專利名稱：一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備低分子量的透明質(zhì)酸鈉的方法，具體的說是一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液中制備低分子量透明質(zhì)酸鈉的方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，簡稱HA)是一種由葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖組成的雙糖單位重復(fù)構(gòu)建成的直鏈線性大分子多糖。透明質(zhì)酸是非均一物質(zhì)，其相對分子質(zhì)量(Mr)分布在一個較寬的范圍(20萬～350萬道爾頓或者更高)。不同Mr的透明質(zhì)酸所呈現(xiàn)出的理化性質(zhì)會有所不同，因此其應(yīng)用領(lǐng)域也會有所不同。研究表明，HA的多種生物活性具有分子量依賴性，某些低分子量透明質(zhì)酸所具有的作用如促進骨生成作用、促血管生成作用、細胞免疫活化作用等，高分子量透明質(zhì)酸不具備或者作用不明顯。
傳統(tǒng)上低分子量(5,000～20,000)的透明質(zhì)酸主要從雞冠和牛眼等動物組織中進行提取，而采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的HA的平均Mr一般在1×106以上。由于近年對動物制品特別是禽類和偶蹄類動物制品的流行病學(xué)擔憂，市場上迫切需要提取物生產(chǎn)低分子量透明質(zhì)酸的替代品。
目前發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的分離純化工藝路線一般為首先將發(fā)酵液中的菌體分離，然后酶解除蛋白質(zhì)，乙醇沉淀，絡(luò)合，解離，再沉淀，脫水干燥獲得透明質(zhì)酸鈉HA-Na成品。中國專利公開號CN1597704A，
公開日是2004年3月23日，名稱為“一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液中制備透明質(zhì)酸鈉的方法”中公開了一種從發(fā)酵液中制備透明質(zhì)酸鈉的方法，其工藝步驟為發(fā)酵液加熱、過濾去除菌體，清液中添加蛋白酶去除蛋白質(zhì)，乙醇沉淀，溶解，絡(luò)合，解離，超濾，乙醇沉淀，最后洗滌脫水干燥獲得透明質(zhì)酸鈉成品。制得的透明質(zhì)酸鈉分子量為1.8×106。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液中制備低分子量透明質(zhì)酸鈉的方法。該法操作簡便，成品純度高且分子量分布相對集中，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案實現(xiàn)的將透明質(zhì)酸發(fā)酵液滅活(也可不滅活)、過濾去除菌體。向濾液中加入乙醇，靜置沉淀出透明質(zhì)酸。用純水溶解沉淀，然后添加透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase)，控制不同的溫度和pH值將高分子量透明質(zhì)酸分子降解為低分子量分子。將得到的分子量相對集中的透明質(zhì)酸發(fā)酵液通過不同分子量通透率的膜組件從而制得低分子量的透明質(zhì)酸鈉。再次用乙醇沉淀，將沉淀用無水乙醇洗滌兩次后真空干燥得到透明質(zhì)酸鈉成品。
具體操作步驟如下1.將發(fā)酵液用純水稀釋1倍，然后按每升40g加入硅藻土、每升1g加入活性炭，攪拌2小時以吸附菌體并脫除發(fā)酵液的顏色，之后用板框過濾或離心分離的方法除去固形物。
2.將所得清液用稀氫氧化鈉調(diào)pH值6.5～7.0，加1.5倍初始發(fā)酵液體積的95％乙醇，靜置沉淀出透明質(zhì)酸，棄去上清液。
3.用與初始發(fā)酵液體積相等的純水攪拌溶解透明質(zhì)酸沉淀。
4.將透明質(zhì)酸溶液的pH值調(diào)至5.0～7.0，溫度調(diào)至35～42℃，按質(zhì)量體積比0.1％加入透明質(zhì)酸酶反應(yīng)4小時，使透明質(zhì)酸降解為低分子量。
5.選擇分子量通透率為5,000～20,000的膜組件，或根據(jù)需要的分子量選擇的膜組件，將發(fā)酵液充分過濾，收集透明質(zhì)酸濾液。
6.向濾液中加入2倍初始發(fā)酵液體積的95％乙醇沉淀，收集沉淀物透明質(zhì)酸鈉。
7.將收集的沉淀物用無水乙醇洗滌2次，然后在60～70℃真空干燥4小時，得到透明質(zhì)酸鈉成品。
本發(fā)明還可以采用這樣的方案將透明質(zhì)酸發(fā)酵液加入1.5倍的95％乙醇靜置沉淀出透明質(zhì)酸，收集沉淀。將沉淀用與發(fā)酵液初始體積相等的純水攪拌充分溶解，然后按40g/L加入硅藻上、按1g/L加入活性炭，攪拌2小時以吸附菌體以及有色物質(zhì)，過濾除去發(fā)酵液中的固形物。將濾液調(diào)節(jié)pH值5.0～7.0，溫度35～42℃，按質(zhì)量體積比0.1％加入透明質(zhì)酸酶，酶解反應(yīng)4小時。選擇分子量通透率5,000～20,000的膜過濾裝置，過濾透明質(zhì)酸溶液，得到透明質(zhì)酸濾液。向濾液中加入2倍初始發(fā)酵液體積的95％乙醇進行沉淀，將收集的沉淀物透明質(zhì)酸鈉用無水乙醇清洗2次，固體在60～70℃真空干燥4小時即得到透明質(zhì)酸鈉成品。
本發(fā)明進一步限定用透明質(zhì)酸酶酶解的pH值為5.5～6.0，最適pH值為5.7；進一步限定酶解的溫度為38.5℃。而通過調(diào)節(jié)不同的酶解條件如pH值、溫度、時間等，以及選擇不同分子量通透率的膜組件可以制得不同平均分子量的低分子量透明制酸鈉。
使用本發(fā)明提供的方法制備的透明質(zhì)酸鈉，根據(jù)所選擇膜組件分子量通透率的不同，其平均分子量可控制在8,000～20,000之間，最低可至5,000左右，而且分子量分布較窄(多分散指數(shù)PD值可控制在1.8以內(nèi))，同時根據(jù)酶反應(yīng)時間長短不同，分子量也可以控制在20,000～500,000之間。蛋白質(zhì)含量不高于0.1％。成品為白色粉末，感官品質(zhì)具佳。使用本法制備透明質(zhì)酸鈉，工藝過程相對簡單，不需大量使用有機溶劑，適于工業(yè)化生產(chǎn)，同時兼顧環(huán)保。通過選擇不同分子量通透率的膜組件可以制備不同分子量的低分子量透明質(zhì)酸鈉。
具體實施例方式
實施例1將發(fā)酵得到的透明質(zhì)酸發(fā)酵液(含透明質(zhì)酸4.4g/L，平均分子量100萬～150萬)1L，用1L純水稀釋，然后加入80g硅藻土和2g活性炭，攪拌2小時以吸附菌體以及有色物質(zhì)，過濾除去發(fā)酵液中的固形物。濾液用稀氫氧化鈉溶液調(diào)pH值6.8，加1.5L的95％乙醇，靜置沉淀出透明質(zhì)酸，收集沉淀，棄去上清液。將沉淀用1L純水攪拌充分溶解，調(diào)節(jié)pH值5.7，溫度38.5℃，加入200u/mg的透明質(zhì)酸酶2g，酶解反應(yīng)4小時。選擇分子量通透率5,000～10,000的膜過濾裝置過濾透明質(zhì)酸溶液，得到透明質(zhì)酸濾液。向濾液中加入95％乙醇2L進行沉淀，將收集的沉淀物透明質(zhì)酸鈉用無水乙醇清洗2次，固體在60～70℃真空干燥4小時即得到透明質(zhì)酸鈉成品。經(jīng)凝膠色譜法檢測分子量為7,600，PD值為1.7。
對照例1用實施例1相同的方法，但是酶解后的透明質(zhì)酸液體不經(jīng)過膜過濾處理，而直接進行第二次乙醇沉淀，脫水干燥后得到透明質(zhì)酸鈉成品。經(jīng)凝膠色譜法檢測分子量為8,400，PD值為2.1。
實施例2將發(fā)酵得到的透明質(zhì)酸發(fā)酵液(含透明質(zhì)酸4.4g/L，平均分子量100萬～150萬)1L加入1.5L的95％乙醇靜置沉淀出透明質(zhì)酸，收集沉淀。將沉淀用1L純水攪拌充分溶解，然后加入40g硅藻土和1g活性炭，攪拌2小時以吸附菌體以及有色物質(zhì)，過濾除去發(fā)酵液中的同形物。將濾液調(diào)節(jié)pH值5.7，溫度38.5℃，加入200u/mg的透明質(zhì)酸酶2g，酶解反應(yīng)3.5小時。選擇分子量通透率12,000～20,000的膜過濾裝置，過濾透明質(zhì)酸溶液，得到透明質(zhì)酸濾液。向濾液中加入95％乙醇2L進行沉淀，將收集的沉淀物透明質(zhì)酸鈉用無水乙醇清洗2次，固體在60～70℃真空干燥4小時即得到透明質(zhì)酸鈉成品。結(jié)果用凝膠色譜法測得分子量為12.500，PD值為1.8。
對照例2用實施例2相同的方法，但是酶解后的透明質(zhì)酸液體不經(jīng)過膜過濾處理，而直接進行第二次乙醇沉淀，脫水干燥后得到透明質(zhì)酸鈉成品。經(jīng)凝膠色譜法檢測分子量為13,800，PD值為2.4。
備注平均分子量分為重均分子量Mw和數(shù)均分子量Mn，其比值稱為多分散指數(shù)(polydispersion index，PD)，即PD＝Mw/Mn，PD值越小表明分子量分布范圍越窄。
權(quán)利要求
1.一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟1)將發(fā)酵液用純水稀釋，然后加入硅藻土、活性炭，攪拌以吸附菌體并脫除發(fā)酵液顏色，之后用板框過濾或離心分離的方法除去固形物。2)將所得清液用稀氫氧化鈉調(diào)pH值6.5～7.0，加1.5倍初始發(fā)酵液體積的95％乙醇，靜置沉淀出透明質(zhì)酸，棄去上清液。3)用與初始發(fā)酵液體積相等的純水攪拌溶解透明質(zhì)酸沉淀。4)調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸溶液的pH值、溫度，加入透明質(zhì)酸酶進行反應(yīng)，使透明質(zhì)酸降解為低分子最。5)選擇不同分子量通透率的膜組件，將發(fā)酵液充分過濾，收集透明質(zhì)酸濾液。6)將濾液加入2倍體積的95％乙醇進行沉淀，收集沉淀物透明質(zhì)酸鈉。7)將收集的沉淀物用無水乙醇洗滌2次，然后真空干燥，得到透明質(zhì)酸鈉成品。
2.一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法，其特征在于該方法還可以采用以下步驟1)將透明質(zhì)酸發(fā)酵液加入1.5倍的95％乙醇靜置沉淀出透明質(zhì)酸，收集沉淀。2)將沉淀用與發(fā)酵液初始體積相等的純水攪拌充分溶解，然后加入硅藻土、活性炭，攪拌以吸附菌體以及有色物質(zhì)，過濾除去發(fā)酵液中的固形物。3)調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸溶液的pH值、溫度，加入透明質(zhì)酸酶進行反應(yīng)，使透明質(zhì)酸降解為低分子量。4)選擇不同分子量通透率的膜組件，將發(fā)酵液充分過濾，得到透明質(zhì)酸濾液。5)濾液用2倍初始發(fā)酵液體積的95％乙醇進行沉淀。6)將收集的沉淀物透明質(zhì)酸鈉用無水乙醇清洗2次，固體在60～70℃真空干燥4小時即得到透明質(zhì)酸鈉成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法，其特征在于用透明質(zhì)酸酶將高分子量透明質(zhì)酸降解為低分子量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法，其特征在于將透明質(zhì)酸溶液的pH值調(diào)至5.5～6.0，進行酶解。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法，其特征在于將透明質(zhì)酸溶液的pH值調(diào)至5.7，進行酶解。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法，其特征在于將透明質(zhì)酸溶液的溫度調(diào)至38.5℃，進行酶解。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法，其特征在于選擇不同分子量通透率的膜組件，對酶解過的透明質(zhì)酸溶液進行過濾。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低分子量透明質(zhì)酸鈉的制備方法，特別是一種從透明質(zhì)酸發(fā)酵液中制備低分子量透明質(zhì)酸鈉的方法。其方法是透明質(zhì)酸發(fā)酵液除去菌體，乙醇沉淀，溶解沉淀，透明質(zhì)酸酶降解，使用膜組件制得低分子量透明質(zhì)酸鈉溶液，再次乙醇沉淀，洗滌沉淀，真空干燥得到成品。其方法還可以是將透明質(zhì)酸發(fā)酵液用乙醇沉淀，溶解沉淀，濾去固形物，濾液用透明質(zhì)酸酶降解，使用膜組件制得低分子量透明質(zhì)酸鈉溶液，再次乙醇沉淀，洗滌沉淀，真空干燥得到成品。本法制備的透明質(zhì)酸鈉其平均分子量可控制在8,000～20,000之間，最低可至5,000左右，而且分子量分布較窄。蛋白質(zhì)含量不高于0.1％。本法工藝過程相對簡單，不需大量使用有機溶劑，適于工業(yè)化生產(chǎn)，同時兼顧環(huán)保。
文檔編號C08B37/00GK101020724SQ20061005481
公開日2007年8月22日 申請日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者丁春華 申請人:鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責任公司