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用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基的制作方法

文檔序號:11837490閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的培養(yǎng)基,其特征在于,包括消化酶溶液、脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基、同步化培養(yǎng)基、誘導分化培養(yǎng)基和成熟培養(yǎng)基;

所述消化酶溶液包含0.1~0.2%質(zhì)量濃度的I型膠原酶、0.1~0.2%質(zhì)量濃度的透明質(zhì)酸酶、1~3U/ml硫酸軟骨素酶和余量的水;

所述脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基為含有10~20%體積分數(shù)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基;

所述同步化培養(yǎng)基為無血清的IMDM培養(yǎng)基;

所述誘導分化培養(yǎng)基包含10~15ng/ml堿性成纖維細胞生長因子、2~5%體積分數(shù)的胎牛血清、20~40ng/ml肝細胞生長因子和1~5μM維甲酸的IMDM培養(yǎng)基;

所述成熟培養(yǎng)基為包含2~5%體積分數(shù)的胎牛血清、10~30ng/ml抑瘤素M、1~2μM地塞米松和1~5%體積分數(shù)的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒的IMDM培養(yǎng)基。

2.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述消化酶溶液包含等體積的0.1~0.2%質(zhì)量濃度的I型膠原酶、0.1~0.2%質(zhì)量濃度的透明質(zhì)酸酶和1~3U/ml硫酸軟骨素酶。

3.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述堿性成纖維細胞生長因子為FGF4。

4.根據(jù)權利要求1所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒為包括8~12μg/ml胰島素、4.5~6.5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和6~7.5ng/ml亞硒酸鈉的水溶液。

5.一種用于體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的試劑盒,包含權利要求1~4任意一項所述的培養(yǎng)基,所述培養(yǎng)基以液態(tài)進行分裝,所述培養(yǎng)基在2~8℃進行保存。

6.權利要求1~4任意一項所述培養(yǎng)基或權利要求4所述試劑盒在體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞中的應用。

7.一種體外誘導脂肪來源間充質(zhì)干細胞分化為肝細胞的方法,其特征在于,包括以下步驟:

采用消化酶溶液對脂肪組織進行消化,將所述消化后的細胞加入到脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng),得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞;

將所述原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中進行傳代擴增培養(yǎng),得到第3~5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞;

將所述第3~5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中進行同步化培養(yǎng),得到周期同步化的細胞;

將所述周期同步化的細胞置于誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng),得到分化后的細胞;

將所述分化后的細胞置于成熟培養(yǎng)基中進行成熟培養(yǎng),得到成熟的肝細胞。

8.根據(jù)權利要求7所述的方法,其特征在于,由所述脂肪組織培養(yǎng)至所述第3~5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞的過程具體為:

采用磷酸鹽緩沖溶液清洗脂肪組織;

將所述清洗后的脂肪組織與消化酶溶液按1:2體積比混合進行消化,所述消化的時間為25~40min,每8~12min進行搖晃;

將所述消化后的脂肪組織過200~400目篩網(wǎng),1000~1500rpm離心5~10min,去除上層液體,得到細胞沉淀;

將所述細胞沉淀用脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基重懸后進行原代培養(yǎng),得到原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞;

將所述原代培養(yǎng)脂肪來源間充質(zhì)干細胞,加入0.2~0.4%質(zhì)量體積分數(shù)的胰酶進行消化,傳代擴增培養(yǎng);

當傳代擴增培養(yǎng)的細胞單層匯合80%時,繼續(xù)傳代培養(yǎng),得到第3~5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞。

9.根據(jù)權利要求7所述的方法,其特征在于,將所述第3~5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)為成熟肝細胞的具體過程包括以下步驟:

將所述第3~5代脂肪來源間充質(zhì)干細胞置于同步化培養(yǎng)基中,繼續(xù)同步化培養(yǎng)2~4天,得到周期同步化的細胞;

將所述周期同步化的細胞加入到誘導分化培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng),培養(yǎng)6~8天得到分化后的細胞;

將所述分化后的細胞加入到成熟培養(yǎng)基中,成熟培養(yǎng)14~21天,得到成熟的肝細胞。

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