專利名稱：一種肽改性鏈段及其在肽分子影像探針改性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肽改性鏈段及其應(yīng)用，特別涉及一種肽改性鏈段及其在肽分子影像探針改性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
正電子發(fā)射斷層掃描(PET)作為21世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷的尖端技術(shù)，被稱為“活體生化顯像”技術(shù)，可以從體外無(wú)創(chuàng)、定量、動(dòng)態(tài)地觀察人體內(nèi)的生理、生化變化，洞察標(biāo)記藥物在正常人或病人體內(nèi)的活動(dòng)，在分子影像研究領(lǐng)域中地位顯著。相比于常規(guī)B 超、CT、MR等解剖影像手段，它可以早期提供功能、代謝信息；與SPECT相比，PET分辨率高， 可定量分析，具有明顯優(yōu)勢(shì)。PET采用的分子影像探針絕大多數(shù)是人體內(nèi)源性代謝物或類似物。PET顯像核素常為體內(nèi)必需元素，如18F可以替換代謝物的H原子，所得類似物的生物活性與原代謝物很相似；且18F的物理半衰期短(tl/2= 109. 7分鐘)，對(duì)人輻照劑量小。以腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的受體為靶向的肽分子影像探針具有快速清除、優(yōu)良的組織滲透性和低免疫原性等特性，是目前分子影像研究的熱點(diǎn)。盡管PET和18F標(biāo)記的分子成像探針具有很多優(yōu)勢(shì)，但目前只有少數(shù)幾種18F標(biāo)記的肽分子影像探針被應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)， 還沒(méi)有一種肽分子影像探針通過(guò)美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)的審批正式用于臨床。 究其原因主要是肽分子影像探針在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)性能差。盡管體外實(shí)驗(yàn)表明許多肽分子影像探針具有很好的受體結(jié)合能力及細(xì)胞攝取，但是PET顯像結(jié)果卻很差，腫瘤攝取和腫瘤與背景的對(duì)比度難以達(dá)到要求。通常必須對(duì)靶向肽進(jìn)行修飾以改進(jìn)其藥代動(dòng)力學(xué)性能，才能用于PET顯像，常用方法包括聚乙二醇(PEG)修飾和引入糖結(jié)構(gòu)。這兩項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于RGD多肽分子影像探針的修飾改性。但是對(duì)于親水性很差的肽分子影像探針， 這兩項(xiàng)技術(shù)改性的效果并不理想，且不易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。因此，開(kāi)發(fā)一種新的肽分子影像探針改性技術(shù)是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述缺陷，提供了一種肽改性鏈段，結(jié)構(gòu)式如下 (L) m- (A) n- (S) ο,
其中L為連接鏈段，m為0-10 ；A為PN或NP氨基酸對(duì)，η為1_10 ；S為間隔鏈段，ο為 0-10。所述連接鏈段L為甘氨酸或乙二醇組成；所述m為1-10，ο為1_10 ；所述m為3，n 為1, ο為1。所述PN或NP氨基酸對(duì)中，氨基酸P和氨基酸N具有相反電荷。所述P為精氨酸或賴氨酸，N為天冬氨酸或谷氨酸，具體選自如下8種組合，PN 精氨酸-天冬氨酸，精氨酸-谷氨酸，賴氨酸-天冬氨酸，賴氨酸-谷氨酸；NP 天冬氨酸-精氨酸，天冬氨酸-賴氨酸，谷氨酸-精氨酸，谷氨酸-賴氨酸。所述間隔鏈段S由氨基酸或乙二醇組成。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種上述肽改性鏈段在肽分子影像探針改性中的應(yīng)用，是將肽改性鏈段插入到分子探針結(jié)構(gòu)中靶向肽部分和顯像核素部分之間制備得到改性后的肽分子影像探針。所述分子探針結(jié)構(gòu)靶向肽部分為具有腫瘤靶向作用的多肽。所述分子探針結(jié)構(gòu)靶向肽部分為胃泌素受體肽。所述顯像核素部分為用于PET/SPECT的顯像核素、含PET/SPECT顯像核素的標(biāo)記前體或近紅外線熒光顯像核素中的任意一種。所述用于PET/SPECT 的顯像核素為 18F, "C，，64Cu, 99mTc，188Re ；所述用于 PET/ SPECT的顯像核素為18F或68^1 ；所述含PET/SPECT顯像核素的標(biāo)記前體為18F-FP, 18F-SFB, 18F-FBA, 68Ga-DOTA,68Ga-NOTA,64Cu-DOTA,99mTc_hynic ；所述含 PET/SPECT 顯像核素的標(biāo)記前體為18F-FP或68^1-DOTA ；所述近紅外線熒光顯像核素為Cy5. 5。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明所提供的肽改性鏈段及其在肽分子影像探針改性中的應(yīng)用，可以顯著改善靶向肽的藥代動(dòng)力學(xué)性能，增加腫瘤攝取值和腫瘤與背景的對(duì)比度， 優(yōu)化顯像質(zhì)量。應(yīng)用自動(dòng)肽合成儀通過(guò)Fmoc保護(hù)化學(xué)可以方便制得目標(biāo)肽產(chǎn)物，適合大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1為18F標(biāo)記的改性前的肽分子影像探針1和應(yīng)用本發(fā)明肽改性鏈段修飾后的 18F標(biāo)記的肽分子影像探針2的結(jié)構(gòu)式。其中，1為18F標(biāo)記的改性前的肽分子影像探針1 ；2為應(yīng)用本發(fā)明肽改性鏈段修飾后的18F標(biāo)記的肽分子影像探針2。圖2為標(biāo)記的改性前的肽分子影像探針3和應(yīng)用本發(fā)明肽改性鏈段修飾后的 68Ga標(biāo)記的肽分子影像探針4的結(jié)構(gòu)式。其中，3為標(biāo)記的改性前的肽分子影像探針3 ；4為應(yīng)用本發(fā)明肽改性鏈段修飾后的68Ga標(biāo)記的肽分子影像探針4。圖3為Cy5. 5標(biāo)記的改性前的肽分子影像探針5和應(yīng)用本發(fā)明肽改性鏈段修飾后的Cy5. 5標(biāo)記的肽分子影像探針6的結(jié)構(gòu)式。其中，5為Cy5. 5標(biāo)記的改性前的肽分子影像探針5 ；6為應(yīng)用本發(fā)明肽改性鏈段修飾后的Cy5. 5標(biāo)記的肽分子影像探針6。圖4為荷PC-3瘤裸鼠尾靜脈分別注射3. 7 MBq (100 μ Ci) 18F標(biāo)記的肽分子影像探針1和2后0. 5、1小時(shí)冠狀microPET顯像圖。圖5為荷PC-3瘤裸鼠尾靜脈分別注射3. 7 MBq (100 μ Ci) 標(biāo)記的肽分子影像探針3和4后0. 5、1小時(shí)冠狀microPET顯像圖。圖6為荷PC-3瘤裸鼠尾靜脈分別注射IOOnM Cy5. 5標(biāo)記的肽分子影像探針5和 6后分別于0. 5、2、4、24小時(shí)的光學(xué)成像圖。其中，探針1、3、5為改性前的探針，探針2、4、6為改性后的探針。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)用新型的具體實(shí)施方式
。
實(shí)施例1
實(shí)驗(yàn)原理
以靶點(diǎn)為胃泌素釋放肽受體的蛙皮素多肽衍生物為例。序列為D-Phe-Gln-Trp-Ala-V Bl-Gly-His-Leu-NHCH2CH3的多肽具有胃泌素釋放肽受體靶向性，可以通過(guò)與正電子核素 (比如18F, 68Ga)標(biāo)記前體18F-2-氟苯丙酸，螯合劑DOTA反應(yīng)制得18F, 標(biāo)記的肽分子影像探針1和3用于PET顯像，或者與近紅外線熒光顯像核素cy5. 5反應(yīng)制得cy5. 5標(biāo)記的肽分子影像探5用于光學(xué)顯像.肽分子影像探針1，3，5顯像效果不好，其改性可通過(guò)將肽改性鏈段 Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn 插入到 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu -NHCH2CH3和顯像部分18F-2-氟苯丙酸，螯合劑DOTA或cy5. 5之間制備得到改性后的肽分子影像探針2，4，6_改性前肽分子影像探針1、3、5和改性后肽分子影像探針2、4、6的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1、2和3所示。材料與方法
1、蛙皮素多肽合成
所用化學(xué)試劑均為化學(xué)純。通過(guò)固相Fmoc化學(xué)法采用CS Bio公司CS 336X多肽自動(dòng)合成儀，制得肽分子影像探針1，3，5的前體肽(D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu -NHCH2CH3)，和肽分子影像探針 2，4，6 的前體肽(Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn-D-Phe-Gln -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-NHCH2CH3)。具體方法為采用[Ethyl-Fmoc-amino)methyl] AM F樹(shù)脂，氨基酸采用Fmoc保護(hù)的前體(Cs Bio公司，美國(guó))，將上述試劑加入合成儀對(duì)應(yīng)的試劑瓶中，按序列置于合成儀樣品盤，采用合成儀自帶的通用程序于室溫自動(dòng)合成。 待合成結(jié)束，取樹(shù)脂，干燥，加IOml三氟乙酸，室溫裂解池，裂解液加乙醚(30ml*2)離心 (4000rpm*5min)，所得白色沉淀物加水溶解，經(jīng)制備型HPLC純化，凍干，即得上述多肽。純化條件為Proto 300 C18 柱(156843 ;5um, 25(^20mm, Higgins Analytical, Inc.美國(guó))， 流速為lOml/min。采用梯度洗脫，洗脫劑組成從0_2分鐘時(shí)的95%溶劑A (0. 1%TFA水溶液)和5%溶劑B (0. 1%TFA的乙腈溶液)變化到32分鐘時(shí)的35%溶劑A (0. 1%TFA水溶液) 和65%溶劑B (0. 1%TFA的乙腈溶液)。上述多肽凍干品經(jīng)MALDI-TOF-MS (Waters 公司，美國(guó))鑒定，D-Phe-Gln-Trp-A 1 a-VaI-Gly-Hi S-Leu-NHCH2CH3 (m/z 984.61，理論值[MW] 984.15); Gly-Gly-Gly-Ar g-Asp-Asn-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS-Leu-NHCH2CH3 (m/z 1540.92，理論值[MW] 1540. 68)。2、多肽標(biāo)記
18F標(biāo)記18F-來(lái)源于GE公司的PETtracer回旋加速器。采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法方法 (Haubner R, Kuhnast B, Mang C, Weber WA, Kessler H, Wester HJ, etal (2004) [18F] Galacto-RGD synthesis, radiolabeling, metabolic stability, and radiation dose estimates. Bioconjug Chem 15:61-69)制得18F_2氟丙酸對(duì)硝基苯酯。干燥后加入前體肽(500ug)的二甲基亞砜溶液(DMS0，200μL)和N，N-二異丙基乙胺溶液(DIPEA，20 μ L)。 40°C反應(yīng)30分鐘，然后加入SOOuL質(zhì)量百分濃度5%乙酸中止反應(yīng)。采用HPLC對(duì)分子探針1 或2的粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化條件為CW Vydac蛋白質(zhì)和肽柱(218TP510 ;5 μ m, 250 X 10 mm)，流速為5ml/min。采用梯度洗脫，洗脫劑組成從0_2分鐘時(shí)的95%溶劑A (0. 1%TFA 水溶液)和5%溶劑B (0. 1%TFA的乙腈溶液)變化到32分鐘時(shí)的35%溶劑A (0. 1%TFA水溶液)和65%溶劑B (0. 1%TFA的乙腈溶液)。收集純化產(chǎn)物并用15mL水稀釋。溶液流經(jīng)C18 萃取柱(S印-Pak C18萃取柱(Waters公司)，使用前用無(wú)水乙醇5ml和水IOml處理)，并用5mL水沖洗。純化后的18F標(biāo)記的分子探針1或2用ImL乙醇洗脫。洗脫液在40°C下用氮?dú)獯蹈?。殘余物溶于生理鹽水中并用0.22 μ m濾膜過(guò)濾至無(wú)菌瓶中備用。過(guò)濾器和聚醚砜膜(孔徑，0.22毫米，直徑13毫米)均購(gòu)自Nalge Nunc International0未修飾的前體肽的標(biāo)記產(chǎn)率為30%左右，修飾過(guò)的前體肽標(biāo)記產(chǎn)率> 90%。所有標(biāo)記產(chǎn)物的放化純由HPLC 測(cè)得均大于95%，條件為C18 Vydac蛋白質(zhì)和肽分析柱(5 μ m, 250 X 4. 6mm)，流速為lml/ min0合成結(jié)束時(shí)根據(jù)放射劑量除以示蹤劑摩爾數(shù)得到比活度約為50TBq/mmol。68Ga標(biāo)記以二甲基甲酰胺200 μ L為溶劑，加入等摩爾的D0TA-NHS — Ester (1，4，7，10-
Tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-Tetraacetic Acid Mono-N-Hydroxysuccinimide Ester, Macrocyclics公司，美國(guó))和前體肽，再加入N，N-二異丙基乙胺溶液(DIPEA) 20μ L，混勻，40°C反應(yīng)30分鐘，加入2ml質(zhì)量百分濃度5%的乙酸中止反應(yīng)。上述粗產(chǎn)品經(jīng) HPLC純化。純化條件為高效液相色譜為Waters600 HPLC系統(tǒng)(Waters公司)。Cw Vydac 蛋白質(zhì)和肽柱(Dionex公司，美國(guó)，218TP510 ;5 μ m，250 X 10 mm)，流速為5ml/min。采用梯度洗脫，洗脫劑組成從0-2分鐘時(shí)的95%溶劑A (0. P/oTFA水溶液)和5%溶劑B (0. 1%TFA 的乙腈溶液)變化到32分鐘時(shí)的35%溶劑A (0. P/oTFA水溶液)和65%溶劑B (0. 1%TFA的乙腈溶液)，凍干，產(chǎn)率> 80%。將純化后產(chǎn)物配成濃度為10ug/10uL的水溶液，取10uL， 加入HEPES緩沖液(1M)450uL，再加入68fei的鹽酸(0. 6M)洗脫液(5mCi/500uL)，混勻，80°C 反應(yīng)10分鐘得到68Ga標(biāo)記的分子探針3或4。標(biāo)記產(chǎn)率(>95%)，HPLC測(cè)定放化純>95%， 測(cè)定條件為C18 Vydac蛋白質(zhì)和肽分析柱(5 μ m, 250 X 4. 6mm)，流速為lml/min)。68Ga 標(biāo)記的分子探針3或4用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾至無(wú)菌瓶中備用。過(guò)濾器和聚醚砜膜(孔徑， 0. 22 毫米，直徑 13 毫米)均購(gòu)自 Nalge Nunc hternational。Cy5. 5標(biāo)記以二甲基甲酰胺200 μ L為溶劑，加入等摩爾的Cy5. 5-NHS Ester (Lumiprobe公司，美國(guó))和前體肽，再加入N, N- 二異丙基乙胺(DIPEA) 20 μ L，混勻，
40°C反應(yīng)30分鐘，加入2ml質(zhì)量百分濃度5%的乙酸中止反應(yīng)。上述粗產(chǎn)品經(jīng)HPLC純化。 純化條件為高效液相色譜為Waters600 HPLC系統(tǒng)(Waters公司)。C18 Vydac蛋白質(zhì)和肽柱(Dionex公司，美國(guó)，218TP510 ;5 μ m, 250 X 10 mm)，流速為5ml/min。采用梯度洗脫，洗脫劑組成從0-2分鐘時(shí)的95%溶劑A (0. P/oTFA水溶液)和5%溶劑B (0. 1%TFA的乙腈溶液)變化到32分鐘時(shí)的35%溶劑A (0. P/oTFA水溶液)和65%溶劑B (0. 1%TFA的乙腈溶液)，凍干，即得Cy5. 5標(biāo)記的分子探針5或6。產(chǎn)率均> 80%。3、建立細(xì)胞和動(dòng)物模型
PC-3人前列腺癌細(xì)胞株用于動(dòng)物模型的制備，在37°C和5% CO2條件下，PC-3細(xì)胞在 F-II培養(yǎng)基(10%FBS) (GIBC0,美國(guó))中生長(zhǎng)。在無(wú)胸腺裸鼠前側(cè)皮下注入5X IO6個(gè)腫瘤細(xì)胞，得PC-3腫瘤模型。當(dāng)腫瘤長(zhǎng)至100 - 300 mm3 (接種后3-4星期)時(shí)，該模型鼠可用于 microPET或光學(xué)顯像。4、MicroPET 顯像
使用西門子INVEON microPET進(jìn)行microPET顯像。在異氟烷麻醉后，荷瘤鼠(每組 5只)尾靜脈注入3. 7 MBq (100 μ Ci) 18F標(biāo)記的肽分子影像探針1或2或標(biāo)記的肽分子影像探針3或4。注射后分別于30分鐘和1小時(shí)，進(jìn)行5分鐘靜態(tài)掃描。使用 2維有序子集最大期望值迭代方法(0SEM 2D)進(jìn)行圖象重建。ASI Pro 5. 2. 4. 01軟件分析。由圖4和圖5 microPET影像中的顏色變化(由黑到白攝取值逐漸增高)，可見(jiàn)18F、68Ga 標(biāo)記的肽分子影像探針1和3性能不佳，探針1未見(jiàn)腫瘤攝取，1和3均見(jiàn)肝、腎、腸攝取高。而經(jīng)過(guò)Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn修飾后的肽分子影像探針2和4則顯像效果良好。 探針2在注射后0. 5，Ih腫瘤吸收分別為2. 8 士0. 7，1. 8 士0. 3 ID%/g，注射后0. 5h腫瘤與肝、腎、肌肉的吸收比值分別為3. 52，0. 71，6. 19。探針4在注射后0. 5，Ih腫瘤吸收分別為 5. 6士 1. 2，3. 7士0. 6 ID%/g ；注射后0. 5h腫瘤與肝、腎、肌肉的吸收比值分別為7. 33，0. 48， 11. 52。連接鏈段修飾前后，示蹤劑的顯著差異性清楚地表明Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn肽改性鏈段可以顯著改善示蹤劑的藥代動(dòng)力學(xué)性能。
5.光學(xué)顯像
使用美國(guó)CRi Maestro 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行光學(xué)顯像，結(jié)果如圖6所示。在異氟烷麻醉后，荷瘤鼠(每組5只)尾靜脈注入Cy5. 5標(biāo)記的肽分子影像探針5或6。注射后分別于30分鐘、2小時(shí)、4小時(shí)和M小時(shí)成像。Cy5. 5標(biāo)記的肽分子影像探針5性能不佳，腫瘤對(duì)探針不攝取(圖6中，由黑到紅攝取值逐漸增高)，主要通過(guò)肝腎排泄。而經(jīng)過(guò) Gly-Gly-Gly-Arg-Asp-Asn修飾后的肽分子影像探針6則顯像效果良好，示蹤劑在腫瘤中濃聚快(0.證已達(dá)高峰)，滯留時(shí)間長(zhǎng)(24h仍可見(jiàn)明顯腫瘤攝取)，腫瘤/肌肉吸收比值于注射后0. 5h，2h，4h，24h分別為5. 1,6. 7，11. 2,9. 5，主要通過(guò)腎排泄。
權(quán)利要求
1.一種肽改性鏈段，其特征在于結(jié)構(gòu)式如下(L) m- (A) n- (S) ο,其中L為連接鏈段，m為0-10 ；A為PN或NP氨基酸對(duì)，η為1_10 ；S為間隔鏈段，ο為 0-10。
2.如權(quán)利要求1所述的肽改性鏈段，其特征在于所述連接鏈段L為甘氨酸或乙二醇組成；所述m為1-10，ο為1-10 ；所述m為3，η為1，ο為1。
3.如權(quán)利要求2所述的肽改性鏈段，其特征在于所述PN或NP氨基酸對(duì)中，氨基酸P 和氨基酸N具有相反電荷。
4.如權(quán)利要求3所述的肽改性鏈段，其特征在于所述P為精氨酸或賴氨酸，N為天冬氨酸或谷氨酸，具體選自如下8種組合，PN:精氨酸-天冬氨酸，精氨酸-谷氨酸，賴氨酸-天冬氨酸，賴氨酸-谷氨酸；NP 天冬氨酸-精氨酸，天冬氨酸-賴氨酸，谷氨酸-精氨酸，谷氨酸-賴氨酸。
5.如權(quán)利要求4所述的肽改性鏈段，其特征在于所述間隔鏈段S由氨基酸或乙二醇組成。
6.一種如權(quán)利要求1-5任一所述的肽改性鏈段在肽分子影像探針改性中的應(yīng)用，其特征在于是將肽改性鏈段插入到分子探針結(jié)構(gòu)中靶向肽部分和顯像核素部分之間制備得到改性后的肽分子影像探針。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述分子探針結(jié)構(gòu)靶向肽部分為具有腫瘤靶向作用的多肽。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述分子探針結(jié)構(gòu)靶向肽部分為胃泌素受體肽。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述顯像核素部分為用于PET/SPECT的顯像核素、含PET/SPECT顯像核素的標(biāo)記前體或近紅外線熒光顯像核素中的任意一種。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述用于PET/SPECT的顯像核素為18F, 11C, 68Ga, 64Cu, 99mTc, 188Re ；所述用于 PET/SPECT 的顯像核素為 18F 或 68Ga ；所述含 PET/ SPECT 顯像核素的標(biāo)記前體為 18F-FP, 18F-SFB, 18F-FBA, 68Ga-DOTA, 68Ga-NOTA, 64Cu-DOTA, 99mTc-hynic ；所述含PET/SPECT顯像核素的標(biāo)記前體為18F-FP或68^1-DOTA ；所述近紅外線熒光顯像核素為Cy5.5。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種肽改性鏈段，結(jié)構(gòu)式如下(L)m-(A)n-(S)o，其中L為連接鏈段，m為0-10；A為PN或NP氨基酸對(duì)，n為1-10；S為間隔鏈段，o為0-10。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明所提供的肽改性鏈段及其在肽分子影像探針改性中的應(yīng)用，可以顯著改善靶向肽的藥代動(dòng)力學(xué)性能，增加腫瘤攝取值和腫瘤與背景的對(duì)比度，優(yōu)化顯像質(zhì)量。應(yīng)用自動(dòng)肽合成儀通過(guò)Fmoc保護(hù)化學(xué)可以方便制得目標(biāo)肽產(chǎn)物，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K101/00GK102276688SQ201110038979
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2011年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月19日
發(fā)明者嚴(yán)勇軍, 楊敏, 陳小元 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所