本發(fā)明涉及干細胞分化技術領域，尤其涉及用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基。

背景技術：

隨著近年來組織工程研究的進展，干細胞移植治療晚期肝病已經(jīng)成為最具前景的發(fā)展方向。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干細胞家族的重要成員，因具有多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控和自我復制等特點，日益受到人們的關注。間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，可分化為多種組織細胞，進而發(fā)揮替代、修復組織的作用。利用MSCs誘導分化為肝細胞進而移植修復肝臟，已成為極具前景的治療肝病的新方法。

目前誘導MSCs向肝細胞分化技術含有：改變干細胞生長的環(huán)境，如聯(lián)合使用細胞因子、小分子化合物、細胞基質(zhì)等，但如何恰當搭配各種因素促進誘導分化效率仍是一個問題；利用基因轉(zhuǎn)移技術改造細胞，但存在致瘤性等安全性問題；蛋白轉(zhuǎn)導技術，采用病毒載體介導蛋白基因轉(zhuǎn)入細胞，但存在轉(zhuǎn)染效率不高的問題。常用的細胞因子組合培養(yǎng)體系包括了成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)，使用的細胞因子多，成本較高。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠很好地應用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的試劑盒的制備和體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的過程中。本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠?qū)崿F(xiàn)脂肪來源間充質(zhì)干細胞的大規(guī)模生產(chǎn)，且實現(xiàn)體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞高效分化為肝細胞，操作簡便、成本低。

本發(fā)明提供了用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基，包括消化酶溶液、脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基、同步化培養(yǎng)基、誘導分化培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基；

所述消化酶溶液包含0.1～0.2％質(zhì)量濃度的I型膠原酶、0.1～0.2％質(zhì)量濃度的透明質(zhì)酸酶、1～3U/ml硫酸軟骨素酶和余量的水；

所述脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基為含有10～20％體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；

所述同步化培養(yǎng)基為無血清的IMDM培養(yǎng)基；

所述誘導分化培養(yǎng)基包含10～15ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、2～5％體積分數(shù)的胎牛血清、20～40ng/ml肝細胞生長因子和1～5μM維甲酸的IMDM培養(yǎng)基；

所述成熟培養(yǎng)基為包含2～5％體積分數(shù)的胎牛血清、10～30ng/ml抑瘤素M、1～2μM地塞米松和1～5％體積分數(shù)的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的IMDM培養(yǎng)基。

優(yōu)選的是，所述消化酶溶液包含等體積的0.1～0.2％質(zhì)量濃度的I型膠原酶、0.1～0.2％質(zhì)量濃度的透明質(zhì)酸酶和1～3U/ml硫酸軟骨素酶。

優(yōu)選的是，所述堿性成纖維細胞生長因子為FGF4。

優(yōu)選的是，所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒為包括8～12μg/ml胰島素、4.5～6.5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和6～7.5ng/ml亞硒酸鈉的水溶液。

本發(fā)明還提供了一種用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的試劑盒，包含權利要求1～4任意一項所述的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基以液態(tài)進行分裝，所述培養(yǎng)基在2～8℃進行保存。

本發(fā)明還提供了權利要求1～4任意一項所述培養(yǎng)基或權利要求4所述試劑盒在體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞中的應用。

本發(fā)明還提供了一種體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的方法，包括以下步驟：

采用消化酶溶液對脂肪組織進行消化，將所述消化后的細胞加入到脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng)，得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞；

將所述原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中進行傳代擴增培養(yǎng)，得到第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞；

將所述第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中進行同步化培養(yǎng)，得到周期同步化的細胞；

將所述周期同步化的細胞置于誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng)，得到分化后的細胞；

將所述分化后的細胞置于成熟培養(yǎng)基中進行成熟培養(yǎng)，得到成熟的肝細胞。

優(yōu)選的是，由所述脂肪組織培養(yǎng)至所述第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞的過程具體為：

采用磷酸鹽緩沖溶液清洗脂肪組織；

將所述清洗后的脂肪組織與消化酶溶液按1:2體積比混合進行消化，所述消化的時間為25～40min，每8～12min進行搖晃；

將所述消化后的脂肪組織過200～400目篩網(wǎng)，1000～1500rpm離心5～10min，去除上層液體，得到細胞沉淀；

將所述細胞沉淀用含10％體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸后接種于培養(yǎng)皿中進行原代培養(yǎng)，得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞；

將所述原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞，加入0.2～0.4％質(zhì)量體積分數(shù)的胰酶進行消化，傳代擴增培養(yǎng)；

當傳代擴增培養(yǎng)的細胞單層匯合80％時，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，得到第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

優(yōu)選的是，將所述第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)為成熟肝細胞的具體過程包括以下步驟：

將所述第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中，繼續(xù)同步化培養(yǎng)2～4天，得到周期同步化的細胞；

將所述周期同步化的細胞加入到誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng)，培養(yǎng)6～8天得到分化后的細胞；

將所述分化后的細胞加入到成熟培養(yǎng)基中，成熟培養(yǎng)14～21天，得到成熟的肝細胞。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基包括消化酶溶液、脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基、同步化培養(yǎng)基、誘導分化培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠應用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的過程中。獲得的脂肪來源間充質(zhì)干細胞數(shù)量多，細胞量為常規(guī)方法的2倍以上，且細胞活力達到98％以上；本發(fā)明提供的培養(yǎng)基誘導效率高，操作簡單，誘導過程無需進行基因轉(zhuǎn)染或病毒介導方法，僅需添加細胞因子和分子化合物等；成本低，僅需使用成纖維細胞生長因子和肝細胞生長因子兩種細胞因子。實現(xiàn)了在體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞中的高效應用。

附圖說明

圖1是實施例3提供的脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)過程中的細胞形態(tài)觀察示意圖；

圖2是實施例3提供的第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞流式細胞儀檢測結(jié)果圖；

圖3是實施例3提供的第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞誘導分化為成熟肝細胞過程中形態(tài)觀測結(jié)果圖；

圖4是實施例3提供的第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞與成熟肝細胞的細胞表面ALB的表達情況圖；

圖5是實施例3提供的第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞與成熟肝細胞的過碘酸雪夫染色結(jié)果圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基，包括消化酶溶液、脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基、同步化培養(yǎng)基、誘導分化培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基；

所述消化培養(yǎng)基包含0.1～0.2％質(zhì)量濃度的I型膠原酶、0.1～0.2％質(zhì)量濃度的透明質(zhì)酸酶、1～3U/ml硫酸軟骨素酶和余量的水；

所述脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基為含有10～20％體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；

所述同步化培養(yǎng)基為無血清的IMDM培養(yǎng)基；

所述誘導分化培養(yǎng)基包含10～15ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、2～5％體積分數(shù)的胎牛血清、20～40ng/ml肝細胞生長因子和1～5μM維甲酸的IMDM培養(yǎng)基；

所述成熟培養(yǎng)基為包含2～5％體積分數(shù)的胎牛血清、10～30ng/ml抑瘤素M、1～2μM地塞米松和1～5％體積分數(shù)的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的IMDM培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，所述消化酶溶液包括0.1～0.2％質(zhì)量濃度的I型膠原酶，優(yōu)選為0.15％；

所述消化酶溶液包括0.1～0.2％質(zhì)量濃度的透明質(zhì)酸酶，優(yōu)選為0.15％；

所述消化酶溶液包括1～3U/ml硫酸軟骨素酶，優(yōu)選為2U/ml；

所述消化酶溶液包括余量的水。

在本發(fā)明中，所述消化酶溶液包含等體積的0.1～0.2％質(zhì)量濃度的I型膠原酶、0.1～0.2％質(zhì)量濃度的透明質(zhì)酸酶和1～3U/ml硫酸軟骨素酶。

在本發(fā)明中，所述脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基為含10～20％體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，更優(yōu)選為含10％體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；

本發(fā)明對胎牛血清沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的胎牛血清的市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明對DMEM培養(yǎng)基的種類和來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的DMEM培養(yǎng)基市售產(chǎn)品即可。

在本發(fā)明中，所述同步化培養(yǎng)基為無血清的IMDM培養(yǎng)基，本發(fā)明所述對IMDM培養(yǎng)基的種類和來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的DMEM培養(yǎng)基市售產(chǎn)品即可。

在本發(fā)明中，所述誘導分化培養(yǎng)基為包括堿性成纖維細胞生長因子、胎牛血清、肝細胞生長因子和維甲酸的IMDM培養(yǎng)基，在所述誘導分化培養(yǎng)基中，包含10～15ng/ml堿性成纖維細胞生長因子，優(yōu)選為12ng/ml；本發(fā)明中，所述堿性成纖維細胞生長因子為FGF4。

所述誘導分化培養(yǎng)基包含2～5％體積分數(shù)的胎牛血清，優(yōu)選為3％；

所述誘導分化培養(yǎng)基包含20～40ng/ml肝細胞生長因子，優(yōu)選為30ng/ml；

所述誘導分化培養(yǎng)基包含1～5μM維甲酸，優(yōu)選包含3μM；

所述誘導分化培養(yǎng)基為包含上述各組分的IMDM培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，所述成熟培養(yǎng)基為包括胎牛血清、抑瘤素M、地塞米松和胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的IMDM培養(yǎng)基。所述成熟培養(yǎng)基包含2～5％體積分數(shù)的胎牛血清，更優(yōu)選為3％；

所述成熟培養(yǎng)基包含10～30ng/ml抑瘤素M，優(yōu)選15～25ng/ml，更優(yōu)選為18～22ng/ml；

所述成熟培養(yǎng)基包含1～5μM的地塞米松，優(yōu)選為1μM；

所述成熟培養(yǎng)基包含1～5％體積分數(shù)的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒，優(yōu)選為2％；

所述成熟培養(yǎng)基為包含上述各組分的IMDM培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉和水，具體的，在本發(fā)明中，所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒優(yōu)選制備成水溶液的形式。在本發(fā)明中，所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒包括8～12μg/ml的胰島素，優(yōu)選為10μg/ml；

所述胰島素鐵硒傳遞蛋白包括4.5～6.5μg/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白，優(yōu)選為5.5μg/ml；

所述胰島素鐵硒傳遞蛋白包括6～7.5ng/ml的亞硒酸鈉，優(yōu)選為6.7ng/ml。

本發(fā)明還提供了一種用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的試劑盒，包含上述技術方案所述的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基以液態(tài)進行分裝，所述培養(yǎng)基在2～8℃進行保存。

本發(fā)明還提供了上述技術方案所述培養(yǎng)基或上述技術方案所述試劑盒在體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞中的應用，具體提供了一種體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的方法，包括以下步驟：

采用消化酶溶液對脂肪組織進行消化，將所述消化后的細胞加入到脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng)，得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞；

將所述原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中進行傳代擴增培養(yǎng)，得到第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞；

將所述第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中進行同步化培養(yǎng)，得到周期同步化的細胞；

將所述周期同步化的細胞置于誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng)，得到分化后的細胞；

將所述分化后的細胞置于成熟培養(yǎng)基中進行成熟培養(yǎng)，得到成熟的肝細胞。

在本發(fā)明中，所述脂肪組織消化的時間優(yōu)選為25～40min，更優(yōu)選為30min；所述消化的溫度優(yōu)選為37℃。本發(fā)明優(yōu)選在所述消化的過程中，每隔8～12min對培養(yǎng)體系進行晃動，更優(yōu)選間隔10min。

完成所述消化后，本發(fā)明將所述消化后的細胞加入到脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng)，得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明在進行所述原代培養(yǎng)前，優(yōu)選將所述消化后的脂肪來源間充質(zhì)干細胞過篩和離心，得到細胞沉淀。在本發(fā)明中，所述過篩的篩網(wǎng)孔徑優(yōu)選為200～400目，更優(yōu)選為200目；所述離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為1000～1500rpm，更優(yōu)選為1000rpm；所述離心的時間優(yōu)選為5～10min。

在本發(fā)明中，所述原代培養(yǎng)過程中，優(yōu)選培養(yǎng)24～36h進行全量換液，更優(yōu)選為24h，隨后每2～3天進行半量換液，培養(yǎng)時間共5～15天，得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

完成所述原代培養(yǎng)后，本發(fā)明將得到的原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞再次接種到脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中進行傳代擴增培養(yǎng)，得到第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明在進行所述傳代擴增培養(yǎng)前，優(yōu)選將得到的原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞采用胰酶消化。在本發(fā)明中，所述胰酶濃度優(yōu)選為0.2～0.4％，更優(yōu)選為0.25％，所述胰酶的消化溫度優(yōu)選為37℃。

所述原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞生長融合達到90％，經(jīng)MTT法檢測細胞活力達98％以上。

所述傳代細胞生長達到單層匯合80％時，進行傳代培養(yǎng)，所述傳代培養(yǎng)時間為3～10天，得到第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

本發(fā)明中，將所述第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)為成熟肝細胞的具體過程包括以下步驟：

將所述第3～5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中，繼續(xù)同步化培養(yǎng)2～4天，更優(yōu)選為3天，得到周期同步化的細胞，促進誘導分化的效率；

將所述周期同步化的細胞加入到誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng)，培養(yǎng)6～8天，更優(yōu)選為7天，得到分化后的細胞；

將所述分化后的細胞加入到成熟培養(yǎng)基中，成熟培養(yǎng)14～21天，，更優(yōu)選為16天，得到成熟的肝細胞。

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明提供的用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基進行詳細的描述，但是不能將它們理解為對本申請保護范圍的限定。

實施例1

用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基分別為：

消化酶溶液：等體積0.15％I型膠原酶、0.15％透明質(zhì)酸酶、2U/ml硫酸軟骨素酶；

脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基：含10％體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；

同步化培養(yǎng)基：無血清的IMDM培養(yǎng)基；

誘導分化培養(yǎng)基：15ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、3％體積分數(shù)的胎牛血清、35ng/ml肝細胞生長因子和2.5μM維甲酸的IMDM培養(yǎng)基；

成熟培養(yǎng)基：3％體積分數(shù)的胎牛血清、15ng/ml抑瘤素M、2μM地塞米松和2％體積分數(shù)的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的IMDM培養(yǎng)基。

脂肪來源間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)

無菌條件下取脂肪組織，用3倍體積的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3遍，添加消化酶溶液，放入CO₂培養(yǎng)箱中37℃下消化培養(yǎng)25min，每隔8min輕輕搖晃培養(yǎng)皿以保證充分消化，200目篩網(wǎng)過濾，1000r/m離心8min，去上層液體，得到細胞沉淀；細胞沉淀用脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基重懸并接種于培養(yǎng)皿中，24h后全量換液，之后每2天半量換液，原代培養(yǎng)5d至生長融合達到90％，細胞活力達98％，得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞。用0.25％的胰酶對原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行消化，進行傳代擴增培養(yǎng)，當傳代細胞生長接近單層匯合80％時，繼續(xù)傳代，得到第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

將不同培養(yǎng)階段得到的細胞置于倒置顯微鏡下進行觀察，原代接種24h后的呈圓形或短梭形，大小不一；2天后細胞逐漸伸展呈長梭形，第6天開始呈漩渦狀生長，第10天可達到80％融合，0.25％胰酶消化并傳代后5天細胞達80％融合，細胞為長梭形，大小均一。

流式細胞儀檢測，第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞的免疫表型CD90、CD73、CD105均呈陽性表達(>98％)，而造血細胞系分子標記物CD45呈陰性表達(0.06％)。

將第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)為成熟肝細胞

將所述第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中，繼續(xù)同步化培養(yǎng)3天，得到周期同步化的細胞；

將上述周期同步化的細胞加入到誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng)，培養(yǎng)6天得到分化后的細胞；

將所述分化后的細胞加入到成熟培養(yǎng)基中，成熟培養(yǎng)16天，得到成熟的肝細胞。

實施例2

用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基分別為：

消化酶溶液：等體積0.2％I型膠原酶、0.2％透明質(zhì)酸酶、3U/ml硫酸軟骨素酶；

脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基：含15％體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；

同步化培養(yǎng)基：無血清的IMDM培養(yǎng)基；

誘導分化培養(yǎng)基：14ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、2％體積分數(shù)的胎牛血清、30ng/ml肝細胞生長因子和2.5μM維甲酸的IMDM培養(yǎng)基；

成熟培養(yǎng)基：3％體積分數(shù)的胎牛血清、28ng/ml抑瘤素M、1.5μM地塞米松和3％體積分數(shù)的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的IMDM培養(yǎng)基。

脂肪來源間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)

無菌條件下取脂肪組織，用2.5倍體積的磷酸鹽緩沖溶液洗滌4遍，添加消化酶溶液，放入CO₂培養(yǎng)箱中37℃下消化培養(yǎng)35min，每隔8min輕輕搖晃培養(yǎng)皿以保證充分消化，400目篩網(wǎng)過濾，1500rpm離心8min，去上層液體，得到細胞沉淀；細胞沉淀用脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基重懸并接種于培養(yǎng)皿中，36h后全量換液，之后每1天半量換液，原代培養(yǎng)6d至生長融合達到90％，細胞活力達98％，得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞。用0.3％的胰酶對原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行消化，進行傳代擴增培養(yǎng)，當傳代細胞生長接近單層匯合80％時，繼續(xù)傳代，得到第5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

將不同培養(yǎng)階段得到的細胞置于倒置顯微鏡下進行觀察，原代接種24h后的呈圓形或短梭形，大小不一；4天后細胞逐漸伸展呈長梭形，第8天開始呈漩渦狀生長，第13天可達到80％融合，0.25％胰酶消化并傳代后4天細胞達80％融合，細胞為長梭形，大小均一。

流式細胞儀檢測，第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞的免疫表型CD90、CD73、CD105均呈陽性表達(>98％)，而造血細胞系分子標記物CD45呈陰性表達(0.06％)。

將第5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)為成熟肝細胞

將所述第5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中，繼續(xù)同步化培養(yǎng)4天，得到周期同步化的細胞；

將上述周期同步化的細胞加入到誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng)，培養(yǎng)6天得到分化后的細胞；

將所述分化后的細胞加入到成熟培養(yǎng)基中，成熟培養(yǎng)21天，得到成熟的肝細胞。

實施例3

用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基分別為：

消化酶溶液：等體積0.1％I型膠原酶、0.1％透明質(zhì)酸酶、1U/ml硫酸軟骨素酶；

脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基：含20％體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基；

同步化培養(yǎng)基：無血清的IMDM培養(yǎng)基；

誘導分化培養(yǎng)基：12ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、4％體積分數(shù)胎牛血清、25ng/ml肝細胞生長因子和1μM維甲酸的IMDM培養(yǎng)基；

成熟培養(yǎng)基：2％體積分數(shù)的胎牛血清、15ng/ml抑瘤素M、1μM地塞米松和1％體積分數(shù)的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的IMDM培養(yǎng)基。

脂肪來源間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)

無菌條件下取脂肪組織，用2倍體積的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3遍，添加消化酶溶液，放入CO₂培養(yǎng)箱中37℃下消化培養(yǎng)30min，每隔10min輕輕搖晃培養(yǎng)皿以保證充分消化，200目篩網(wǎng)過濾，1000r/m離心10min，去上層液體，得到細胞沉淀；細胞沉淀用脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基重懸并接種于培養(yǎng)皿中，24h后全量換液，之后每2天半量換液，原代培養(yǎng)3～5d至生長融合達到90％，細胞活力達98％，得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞。用0.25％的胰酶對原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞進行消化，進行傳代擴增培養(yǎng)，當傳代細胞生長接近單層匯合80％時，繼續(xù)傳代，得到第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

將不同培養(yǎng)階段得到的細胞置于倒置顯微鏡下進行觀察，原代接種24h后的呈圓形或短梭形，大小不一；3天后細胞逐漸伸展呈長梭形，第7天開始呈漩渦狀生長，第12天可達到80％融合，0.25％胰酶消化并1:3傳代后3天細胞達80％融合，細胞為長梭形，大小均一，觀察結(jié)果如圖1所示，其中圖1-1為原代培養(yǎng)7天后的細胞(100×)，圖1-2為第一次傳代培養(yǎng)3天后的細胞(100×)。

流式細胞儀檢測，第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞的免疫表型CD90、CD73、CD105均呈陽性表達(>98％)，而造血細胞系分子標記物CD45呈陰性表達(0.06％)，第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞流式細胞儀檢測結(jié)果見圖2。

將第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)為成熟肝細胞

將所述第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中，繼續(xù)同步化培養(yǎng)2天，得到周期同步化的細胞；

將上述周期同步化的細胞加入到誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng)，培養(yǎng)7天得到分化后的細胞；

將所述分化后的細胞加入到成熟培養(yǎng)基中，成熟培養(yǎng)14天，得到成熟的肝細胞。

對上述培養(yǎng)得到的肝細胞表型和功能進行鑒定

①形態(tài)表型

通過倒置顯微鏡，第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞呈現(xiàn)纖維樣細胞形態(tài)如圖3-1所示(標尺：100μm)，在誘導分化為成熟肝細胞的過程中，細胞形態(tài)逐漸變?yōu)槎噙呅?，成熟培養(yǎng)第21天的觀察結(jié)果如圖3-2所示(標尺：50μm)，細胞多為多邊形、類圓形等上皮細胞樣形態(tài)，細胞大小不等，折光性強，核大而圓，可見少數(shù)細胞為雙核。

②白蛋白(albumin，ALB)分化率

通過流式細胞術分別檢測誘導分化前后細胞表面ALB的表達情況，結(jié)果顯示：經(jīng)誘導后，90％以上的細胞表達ALB，說明第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞成功誘導分化得到了肝細胞。誘導分化前后細胞表面ALB的表達情況如圖4所示，圖4-1為第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞表面ALB的表達情況，圖4-2為成熟肝細胞表面ALB的表達情況。

③過碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff，PAS)染色

誘導分化后PAS染色陽性，細胞質(zhì)可見紫色糖原顆粒。染色結(jié)果如圖5所示((標尺均為50μm))，圖5-1為第3代脂肪來源間充質(zhì)干細胞PAS染色結(jié)果，圖5-2為成熟肝細胞PAS染色結(jié)果。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。