lián)到單個(gè)多肽上。例如，低分子量透明質(zhì)酸能以與其他多糖的多種組合方式被結(jié)合于多肽或蛋白質(zhì)。這種多糖的實(shí)例是b型流感嗜血菌的莢膜多糖；B族鏈球菌Ia，和Ib，II，III，IV，V，VI和VIII型的英膜多糖；A族，B族和C族腦膜炎球菌的莢膜多糖；A族鏈球菌多糖。
根據(jù)本發(fā)明的免疫原性偶聯(lián)物提供了有用的藥物組合物，如疫苗，在給哺乳動(dòng)物，尤其是人和馬提供保護(hù)以免被含HA的細(xì)菌，如A族和C族鏈球菌感染方面，該藥物組合物是重要的。此外，作為一種在出生前給新生兒提供保護(hù)性抗體的方式，這些疫苗可用于對(duì)孕婦給藥。
發(fā)明的免疫原性組合物可被用于作為一種產(chǎn)生對(duì)預(yù)防、治療和診斷用途有用的單克隆、多克隆或抗獨(dú)特型抗體的方式。在對(duì)由含HA的細(xì)菌，如A族或C族鏈球菌引起的各種感染和疾病的監(jiān)測和檢測中，診斷學(xué)是尤其有用的。對(duì)那些尤其是被A族或C族鏈球菌感染，或處于被A族或C族鏈球菌感染危險(xiǎn)中的個(gè)體而言，本發(fā)明的免疫原性組合物可被用于作為免疫原用于主動(dòng)和被動(dòng)免疫原性保護(hù)中。通過采用發(fā)明的任何免疫原性組合物對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫，可生成用于被動(dòng)保護(hù)的殺菌性抗體，然后將殺菌性抗體回收。用于本發(fā)明的殺菌抗體可以存在于血清、部分純化的組分，如γ球蛋白組分、或純化的抗體中。例如利用蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G-瓊脂糖，可從粗蛋白混合物，如血清或腹水中純化得到IgG。蛋白質(zhì)A結(jié)合到IgG的Fc部分。蛋白質(zhì)G也結(jié)合到Fc區(qū)域，不過也可結(jié)合到Fab區(qū)域，使其可用于IgGs的F(ab)’2片段的純化。利用蛋白質(zhì)A-或蛋白質(zhì)G-瓊脂糖柱可以純化IgGs的粗樣品。上柱前，應(yīng)采用緩沖液以至少1∶1的比例稀釋血清樣品、腹水或組織培養(yǎng)物上清液。上樣后，采用洗滌緩沖液，如20mM磷酸鈉、150mMNaCl，pH7.4，對(duì)柱進(jìn)行洗滌，直至大部分雜質(zhì)被除去為止。繼而采用洗脫緩沖液，如100mM甘氨酸、pH3.0，洗脫IgG。IgG繼而可通過透濾進(jìn)行濃縮、或通過離子交換或大小排阻色譜進(jìn)一步純化。
“人源化”抗體(包括嵌合抗體和CDR-嫁接抗體)，抗體片段，尤其是基于所要求保護(hù)的單克隆抗體的雙特異性抗體，以及在原核或真核細(xì)胞中產(chǎn)生的重組抗體相關(guān)產(chǎn)物，均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，基于對(duì)發(fā)明抗體的可變區(qū)進(jìn)行結(jié)構(gòu)(序列)信息的測定，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，如大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可產(chǎn)生抗體片段，如Fab和F(ab’)2片段。見，例如U.S.Patent No.6,180,377?？勺儏^(qū)的序列信息也使制備CDR-嫁接抗體成為可能。此外，采用轉(zhuǎn)化的小鼠骨髓瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞可制備嵌合抗體(如小鼠/人類抗體)，并且通過雜交雜交瘤細(xì)胞可生成雙特異性抗體。
發(fā)明的藥物組合物和疫苗典型地通過將低分子量透明質(zhì)酸和/或偶聯(lián)物分散在合適的藥學(xué)可接受載體，如生理鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水或其它可注射液體中而形成。藥物組合物或疫苗可以是腸胃外給藥，例如皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)。藥物組合物，如疫苗中也可添加常用的添加劑；例如，穩(wěn)定劑，如乳糖或山梨醇，和佐劑，如磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋁、單磷酰脂A、QS21、或硬脂酰酪氨酸。這種藥物組合物可以包含低分子量透明質(zhì)酸、其偶聯(lián)物、或低分子量透明質(zhì)酸和/或其偶聯(lián)物的抗體。該組合物可單獨(dú)用藥，或與至少一種其它試劑，如佐劑或穩(wěn)定化合物聯(lián)合用藥，并可于任何無菌、生物相容藥物載體，包括但不僅限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖和水中用藥。該組合物可單獨(dú)給予患者，或與其它試劑、藥品、激素或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物聯(lián)合用藥。
以足以引起免疫原性應(yīng)答的量給予該藥物組合物和疫苗。劑量通常為每公斤體重約0.1～50μg偶聯(lián)物分子。劑量可根據(jù)個(gè)體的大小、重量或年齡調(diào)整，并且應(yīng)在本領(lǐng)域技術(shù)水平范圍內(nèi)?？山o予系列劑量以獲得最佳免疫。通過測定抗體滴度或殺菌活性可監(jiān)測個(gè)體的抗體應(yīng)答，如有必要，可對(duì)個(gè)體加強(qiáng)免疫，以增強(qiáng)應(yīng)答。
本發(fā)明提供了包含抗體，如純化的抗體，γ球蛋白組分和血清的組合物，該組合物可用于為含HA的細(xì)菌，尤其是A族或C族鏈球菌所感染，或處于暴露于含HA的細(xì)菌，尤其是A族或C族鏈球菌的危險(xiǎn)中的哺乳動(dòng)物提供被動(dòng)免疫。與顯著的發(fā)病率和死亡率相關(guān)的侵襲性軟組織感染屬于諸多因鏈球菌引起的病理之一。見，例如Ashbaughet al.J.Clin.Invest.，1998，102550。本發(fā)明提供的IgGs、抗體片段、抗體、γ球蛋白組分和血清在抑制或預(yù)防由含HA的細(xì)菌，如A族和C族鏈球菌引起的感染，以及由這種感染引起的組織壞死和其它病理方面是有用的。包含抗體，如純化的抗體、γ球蛋白組分和血清的藥物組合物是典型地通過將抗體分散在合適的藥物可接受載體，如生理鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水或其它可注射液體中而形成的。該藥物組合物可以是腸胃外給藥，例如皮下、腹膜內(nèi)或肌肉。常用的添加劑也可被添加至該藥物組合物中。該組合物可單獨(dú)用藥，或與至少一種其它試劑，如穩(wěn)定化合物聯(lián)合用藥，并可溶于任何無菌、生物相容藥物載體，包括但不僅限于鹽水、緩沖鹽水、右旋糖和水中用藥。該組合物可單獨(dú)給予患者，或與其它試劑、藥品、激素或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物聯(lián)合用藥。
以足以抑制細(xì)菌感染的量給予該包含抗體的藥物組合物。劑量可根據(jù)個(gè)體的大小、重量或年齡調(diào)整，并且在本領(lǐng)域技術(shù)水平范圍內(nèi)?？山o予系列劑量以獲得最佳免疫。通過測定抗體滴度或殺菌活性可監(jiān)測個(gè)體的劑量應(yīng)答，如有必要，可對(duì)個(gè)體加強(qiáng)免疫，以增強(qiáng)應(yīng)答。
根據(jù)本發(fā)明制備的抗體在不同免疫試劑制備和免疫測定方面也是有用的。例如，對(duì)免疫測定而言，可將低分子量透明質(zhì)酸片段或其偶聯(lián)物直接或通過接頭，如多肽接頭，固定在固體支持體上。可采用與制造偶聯(lián)物相似的方法進(jìn)行固定。該抗體可隨后被應(yīng)用在本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的各種免疫測定體系中，包括用于檢測含HA的細(xì)菌，如A族或C族鏈球菌的存在的放射免疫測定法和ELISA。這種測定法可被用于測定血清或其它體液中A族或C族鏈球菌抗體的存在，從而診斷個(gè)體中感染的存在。
此處給出的實(shí)施例意欲例證實(shí)施發(fā)明的不同方面，并且不以任何方式限定該發(fā)明的范圍。說明書中引用的所有出版物、專利和論文均被全文引入本說明書中。
實(shí)施例1LMW-HA的制備酸水解解聚透明質(zhì)酸將透明質(zhì)酸(100mg，Lifecore lot 1-9062-5)添加至10ml 0.05NHCl溶液中。于80℃加熱該混合物2小時(shí)，并攪拌以溶解全部固體。于100℃將該樣品繼續(xù)加熱1.5小時(shí)。于不同時(shí)間從反應(yīng)混合物中取出等分試樣，并在配有Superose12 HR 10/30柱(Pharmacia)的Bio-Rad系統(tǒng)(Biologic)上進(jìn)行分析，以監(jiān)測解聚作用。采用0.5N Na0H中和該溶液，繼而采用截留分子量(MWCO)為3,500的Diaflo膜進(jìn)行透析后，再凍干。通過Superdex200PG(Pharmacia)柱對(duì)該產(chǎn)物進(jìn)行分子大小分級(jí)分離，從而獲得65mg固體產(chǎn)物。于500MHz對(duì)樣品進(jìn)行的1H-NMR分析證實(shí)透明質(zhì)酸(HA)的二糖重復(fù)單位結(jié)構(gòu)。通過大小排阻色譜，聯(lián)合多角度激光散射光度測定法(SEC MALLS)估計(jì)產(chǎn)生片段的平均分子量約為12,000道爾頓。
非還原末端含D-葡糖醛酸的HA寡糖的制備采用0.1N HCl在80℃處理透明質(zhì)酸(100mg，Lifecore lot 1-9062-5)10小時(shí)。采用0.5N NaOH中和該溶液，并通過SephadexG-20(Pharmacia)柱，用水洗脫進(jìn)行脫鹽。將脫鹽產(chǎn)物凍干，并經(jīng)β-N-乙?；被咸擒彰?EC 3.2.1.30；Calbiochem)處理，以生成具有約4到約20個(gè)重復(fù)單位，并在其非還原末端含有D-葡糖醛酸的LMW-HA片段。通過NMR光譜法和甲基化分析證實(shí)寡糖的結(jié)構(gòu)。
超聲解聚透明質(zhì)酸將透明質(zhì)酸(100mg，Lifecore lot 1-9062-5)溶于20ml 10mM PBS緩沖液中，并攪拌懸浮液直至溶解。采用450型Branson超聲波儀(超聲設(shè)置輸出控制3；工作循環(huán)50％；溫度2℃)對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理18小時(shí)。透析并凍干后，回收57mg固體產(chǎn)物。利用MiniDawn裝置(Wyatt技術(shù)，Santa Barara，CA)和Superose12 HR 10/30柱(Pharmacia)通過SEC-MALLS測定所獲超聲處理的透明質(zhì)酸的平均分子量為18,000道爾頓。于500MHz對(duì)樣品進(jìn)行的1H-NMR分析證實(shí)透明質(zhì)酸的二糖重復(fù)單位結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2LMW-HA偶聯(lián)物的制備采用NaBH4還原酸處理的透明質(zhì)酸將經(jīng)鹽酸解聚的透明質(zhì)酸(65mg)溶解于6.5ml去離子水中。采用0.5N NaOH將pH調(diào)至10，并添加NaBH4至該溶液中。于室溫保持該反應(yīng)混合物2小時(shí)。采用1M乙酸破壞過量的NaBH4。采用MWCO為3,500的Diaflo膜透析除水后，繼而凍干，獲得35mg固體產(chǎn)物。對(duì)還原的酸處理透明質(zhì)酸的高碘酸鹽氧化將兩份18mg已還原并分級(jí)的多糖樣品分別溶解于1.3ml和0.87ml的10mM NaIO4水溶液中，從而實(shí)現(xiàn)分別為10％和20％的氧化程度(d.o.)。室溫下于暗處攪拌反應(yīng)2小時(shí)，并采用20μl乙二醇猝滅兩份樣品。繼而將反應(yīng)混合物透析，并凍干，獲得17mg固體產(chǎn)物。酸處理的透明質(zhì)酸-破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)物(LMW-HA/TT)的制備將經(jīng)由高碘酸鹽氧化的(d.o.10％和20％)酸處理的透明質(zhì)酸(每份分別為10mg)和純化的破傷風(fēng)類毒素單體(每份樣品5mg，StatensSerum Institute，Copenhagen，Denmark)溶解于0.5ml 0.2M pH7.4的磷酸鈉溶液中。添加重結(jié)晶的氰基硼氫鈉(每份樣品添加10mg)，并于室溫保持該混合物過夜。采用配有Superose12 HR 10/30柱(Pharmacia)的Bio-Rad(Biologic)系統(tǒng)于不同時(shí)間監(jiān)測反應(yīng)過程。通過在柱空隙體積中洗脫的UV(280nm)峰的遞增顯示多糖與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)。偶聯(lián)完成后，將溶解于1ml 0.1N NaOH中的10mgNABH4添加至每份樣品中，以減少任何殘余未偶聯(lián)的醛。通過Superdex200PG(Pharmacia)柱(1.6×60cm)，并采用含0.01％硫柳汞的10mM PBS洗脫，純化偶聯(lián)物。將相當(dāng)于空隙體積峰的級(jí)分合并，并于4℃儲(chǔ)存。產(chǎn)物分別被指定為偶聯(lián)物1和2，其多糖中分別有10％和20％的氧化程度。
經(jīng)過超聲處理的透明質(zhì)酸的高碘酸鹽氧化將兩份分別為26mg和30mg已經(jīng)超聲處理的多糖分別溶解于2和1.5ml去離子水中，并分別采用0.65ml和1.5ml的10mM NaIO4水溶液處理，以實(shí)現(xiàn)分別為10％和20％的氧化程度(d.o.)。室溫下于暗處攪拌反應(yīng)2小時(shí)，并分別用20μl乙二醇猝滅。繼而將溶液透析并凍干，分別獲得24mg和25mg產(chǎn)物。
經(jīng)過超聲處理的透明質(zhì)酸-破傷風(fēng)類毒素偶聯(lián)物(LMW-HA/TT)的制備將已經(jīng)超聲處理，并被高碘酸鹽氧化的HA(每份樣品7mg，d.o.分別為10％和20％)，和純化的破傷風(fēng)類毒素單體(每份樣品3.5mg)溶解于350μl 0.2M pH7.4的磷酸鈉溶液中。添加氰基硼氫鈉(每份樣品7mg)，并于室溫下保持該混合物過夜。通過在不同時(shí)間從反應(yīng)混合物中取出等分試樣，繼而采用配有Superose12 HR 10/30柱(Pharmacia)的Bio-Rad(Biologic)系統(tǒng)進(jìn)行分析，從而監(jiān)測每個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)的過程。通過在柱空隙體積中洗脫的UV吸收峰(280nm)的遞增顯示多糖與多肽的偶聯(lián)。偶聯(lián)完成后，將NABH4(10mg溶解在1ml 0.1N NaOH中)添加至反應(yīng)混合物中，以減少任何殘余未偶聯(lián)的醛。通過Superdex200PG(Pharmacia)柱，并采用含0.01％硫柳汞的10mM PBS洗脫，純化偶聯(lián)物。將相當(dāng)于空隙體積峰的級(jí)分合并，并于4℃儲(chǔ)存。產(chǎn)物分別被指定為偶聯(lián)物3和4，其多糖中分別有10％和20％氧化程度。
經(jīng)過超聲處理的透明質(zhì)酸與重組3類奈瑟球菌膜孔蛋白的偶聯(lián)(LMW-HA/rPorB)將已經(jīng)超聲處理，并被高碘酸鹽氧化的透明質(zhì)酸(20mg，20％d.o.)，和rPorB(10mg)溶解于717μl 0.25M pH8.5的HEPES緩沖溶液中，該緩沖液含0.25M NaCl、0.05％Zwittergent Z3，14(Calbiochem，San Diego，CA)。添加氰基硼氫鈉(20mg)，并于37℃溫育該混合物1天。偶聯(lián)完成后，將溶解于1ml 0.1N NaOH中的10mg硼氫化鈉添加至反應(yīng)混合物中，以除去任何殘余的醛。通過Superdex200PG(Pharmacia)柱，并采用含0.01％硫柳汞的10mM PBS洗脫而純化偶聯(lián)物。通過在280nmUV吸光度的監(jiān)測，將相當(dāng)于空隙體積峰的級(jí)分合并，并于4℃儲(chǔ)存。產(chǎn)物被標(biāo)記為偶聯(lián)物5。作為ELISA包被抗原的透明質(zhì)酸-人血清白蛋白偶聯(lián)物(LMW-HA/HAS)的制備將已經(jīng)酸處理，超聲處理，并被高碘酸鹽氧化，具有10％d.o.的透明質(zhì)酸，和人血清白蛋白(HAS，F(xiàn)luka)溶解于0.5ml pH7.4的磷酸鈉緩沖溶液中。添加氰基硼氫鈉，并于37℃溫育該混合物1天。偶聯(lián)完成后，將溶解于0.1N NaOH中的硼氫化鈉添加至反應(yīng)混合物中，如對(duì)其它偶聯(lián)物的描述一樣，以除去任何殘余的醛。將偶聯(lián)物透析，并凍干。
表1LMW-HA/蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的物理化學(xué)特性
分別通過咔唑(用于糖醛酸)(Bitter，T.1962 Anal.Biochem.4∶330)和考馬斯(BioRad)分析測定偶聯(lián)物中透明質(zhì)酸和蛋白質(zhì)的含量。
實(shí)施例3透明質(zhì)酸寡糖抑制物的分離將3支安瓿含量，溶解于10mM PBS中的來源自Streptomyceshyalurolyticus(Sigma Biochemicals)的透明質(zhì)酸酯裂解酶(EC4.2.2.1)添加至已經(jīng)超聲處理的透明質(zhì)酸(60mg)中，并于37℃溫育1.5小時(shí)。于水浴中使反應(yīng)混合物100℃沸騰一分鐘以終止反應(yīng)。通過取出反應(yīng)混合物的等分試樣，并采用配有Superdex肽柱(Pharmacia)的BIO-RAD系統(tǒng)(Biologic)，采用10mM PBS為洗脫液以0.75ml/min的流速條件進(jìn)行分析，從而監(jiān)測酶消化的過程。將溶液于4℃儲(chǔ)存直至進(jìn)一步純化。
通過用Mono-QHR5/5柱(Pharmacia)的陰離子交換色譜，以HPLC1090(Hewlett Packard 1090 Series II)系統(tǒng)進(jìn)行寡糖的分離，該系統(tǒng)配有二極管陣列檢測器、可編程自動(dòng)進(jìn)樣器、級(jí)分收集儀、以及用于系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集/處理的Hewlett Packard Chemstation軟件程序。于Tris-HCl緩沖溶液中采用氯化鈉梯度成分以進(jìn)行分離。將對(duì)應(yīng)于二聚物(DP2)和四聚物(DP4)，分別于18～26分鐘和28～31分鐘洗脫所得的兩份寡糖級(jí)分收集，凍干，并采用Sephadex G-10柱(Pharmacia)，并以去離子水為洗脫液進(jìn)行脫鹽。通過于500MHz檢測寡糖的1H-NMR光譜以證實(shí)其結(jié)構(gòu)。DP2寡糖對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為Δ4，5-β-GlcU-(1，3)-D-GlcNAc，DP4對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為Δ4，5-β-GlcU-(1，3)-β-D-GlcNAc-(1，4)-β-D-GlcU-(1，3)-β-D-GlcNAc。
實(shí)施例4血清學(xué)研究兔抗血清對(duì)低分子量透明質(zhì)酸(LMW-HAs)的免疫特異性免疫原性研究對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行10μg偶聯(lián)多糖/劑LMW-HA/TT的皮下免疫，以21天為間隔免疫3次(第0、21和41天)，第一劑采用弗氏完全佐劑，第二劑和第三劑采用弗氏不完全佐劑。于21、31和41天抽取白兔耳血，并于第三次免疫后10天進(jìn)行心臟穿刺試驗(yàn)。
兔抗血清在LMW-HA/HAS包被的板上的滴度采用溶解于PBS(50mM磷酸鈉，150mM NaCl，pH＝7.4)中已經(jīng)超聲處理的LMW-HA/HAS或已經(jīng)酸水解的LMW-HA/HAS偶聯(lián)物(100μl約25ng PS/孔)于37℃包被微量滴定板(NUNC Polysorp)1小時(shí)。繼而采用PBS+0.05％Tween20(PBS Tween，pH＝7.4)洗滌板，再于室溫采用150μL/孔PBS+0.1％牛血清白蛋白(PBS+BSA，pH7.4)包被板。包被后，再次洗滌并將其儲(chǔ)存于2～8℃直至使用。
在聲處理過的LMW-HA/HAS或酸水解的LMW-HA/HAS包被的微量滴定板小孔中將兔抗血清用PBS Tween系列稀釋超至終體積為100μl/孔，并于室溫溫育1小時(shí)。采用PBS Tween洗滌板，并于每孔添加100μl以1∶2,500在PBS Tween中稀釋的山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(Kirkegaard and Perry Laboratories)。于室溫溫育1小時(shí)后，再次洗滌板，并每孔添加100μl TMB底物溶液(KPL)。于室溫溫育該板5～10分鐘后，每孔添加100μl的單組分終止溶液(KPL)以終止顯色。于450nm處讀每孔的光密度，并制得適于每一條件的滴定曲線。對(duì)在LMW-HA/HAS包被的板中兔抗血清與經(jīng)超聲處理的LMW-HA/TT結(jié)合的抑制如上所述包被微量滴定板。在超聲處理過的LMW-HA/HAS偶聯(lián)物包被的板中滴定兔抗-超聲處理過的LMW-HA/TT抗血清。選擇對(duì)應(yīng)于最大信號(hào)約一半處的稀釋度，作為適于抑制研究的稀釋度。將兔抗血清稀釋在PBS Tween中。在Titertubes(Bio-Rad)中，將抑制物系列稀釋在含稀釋的抗血清的緩沖液中，并從Titertubes中取出每份為100μl的樣品，將其直接添加至已包被的微量滴定板孔中。室溫下溫育微量滴定板中的樣品1小時(shí)。采用PBS Tween洗滌微量滴定板后，每孔添加100μl以1∶2,500在PBS Tween中稀釋的山羊抗兔IgG-HRP偶聯(lián)物(KPL)。室溫下溫育該板1小時(shí)，采用PBS Tween洗滌。每孔添加100μlTMB底物溶液(KPL)。室溫溫育該板5～10分鐘后，每孔添加100μl的單組分終止溶液(KPL)以終止顯色，于450nm處讀取吸光度。抑制作用測定為采用不含任何抑制物的稀釋抗血清得到的最大信號(hào)的百分比。
新西蘭白兔的免疫應(yīng)答采用已經(jīng)超聲處理的透明質(zhì)酸-破傷風(fēng)類毒素(LMW-HA/TT)或經(jīng)酸水解的透明質(zhì)酸-破傷風(fēng)類毒素(LMW-HA/TT)偶聯(lián)物，對(duì)八只新西蘭白兔進(jìn)行三次皮下注射免疫(每種偶聯(lián)物接種四只白兔)。圖4顯示的是每只個(gè)體兔對(duì)經(jīng)超聲處理的LMW-HA/TT偶聯(lián)物免疫原的免疫應(yīng)答。全部四只白兔對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)生應(yīng)答，ELISA滴度超過50,000。圖5顯示的是采用經(jīng)酸水解的LMW-HA/TT偶聯(lián)物免疫的個(gè)體兔的免疫應(yīng)答。全部四只個(gè)體兔對(duì)透明質(zhì)酸產(chǎn)生應(yīng)答，ELISA滴度約為10,000，或者更高。
證實(shí)兔的免疫應(yīng)答是特異性的，這取決于用于免疫的偶聯(lián)物的性質(zhì)。圖6顯示的是來源自經(jīng)超聲處理的LMW-HA/TT偶聯(lián)物免疫的動(dòng)物的抗體，一般比來源自經(jīng)酸水解LMW-HA/HAS免疫的動(dòng)物的抗體更容易與由經(jīng)超聲處理的LMW-HA/HAS包被的板反應(yīng)。在這些不同包被抗原之間，至少在免疫反應(yīng)性方面有一個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。對(duì)于用酸水解的LMW-HA/TT偶聯(lián)物免疫的動(dòng)物而言情況也是如此。圖7顯示的是與超聲處理的LMW-HA/HAS固相對(duì)照，這些抗血清對(duì)酸水解LMW-HA/HAS偶聯(lián)物的一個(gè)數(shù)量級(jí)的優(yōu)先。
超聲處理的LMW-HA/TT在新西蘭白兔體內(nèi)產(chǎn)生的抗血清的特異性采用超聲處理的LMW-HA/TT偶聯(lián)物免疫的兔體內(nèi)產(chǎn)生的抗血清的特異性是通過微量滴定板抑制試驗(yàn)檢測的。對(duì)來自超聲處理的LMW-HA/TT免疫的兔#75295的抗血清進(jìn)行的抑制研究結(jié)果如圖8和圖9所示。圖8顯示的是用作抑制物的幾類超聲處理HA及幾類酸水解HA。該試驗(yàn)中，所有形式的酸水解的HA均是與包被的超聲處理的LMW-HA/HAS結(jié)合的抗體的不良抑制物。至于超聲處理的抑制物種類，趨勢似乎是超聲處理產(chǎn)生的HA片段越小，該片段作為抑制物就越有效。這表明較小的HA分子與較大種類相比，每單位質(zhì)量具有更多的表位。
圖9所示結(jié)果進(jìn)一步說明了該發(fā)現(xiàn)。在此，極高分子量的天然HA被認(rèn)為是非常低效的抑制物，幾乎比采用20kD HA為免疫原低3個(gè)數(shù)量級(jí)。該試驗(yàn)中也以較小種類作為抑制物。HA的四糖形式是相對(duì)有效的抑制物，而二糖和D-葡糖醛酸形式根本不抑制與固相結(jié)合的抗體。
采用來自也經(jīng)由超聲處理LMW-HA/TT偶聯(lián)物免疫的兔#72700的抗血清，進(jìn)行抑制研究所得的結(jié)果如圖10和圖11所示。這些結(jié)果與前述的通過兔#75295獲得的結(jié)果十分相似。圖10顯示的結(jié)果與圖9中顯示結(jié)果相似。即HA的四糖形式與HA的超聲處理(20K)免疫原形式抑制良好，而HA的二糖和天然形式則抑制不佳。采用HA的六糖形式進(jìn)一步檢驗(yàn)HA的大小和免疫反應(yīng)性之間的關(guān)系。結(jié)果如圖11所示。結(jié)果表明HA的這一形式可完全抑制抗體結(jié)合。從這些研究中，可以明顯看出至少HA的四糖形式(兩個(gè)重復(fù)亞單位)對(duì)完全抑制是必須的。HA的二糖形式不足以發(fā)揮抑制作用，并且分子的天然形式不是最佳抑制物。因此，就免疫識(shí)別而言，優(yōu)選的是將大的天然HA分子的尺寸減小。
實(shí)施例5小鼠中的免疫原性研究小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的透明質(zhì)酸-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的抗血清采用LMW-HA/蛋白質(zhì)偶聯(lián)物疫苗對(duì)BALB/c和CD1小鼠進(jìn)行三次注射免疫。偶聯(lián)物或者是與兔免疫一樣的超聲處理的LMW-HA/TT，或者是超聲處理的HA與rPorB的偶聯(lián)物(LMW-HA/rPorB)。LMW-HA/TT偶聯(lián)物疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不大于陰性對(duì)照。然而，LMW-HA/rPorB偶聯(lián)物在100％的免疫動(dòng)物體內(nèi)均可產(chǎn)生可檢測的ELISA滴度。這些數(shù)據(jù)如分別針對(duì)BALB/c小鼠和CD1小鼠的圖12和圖13所示。
實(shí)施例6保護(hù)試驗(yàn)被動(dòng)免疫采用LMW-HA/TT偶聯(lián)物的兔抗血清在成年Balb/c小鼠體內(nèi)的被動(dòng)免疫中進(jìn)行保護(hù)試驗(yàn)。于采用A族鏈球菌(GAS)6型或3型的LD90侵襲劑量進(jìn)行侵襲(IP)前2個(gè)小時(shí)，將1倍稀釋于無菌PBS的兔抗血清(0.5ml)進(jìn)行腹膜內(nèi)注射(IP)。經(jīng)由磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和弗氏完全佐劑(CFA)免疫的兔的抗血清、以及針對(duì)偶聯(lián)于至破傷風(fēng)類毒素的A族鏈球菌碳水化合物產(chǎn)生的兔抗血清被作為對(duì)照血清包括于保護(hù)試驗(yàn)中。侵襲后10天內(nèi)記錄存活情況。
采用經(jīng)PBS/CFA免疫的兔抗血清對(duì)Balb/c小鼠免疫2個(gè)小時(shí)后，以一定劑量范圍的GAS 6型或3型IP侵襲，事先測定LD90s。測定的6型和3型的LD90分別為5×103和2×105cuf/ml。侵襲試驗(yàn)結(jié)果如圖14和圖15所示。
權(quán)利要求
1.一種免疫原性偶聯(lián)物分子，包含與免疫學(xué)合適的多肽載體共價(jià)結(jié)合的透明質(zhì)酸。
2.權(quán)利要求1的免疫原性偶聯(lián)物，其中超過約50％的透明質(zhì)酸分子具有非還原末端葡糖醛酸和/或不飽和葡糖醛酸殘基。
3.權(quán)利要求2的免疫原性偶聯(lián)物，其中透明質(zhì)酸是分子量等于或低于約400Kd，并等于或高于約600道爾頓的低分子量透明質(zhì)酸。
4.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中至少90％或超過90％的低分子量透明質(zhì)酸片段具有非還原末端葡糖醛酸和/或不飽和葡糖醛酸殘基。
5.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中至少95％或超過95％的低分子量透明質(zhì)酸片段具有非還原末端葡糖醛酸和/或不飽和葡糖醛酸殘基。
6.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中至少98％或超過98％的低分子量透明質(zhì)酸片段具有非還原末端葡糖醛酸和/或不飽和葡糖醛酸殘基。
7.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中至少99％或超過99％的低分子量透明質(zhì)酸片段具有非還原末端葡糖醛酸和/或不飽和葡糖醛酸殘基。
8.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中低分子量透明質(zhì)酸大小為至少約4個(gè)糖基殘基。
9.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中低分子量透明質(zhì)酸具有約2到約20個(gè)二糖亞單位。
10.權(quán)利要求9的免疫原性偶聯(lián)物，其中低分子量透明質(zhì)酸具有約2到約10個(gè)二糖亞單位。
11.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中多肽載體選自破傷風(fēng)類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素、來源自鏈球菌的免疫原性多肽、來源自流感的免疫原性多肽、來源自腦膜炎球菌的免疫原性多肽、來源自肺炎球菌的免疫原性多肽、和來源自大腸桿菌的免疫原性多肽。
12.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中多肽載體是來自奈瑟球菌的膜孔蛋白。
13.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中偶聯(lián)物是直接連接的。
14.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中偶聯(lián)物激發(fā)與表位結(jié)合的抗體，該表位包括作為低分子量透明質(zhì)酸非還原末端糖的葡糖醛酸或不飽和葡糖醛酸。
15.權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物，其中偶聯(lián)物激發(fā)與存在于細(xì)菌中的莢膜透明質(zhì)酸結(jié)合的抗體。
16.權(quán)利要求15的免疫原性偶聯(lián)物，其中細(xì)菌為A族鏈球菌或C族鏈球菌。
17.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求3的偶聯(lián)物和藥學(xué)可接受載體。
18.權(quán)利要求17的藥物組合物，進(jìn)一步包含生理學(xué)可接受的佐劑。
19.制備低分子量透明質(zhì)酸-多肽偶聯(lián)物分子的方法，包括將低分子量透明質(zhì)酸片段與免疫學(xué)合適的多肽共價(jià)連接，其中約50％或大于50％的低分子量透明質(zhì)酸片段在其非還原末端具有葡糖醛酸和/或不飽和葡糖醛酸殘基。
20.權(quán)利要求19的方法，其中該方法包括將低分子量透明質(zhì)酸與免疫學(xué)合適的多肽共價(jià)連接，包括還原胺化。
21.結(jié)合于權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物分子的純化的抗體。
22.權(quán)利要求21的純化的抗體，其中低分子量透明質(zhì)酸片段大小為至少約4個(gè)糖基殘基。
23.權(quán)利要求22的純化的抗體，其中透明質(zhì)酸片段大小為至少約4個(gè)糖基殘基，并且不超過約40KD。
24.有效地治療或抑制A族鏈球菌或C族鏈球菌感染的藥物組合物，包含選自權(quán)利要求17的組合物激發(fā)的抗體、權(quán)利要求21的抗體、或偶聯(lián)于脂質(zhì)體的低分子量透明質(zhì)酸激發(fā)的抗體。
25.在哺乳動(dòng)物中激發(fā)抗體應(yīng)答的方法，包括給予個(gè)體哺乳動(dòng)物一定量的權(quán)利要求17的藥物組合物，該量足以激發(fā)抗體應(yīng)答。
26.權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物為人。
27.權(quán)利要求25的方法，其中藥物組合物是通過肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈給藥。
28.權(quán)利要求25的方法，其中藥物組合物是以每公斤體重約0.1到約50微克的量給藥。
29.在人體中激發(fā)有效水平的抗低分子量透明質(zhì)酸抗體的疫苗，包含權(quán)利要求3的免疫原性偶聯(lián)物。
30.在哺乳動(dòng)物中抑制鏈球菌感染的方法，包括給予哺乳動(dòng)物足以抑制感染的量的權(quán)利要求3的藥物組合物。
31.抑制哺乳動(dòng)物中由含HA的細(xì)菌引起的感染進(jìn)展的方法，包括給予哺乳動(dòng)物足以抑制感染進(jìn)展的量的包括權(quán)利要求24的藥物組合物的組合物。
32.權(quán)利要求31的方法，其中細(xì)菌是A族鏈球菌或C族鏈球菌。
33.用于檢測由鏈球菌引起的感染的診斷免疫測定試劑盒，包含權(quán)利要求21的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了治療與預(yù)防由A族和C族鏈球菌引起的感染和疾病的抗原組合物及方法。特別是本發(fā)明提供了低分子量透明質(zhì)酸、與載體連接的低分子量透明質(zhì)酸及包含它們的組合物。該組合物激發(fā)針對(duì)低分子量透明質(zhì)酸的抗體，該抗體具有與A族和C族鏈球菌的交叉反應(yīng)性，并且具有與天然透明質(zhì)酸最低的交叉反應(yīng)性。在對(duì)那些被A族和C族鏈球菌感染或處于感染危險(xiǎn)中的人提供主動(dòng)和被動(dòng)免疫原性保護(hù)方面，本發(fā)明尤其有用。另外，本發(fā)明還提供了對(duì)診斷由A族和C族鏈球菌引起的感染和疾病有用的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1525869SQ02813943
公開日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2002年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月11日
發(fā)明者F·米雄, S·穆爾, M·勞德－夏普, M·布拉克, , F 米雄, 夏普 申請(qǐng)人:巴克斯特國際有限公司, 巴克斯特健康護(hù)理股份有限公司