專利名稱：使用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管病癥的方法
使用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管病癥的方法本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2005年5月25日，申請(qǐng)?zhí)枮?00580050265. 1，發(fā)明名稱為“使用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管病癥的方法”的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)是2004年2月20日提交發(fā)明名稱為《使用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管病癥的方法》的美國(guó)申請(qǐng)No. 10/783,957 (其要求2003年2月20日提交發(fā)明名稱為《使用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管病癥的方法》的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/449，279和2003年4月15日提交發(fā)明名稱為《使用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管病癥的方法》的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/462,911的優(yōu)先權(quán))的部分繼續(xù)申請(qǐng)，以及2004年6月25日提交發(fā)明名稱為《從組織分離和濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)和方法》的美國(guó)申請(qǐng)No. 10/877, 822 (其要求2003年8月20日提交發(fā)明名稱為《從組織分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)和方法》的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/496，467和2003年提交發(fā)明名稱為《從組織分離再生細(xì)胞的系統(tǒng)和方法》的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/482, 820的優(yōu)先權(quán))的部分繼續(xù)申請(qǐng)，其中美國(guó)申請(qǐng)No. 10/783,957和美 國(guó)申請(qǐng)No. 10/877，822都是2002年12月9日提交發(fā)明名稱為《使用處理過的脂肪抽出物(Iipoaspirate)細(xì)胞治療患者的系統(tǒng)和方法》的美國(guó)申請(qǐng)No. 10/316, 127 (其要求2001年12月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/338，856的權(quán)利)的部分繼續(xù)申請(qǐng)。這里明確地引入所有前述申請(qǐng)的內(nèi)容作為參考。
背景技術(shù)：
I.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明整體上涉及來源于脂肪組織的再生細(xì)胞，更具體地，涉及脂肪(adipose)來源的再生細(xì)胞(例如脂肪來源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞)，脂肪來源的再生細(xì)胞的使用方法，含有脂肪來源的再生細(xì)胞的組合物，以及制備和使用脂肪來源的再生細(xì)胞的系統(tǒng)，所述脂肪來源的再生細(xì)胞被用于治療心血管疾病和紊亂。2.相關(guān)技術(shù)的描述心血管疾病和紊亂是所有的工業(yè)化國(guó)家中死亡和喪失勞動(dòng)能力的首要原因。僅在美國(guó)，心血管疾病占死亡率的大約40%，并侵襲5800萬美國(guó)人(美國(guó)心臟協(xié)會(huì)，2002 )。造成心血管疾病尤其具有破壞性的主要因素之一是心臟在受損之后不能夠自身修復(fù)。因?yàn)樾募〖?xì)胞不能夠分裂并重新占據(jù)受損區(qū)域，由于損傷或者疾病導(dǎo)致的心臟細(xì)胞損失很大程度上是不可逆轉(zhuǎn)的(Abbate 等人,2002 ；Remme, 2000)。在可以利用的治療形式中，人與人之間的心臟移植已經(jīng)成為治療嚴(yán)重心血管疾病和紊亂中最有效的。事實(shí)上，目前普通心臟移植受體的一年和五年生存率超過了 70%。然而，不幸的是，由于許多原因，移植是非常受限的治療形式，所述原因即缺乏適宜的供體、該方法的費(fèi)用以及很可能產(chǎn)生移植物排斥和相關(guān)問題如感染、腎功能異常以及免疫抑制劑相關(guān)癌癥(美國(guó)心臟協(xié)會(huì)，2002 )。移植治療的備選方案是使用再生藥物修復(fù)和再生受損的心肌細(xì)胞。再生藥物以臨床革G向的方式控制干細(xì)胞的能力(即身體未特化的主細(xì)胞(mastercell))以自身無限地地更新并發(fā)育成成熟的特化細(xì)胞。在發(fā)育早期的胚胎、胎兒組織以及某些成年器官和組織中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞(Pera等人，2000)。已知胚胎干細(xì)胞(下文中稱作“ESC”)會(huì)變成身體的所有細(xì)胞和組織類型。ESC不僅含有個(gè)體的全部遺傳信息，還含有變成身體200+細(xì)胞和組織中任何一種的新生能力。因此，這些細(xì)胞具有作為再生藥物的巨大潛力。例如ESC能夠發(fā)育成特定組織如心、肺或腎，然后它們能夠被用于修復(fù)受損和患病的器官(Assady等人，2001 ；Jacobson等人，2001 ;0dorico等人，2001 )。然而，ESC來源的組織具有臨床局限性。因?yàn)椋珽SC必須來自另一個(gè)個(gè)體，即胚胎，所以存在受體的免疫系統(tǒng)排斥新的生物材料的風(fēng)險(xiǎn)。盡管可以利用防止這些排斥的免疫抑制藥物，但已知這些藥物也會(huì)阻斷期望的免疫應(yīng)答，如針對(duì)細(xì)菌感染和病毒的免疫應(yīng)答。此外，對(duì)于ESC的來源(即胚胎)的倫理上的辯論是由來已久的，可能是可預(yù)見的將來不可克服的障礙。成年干細(xì)胞(下面可互換地被稱作“ASC”)代表使用ESC的備選方案。ASC靜止地存在于許多非胚胎組織中，可能等待對(duì)外傷或其他破壞性疾病 進(jìn)程作出應(yīng)答，從而它們能夠治療受傷的組織(Arvidsson 等人，2002 ；Bonner-ffeir 和 Sharma, 2002 ；Clarke 和 Frisen,2001 ;Crosby和Strain, 2001 ;Jiang等人,2002a)。值得注意的是,不斷出現(xiàn)的科學(xué)證據(jù)顯示每個(gè)個(gè)體都攜帶ASC庫，其與ESC都具有變成許多(如果不是全部)細(xì)胞和組織類型的能力(Young 等人，2001 ；Jiang 等人，2002a ；Jiang 等人，2002b ；Schwartz 等人，2002)。因此，ASC像ESC —樣具有再生藥物的臨床應(yīng)用的巨大潛力。已經(jīng)表明ASC群體存在于骨髓、皮膚、肌肉、肝和腦的一種或多種中(Jiang等人，2002b ；Alison, 1998 ；Crosby Strain，2001 )。然而，這些組織中ASC的出現(xiàn)率很低。例如，估計(jì)骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的出現(xiàn)率為100，000個(gè)有核細(xì)胞中有I個(gè)至1，000, 000個(gè)有核細(xì)胞中I個(gè)之間(D，Ippolito等人，1999 ；Banfi等人,2001 ；Falla等人，1993)。類似地，從皮膚提取ASC包括數(shù)周內(nèi)的一系列復(fù)雜的細(xì)胞培養(yǎng)步驟(Toma等人，2001)并且骨骼肌來源的ASC的臨床應(yīng)用需要兩到三周的培養(yǎng)期(Hagege等人，2003)。從而，來自這些組織的ASC的所有的設(shè)計(jì)的臨床應(yīng)用需要通過細(xì)胞純化和細(xì)胞培養(yǎng)方法增加細(xì)胞數(shù)、純度和成熟度。盡管細(xì)胞培養(yǎng)步驟可以提供增加的細(xì)胞數(shù)、純度和成熟度，但是需要付出代價(jià)。該代價(jià)可以包括下面的技術(shù)困難中的一個(gè)或多個(gè)由于細(xì)胞老化喪失細(xì)胞功能、可能有用的非干細(xì)胞群體的損失、細(xì)胞可能應(yīng)用于患者的延遲、金錢花費(fèi)增加，以及培養(yǎng)期間細(xì)胞受到環(huán)境微生物污染的危險(xiǎn)增加。最近檢查骨髓來源的ASC的治療效果的研究使用基本上完整的骨髓以克服與細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)的問題(Horwitz等人，2001 ；Orlic等人，2001 ;Stamm等人，2003 ；Strauer等人，2002 )。然而，臨床益處是次最佳的，并且結(jié)果幾乎無疑與有限的ASC劑量和骨髓中內(nèi)在可利用的純度有關(guān)。最近，已經(jīng)證明脂肪組織是ASC的來源之一(Zuk等人，2001 ;Zuk等人，2002)。與骨髓、皮膚、肌肉、肝和腦不同，脂肪組織相當(dāng)容易以相對(duì)大的量收獲(Commons等人，2001 ；Katz等人，2001b)。此外，已經(jīng)表明脂肪來源的ASC具有在體外產(chǎn)生多種組織，包括骨髓、月旨肪、軟骨和肌肉的能力(Asbjian等人,2003 ；Mizuno等人,2002 ；Zuk等人,2001 ；Zuk等人，2002)。從而，脂肪組織提供了用于再生藥物中ASC的最佳來源。然而，本領(lǐng)域中缺少收獲脂肪來源的ASC的適宜方法。現(xiàn)有方法具有許多缺點(diǎn)。例如，現(xiàn)有方法不能最佳地容納用于除去脂肪組織的吸出裝置?，F(xiàn)有方法還缺少從脂肪組織收獲期到組織加工期的部分或完全自動(dòng)化(Katz等人，2001a)?，F(xiàn)有方法還缺少大于IOOml脂肪組織的體積容量?，F(xiàn)有方法還缺少從脂肪組織收獲期到組織加工期的部分或全部密閉系統(tǒng)。最后，現(xiàn)有方法缺少組分處理能力以減小一個(gè)樣品與另一個(gè)樣品的物質(zhì)的交叉污染的伴隨危險(xiǎn)。總之，用于從脂肪組織收獲ASC的現(xiàn)有技術(shù)方法沒有克服與從上述皮膚、肌肉、肝臟和腦收獲ASC相關(guān)的技術(shù)困難。因此，考慮到ASC的巨大的治療潛力，本領(lǐng)域中迫切需要從產(chǎn)生ASC群體的脂肪組織以高產(chǎn)率、一致性和/或純度收獲ASC并且快速而可靠地收獲并且減小或者不存在(nonexistent)對(duì)提取后操作的需要的裝置、細(xì)胞或者方法。理想地，這種裝置、系統(tǒng)或者方法將以適于直接置于受體的方式產(chǎn)生ASC。這種裝置、系統(tǒng)或方法的獲得以及使用脂肪來源的ASC治療心血管疾病和紊亂的方法和組合物將對(duì)這些紊亂的治療產(chǎn)生根本變化?？紤]到心血管疾病的普遍和當(dāng)前治療選擇的不足，迫切需要這種治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及可以用于治療心血管病癥、疾病和紊亂的再生細(xì)胞例如成年干細(xì)胞和祖細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于從如脂肪組織的組織分離和濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。本發(fā) 明還涉及用于心血管相關(guān)治療應(yīng)用的再生細(xì)胞組合物。因此，在常規(guī)的實(shí)施方式中，本發(fā)明針對(duì)使用來源于組織的再生細(xì)胞的組合物、方法和系統(tǒng)，所述細(xì)胞與促進(jìn)、產(chǎn)生或者支持治療心血管相關(guān)益處所需的添加劑一起直接置于受體中。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的再生細(xì)胞可以被用于治療心血管病癥、疾病和紊亂，其基于例如再生細(xì)胞的合成和分泌刺激新血管形成的生長(zhǎng)因子的能力，再生細(xì)胞的合成和分泌刺激細(xì)胞存活、增殖和/或改變其他細(xì)胞損傷應(yīng)答的生長(zhǎng)因子的能力，再生細(xì)胞的增殖和/或分化成直接參與新血管形成的細(xì)胞的能力，再生細(xì)胞的移入到受損心肌層并改變疤痕形成(膠原蛋白的沉積、膠原蛋白的分解和交聯(lián))的能力，再生細(xì)胞的增殖并分化成能夠有助于心肌收縮的心肌細(xì)胞(cardiomyocyte)或心肌細(xì)胞樣肌細(xì)胞(cardiomyocyte-like muscle cell)的能力，再生細(xì)胞的增殖并分化成心肌細(xì)胞(myocardial cell)的能力，再生細(xì)胞改善灌注并再生受損心肌(myocardium)的能力，再生細(xì)胞防止心肌梗死之后肥大(重建)進(jìn)展的能力。對(duì)心臟病患者給藥的再生細(xì)胞可以包括例如干細(xì)胞、祖細(xì)胞及其組合。在某些實(shí)施方式中，可以需要給藥多劑量和/或多類型的再生細(xì)胞以產(chǎn)生治療益處。另外，可以與再生細(xì)胞同時(shí)給藥例如一種或者多種生長(zhǎng)因子的添加劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，再生細(xì)胞被與血管生成生長(zhǎng)因子、動(dòng)脈生成生長(zhǎng)因子和/或心臟特異性生長(zhǎng)因子單獨(dú)或與其他添加劑的組合進(jìn)行給藥。所述再生細(xì)胞也可以與一種或者多種免疫抑制藥物進(jìn)行給藥。再生細(xì)胞的給藥途徑是本領(lǐng)域已知的，并且包括直接將細(xì)胞給藥到期望有利的位置。這可以通過下列達(dá)到經(jīng)心臟的外表面(心外膜)直接注射到心肌，經(jīng)過插入適當(dāng)?shù)牟骞芡ㄟ^內(nèi)表面(心內(nèi)膜)直接注射入心肌，通過動(dòng)脈或靜脈輸注(包括逆行流動(dòng)機(jī)制)，或者通過這里所公開或本領(lǐng)域中已知的其他方式例如心包注射。本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的給藥途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)、心內(nèi)膜心肌、心肌外膜、心室內(nèi)、逆行冠狀竇或靜脈內(nèi)給藥。在為患者給藥前，再生細(xì)胞可以在細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行生長(zhǎng)以例如促進(jìn)其朝著心臟表型分化。在為患者給藥前，可以通過基因轉(zhuǎn)移對(duì)細(xì)胞進(jìn)行修飾，這樣改變了在被修飾的再生細(xì)胞中一種或者多種基因例如心臟基因的表達(dá)。
本發(fā)明還涉及高度通用的系統(tǒng)和方法，其能夠從給定的組織分離和濃縮適合再被輸注到受試者的再生細(xì)胞，例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該系統(tǒng)是自動(dòng)化的。通常本發(fā)明的系統(tǒng)包括一個(gè)或者多個(gè)采集腔室(chamber)、處理腔室、廢物腔室、輸出腔室和樣品腔室。不同的腔室通過一個(gè)或者多個(gè)導(dǎo)管連接到一起，使得包含生物材料的流體可以在閉合的、無菌的流體/組織通道內(nèi)從一個(gè)腔室通到另一個(gè)腔室。在某些實(shí)施方式中，廢物腔室、輸出腔室和樣本腔室是可選的。在一個(gè)實(shí)施方式中，從組織提取經(jīng)過處理和將設(shè)備置入受體內(nèi)的全部程序，會(huì)都在相同的裝置中進(jìn)行，事實(shí)上，即使在患者的同一房間內(nèi)也可以進(jìn)行該程序。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，治療患者中心血管相關(guān)紊亂的方法包括下列步驟a)提供組織移除系統(tǒng)山)使用組織移除系統(tǒng)從患者移出脂肪組織，脂肪組織具有一定濃度的再生細(xì)胞；c)處理至少一部分脂肪組織以獲得一定濃度的再生細(xì)胞，該濃度與處理前的脂肪組織中再生細(xì)胞的濃度不同；以及d)將再生細(xì)胞給藥給患者，不需要在對(duì)病人進(jìn)行給藥前從組織移除系統(tǒng)移除再生細(xì)胞。這里所描述的任何特征或者特征的組合都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，只要在任何這 樣的組合中包括的特征沒有與通過上下文，本說明書和本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)顯而易見的特征互相不符合。本發(fā)明的附加優(yōu)點(diǎn)和方面在接下來的詳細(xì)描述中變得明顯。


圖I示出了用于從組織分離并且濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括一個(gè)過濾器組件；圖2示出了與圖I相似的系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有多個(gè)串聯(lián)構(gòu)造的過濾器組件；圖3示出了與圖I相似的系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有多個(gè)并聯(lián)構(gòu)造的過濾器組件；圖4示出了用于從組織分離并且濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括離心分離腔室;圖5為包括用于從組織分離并且濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)中使用的前置過濾器的采集腔室的截面圖；圖6為使用滲濾過濾系統(tǒng)、從組織分離并且濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)的處理腔室的截面圖；圖7為用于分離和濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)的處理腔室的截面圖，其利用離心分離設(shè)備來濃縮再生細(xì)胞；圖8為圖7的處理腔室的另一張截面圖；圖9. I、圖9. 2和圖9. 3示出了與本發(fā)明的系統(tǒng)一起使用的淘析部件；圖10示出了用于從組織分離并且濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)，其利用真空壓力來使流體運(yùn)動(dòng)通過系統(tǒng)。通過將真空泵或真空源施加到系統(tǒng)的出口，控制在預(yù)先確定的速率來拉動(dòng)組織和流體通過，使用旋閥、排出口和夾具的系統(tǒng)來控制流動(dòng)的方向和定時(shí)來構(gòu)造真空系統(tǒng)；圖11示出了用于從組織分離并且濃縮再生細(xì)胞的系統(tǒng)，其利用正壓力來使流體運(yùn)動(dòng)通過系統(tǒng)。正壓力系統(tǒng)使用諸如蠕動(dòng)泵的機(jī)械裝置來推動(dòng)或推進(jìn)流體和組織以預(yù)先確定的速率通過系統(tǒng)，使用閥(valve)、旋閥(stopcock)、排出口和夾具來控制流動(dòng)的方向和定時(shí)；圖12A示出了過濾過程，其中流入的流體流與過濾器的孔成切向流動(dòng)；圖12B示出了過濾過程，其中流體的流入流垂直于過濾器的孔流動(dòng)；圖13示出了用于本發(fā)明的系統(tǒng)的示例性的一次性的用具；圖14示出了用于本發(fā)明的系統(tǒng)的示例性的可重復(fù)使用的部件；圖15A示出了使用圖13的一次性用具和圖14的可重復(fù)使用的部件裝配的本發(fā)明的示例性設(shè)備；圖15B為示出了示例性的預(yù)編程步驟的流程圖，其通過軟件程序執(zhí)行，該軟件程序控制本發(fā)明的系統(tǒng)的自動(dòng)化實(shí)施例。示出了兩組可替換的處理參數(shù)，以表示該系統(tǒng)的通用性；
圖16A和圖16B描繪了培養(yǎng)的脂肪來源的干細(xì)胞的VEGF (5A)和PIGF (5B)蛋白質(zhì)的表達(dá)；圖17描繪了脂肪來源的干細(xì)胞群內(nèi)內(nèi)皮祖細(xì)胞的檢測(cè)；圖18A和圖18B描繪了正常(7A)和鏈唑霉素處理的(7B)小鼠脈管結(jié)構(gòu)的體外發(fā)育；圖19描繪了與陰性對(duì)照比較，脂肪來源的干細(xì)胞處理的后肢局部缺血小鼠中血流的平均恢復(fù)的增加；圖20A和圖20B表明增加脂肪來源的干細(xì)胞劑量提高移植存活和血管生成(20A)并描繪了組織樣品中脂肪組織構(gòu)造的保持(20B );圖21描繪了梗死的心肌區(qū)域中來自供體的脂肪來源的干細(xì)胞移植的組織學(xué)時(shí)間線(timeline)；圖22描繪了半乳糖苷酶和肌球蛋白重鏈的雙陽性染色。高亮細(xì)胞都顯示出藍(lán)色的半乳糖苷酶染色，表明它們來源于供體脂肪組織細(xì)胞，褐色染色表明心肌蛋白肌球蛋白重鏈的表達(dá)。顯示出褐色和藍(lán)色染色的細(xì)胞(如通過箭頭指出)是呈現(xiàn)出心肌細(xì)胞表型的脂肪組織來源的細(xì)胞；圖23描繪了大鼠中阻塞/再灌注損傷后梗死的心肌區(qū)域中來自供體的脂肪來源的干細(xì)胞群；圖24描繪基于回聲和收縮性分析，與鹽水相比，接受脂肪來源的再生細(xì)胞治療的大鼠在心肌梗死后12周顯著改善的噴血分?jǐn)?shù)；圖25描繪基于回聲和收縮性分析，與鹽水相比，接受脂肪來源的再生細(xì)胞治療的大鼠在心肌梗死后12周顯著改善的基線收縮；圖26描繪基于回聲和收縮性分析，與鹽水相比，接受脂肪來源的再生細(xì)胞治療的大鼠在心肌梗死后12周顯著改善的基線舒張；圖27描繪與鹽水相比，接受脂肪來源的再生細(xì)胞治療的大鼠在心肌梗死后12周重建參數(shù)方面的改變，即降低的心室隔膜(septal)厚度；圖28描繪與鹽水相比，在接受ADC治療的大鼠心肌梗死后12周，以降低心室隔膜厚度(心臟收縮)作為證據(jù)的防止心室擴(kuò)張進(jìn)程；圖29和圖30表示與鹽水相比，在接受脂肪來源的再生細(xì)胞治療的大鼠心肌梗死后12周，以在心臟舒張(圖29)和心臟收縮(圖30)中都降低后壁(posterior wall)厚度為證據(jù)的防止心室擴(kuò)張進(jìn)程；圖31描繪在細(xì)胞灌注組豬與對(duì)照組豬相比，左心室射血分?jǐn)?shù)的顯著提高細(xì)胞灌注組(3. 0%±6· 0%，平均值土SD)對(duì)比對(duì)照組(-9. 0%±5· 0%，p=0. 01)。通過血管顯像術(shù)的LVEF (n=12)表示相似的趨勢(shì)，其值為分別3. 7%±5· 0%對(duì)-2. 0%±7· 5% (p=0. 16)。發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了使用脂肪來源的再生細(xì)胞例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞治療心血管病癥、疾病和紊亂的系統(tǒng)和方法。具體地，本發(fā)明闡明本發(fā)明的脂肪來源的再生細(xì)胞(I)表達(dá)血管生成和動(dòng)脈生成生長(zhǎng)因子，包括PIGF、VEGF, bFGF、IGF-II、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(Eotaxin), G-CSF, GM-CSF, IL_12p40/p70、IL_12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦素(L印tin)、MCP-U M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-U ΜΡ-2、TNF-α 和血小板生成素(Thrombopoetin)，(2)含有在血管形成中具有明確功能的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，(3)在體外發(fā)育成血管，以及(4)支持體內(nèi)局部缺血組織生存，(5)誘導(dǎo)后肢的阻塞/再灌注損傷后的恢復(fù)灌注(restoreperfusion), (6)當(dāng)心臟損傷后注射到動(dòng)物時(shí)歸巢到心臟，(7)當(dāng)心臟損傷后注射到動(dòng)物時(shí) 分化成細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)與它們分化成心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞樣細(xì)胞相一致的標(biāo)記，(8)改善小鼠后肢局部缺血外科模型中心肌梗死后的灌注，O)防止重建的進(jìn)展以及(10)改善心肌梗死的小動(dòng)物和大動(dòng)物模型中的功能。因此，本公開闡明本發(fā)明脂肪來源的再生細(xì)胞可用于治療心血管疾病和紊亂。為了更易理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。其他定義在詳細(xì)描述中給出。在這里使用的，“再生細(xì)胞”指的是使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法獲得的任何異源的或同源的細(xì)胞，其導(dǎo)致或幫助完全或部分再生、恢復(fù)或代替器官、組織或生理單元或系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)或功能，以由此提供治療、結(jié)構(gòu)或美容的益處。再生細(xì)胞的例子包括成人干細(xì)胞(ASC)、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、周皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞(preadipocyte)、分化或去分化的脂肪細(xì)胞、角化細(xì)胞、單能的和多能的祖細(xì)胞和前體細(xì)胞(和其后代)以及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、組織細(xì)胞(histiocyte)(組織巨噬細(xì)胞)、淋巴系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞、神經(jīng)元、神經(jīng)元前體細(xì)胞和施旺細(xì)胞(Schwann cell)。再生細(xì)胞可以提供治療、結(jié)構(gòu)或美容的益處的一種機(jī)制是通過將它們自身或它們的后代摻入新生成的、現(xiàn)有的或修補(bǔ)的組織或組織成分。例如ASC和/或它們的后代可以摻入新生成的骨、肌肉、或其它結(jié)構(gòu)或功能組織并且由此導(dǎo)致或有助于治療、結(jié)構(gòu)或美容的改善。相似地，內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮前體或祖細(xì)胞和它們的后代可以摻入現(xiàn)有的、新生成的、修補(bǔ)的或擴(kuò)張的血管以由此導(dǎo)致或有助于治療、結(jié)構(gòu)或美容的益處。再生細(xì)胞通可以提供治療、結(jié)構(gòu)或美容的益處的另一種機(jī)制是通過表達(dá)和/或分泌分子例如生長(zhǎng)因子，其促進(jìn)給定組織或組織成分的結(jié)構(gòu)或功能的形成、保持、恢復(fù)和/或再生。例如再生細(xì)胞可以表達(dá)和/或分泌分子，其導(dǎo)致增強(qiáng)的組織或細(xì)胞生長(zhǎng)，其隨后直接或間接地參與改善的結(jié)構(gòu)或功能。再生細(xì)胞可以表達(dá)和/或分泌生長(zhǎng)因子，包括例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)、bFGF、IGF-II、嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白(Eotaxin), G-CSF, GM-CSF, IL_12p40/p70、IL_12p70、IL-13, IL-6, IL-9、瘦素(L印tin)、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、 ΜΡ-1、HMP_2、TNF-a、血栓形成素(Thrombopoetin)和它們的同等型，其可以執(zhí)行一種或多種下面的功能剌激新血管發(fā)育，即促進(jìn)血管生成；通過擴(kuò)張先存的小血管(旁系血管)的血液運(yùn)載容量來改善它們的供氧；誘導(dǎo)再生細(xì)胞從遠(yuǎn)離損傷位點(diǎn)的地點(diǎn)遷移，以由此增強(qiáng)將這樣的細(xì)胞歸巢并且遷移到損傷地點(diǎn)；剌激生長(zhǎng)和/或促進(jìn)細(xì)胞在損傷位點(diǎn)內(nèi)的生存，由此促進(jìn)功能或結(jié)構(gòu)的保持；輸送具有抗凋亡性質(zhì)的分子，由此降低細(xì)胞死亡和功能永久喪失的比率或可能性；以及與內(nèi)源的再生細(xì)胞和/或其它生理機(jī)制互相作用。再生細(xì)胞可以以它們的“天然”形式使用，如存在于組織中或使用本發(fā)明的系統(tǒng)和方法從組織分離并且濃縮，或者如在這里進(jìn)一步描述的，可以通過用生長(zhǎng)因子或其它生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑來刺激或啟動(dòng)，通過基因轉(zhuǎn)移(瞬時(shí)的或穩(wěn)定轉(zhuǎn)移)，通過對(duì)所得到的群體的亞分級(jí)分離基于物理性質(zhì)(例如尺寸或密度)、對(duì) 固相材料不同的吸附力、細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)分子的表達(dá)、細(xì)胞培養(yǎng)或其它體外或體內(nèi)操縱、修飾或分級(jí)分離，對(duì)再生細(xì)胞進(jìn)行修飾。再生細(xì)胞也可以與其它細(xì)胞或設(shè)備結(jié)合使用，諸如合成的或生物的骨架、材料或設(shè)備，其輸送修飾或增強(qiáng)細(xì)胞的有關(guān)的特性的因子、藥物、化學(xué)物質(zhì)或其它制劑如這里進(jìn)一步描述的。在這里使用的，“再生細(xì)胞組合物”指的是組織，例如脂肪組織被清洗并且至少部分分解以后通常存在于一定體積的液體內(nèi)的細(xì)胞組合物。例如，本發(fā)明的再生細(xì)胞組合物包括多種不同類型的再生細(xì)胞包括ASC、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維原細(xì)胞、周皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、分化或去分化的脂肪細(xì)胞、角化細(xì)胞、單能的和多能的祖細(xì)胞和前體細(xì)胞(和其后代)和淋巴細(xì)胞。再生細(xì)胞組合物還可以包含一種或多種污染物，諸如可以存在于組織片段中的膠原蛋白，或在這里描述的組織分解過程中所采用或者從該過程中所產(chǎn)生的殘余膠原酶或其它酶或制劑。在這里所使用的“再生藥物”是指來自直接或者間接將再生細(xì)胞置入受試者內(nèi)所得到的治療、結(jié)構(gòu)或者美容的益處。在這里所使用的短語“心血管病癥、疾病和紊亂”為了包括特征為不足、不希望或者異常的心臟功能的所有紊亂，例如局部缺血性心臟病、高血壓心臟病和肺部高血壓心臟病、瓣膜疾病、先天性心臟病、中毒性或傳染性心肌癥和導(dǎo)致受試者尤其人類受試者中例如充血性心力衰竭的心力衰竭。不足或異常的心臟功能可以由疾病、損傷和/或老化導(dǎo)致。作為背景，對(duì)心肌損傷的應(yīng)答按照確定的途徑，其中一些細(xì)胞死亡而其他細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)(hibernation)，它們還沒有死亡但是功能異常。接著，炎癥細(xì)胞的滲入、膠原作為疤痕部分沉積，所有這些都與新血管內(nèi)不生長(zhǎng)和一定程度的持續(xù)細(xì)胞死亡平行發(fā)生。這里所用的術(shù)語“局部缺血”指由于血流減少和/或氧和/或其他營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)的減少，而引起的任何局部組織缺血(例如局部組織缺血或者全面組織缺血例如休克時(shí))。術(shù)語“心肌局部缺血”指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和/或心肌的供血、氧和/或營(yíng)養(yǎng)物不足導(dǎo)致的循環(huán)紊亂。術(shù)語“心肌梗死”是指由于缺少血液流動(dòng)而導(dǎo)致的心肌組織的缺血損傷。特別地，這種損傷來自于冠狀循環(huán)中的阻塞(例如，血栓形成或栓塞)事件并產(chǎn)生這樣的環(huán)境，心肌代謝需要量超過對(duì)心肌組織的供氧和/或營(yíng)養(yǎng)物的供給。這里所用的術(shù)語“血管生成”指從現(xiàn)有的脈管系統(tǒng)和組織產(chǎn)生新血管的過程(Folkman, 1995)。術(shù)語“修復(fù)”指被損傷脈管系統(tǒng)的再形成(reformation)。組織局部缺血的減輕大大依賴于血管生成。新血管的自發(fā)生長(zhǎng)提供了局部缺血區(qū)域內(nèi)和周圍的側(cè)枝循環(huán)，提高了血流，并減輕了局部缺血導(dǎo)致的癥狀。這里所用的術(shù)語“血管生成因子”或者“血管生成蛋白質(zhì)”指能夠從現(xiàn)有脈管系統(tǒng)生長(zhǎng)新血管(“血管生成”)的任何已知的蛋白質(zhì)、肽或者其他試劑。用于本發(fā)明適宜的血管生成因子包括但不限于胎盤生長(zhǎng)因子(Luttun等人，2002)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Aharinejad等人，1995)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落剌激因子(Buschmann 等人，2003)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) -A, VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E (Mints等人,2002)、神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin) (Wang等人,2003)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF) -I、FGF-2 (bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6 (Botta 等人，2000)、血管生成素(angiopoietin) I、血管生成素2 (Sundberg等人，2002)、紅細(xì)胞生成素(Ribatti等人，2003)、BMP-2，BMP-4、BMP-7 (Carano 和 Filvaroff，2003),TGF- β (Xiong 等人，2002)、IGF-I (Shigematsu等人，1999)、骨橋蛋白(Asou等人，2001 )、多效營(yíng)養(yǎng)因子(Beecken等人，2000)、活化素(Lamouille 等人，2002)、內(nèi)皮素-I (Bagnato 和 Spinella，2003)和它們的組合。血管生成因子可以獨(dú)立地或者相互組合地作用。當(dāng)組合時(shí)，血管生成因子可以協(xié)同起作用，從而因子的組合效果大于單獨(dú)采取各自因子效果的總和。術(shù)語“血管生成因子”或者“血管生成蛋白”還包括這些因子的功能類似物。功能類似物包括例如，因子的功能部分。功能類似物還包括抗獨(dú)特型抗體，其結(jié)合所述因子的受體，從而模擬所述因子的活性以促進(jìn)血管生成和/或組織修復(fù)。產(chǎn)生這些抗獨(dú)特型抗體的方法是本領(lǐng)域中熟知的并且在例如TO97/23510中被描述，這里將W097/23510的內(nèi)容完整并入本文作為參考。用于本發(fā)明的血管生成因子可以從任何適宜的來源生產(chǎn)或者得到。例如，所述因子可以從它們的天然來源純化、或者合成產(chǎn)生或者重組表達(dá)產(chǎn)生。所述因子可以作為蛋白 質(zhì)組合物為患者進(jìn)行給藥。備選地，所述因子可以以編碼該因子的表達(dá)質(zhì)粒的形式給藥。適宜的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建是本領(lǐng)域中熟知的。用于構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的適宜的載體包括例如，腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、RNA載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)體、慢病毒載體和轉(zhuǎn)位子。這里所用的術(shù)語“動(dòng)脈生成”指增強(qiáng)側(cè)枝動(dòng)脈和/或來自現(xiàn)有小動(dòng)脈連接的其他動(dòng)脈的生長(zhǎng)的過程(CarmeIiet, 2000 ;SchoIz等人,2001 ;SchoIz等人,2002)。更具體地,動(dòng)脈生成是通過來自現(xiàn)有小動(dòng)脈連接的內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞的增殖原位募集和擴(kuò)增動(dòng)脈，從而為局部缺血組織、腫瘤或者炎癥部位提供血液。這些血管大部分生長(zhǎng)在受影響的組織外部并且對(duì)于將營(yíng)養(yǎng)物向局部缺血區(qū)域、腫瘤或者炎癥部位的傳輸是重要的。動(dòng)脈生成是對(duì)心肌局部缺血的正常應(yīng)答的一部分(Mills等人，2000 ；Monteiro等人，2003)。此外，冠狀動(dòng)脈旁路移植(CABG)的常規(guī)手術(shù)技術(shù)實(shí)際上不過是產(chǎn)生動(dòng)脈側(cè)枝血管(Sergeant等人，1997)。從而，梗死后增強(qiáng)血管生成的方法是提高到達(dá)局部缺血組織的血流，導(dǎo)致細(xì)胞死亡減少和梗死尺寸減小。這些提高將導(dǎo)致改善的心臟功能和治療益處。在這里使用的，“干細(xì)胞”指的是多能的再生細(xì)胞，其能夠分化為多種其它細(xì)胞類型，其執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)特定的功能并且具有自我更新的能力。在這里公開的干細(xì)胞的一些可以為多能的。在這里使用的，“祖細(xì)胞”指的是多能的再生細(xì)胞，其能夠分化為多種細(xì)胞類型并且具有限制的或不具有自我更新的能力。在這里使用的，“祖細(xì)胞”還指的是能夠分化為僅單一的細(xì)胞類型的單能細(xì)胞，其執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)特定的功能并且具有限制的或不具有自我更新的能力。特別地，在這里使用的，“內(nèi)皮祖細(xì)胞”指的是能夠分化為脈管內(nèi)皮細(xì)胞的多能或單能的細(xì)胞。在這里使用的，“前體細(xì)胞”指的是能夠分化為一種細(xì)胞類型的單能再生細(xì)胞。前體細(xì)胞和它們的后代可以保持大量增殖的能力，例如，淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，其能夠在適合的條件下增殖。
在這里使用的，“干細(xì)胞數(shù)量”或“干細(xì)胞出現(xiàn)率”指的是在克隆源性檢定中觀察到的集群的數(shù)量，在克隆源性檢定中，脂肪來源的細(xì)胞(ADC)以低細(xì)胞密度(〈10000細(xì)胞/孔)平鋪并且在支持MSC生長(zhǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充有10%的胎牛血清、5%的馬血清和抗細(xì)菌/抗真菌劑的DMEM/F12培養(yǎng)基)內(nèi)生長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)兩個(gè)星期，隨后培養(yǎng)物通過蘇木精著色，并且多于50個(gè)細(xì)胞的集群計(jì)算為CFU-F，干細(xì)胞出現(xiàn)率計(jì)算為每100個(gè)平鋪的有核細(xì)胞觀察到的CFU-F的數(shù)量(例如在初始具有1000個(gè)有核再生細(xì)胞的盤中計(jì)數(shù)到15個(gè)集群給出的干細(xì)胞出現(xiàn)率為1.5%)。干細(xì)胞的數(shù)量計(jì)算為干細(xì)胞出現(xiàn)率乘以獲得的有核ADC細(xì)胞的總數(shù)量。從再生細(xì)胞生長(zhǎng)的高百分比( 100%)的CFU-F表達(dá)細(xì)胞表面分子⑶105，其還通過源自骨髓的干細(xì)胞表達(dá)(Barry等人，1999)。⑶105也通過脂肪來源組織的干細(xì)胞表達(dá)(Zuk 等人，2002)。在這里使用的，術(shù)語“脂肪組織”指的是脂肪，包括存儲(chǔ)脂肪的結(jié)締組織。脂肪組織包含多種再生細(xì)胞類型，包括ASC和內(nèi)皮祖細(xì)胞和前體細(xì)胞。在這里使用的，術(shù)語“脂肪組織單元”指的是分離的或可測(cè)量的脂肪組織的量。可 以通過確定單元的重量和/或體積來測(cè)量脂肪組織單元?；谏厦娲_定的數(shù)據(jù)，當(dāng)從患者體內(nèi)移除時(shí)，處理過的脂肪抽出物單元具有細(xì)胞成分，其中至少O. 1%的細(xì)胞成分為干細(xì)胞；即，如上所述確定的其干細(xì)胞出現(xiàn)率為至少O. 1%。參考這里所公開的，脂肪組織單元可以指的是從患者移除的全部的量的脂肪組織，或者小于從患者移除的全部的量的脂肪組織。從而，脂肪組織單元可以與另一個(gè)脂肪組織單元，結(jié)合以形成重量或體積為單獨(dú)的單元的和的脂肪組織單元。在這里使用的，術(shù)語“部分”指的是小于全部的材料的量。較小的部分指的是小于50%的量，并且較大的部分指的是大于50%的量。從而，小于從患者移除的脂肪組織的全部量的脂肪組織單元為移除的脂肪組織的一部分。在這里使用的，術(shù)語“處理過的脂肪抽出物”指的是已經(jīng)被處理以從成熟的脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織分離活性的細(xì)胞成分(例如，包含再生的成分)的脂肪組織。此部分在這里指的是“脂肪來源的細(xì)胞”或“ADC”。通常，ADC指的是通過清洗并且從脂肪組織分離并且濃縮細(xì)胞獲得的再生細(xì)胞小團(tuán)。該小團(tuán)通常通過離心分離細(xì)胞的懸浮液，使得細(xì)胞聚集在離心分離腔室或細(xì)胞濃縮器的底部來獲得。在這里使用的，術(shù)語“給藥”、“遞送”、“輸送”、“放置”和“移植”在這里可互換地使用并且指的是通過導(dǎo)致再生細(xì)胞至少部分定位在希望的地點(diǎn)的方法或路線，將本發(fā)明的再生細(xì)胞放置到受試者體內(nèi)。再生細(xì)胞可以通過任何適合的路線給藥，其導(dǎo)致輸送到受試者體內(nèi)希望的位置，在該處細(xì)胞或細(xì)胞成分的至少一部分保持能夠生存。在給藥到受試者以后細(xì)胞能生存的時(shí)期可能短到數(shù)個(gè)小時(shí)如24小時(shí)，到數(shù)天，到長(zhǎng)達(dá)數(shù)年。在這里使用的，術(shù)語“治療”包括減小或減輕疾病或病癥的至少一種有害影響或癥狀。在這里使用的，“治療有效劑量的再生細(xì)胞”指的是一定量的再生細(xì)胞，其足夠引起有益的或希望的臨床效果。所述劑量可以是單次或多次給藥。然而，精確地確定被認(rèn)為是有效的劑量的量可以基于每個(gè)患者的獨(dú)特因素，包括但不限于患者的年齡、尺寸(size)、疾病類型或程度、疾病的階段、再生細(xì)胞的給藥途徑、所使用補(bǔ)充治療的類型或程度、正在進(jìn)行的疾病過程和希望的治療類型(例如，主動(dòng)的或者常規(guī)的治療)。
在這里使用的，術(shù)語“受試者”包括溫血?jiǎng)游?，?yōu)選為哺乳動(dòng)物，包括人類，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試者為靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，受試者為人類。如之前在這里闡明的，再生細(xì)胞例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞，可以從多種組織獲取。本發(fā)明的系統(tǒng)可以用于全部這樣的組織。然而，脂肪組織是特別充足的再生細(xì)胞來源。因此，在這里示出的本發(fā)明的系統(tǒng)使用脂肪組織作為再生細(xì)胞源，這僅是作為示例而不是限制性的?？梢酝ㄟ^任何本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知的方法獲得脂肪組織。例如，可以通過吸脂(注射器或動(dòng)力輔助的)或通過脂肪切除術(shù)，例如抽吸輔助的脂肪成形術(shù)、超聲輔助的脂肪成形術(shù)和切除的脂肪切除術(shù)或它們的組合，來從患者移除脂肪組織。移除脂肪組織并采集，并且可以根據(jù)在這里描述的本發(fā)明的系統(tǒng)的任何實(shí)施方式進(jìn)行處理。采集的組織的量取決于許多因素，包括指供體的身體質(zhì)量指數(shù)和年齡，可用于采集的時(shí)間，可到達(dá)的脂肪組織獲取地點(diǎn)的可用性，伴隨的和預(yù)先存在的藥物和狀態(tài)(諸如抗凝血療法)，以及采集組織的臨床目的。例如，從瘦的個(gè)體取出的100毫升脂肪組織的再生細(xì)胞百分率大于從肥胖的指獻(xiàn)者取出的100毫升脂肪組織的再生細(xì)胞百分率(表I)。這可能反映肥胖的個(gè)體中， 增加的脂肪含量的稀釋效率。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，與瘦的患者比較，希望從超重的供體獲得更大量的組織。此觀察結(jié)果還指示本發(fā)明的使用不限于具有大量脂肪組織的個(gè)體。表I :身體質(zhì)量指數(shù)對(duì)組織和細(xì)胞產(chǎn)量的影響
身體質(zhì)量指數(shù)狀態(tài) I所獲得組織的量(克)I總的再生細(xì)胞產(chǎn)量(Xio7)
正常641 + 1422. 1 + 0.4
月巴月半I, 225 士 1732. 4 + 0. 5
P 值00306在脂肪組織被處理以后，所得到的再生細(xì)胞基本上沒有成熟的脂肪細(xì)胞和結(jié)締組織。例如，所得到的再生細(xì)胞可以基本上沒有膠原和細(xì)胞外基質(zhì)組合物，但可以含有出現(xiàn)在結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞。因此，本發(fā)明的系統(tǒng)產(chǎn)生多種異源的脂肪來源的再生細(xì)胞，其可以用于研究和/或治療目的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞適合用于放置或重新注入受體的身體內(nèi)，在其它實(shí)施方式中，這些細(xì)胞可以用于研究，例如，這些細(xì)胞可以用于建立干細(xì)胞或祖細(xì)胞系，其可以長(zhǎng)時(shí)期生存并且用于進(jìn)一步的研究?，F(xiàn)在將詳細(xì)地參考本發(fā)明的當(dāng)前優(yōu)選的實(shí)施方式，其實(shí)施例在附圖中示出?？赡艿脑挘诟綀D和描述中使用的相同或相似的參考數(shù)字指的是相同或相似的部分。需要注意，附圖為簡(jiǎn)化的形式而不是比例精確的。參考這里所公開的，僅為了方便和清晰，相對(duì)于附圖使用諸如頂部、底部、左、右、上、下、上面、之上、下面、之下、后、前、遠(yuǎn)端和近端的方向術(shù)語。這樣的方向術(shù)語不應(yīng)該解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。雖然這里的所公開的指的是某些說明的實(shí)施方式，應(yīng)該理解這些實(shí)施方式是通過實(shí)施例提出并且不是限制性的。雖然討論的是示例性的實(shí)施方式，下面詳細(xì)描述的目的應(yīng)該解釋為覆蓋屬于通過后附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的實(shí)施方式的所有修飾、替代物和等價(jià)物。本發(fā)明可以與本領(lǐng)域中通常使用的各種醫(yī)療過程結(jié)合使用。現(xiàn)在參考附圖，本發(fā)明的系統(tǒng)10通常包括一個(gè)或多個(gè)組織采集腔室20、處理腔室30、廢物腔室40、輸出腔室50和樣品腔室60。不同的腔室通過一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)管12連接到一起，使得包含生物材料的流體可以從一個(gè)腔室通到另一個(gè)腔室，同時(shí)保持閉合無菌的流體/組織通道。導(dǎo)管可以包括剛性或柔性的主體，在這里可互換地分別指管腔和管道。在某些實(shí)施方式中，導(dǎo)管的形式為柔性的管道，諸如臨床設(shè)施中通常使用的聚乙烯管道、硅樹脂管道或本領(lǐng)域中已知的任何其它材料。導(dǎo)管12的尺寸可以根據(jù)需要流體通道還是組織通道而變化。導(dǎo)管12的尺寸還可以根據(jù)循環(huán)通過系統(tǒng)的組織或流體的量而變化。例如，對(duì)于流體通道，導(dǎo)管的直徑在大約O. 060英寸 大約O. 075英寸的范圍內(nèi)，而對(duì)于組織通道，導(dǎo)管的直徑在O. 312英寸、.750英寸的范圍內(nèi)。通常，選擇導(dǎo)管的尺寸以平衡導(dǎo)管能夠容納的體積和傳送組織或流體通過所述導(dǎo)管所需要的時(shí)間。在系統(tǒng)的自動(dòng)化實(shí)施方式中，前述參數(shù)，即體積和傳送時(shí)間，必須被識(shí)別，以使得適合的信號(hào)可以傳輸?shù)较到y(tǒng)的處理設(shè)備。這使得設(shè)備將準(zhǔn)確體積的液體和組織從一個(gè)腔室運(yùn)動(dòng)到另一個(gè)腔室。所使用柔性的管道應(yīng)該能夠承受負(fù)壓以減小塌陷的可能。所使用柔性的管道還應(yīng)該能夠承受通過例如可以用于系統(tǒng) 中的正排量泵產(chǎn)生的正壓。系統(tǒng)的全部腔室可以包括一個(gè)或多個(gè)口，例如，出口 22或入口 21，其接受標(biāo)準(zhǔn)IV、注射器和抽吸管道連接器。這些口可以為密封的口，諸如用橡膠隔片關(guān)閉的注射器針進(jìn)入口 51。入口可以通過導(dǎo)管連接到一個(gè)或多個(gè)插管(cannulas)(未示出)。例如，組織入口21可以連接到整體單一使用的吸脂插管，并且導(dǎo)管可以為柔性管道。導(dǎo)管通常定位為提供從系統(tǒng)一個(gè)腔室到另一個(gè)腔室的流體通道。為此，導(dǎo)管和口可以連接到例如可以手動(dòng)或自動(dòng)操作的抽吸設(shè)備(未示出)。該抽吸設(shè)備可以為例如，注射器或電泵。抽吸設(shè)備應(yīng)該能夠提供足夠的負(fù)壓以從患者抽出組織。通常，可以使用本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員，例如外科醫(yī)生已知的任何適合的抽吸設(shè)備。導(dǎo)管12還可以包括一個(gè)或多個(gè)夾具(未示出)以控制材料在系統(tǒng)的不同部件之間流動(dòng)。通過有效地密封系統(tǒng)的不同區(qū)域，夾具可以用于保持系統(tǒng)無菌。替代地，導(dǎo)管12可以包括控制材料流動(dòng)通過系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)閥14。在圖中，閥14標(biāo)識(shí)為空心圓(opencircle)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，閥可以為機(jī)電夾緊式膠管閥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，閥可以為氣動(dòng)閥。在另一個(gè)實(shí)施方式中，閥可以為液壓閥或機(jī)械閥。這樣的閥優(yōu)選為通過可以連接到杠桿的控制系統(tǒng)觸發(fā)?？梢允謩?dòng)操縱杠桿使其被觸發(fā)。在自動(dòng)化的實(shí)施方式中，控制系統(tǒng)可以連接到杠桿以及連接到處理設(shè)備，其可以在預(yù)先確定的觸發(fā)條件觸發(fā)閥。在某些自動(dòng)化的實(shí)施方式中，閥的觸發(fā)可以是部分自動(dòng)并且部分根據(jù)使用者的偏好，使得過程可以被優(yōu)化。在其它的實(shí)施方式中，某些閥可以手動(dòng)觸發(fā)，同時(shí)另一些閥通過處理設(shè)備自動(dòng)地觸發(fā)。閥14還可以與一個(gè)或多個(gè)泵，例如蠕動(dòng)泵34或正排量泵(未示出)結(jié)合使用。導(dǎo)管12和/或閥14還可以包括傳感器29，例如，光學(xué)傳感器、超聲傳感器、壓力傳感器或本領(lǐng)域已知能夠分辨流過系統(tǒng)的不同流體成分和流體水平的其它形式的監(jiān)控器。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，傳感器29可以為光學(xué)傳感器。系統(tǒng)還可以包括多個(gè)過濾器36。在某些實(shí)施方式中，過濾器可以在系統(tǒng)的腔室28內(nèi)。系統(tǒng)內(nèi)的不同腔室可以包括不同的過濾器，過濾器有效地從不期望的細(xì)胞和可以根據(jù)本系統(tǒng)使用的分解劑中分離再生細(xì)胞例如干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器組件36包括空心纖維過濾設(shè)備。在另一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器組件36包括滲濾(percolative)過濾設(shè)備,其可以與或可以不與沉淀過程一起使用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器組件36包括離心設(shè)備，其可以與或可以不與淘析設(shè)備和過程一起使用。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，該系統(tǒng)包括這些過濾設(shè)備的結(jié)合。本發(fā)明的過濾功能可以為雙重的，一些過濾器從諸如膠原蛋白、游離的脂質(zhì)、游離的脂肪細(xì)胞和殘余的膠原酶的最終濃縮物移除物質(zhì)，其它過濾器用于濃縮最終產(chǎn)品。該系統(tǒng)的過濾器可以包括多個(gè)孔，孔的直徑和/或長(zhǎng)度從20微米 800微米。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采集腔室20具有前置過濾器28，前置過濾器28具有多個(gè)80微米 400微米的孔。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，采集腔室20具有前置過濾器28，前置過濾器28具有多個(gè)265微米的孔。在其它實(shí)施方式中，過濾器可以為可拆的和/或一次性的。系統(tǒng)還可以包括一個(gè)或多個(gè)溫度控制設(shè)備(未示出)，其定位為調(diào)節(jié)包含在系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)腔室內(nèi)材料的溫度。溫度控制設(shè)備可以為加熱器、冷卻器或二者都有，即可以能夠在加熱器和冷卻器之間轉(zhuǎn)換。溫度設(shè)備可以調(diào)節(jié)通過系統(tǒng)的任何材料的溫度，包括組織、 分解劑、重懸浮劑、漂洗劑、清洗劑或添加劑。例如，加熱脂肪組織促進(jìn)分解，而冷卻再生細(xì)胞輸出對(duì)保持生存能力是需要的。而且，如果需要預(yù)熱的試劑以優(yōu)化組織處理，則溫度設(shè)備的任務(wù)為保持預(yù)先確定的溫度而不是增加或降低該溫度。為了保持閉合無菌的流體/組織通道，全部口和閥可以包括保持系統(tǒng)的密封構(gòu)造的封閉裝置。封閉裝置可以為不能滲透流體、空氣和其它污染物的膜，或者其可以為本領(lǐng)域中已知的任何其它適合的封閉裝置。此外，系統(tǒng)的全部口可以設(shè)計(jì)為使得它們可以容納注射器、針或其它用于在不會(huì)危害系統(tǒng)的無菌性的情況下抽出腔室內(nèi)的材料的設(shè)備。如在這里闡明的，可以通過任何本領(lǐng)域中公認(rèn)的方法從患者取出組織。抽吸的組織可以在放置在系統(tǒng)內(nèi)用于處理之前取出。抽吸的組織通常經(jīng)由密封的入口，諸如用橡膠隔片關(guān)閉的注射器針入口(未在采集腔室上示出)，通過導(dǎo)管12傳輸?shù)讲杉皇?0。替代地，組織取出步驟可以為系統(tǒng)的一部分。例如，采集腔室20可以包括真空管線11，其促進(jìn)使用插入患者的標(biāo)準(zhǔn)插管來移除組織。從而，在此實(shí)施例中，整個(gè)系統(tǒng)接附到患者。可以經(jīng)由為閉合的無菌通道的一部分的諸如12a的導(dǎo)管，通過入口 21將組織引入采集腔室20。采集腔室20可以包括多個(gè)柔性的或剛性的罐或圓筒或它們的組合。例如，采集腔室20可以包括一個(gè)或多個(gè)不同尺寸的剛性罐。采集腔室20還可以包括一個(gè)或多個(gè)柔性的袋。在這樣的系統(tǒng)中，袋優(yōu)選為提供有支撐件，諸如內(nèi)部或外部的框，其幫助減小袋在抽吸作用下塌陷的可能。采集腔室20的尺寸為保持需要量的鹽水，以在處理腔室30內(nèi)執(zhí)行過程的清洗和濃縮階段之前，適當(dāng)?shù)厍逑春头纸饨M織。優(yōu)選地，可以容易地用肉眼確定存在于采集腔室20內(nèi)的組織或流體的體積。例如，為了從脂肪組織獲得再生細(xì)胞，適合的采集腔室具有保持800毫升脂肪抽出物和1200毫升鹽水的容量。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，采集腔室20具有至少2升的容量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，為了從血液分離并且濃縮紅細(xì)胞，采集腔室20具有至少I. 5升的容量。通常，采集腔室20的尺寸將根據(jù)從患者采集的組織的類型和量變化。采集腔室20的尺寸為保持最小大約5毫升到大約2升組織。對(duì)于較小的組織體積，例如，5毫升到100毫升，在傳輸?shù)讲杉皇?0之前可以將組織收集在注射器內(nèi)。采集腔室20可以使用任何能夠被殺菌的生物相容的適合的材料制造。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采集腔室20用一次性材料制造，該材料符合在ISO10993標(biāo)準(zhǔn)中描述的用于血管內(nèi)接觸的生物相容性要求。例如，可以使用聚碳酸酯丙烯酸樹脂或ABS。采集腔室20的流體通道優(yōu)選為無熱原的，即，適用于血液用途，沒有傳輸疾病的危險(xiǎn)。在一個(gè)實(shí)施方式中，采集腔室20由允許使用者用視覺確定存在于腔室內(nèi)的組織的大致體積的材料制造。在其它實(shí)施方式中，采集腔室20內(nèi)的組織和/或流 體的體積通過自動(dòng)傳感器29確定。采集腔室20優(yōu)選地設(shè)計(jì)為使得在自動(dòng)化的實(shí)施方式中，系統(tǒng)能夠以合理的精確度確定腔室內(nèi)的組織和/或流體的體積。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，系統(tǒng)以正負(fù)百分之十五的精確度感測(cè)采集腔室內(nèi)的體積。在僅作為示例提供的特定實(shí)施方式中，采集腔室20為剛性腔室的形式，例如，由醫(yī)用聚碳酸酯制造的腔室，包含由網(wǎng)格尺寸為265微米(參看圖5)的醫(yī)用聚酯制造的大致為圓錐形的前置過濾器28。剛性的組織采集容器的尺寸可以為大約8英寸高并且直徑大約為5英寸；壁厚可以為大約O. 125英寸。圓筒的內(nèi)部可以通過以下口進(jìn)入例如，一個(gè)或多個(gè)用于抽吸管道的口，一個(gè)或多個(gè)具有用于通過無菌對(duì)接技術(shù)連接的管道的口，和/或一個(gè)或多個(gè)用于針通過橡膠隔片刺穿進(jìn)入的口。采集腔室20內(nèi)部的前置過濾器28優(yōu)選構(gòu)造為例如在從患者移除組織時(shí)，保留脂肪組織并且讓非脂肪組織通過。更特定地，在開始獲取脂肪組織期間或者在另一個(gè)實(shí)施方式中在開始獲取脂肪組織以后，過濾器28可以允許游離的脂質(zhì)、血液和鹽水通過，而保留脂肪組織的片段。因此，過濾器28包括多個(gè)相同或不同尺寸的孔，孔的尺寸在20微米 5毫米的范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，過濾器28包括多個(gè)400微米的孔。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，過濾器28為厚度大約200微米、孔尺寸為大約265微米并且開孔面積為大約47%的醫(yī)用聚酯網(wǎng)。此材料在漂洗過程中保留組織但是隨著組織分解允許細(xì)胞通過該網(wǎng)。從而，當(dāng)組織從患者體內(nèi)抽出時(shí)，可以從脂肪組織分離非脂肪組織?？梢杂貌煌牟牧稀⒕W(wǎng)格尺寸和孔的數(shù)量和類型實(shí)現(xiàn)相同的功能。例如，小于100微米或數(shù)千微米大的網(wǎng)格孔尺寸可以實(shí)現(xiàn)相同的目的，即在保留脂肪聚集體和片段的同時(shí)允許鹽水和血細(xì)胞通過。相似地，可以使用替代的剛性塑料材料，或者通過本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員所知道的許多其它修飾實(shí)現(xiàn)相同的目的。系統(tǒng)10也可以包括一個(gè)或多個(gè)溶液源22。溶液源可以包括清洗溶液源23，以及組織分解劑源24，諸如膠原酶。采集腔室20包括允許以無菌的方式將清洗和分解溶液或制劑添加到組織的閉合的流體通道。用于清洗溶液23和分解劑24的容器可以為任何適合的容器，其能夠以無茵的方式保持它們的內(nèi)容物，例如，可折疊收縮的袋，諸如用于臨床設(shè)施中的IV袋。這些容器可以具有導(dǎo)管12，諸如導(dǎo)管12e，其連接到采集腔室20，使得清洗溶液和分解劑能夠輸送到采集腔室20內(nèi)部。清洗溶液和分解劑可以通過任何本領(lǐng)域認(rèn)可的方式輸送到采集腔室20內(nèi)部，包括施加到用于鹽水23和/或分解劑24的容器外部的簡(jiǎn)單的重力壓力，或者通過在例如圖4所示導(dǎo)管12d的導(dǎo)管上放置正排量泵。在自動(dòng)化的實(shí)施方式中，系統(tǒng)的處理設(shè)備基于使用者初始輸入的信息(例如，處理的組織的體積)來計(jì)算不同的參數(shù)，例如，鹽水的體積和清洗需妥的時(shí)間或循環(huán)的數(shù)量，以及分解劑的濃度或量和分解需要的時(shí)間。替代地，量、時(shí)間等參數(shù)可以由使用者手動(dòng)操縱。采集腔室內(nèi)的組織和/或流體應(yīng)該保持在30 V到40 V的溫度范圍內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采集腔室內(nèi)的懸浮液的溫度保持在37 °C。在某些實(shí)施方式中，如果外科手術(shù)過程或治療應(yīng)用需要延遲，可以將選擇的組織存儲(chǔ)在采集腔室內(nèi)稍后使用。組織可以存儲(chǔ)在室溫或大約室溫或者存儲(chǔ)在大約4°C達(dá)到96小時(shí)。清洗溶液可以為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知的任何溶液,包括鹽水或任何其它含緩沖劑或不含緩沖劑的電解質(zhì)溶液。處理的組織類型將指示使用的清洗溶液的類型或組合。通常，清洗溶液，諸如鹽水，在已經(jīng)從患者移除脂肪組織并且將脂肪組織放置到采集腔室內(nèi)以后進(jìn)入采集腔室20。然而，清洗溶液可以在取出脂肪組織以前輸送到采集容器20，或者可以與脂肪組織同時(shí)輸送到采集腔室20。在采集腔室20中，清洗溶液和取出的脂肪組織可以通過包括下述方法的任何方法混合。例如，該組織可以通過攪動(dòng)清洗(其最大化細(xì)胞生存能力并且最小化輸送的游離的脂質(zhì)的量)。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)由通過不同度的弧(例如，通過大約45度到大約90度的孤)以不同的速度，例如大約每分鐘30轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)整個(gè)采集腔室20來攪動(dòng)組織。在其它實(shí)施方式中，經(jīng)由通過不同度的孤(例如，通過大約45度到大約90度的弧)以不同的速度，例如大約每分鐘30轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)整個(gè)采集腔室20來攪動(dòng)組織，其中采集腔室20包括一個(gè)或多個(gè)剛性接附到采集腔室內(nèi)表面的槳或突出物。上述采集腔室20的旋轉(zhuǎn)可以通過接附到或接 近采集腔室20的驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)。驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)可以為簡(jiǎn)單的傳動(dòng)帶或齒輪或本領(lǐng)域已知的其它驅(qū)動(dòng)機(jī)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)的速度可以為例如每分鐘30轉(zhuǎn)。通常，發(fā)現(xiàn)較高速度產(chǎn)生較大量游離的脂質(zhì)，因此不是最佳的。在其它實(shí)施方式中，通過將可旋轉(zhuǎn)的軸25放置在采集腔室20內(nèi)部來攪動(dòng)組織，其中，可旋轉(zhuǎn)的軸包括一個(gè)或多個(gè)剛性接附到可旋轉(zhuǎn)的軸25的槳25a或突出物，在旋轉(zhuǎn)軸時(shí)，槳25a或突出物通過混合物。在某些實(shí)施方式中，具有剛性接附的槳25a的可旋轉(zhuǎn)的軸25可以靠在采集腔室20的底部上。這可以，例如，通過將槳狀設(shè)備放置到旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)內(nèi)實(shí)現(xiàn)(例如，磁力攪拌器)。替代地，可以使用本領(lǐng)域中已知的簡(jiǎn)單的攪拌器，即，執(zhí)行上下?lián)u動(dòng)而不旋轉(zhuǎn)的設(shè)備來實(shí)現(xiàn)。也可以使用本領(lǐng)域認(rèn)可的任何其它方法來清洗組織，包括搖擺、搖動(dòng)、倒轉(zhuǎn)等等。在需要的數(shù)量的清洗循環(huán)以后，可以將組織分解劑輸送到采集腔室20，以從剩下的脂肪組織成分分離再生細(xì)胞。分解劑可以為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知的任何分解齊U?？梢允褂玫姆纸鈩┌ㄖ行缘鞍酌?、膠原酶、胰蛋白酶、脂肪酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶、Blendzyme酶混合物族成員，例如LiberaseHl、胃蛋白酶、超聲或其它物理能量、激光、微波、其它機(jī)械設(shè)備和/或它們的組合。本發(fā)明優(yōu)選的分解劑為膠原酶。分解劑可以與其它溶液一起添加。例如，鹽水，諸如從上述鹽水源23輸送的鹽水，可以與膠原酶同時(shí)添加或者緊接著之后添加到脂肪組織。在一個(gè)實(shí)施方式中，清洗的脂肪組織在37°C或在37°C左右與包含膠原酶的酶溶液混合大約2(Γ60分鐘。在其它實(shí)施方式中，可以添加更高濃度的膠原酶或相似制劑以減小消化時(shí)間。清洗的脂肪組織和組織分解劑可以隨后以與上述攪動(dòng)方法相似的方式攪動(dòng)，直到清洗的脂肪組織分解。例如，可以經(jīng)由通過大約90度的弧旋轉(zhuǎn)整個(gè)采集腔室，通過具有包含一個(gè)或多個(gè)槳的軸，該槳在軸旋轉(zhuǎn)時(shí)通過溶液和/或通過旋轉(zhuǎn)整個(gè)采集腔室，在該采集腔室的內(nèi)表面上包含槳或突出物，來攪動(dòng)清洗的脂肪組織和組織分解劑。根據(jù)脂肪來源的細(xì)胞的使用目的，脂肪組織可以部分分解或完全分解。例如，在脂肪來源的細(xì)胞要與脂肪組織單元結(jié)合的實(shí)施方式中，需要部分分解獲取的脂肪組織，移除部分分解的脂肪組織的一部分，并且隨后繼續(xù)分解剩余在采集腔室中的脂肪組織的剩余部分。替代地，在任何消化以前，可以移除一部分清洗的脂肪組織并且將其擱置在樣品容器內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，獲取的脂肪組織被部分地分解以在被重新引入回到患者體內(nèi)以前濃縮細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，脂肪組織與組織分解劑混合通常小于大約20分鐘的一段時(shí)間。隨后從采集腔室移除部分地分解的組織的一部分，并且可以通過將脂肪組織與組織分解劑再混合40分鐘來進(jìn)一步分解剩余的部分地分解的組織。當(dāng)脂肪來源的細(xì)胞要用作基本上純的再生細(xì)胞群體時(shí)，脂肪組織可以被完全分解。消化以后，允許組織和分解劑溶液沉淀一段足夠的時(shí)間，以允許溶液能漂浮的部分和不能漂浮的部分在采集腔室內(nèi)區(qū)分。通常，時(shí)間在大約15秒到數(shù)分鐘的范圍內(nèi)，但是在修飾的實(shí)施例中，也可以使用其它時(shí)間。能漂浮的層包括需要進(jìn)一步清洗和濃縮的再生細(xì)胞。不能漂浮的層包括血液、膠原蛋白、脂質(zhì)和組織的其它非再生細(xì)胞成分。不能漂浮的層必須被移除到廢物腔室。因此，采集腔室20優(yōu)選為包括在腔室的最下面的位置的出口 22，使得血液和組織的其它不能漂浮的部分可以通過一個(gè)或多個(gè)導(dǎo)管12排出到一個(gè)或多個(gè)廢物容器400采集腔室20通常處于(或者可以放置在)直立的位置，使得出口 22定位在采集腔室的底部。排 出可以為被動(dòng)的或主動(dòng)的。例如，上述不能漂浮的成分可以使用重力、通過施加正或負(fù)壓力、通過使用泵34或通過使用排出口 32排出。在自動(dòng)化的實(shí)施方式中，處理設(shè)備可以發(fā)信號(hào)通知某些閥和/或泵以從采集腔室20排出不能漂浮的層。自動(dòng)化的實(shí)施方式也可以包括傳感器29，其能夠探測(cè)能飄浮的和不能漂浮的液體之間何時(shí)達(dá)到分界面。自動(dòng)化的實(shí)施方式也可以包括傳感器29，例如，光學(xué)傳感器，其可以能夠探測(cè)直通采集腔室的導(dǎo)管內(nèi)流動(dòng)的流出物的光折射的變化，光折射的適當(dāng)變化可以標(biāo)志輸出導(dǎo)管內(nèi)存在能漂浮的層，其指示不能漂浮的層已經(jīng)被排出。傳感器29能夠隨后發(fā)信號(hào)通知處理設(shè)備繼續(xù)下一個(gè)步驟。然而，在某些實(shí)施方式中，組織可以被處理以取回組織的非再生細(xì)胞成分。例如，在某些治療的或研究的應(yīng)用中，可能需要膠原質(zhì)、蛋白質(zhì)、基質(zhì)或基質(zhì)的成分、脂質(zhì)、脂肪細(xì)胞或組織的其它成分。在這樣的實(shí)施方式中，包括再生細(xì)胞的能漂浮的層必須如上述般被移除到廢物腔室。不能漂浮的層隨后保留在系統(tǒng)中以根據(jù)需要用于進(jìn)一步處理。一旦移除不能漂浮的層，包括再生細(xì)胞的能漂浮的層可以被清洗一次或多次以移除殘余的污染物。因此，采集腔室20通常包括用于允許清洗溶液被輸送到腔室內(nèi)部的一個(gè)或多個(gè)口(port) 21，以及用于允許廢物和其它材料被引導(dǎo)出采集腔室20的一個(gè)或多個(gè)口22。例如，采集腔室可以包括一個(gè)或多個(gè)如在這里描述的密封的進(jìn)入口。采集腔室20還可以包括一個(gè)或多個(gè)帽(未示出)，諸如頂部帽和底部帽，以進(jìn)一步確保在清洗溶液被輸送到采集腔室內(nèi)和/或廢物被傳送出采集腔室的同時(shí)系統(tǒng)保持無菌。口 21可以提供在采集腔室的帽上或者在采集腔室的側(cè)壁上。可以重復(fù)使用新的清洗溶液的清洗過程，直到溶液內(nèi)的不能漂的污染物的殘余量達(dá)到預(yù)先確定的水平。換句話說，采集腔室20內(nèi)剩余的材料，其包括上述混合物的能漂浮的材料，包括脂肪組織片段，可以被額外清洗一次或多次，直到不需要的材料的量減小到需要的預(yù)先確定的水平。一種確定清洗的終點(diǎn)的方法為測(cè)量組織溶液內(nèi)紅細(xì)胞的量。這能夠通過測(cè)量在540納米波長(zhǎng)吸收光來實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，認(rèn)為大約O. 546 大約O. 842之間的范圍是可以接受的。在清洗和/或分解期間，一種或多種添加劑可以根據(jù)需要添加到不同的容器以增強(qiáng)結(jié)果。一些添加劑的例子包括優(yōu)化清洗和分解的制劑、增強(qiáng)處理期間活性的細(xì)胞群體的生存能力的添加劑、抗微生物劑(例如抗生素)、溶解脂肪細(xì)胞和/或紅細(xì)胞的添加劑、或富集所期望細(xì)胞群體的添加劑(通過有差別地粘附到回相部分或另外促進(jìn)細(xì)胞群體的相當(dāng)大的減少或者富集)。其它可能的添加劑包括那些促進(jìn)再生細(xì)胞恢復(fù)和生存能力的添加劑(例如，半脫氨酸蛋白酶抑制劑)或那些減小注入或安置中的有害反應(yīng)的可能性的添加劑(例如，細(xì)胞或結(jié)締組織再次分解的抑制劑)。在足夠的沉淀時(shí)間以后，所得到的清洗的脂肪組織片段和脂肪分解劑的混合物的不能漂浮的部份將包含再生細(xì)胞，例如，干細(xì)胞和其它脂肪來源的祖細(xì)胞。如在這里討論的，包含再生細(xì)胞的不能漂浮的部份將被傳輸?shù)教幚砬皇?0，其中，所關(guān)心的再生細(xì)胞，諸如脂肪來源的干細(xì)胞，將從存在于混合物的不能漂浮的部份中的其它細(xì)胞和材料分離。在這里，不能漂浮的部份指的是再生細(xì)胞組合物并且包括多種不同類型的細(xì)胞，包括干細(xì)胞、祖細(xì)胞、內(nèi)皮前體細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和其它在這里描述的再生細(xì)胞。再生細(xì)胞組合物還可以包含一種或多種污染物，諸如存在于脂肪組織片段中的膠原蛋白和其它結(jié)締組織蛋白質(zhì)和其片段，或來自組織分解過程的殘余的膠原酶。
本發(fā)明的處理腔室30優(yōu)選地定位在系統(tǒng)內(nèi)部，使得再生細(xì)胞組合物通過管道12、閥14和泵34以無菌的方式從采集腔室20運(yùn)動(dòng)到處理腔室30。處理腔室的尺寸為容納10毫升 I. 2升范圍內(nèi)的組織/流體混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，處理腔室的尺寸為容納800毫升。在某些實(shí)施方式中，來自采集腔室20的全部再生細(xì)胞組合物被引導(dǎo)到處理腔室30。然而，在其它實(shí)施方式中，再生細(xì)胞組合物的一部分被引導(dǎo)到處理腔室30，并且另一部分被引導(dǎo)到系統(tǒng)的不同的區(qū)域，例如，樣品腔室60，以稍后與處理腔室30內(nèi)處理的細(xì)胞重新結(jié)合。處理腔室30可以使用任何能夠與被殺菌的生物相容的適合材料制造。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，采集腔室30用一次性材料制造，該材料符合在ISO10993標(biāo)準(zhǔn)中描述的用于血管內(nèi)接觸的生物相容性要求，例如，可以使用聚碳酸酯、丙烯酸樹脂、ABS、乙烯-醋酸乙烯共聚物或苯乙烯丁二烯共聚物(SBC)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，一次性的處理腔室的流體通道為無熱原的，處理腔室可以采取塑料袋的形式，諸如那些通常用于在血庫中處理血液的塑料袋；或者在其它實(shí)施方式中，其可以為剛性結(jié)構(gòu)(圖6)。在一個(gè)實(shí)施方式中，處理腔室30可以與共同擁有的2001年12月7日提出的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/316, 127和2002年12月20日提出的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/325,728中公開的處理腔室相似，這里將這兩篇專利申請(qǐng)的內(nèi)容全文通過參考進(jìn)行引入。處理腔室30可以以任何適合于分離和濃縮細(xì)胞的方式構(gòu)造，包括過濾和離心分離和/或它們的組合。在某些實(shí)施方式中，來自采集腔室20的再生細(xì)胞組合物被引入處理腔室30，此處能夠過濾該組合物以分離和/或濃縮特定的再生細(xì)胞群體。細(xì)胞過濾為將特定的成分和細(xì)胞從其它不同的成分或不同類型的細(xì)胞分離的方法。例如，本發(fā)明的再生細(xì)胞組合物包括多種不同類型的細(xì)胞，包括干細(xì)胞、祖細(xì)胞和脂肪細(xì)胞以及一種或多種污染物，諸如膠原蛋白，其存在于脂肪組織片段中或來自組織分解過程的殘余的膠原酶。存在于處理腔室30中的過濾器36可以允許分離和濃縮再生細(xì)胞的特定的亞群體，例如，干細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞等等。一些與從液體過濾細(xì)胞相關(guān)的變量包括但不限于，過濾器介質(zhì)的孔尺寸、孔的幾何形狀(形狀)、過濾器的表面積、過濾的溶液的流動(dòng)方向、貫穿膜的壓力、特定的細(xì)胞群體的稀釋度、微粒的大小和形狀以及細(xì)胞大小和細(xì)胞生存能力。根據(jù)這里的公開物，需要分離或過濾的特定細(xì)胞通常為脂肪來源的干細(xì)胞。然而，在某些實(shí)施方式中，特定的細(xì)胞可以包括脂肪來源的祖細(xì)胞，諸如單獨(dú)的內(nèi)皮前體細(xì)胞或內(nèi)皮前體細(xì)胞與干細(xì)胞組合。再生細(xì)胞組合物可以被引導(dǎo)通過過濾器組件，諸如過濾器組件36。在某些實(shí)施方式中，過濾器組件36包括構(gòu)造為執(zhí)行不同的功能并且將再生細(xì)胞組合物分離為不同的部分或成分的多個(gè)過濾器。例如，過濾器之一可以構(gòu)造為從再生細(xì)胞組合物分離膠原蛋白，過濾器之一可以構(gòu)造為從再生細(xì)胞組合物分離脂肪細(xì)胞和/或脂質(zhì)成分，以及過濾器之一可以構(gòu)造為從再生細(xì)胞組合物分離殘余的酶，諸如組織分解劑。在某些實(shí)施方式中，過濾器之一能夠執(zhí)行兩個(gè)功能，諸如從組合物分離膠原蛋白和組織 分解劑。多個(gè)過濾器通常串聯(lián)地布置，然而，過濾器的至少一部分也可以并聯(lián)地布置。圖2中示出了過濾器組件36的過濾器的串聯(lián)布置。圖3中示出了過濾器組件36的過濾器的并聯(lián)布置。在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器組件36包括第一過濾器、第二過濾器和第三過濾器。第一過濾器構(gòu)造為移除存在于再生細(xì)胞組合物中的膠原質(zhì)顆粒。這些膠原蛋白顆粒通常直徑大約為O. I微米并且長(zhǎng)度能夠達(dá)到20微米。根據(jù)消化能力，膠原蛋白顆?？梢詾椴煌某叽纭Ｋ鼈円部梢允窃w維，意味著它們具有扭曲和旋轉(zhuǎn)。這里描述的任何過濾器可以由聚醚砜、聚醋、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚偏氟乙稀、或可能由纖維素構(gòu)造。過濾膠原蛋白存在兩種可能性。一種為試圖首先移除較大的顆粒，讓細(xì)胞通過，這需要例如大約在10微米范圍的過濾器。第二種方法為使用較小尺寸的過濾器，諸如4.5微米，目的為很好地消化膠原蛋白，以便捕獲細(xì)胞，并且讓膠原蛋白通過。這需要讓細(xì)胞從過濾器漂浮退出的裝置。還可能實(shí)現(xiàn)吸引并且保持膠原蛋白纖維的過濾器。第二過濾器構(gòu)造為移除在再生細(xì)胞組合物中不能漂浮的游離不成熟脂肪細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二過濾器可以由聚酯構(gòu)造并且孔尺寸在大約30和大約50微米之間，優(yōu)選的孔尺寸為大約40微米。雖然稱作第二過濾器，這樣的設(shè)備可以放置在第一而不是第二位置，以促進(jìn)初始移除較大的細(xì)胞和顆粒。第三過濾器構(gòu)造為移除存在于組合物中的未用過的或殘余的膠原酶或其它組織分解劑。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，膠原酶可以隨著時(shí)間的過去而退化。在一個(gè)實(shí)施方式中，第三過濾器包括多個(gè)直徑或長(zhǎng)度小于I微米的孔。在某些實(shí)施方式中，孔的直徑可以小于I微米。在其它實(shí)施方式中，孔的直徑在10千道爾頓和5微米之間。在某些實(shí)施方式中，第二過濾器可以構(gòu)造為將再生細(xì)胞群體濃縮到小體積的鹽水或其它清洗溶液中，如在這里描述的。當(dāng)前優(yōu)選地，僅最終過濾器為空心纖維單元。沒有必要任何過濾器必須是空心纖維類型的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，空心纖維單元用于最終過濾器，因?yàn)槠鋵?duì)在對(duì)再生細(xì)胞的有害影響最小的情況下移除膠原酶是最有效的。在設(shè)備采用現(xiàn)成的物品的實(shí)施例中，三個(gè)過濾器在分開的殼體中。如果空心纖維單元用于第二過濾器，將第一和第二過濾器結(jié)合到一個(gè)殼體內(nèi)是合理的。如采最終過濾器不是空心纖維配置，那么全部三個(gè)過濾器能夠包在一個(gè)殼體內(nèi)。過濾器組件36的過濾器可以定位在處理腔室30內(nèi)或可以提供為從處理腔室30分離的部件。另外，過濾器組件36的過濾器可以提供在多個(gè)處理腔室內(nèi)或者以在管線內(nèi)的方式提供。在某些實(shí)施方式中，導(dǎo)管或管道可以作為一個(gè)或多個(gè)處理腔室。處理腔室的尺寸可以減小，使得其變成連接過濾器的導(dǎo)管的內(nèi)部體積。如果組織溶液的體積大小適合，此類型系統(tǒng)將正確地起作用。從而，通過在具有細(xì)胞的流體穿過過濾器時(shí)容納該流體，導(dǎo)管可以作為處理腔室。應(yīng)該注意使得導(dǎo)管的體積最小，使得在起動(dòng)和運(yùn)行系統(tǒng)的過程中不會(huì)不必要地?fù)p失細(xì)胞/組織。參考上述實(shí)施方式，包含清洗的細(xì)胞和殘余的膠原蛋白、脂肪細(xì)胞和/或未消化的組織分解劑的再生細(xì)胞組合物可以被引導(dǎo)通過第一過濾器，以從該組合物移除膠原顆粒的至少一部分并且優(yōu)選地移除基本上全部，使得較少優(yōu)選沒有膠原蛋白顆粒存在于過濾的溶液內(nèi)。包含脂肪細(xì)胞和/或未消化的組織分解劑的過濾的再生細(xì)胞組合物，可以隨后被引導(dǎo)通過第二過濾器，以從過濾的再生細(xì)胞組合物移除游離的脂肪細(xì)胞的至少一部分并且優(yōu)選移除基本上全部。隨后，包含未消化的組織分解劑的兩次過濾的再生細(xì)胞組合物，可以被引導(dǎo)通過第二過濾器，諸如如在這里所討論的空心纖維過濾設(shè)備，以從再生細(xì)胞組合物移除或減少未消化的組織分解劑。三次過濾的再生細(xì)胞組合物(即在通過第一、第二和第二過濾器后剩余的組合物)可以隨后被引導(dǎo)到多個(gè)出口，其可以包括包含多個(gè)出口的處理腔室30的一部分。這些出口 可以用來維持必要的壓力，以及通過導(dǎo)管提供到其它容器的連接，其它容器可以包括采集腔室20、輸出腔室50和/或廢物容器40。在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器組件36的過濾器包括空心纖維過濾構(gòu)件?；蛘邠Q句話說，過濾器包括用過濾器介質(zhì)形成的空心管的聚集?？梢耘c公開的系統(tǒng)10—起使用的過濾器介質(zhì)的示例包括聚砜、聚醚砜或混合的酯材料和類似物。這些過濾器介質(zhì)的空心纖維或空心管可以包含在過濾器組件36的圓柱形濾筒內(nèi)。過濾器介質(zhì)的單獨(dú)的管或纖維的內(nèi)直徑通常在大約O. I毫米到大約I毫米的范圍內(nèi)，優(yōu)選的值為大約O. 5毫米。適合的圓柱形濾筒的直徑和長(zhǎng)度將確定可以放置在濾筒內(nèi)的過濾器介質(zhì)的單獨(dú)的管的數(shù)量。一個(gè)適合的空心纖維過濾器濾筒的示例為l.-iberFto185切向流過濾器，目錄#M-c-050-K(MinntechMinneapolis, Minnesota)。過濾器介質(zhì)的孔尺寸能夠在大約IOK道爾頓和大約5微米之間的范圍內(nèi)，優(yōu)選的孔尺寸為大約O. 5微米。在空心纖維過濾器中，每個(gè)空心管的主體具有第一端、第二端和定位在主體內(nèi)并且在第一端和第二端之間延伸的內(nèi)腔。每個(gè)空心管的主體包括多個(gè)孔。孔通常在主體內(nèi)定向?yàn)槭沟猛ㄟ^使再生細(xì)胞組合物流動(dòng)通過主體的內(nèi)腔來過濾再生細(xì)胞組合物，并且要被過濾的產(chǎn)品切向地通過孔，如圖12A所示。換句話說，液體中的較小顆粒相對(duì)于通過主體的內(nèi)腔的流體流動(dòng)切向地通過孔。當(dāng)過濾組合物時(shí)，具有再生細(xì)胞的組合物通過每個(gè)空心管的內(nèi)腔。優(yōu)選地，組合物的流動(dòng)與每個(gè)空心管的主體的孔成切向。通過使用切向地流動(dòng)的流體，與其它過濾技術(shù)相比，可以增強(qiáng)干細(xì)胞的過濾效率。例如，根據(jù)一些過濾技術(shù)，過濾器介質(zhì)的孔以這樣的方式布置，使得過濾器定向?yàn)榇怪庇诹黧w的流動(dòng)，使得過濾器介質(zhì)阻塞被過濾的流體的通道，如在圖12B中所示。在此類型的過濾中，被從例如干細(xì)胞的再生細(xì)胞組合物中濾出的顆粒傾向于在過濾器的一側(cè)積累并且阻塞流體通過孔的流動(dòng)。此阻塞可以減小過濾器的效率。另外，細(xì)胞被流體流的壓力以及積累在過濾器的上游側(cè)的細(xì)胞的重量不斷地壓縮。這能夠?qū)е略黾痈杉?xì)胞溶解。從而，在這樣的流體的流動(dòng)與過濾器內(nèi)的孔的方位平行的過濾技術(shù)中，在流體通過孔時(shí)，大細(xì)胞和小顆粒都可能被不合需要地引導(dǎo)靠著過濾器介質(zhì)。從而，諸如細(xì)胞的液體內(nèi)的較大的產(chǎn)品可能阻塞孔，從而降低過濾效果并且增加細(xì)胞破裂或傷害的發(fā)生。
相反，在當(dāng)前系統(tǒng)10的空心纖維構(gòu)造中，被過濾的流體在空心管的內(nèi)腔內(nèi)流動(dòng)。能夠通過過濾器的主體的孔的流體的部分借助于在主體的內(nèi)側(cè)上的流體的正壓力以及施加在主體的外側(cè)上的負(fù)壓力通過過濾器的主體的孔。在此實(shí)施例中，細(xì)胞通常不遭受流體流的壓力或其它細(xì)胞的重量，并且因此，減小了在干細(xì)胞上的剪切力。從而，能夠通過減小阻塞率和減小再生細(xì)胞溶解增強(qiáng)過濾的效率和效果。由于鹽水和不需要的蛋白質(zhì)分子的尺寸，在過濾期間，這些分子和其它小成分通過空心管的主體的孔到達(dá)空心管外部，并且被引導(dǎo)到廢物容器40。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過在空心管過濾器介質(zhì)的外側(cè)產(chǎn)生真空來自增強(qiáng)過濾。由于再生細(xì)胞例如干細(xì)胞或祖細(xì)胞的尺寸，這些細(xì)胞通常不能通過主體的孔，并且因此保留在空心管過濾器的內(nèi)側(cè)上(例如，在管的內(nèi)腔內(nèi))，并且通過在過濾器和處理腔室之間的導(dǎo)管被引導(dǎo)回到處理腔室30，或者到輸出腔室50。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，空心纖維過濾器的孔尺寸為大約O. 05微米，并且包含大約550平方厘米的過濾器介質(zhì)表面積。單獨(dú)的介質(zhì)管的直徑通常為大約O. 5毫米。在處理130毫升再生細(xì)胞組合物中，大約120毫升附加的鹽水可以添加到組合物。處理或過濾器時(shí)間可以為大約8分鐘?？招睦w維管的主體任一側(cè)上的壓力差異(例如，主體內(nèi)腔內(nèi)的壓 力和主體外部)認(rèn)為是貫穿膜的壓力。貫穿膜的壓力可以在大約I毫米汞柱到大約500毫米汞柱的范圍內(nèi)，優(yōu)選為大約200毫米汞柱。使用空心纖維過濾的平均有核細(xì)胞恢復(fù)和生存能力可以為大約生存的細(xì)胞的80%。在這樣的系統(tǒng)中通常被移除的膠原酶的量等于減少了 1000倍。例如，如果從采集腔室傳輸?shù)教幚砬皇业脑偕?xì)胞組合物中的膠原酶的初始濃度為O. 078U/ml，最終的再生細(xì)胞組合物中的膠原酶濃度將為O. 00078U/ml。膠原酶在空心纖維過濾器中被移除，并且空心纖維過濾器對(duì)應(yīng)上述第二過濾器。說明了一種或多種上述細(xì)胞過濾方法的處理腔室在圖中示出，特別是圖廣3。參考圖廣3，在處理腔室30和過濾器組件36的過濾腔室之間，可以提供泵，諸如泵34。另外，排出口和壓力傳感器，諸如排出口 32和壓力傳感器39，可以和處理腔室30和過濾器組件36共管線提供。也可以提供用于輸出腔室50的配件。這些可選的部件(例如，泵34、排出口 32、壓力傳感器39，以及用于輸出腔室50的配件)可以提供在處理腔室30和過濾器組件36之間，使得容納在處理腔室30內(nèi)的液體可以在流動(dòng)通過過濾器組件36以前流到這些可選的部件中的一個(gè)或多個(gè)。例如，液體可以在通到過濾器組件36以前流動(dòng)通過泵34。或者，液體可以在通過過濾器組件以前通過壓力傳感器39，以在系統(tǒng)內(nèi)獲得過濾器前的液體壓力。在某些情況中，一種或多種這樣的部件也可以提供為處理腔室30的元件，諸如圖6中所示的排出口 32。在示出的實(shí)施方式中，壓力傳感器39在管線內(nèi)，以在再生細(xì)胞組合物進(jìn)入過濾器組件36的過濾腔室時(shí)確定由泵34產(chǎn)生的再生細(xì)胞組合物的壓力。此構(gòu)造能夠促進(jìn)監(jiān)測(cè)穿過過濾器膜的貫穿膜的壓力。附加的鹽水或其它緩沖和清洗溶液可以添加到再生細(xì)胞組合物，以當(dāng)該組合物通過過濾器組件36被過濾時(shí)，幫助移除不需要的蛋白質(zhì)。此重復(fù)的清洗能夠被執(zhí)行多次以增強(qiáng)再生細(xì)胞的純度。在某些實(shí)施例中，鹽水能夠在任何認(rèn)為有必要的步驟添加，以增強(qiáng)過濾。在一個(gè)作為示例提供并且不是限制性的特定的實(shí)施方式中，以接下來的方式移除不需要的蛋白質(zhì)和鹽水或其它清洗溶液。具有再生細(xì)胞，以及膠原蛋白和結(jié)締組織顆?；蚱巍⒅炯?xì)胞和膠原酶的組合物，被循環(huán)通過一系列過濾器，直到達(dá)到最小的體積。該最小的體積為系統(tǒng)的總滯留體積和一些預(yù)先確定的常數(shù)的函數(shù)。滯留體積為如果全部處理腔室是空的，包含在管道和導(dǎo)管中的液體的體積。在一個(gè)實(shí)施例中，最小的體積為15毫升。當(dāng)達(dá)到最小的體積時(shí)，將預(yù)先確定量的清洗溶液引入系統(tǒng)以與再生細(xì)胞組合物混合。此清洗溶液和再生細(xì)胞組合物的混合物隨后被循環(huán)通過過濾器，直到再次達(dá)到最小體積。此循環(huán)可以重復(fù)多次以提高再生細(xì)胞的純度，或者換句話說，增加組合物中的再生細(xì)胞對(duì)組合物中的其它材料的比率。參看圖10和圖11。在已經(jīng)確定已經(jīng)從再生細(xì)胞組合物清除了不需要的蛋白質(zhì)并且充分地濃縮(在示例性的實(shí)施方式中，可以使用的最小濃度在大約IxlO5到大約IxlO7細(xì)胞/毫升的范圍內(nèi)并且，在優(yōu)選的實(shí)施方式中最小濃度可以為大約IxlO7細(xì)胞/毫升)以后，輸出腔室50，諸如輸出袋，可以根據(jù)特定的實(shí)施方式連接到處理腔室30和/或過濾器組件36的出口。諸如排出口 32的排出口可以隨后打開以促進(jìn)濃縮的再生細(xì)胞輸出。在一個(gè)實(shí)施方式中，在已經(jīng)運(yùn)行實(shí)驗(yàn)以后，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定何時(shí)到達(dá)最小濃度，并且編程序到設(shè)備的電子控制器內(nèi)。該確定可以為需要出產(chǎn)什么，即需要多少干/祖細(xì)胞，或者細(xì)胞濃度的范圍的過程的輸入。基于科 學(xué)的數(shù)據(jù)，預(yù)定量的脂肪組織需要被獲得并且放置到系統(tǒng)內(nèi)以獲得需要的輸出。通過排出口 32打開，諸如泵34的泵可以工作以將濃縮的再生細(xì)胞傳輸?shù)捷敵龃鼉?nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，輸出袋50與具有在一端具有配件的管的空的血袋相似。輸出袋上的配件可以以無菌的方式接附到出口，并且濃縮的再生細(xì)胞可以被傳輸?shù)捷敵龃?。如圖I到圖3所示，可以在系統(tǒng)10中提供真空泵26以改變系統(tǒng)內(nèi)的壓力和其它參數(shù)。例如，真空泵26可以通過諸如導(dǎo)管12b的導(dǎo)管連接到采集腔室20，以導(dǎo)致采集腔室20內(nèi)的壓力降低。真空泵26也可以通過諸如導(dǎo)管12g的導(dǎo)管連接到處理腔室30?？紤]到真空泵26連同泵34的操作，可以實(shí)施兩個(gè)分開的真空泵或源，或者，通過使用將真空拉力引導(dǎo)到在過程的特定點(diǎn)需要真空拉力的不同的導(dǎo)管的閥，可以實(shí)施單獨(dú)的真空泵或源。另夕卜，真空泵26可以通過諸如導(dǎo)管12f的導(dǎo)管連接到廢物容器40。參考圖10和圖11，通過真空泵26產(chǎn)生的壓力可以用于引導(dǎo)包括再生細(xì)胞的流體流動(dòng)通過導(dǎo)管12。此壓力可以以多個(gè)方向施加，例如，通過自動(dòng)地或手動(dòng)地控制系統(tǒng)10中的一個(gè)或多個(gè)閥14的位置?？梢酝ㄟ^使用正壓力或負(fù)壓力或它們的組合來使得系統(tǒng)10正確地發(fā)揮作用。例如，再生細(xì)胞可以被拉動(dòng)通過上述第一和第二過濾器進(jìn)入連接到第三過濾器的軟側(cè)的容器。軟側(cè)容器可以連接在第三過濾器前面的管線內(nèi)(串聯(lián))。最終輸出腔室可以為軟側(cè)的容器，其在第三過濾器的另一側(cè)(例如，下游側(cè))。在此實(shí)施方式中，使用壓力將再生細(xì)胞從一個(gè)軟側(cè)容器通過過濾器運(yùn)動(dòng)到第二軟側(cè)容器。在系統(tǒng)10的另一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用滲濾過濾和沉淀結(jié)合來實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞和/或源自脂肪的祖細(xì)胞的過濾，例如，這樣的系統(tǒng)使用鹽水，將該鹽水通過組織再生細(xì)胞組合物(例如，包含干細(xì)胞和/或源自脂肪的祖細(xì)胞的組合物)并且隨后通過過濾器。與從再生細(xì)胞組合物滲濾過濾細(xì)胞有關(guān)的變量的一些包括但不限于，過濾器介質(zhì)的孔尺寸、孔幾何形狀或形狀、過濾器的表面積、被過濾的再生細(xì)胞組合物的流動(dòng)方向、注入的鹽水的流速、貫穿膜的壓力、細(xì)胞群體的稀釋度、細(xì)胞尺寸和生存能力。在系統(tǒng)10的一個(gè)實(shí)施方式中，處理腔室30使用過濾器組件36，其執(zhí)行滲濾過濾和沉淀以分離和濃縮再生細(xì)胞。示例性的而不是限制性的，處理腔室30限定為如圖6所示的大致上圓筒形的主體，具有側(cè)壁30a、頂部表面30b和底部表面30C。在頂部表面30b內(nèi)提供了無菌的排出口 32。在圖6所示的實(shí)施方式中，處理腔室30示出為包括過濾器組件36，過濾器組件36包括兩個(gè)過濾器，諸如大孔過濾器36a和小孔過濾器36b。過濾器36a和36b的孔尺寸通常在大約O. 05微米和大約10微米的范圍內(nèi)。大孔過濾器36a可以包括直徑為大約5微米的孔，并且小孔過濾器36b可以包括直徑為大約I到3微米的孔。在一個(gè)實(shí)施方式中，過濾器的表面積為大約785平方毫米。過濾器36a和36b劃分處理腔室30的內(nèi)部以包括第一腔室37a、第二腔室37b和第三腔室37c。如圖6所示，第一腔室37a定位在第二腔室37b和第二腔室37c之間。另外，第一腔室37a示出為具有入口 31a和出口 31b的處理腔室30的區(qū)域。示出的處理腔室30包括多個(gè)提供從處理腔室30的外部到處理腔室30的內(nèi)部的連通通道的口，諸如口 31a、31b和31c。口 31a、31b和31c示出為設(shè)置在處理腔室30的主體的側(cè)壁30a內(nèi)。然而，口 31a、31b和31c也可以定位在其它區(qū)域內(nèi)?？?31a示出為樣品入口，其構(gòu)造為連接到導(dǎo)管，使得包含再生細(xì)胞的組合物可以進(jìn)入處理腔室30內(nèi)部?？?31b示出為出口，其構(gòu)造為連接到導(dǎo)管，使得分離并且濃縮的細(xì)胞可以從處理腔室30的內(nèi)部移 除。口 31c示出為入口，其構(gòu)造為連接到導(dǎo)管，用于將諸如鹽水的新的清洗溶液輸送到處理腔室30的內(nèi)部。使用中，再生細(xì)胞可以通過入口 31a引入中央的腔室37a。鹽水或其它緩沖劑通過入口 31c引入底部腔室37b。可以以大約10毫升/分鐘的速率引導(dǎo)鹽水通過腔室37a中的再生細(xì)胞組合物。鹽水的流速為使得其抵消重力。鹽水的流動(dòng)使得腔室內(nèi)的細(xì)胞能夠基于細(xì)胞的密度分離。通常，當(dāng)迫使鹽水上升通過組合物時(shí)，組合物中的較大的細(xì)胞將沉淀到中央腔室37a的底部，而較小的細(xì)胞和蛋白質(zhì)將被運(yùn)走通過第二過濾器36b進(jìn)入頂部腔室37c。通過調(diào)節(jié)鹽水的流邊，使得較大的細(xì)胞在允許使較小的顆粒脫離并且用鹽水帶走的位置滾動(dòng)，該過濾可以實(shí)現(xiàn)。在腔室30中包括無菌的排出口 32以確保在處理單元內(nèi)部的三個(gè)腔室內(nèi)維持正確的壓力梯度。上腔室37c可以包括吸收劑介質(zhì)33。吸收劑介質(zhì)的目的為捕獲溶液中的不合需要的蛋白質(zhì)，以確保如果例如鹽水的流速降低，溶液中的不合需要的蛋白質(zhì)不會(huì)穿過過濾器介質(zhì)回到處理溶液內(nèi)。吸收劑介質(zhì)可以為某種類型的過濾器材料，其為吸收劑、或吸引要被濾出的材料或成分。可以在頂部過濾器上方添加流出口以幫助排出廢物。排出廢物的另一個(gè)實(shí)施方式可以為從頂部施加輕度的真空以幫助排出廢物。如在示出的實(shí)施例中，吸收劑介質(zhì)可以在流速相對(duì)較小時(shí)實(shí)施。多余的鹽水和蛋白質(zhì)隨后被運(yùn)走到廢物容器。當(dāng)已經(jīng)充分地從較小的細(xì)胞和蛋白質(zhì)分離較大的細(xì)胞(例如，源自脂肪的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞)后，如在這里討論的，可以濃縮包含分離的細(xì)胞的組合物。在已經(jīng)通過出口31b從腔室37a移除組合物以后，或當(dāng)其在腔室37a中時(shí)，該組合物可以被進(jìn)一步濃縮。在一個(gè)實(shí)施例中，以接下來的方式增加組合物中的細(xì)胞濃度。在細(xì)胞已經(jīng)被充分地分離以后，諸如過濾器36a和36b的過濾器可以朝向彼此運(yùn)動(dòng)。此運(yùn)動(dòng)的效果為減小兩個(gè)過濾器之間的體積(例如，腔室37a的體積)。也可以提供與處理腔室30相結(jié)合的振動(dòng)構(gòu)件，以促進(jìn)組合物中的細(xì)胞濃縮。在一個(gè)實(shí)施方式中，振動(dòng)構(gòu)件可以連接到過濾器36b (例如，小孔過濾器)。振動(dòng)可以減小細(xì)胞被捕獲在過濾器內(nèi)的發(fā)生率。組合物體積的減小允許移除多余的鹽水作為廢物和細(xì)胞濃縮為較小的體積。在另一個(gè)實(shí)施方式中，以接下來的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)再生細(xì)胞的濃縮。在細(xì)胞已經(jīng)被充分地分離以后，可以將再生細(xì)胞組合物傳輸?shù)搅硪粋€(gè)腔室(未示出)，該腔室使用重力來濾出多余的鹽水。在優(yōu)選的實(shí)施例中，沉淀可以在滲濾的同時(shí)發(fā)生?？梢酝ㄟ^將組合物引入到孔尺寸從大約10千道爾頓到大約2微米的范圍內(nèi)的過濾器的頂部來實(shí)現(xiàn)沉淀。在一個(gè)實(shí)施方式中，適合的過濾器的孔尺寸為大約I微米。重力將在防止組合物中的細(xì)胞流動(dòng)通過過濾器的同時(shí)允許鹽水和較小的顆粒通過過濾器。在已經(jīng)獲得對(duì)細(xì)胞的需要的濃縮以后，并且在已經(jīng)從過濾器下方移除過濾的較小的顆粒以后，可以攪動(dòng)再生細(xì)胞組合物以從過濾器移除細(xì)胞，并且隨后將濃縮的再生細(xì)胞傳輸?shù)捷敵龃?。較小的顆?？梢宰鳛閺U物通過出口排出。在特定的實(shí)施例中，來自采集腔室20的再生細(xì)胞組合物被傳送到處理腔室30，其中可以離心分離組合物以分離和濃縮再生細(xì)胞。離心分離原理在本技術(shù)領(lǐng)域中眾所周知，因此為了簡(jiǎn)短，將不在這里重復(fù)敘述。這里使用標(biāo)準(zhǔn)的、領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)可的離心分離設(shè)備、部件和參數(shù)。用作離心分離設(shè)備的一部分的示例性的處理腔室在圖7和圖8中示出。通常，離心分離設(shè)備導(dǎo)致離心分離腔室(諸如圖7中所示的離心分離腔室)圍繞軸線旋轉(zhuǎn)，以由此增加作用在溶液中的細(xì)胞上的力以使得該力大于重力。溶液中密度較大或較重的材料通常沉淀到離心分離腔室，即圖7所示的輸出腔室50的一端，以形成再生細(xì)胞小團(tuán)。該小團(tuán)可以 隨后重新懸浮以獲得具有需要的細(xì)胞濃度和/或需要的細(xì)胞和介質(zhì)量的溶液。圖7所示的處理腔室構(gòu)造為使用離心力和重力分離和濃縮細(xì)胞。特定地，在離心分離期間，離心力引導(dǎo)再生細(xì)胞組合物的密度較大的成分，例如再生細(xì)胞，朝向離心分離腔室的最遠(yuǎn)端。在離心分離腔室慢下來并且最終停止時(shí)，重力幫助再生細(xì)胞保持在離心分離腔室的最遠(yuǎn)端并且形成細(xì)胞小團(tuán)。因此，再生細(xì)胞組合物的不需要的成分，即廢物，可以在不防礙細(xì)胞小團(tuán)的情況下被移除。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式中，處理腔室可以包括旋轉(zhuǎn)膜過濾器形式的細(xì)胞濃縮器。在離心分離過程的再一個(gè)實(shí)施方式中，也可以應(yīng)用離心淘析法。在此實(shí)施例中，可以基于個(gè)體細(xì)胞的沉淀速率分離細(xì)胞，使得通過離心分離施加的定向的(例如，向外的)力導(dǎo)致細(xì)胞和溶液以不同的速率沉淀。在淘析中，目標(biāo)細(xì)胞群體的沉淀速率與通過在與離心力相反的方向泵送溶液施加的相反的(例如，向內(nèi)的)流速對(duì)抗。調(diào)節(jié)該逆流使得溶液內(nèi)的細(xì)胞和顆粒分離。淘析已經(jīng)被應(yīng)用于許多細(xì)胞分離的例子中(Inoue, Carsten等人,1981 ；Hayner, Braun等人，1984 ;Nogal999),并且用于優(yōu)化流動(dòng)和離心參數(shù)的原理和實(shí)踐可以由本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員根據(jù)本公開物在這里實(shí)施。圖9示出了與根據(jù)本發(fā)明的淘析實(shí)現(xiàn)有關(guān)的原理。在使用旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子將力施加到溶液的方面，該淘析實(shí)施例與尚心分尚實(shí)現(xiàn)相似。與目前具體化的淘析分尚有關(guān)的一些變量包括但不限于，旋轉(zhuǎn)腔室的尺寸和形狀、轉(zhuǎn)子的直徑、轉(zhuǎn)子的速度、逆流管道的直徑、逆流的流速、以及要從溶液移除的顆粒和細(xì)胞的尺寸和密度。如在離心分離中一樣，再生細(xì)胞可以基于個(gè)體細(xì)胞密度分離。在一個(gè)實(shí)施方式中，再生細(xì)胞組合物，例如，包含再生細(xì)胞和膠原酶的溶液，被引入如圖9. I所示的旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)子的腔室。在溶液已經(jīng)添加到腔室以后，以預(yù)先確定的流速將附加的鹽水添加到腔室。鹽水的流速可以作為轉(zhuǎn)子速度、細(xì)胞直徑和根據(jù)經(jīng)驗(yàn)所設(shè)的腔室常數(shù)的函數(shù)確定。例如使用與IV泵相似的設(shè)備來控制流速。附加的鹽水的目的為在轉(zhuǎn)子腔室內(nèi)提供某種狀態(tài)，在該狀態(tài)下，較大的顆粒將運(yùn)動(dòng)到腔室的一側(cè)并且較小的顆粒將運(yùn)動(dòng)到另一側(cè)，如圖9. 2中所示。調(diào)節(jié)該流動(dòng)使得，在此應(yīng)用中，較小的顆粒將退出腔室并且運(yùn)動(dòng)到廢物容器，如圖9. 3中所示。此運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致轉(zhuǎn)子腔室內(nèi)的溶液具有基本上均勻的細(xì)胞群體，諸如干細(xì)胞。在已經(jīng)確定干細(xì)胞已經(jīng)被從溶液中剩下的物品分離以后(不需要的蛋白質(zhì)和游離的脂質(zhì)已經(jīng)從腔室移除)，停止逆流。腔室內(nèi)的細(xì)胞將隨后在腔室的外壁上形成濃縮的小團(tuán)。逆流反轉(zhuǎn)并且細(xì)胞小團(tuán)被傳輸?shù)捷敵龃?。如之前在這里闡明的，處理腔室30或輸出腔室50可以包括一個(gè)或多個(gè)口，例如口51或52。一個(gè)或多個(gè)這些口可以設(shè)計(jì)為將使用任何上述方法的組合獲得的再生細(xì)胞或其一部分通過導(dǎo)管傳送到其它外科手術(shù)設(shè)備、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備、細(xì)胞腌泡設(shè)備、基因治療設(shè)備或純化設(shè)備。這些口也可以設(shè)計(jì)為將再生細(xì)胞通過導(dǎo)管傳送到系統(tǒng)內(nèi)另外的腔室或容器或作為用于與上述相同的目的的另一個(gè)系統(tǒng)的一部分的腔室或容器。口和導(dǎo)管也可以用于添加一種或多種添加劑，例如，生長(zhǎng)因子、重新懸浮流體、細(xì)胞培養(yǎng)試劑、細(xì)胞擴(kuò)張?jiān)噭?、?xì)胞保存試劑或包括將基因傳輸?shù)郊?xì)胞的制劑的細(xì)胞修改試劑?？诤蛯?dǎo)管也可以用于將再生細(xì)胞傳送到諸如植入材料(例如，架子或骨片段)以及其它外科手術(shù)植入物和設(shè)備的其它目標(biāo)。
還可以通過重構(gòu)現(xiàn)有系統(tǒng)的一次性用具的相互連接、為現(xiàn)有系統(tǒng)的處理設(shè)備重新編程序、通過為現(xiàn)有系統(tǒng)提供不同的或附加的容器和/或腔室、通過將細(xì)胞傳送到一個(gè)或多個(gè)附加的系統(tǒng)或設(shè)備和/或它們的任何組合，來開始對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步處理。例如，系統(tǒng)可以通過任何上述方法重構(gòu)，使得使用該系統(tǒng)獲得的再生細(xì)胞可以經(jīng)歷接下來的一種或多種處理細(xì)胞擴(kuò)張(針對(duì)一種或多種再生細(xì)胞)和細(xì)胞維護(hù)(包括細(xì)胞片漂洗和介質(zhì)變化);次培養(yǎng)；細(xì)胞播種；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(包括從大量供給播種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)；獲取(包括酶促、非酶促的獲取和通過機(jī)械刮削獲取)；測(cè)量細(xì)胞生存能力；細(xì)胞平鋪(例如，在微量滴定板上，包括從單獨(dú)的井拾取用于擴(kuò)張的細(xì)胞，將細(xì)胞擴(kuò)張到新的井內(nèi))；高吞吐量篩選；細(xì)胞治療應(yīng)用；基因治療應(yīng)用；組織工程應(yīng)用；治療的蛋白質(zhì)應(yīng)用；病毒疫苗應(yīng)用；獲取再生細(xì)胞或上清液用于庫存或篩選，測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)、溶解、培植、感染或引入；產(chǎn)生細(xì)胞系(包括雜交瘤細(xì)胞)；培養(yǎng)細(xì)胞用于滲透性研究；用于RNAi和抗病毒研究的細(xì)胞；用于破壞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的細(xì)胞；親和力純化作用研究；結(jié)構(gòu)生物學(xué)應(yīng)用；檢定開發(fā)和蛋白質(zhì)工程應(yīng)用。例如，如果對(duì)于特定的應(yīng)用需要擴(kuò)張?jiān)偕?xì)胞群體，可能使用這樣的方法，其使用培養(yǎng)條件來優(yōu)選地?cái)U(kuò)張?jiān)撊后w，而其它群體由于需要的生長(zhǎng)條件缺乏而維持(并且因此通過被生長(zhǎng)的選擇的細(xì)胞稀釋而減小)或損失。Sekiya等人已經(jīng)描述了可以在這點(diǎn)上用于源自骨髓的干細(xì)胞的條件(Sekiya等人，2002)。可以將此方法(到組織培養(yǎng)塑料的附著力有差異或沒有差異)應(yīng)用到本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式。在此實(shí)施方式中，從輸出腔室移除最終的再生細(xì)胞小團(tuán)并且將其放置到提供細(xì)胞培養(yǎng)部件的第二系統(tǒng)內(nèi)。這可以采取傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)培育器或生物反應(yīng)器類型的設(shè)備的形式，諸如Tsao等人在美國(guó)專利No. 6,001,642中所描述的，或Armstrong等人在美國(guó)專利No. 6，238，908中所描述的。在替代的實(shí)施例中，細(xì)胞擴(kuò)張或細(xì)胞培養(yǎng)部件可以添加到現(xiàn)有系統(tǒng)中，例如，添加到輸出腔室內(nèi)，允許脂肪來源的細(xì)胞群體短期粘附和/或細(xì)胞培養(yǎng)。此替代的實(shí)施方式允許將細(xì)胞培養(yǎng)和/或細(xì)胞擴(kuò)張部件整合到系統(tǒng)并且不再需要從此系統(tǒng)移除細(xì)胞并且將其放置到另一個(gè)系統(tǒng)內(nèi)。在處理期間，根據(jù)需要，可以將一種或多種添加劑添加到不同的腔室或容器或與其一起提供，以增強(qiáng)結(jié)果。這些添加劑也可以提供為與現(xiàn)有系統(tǒng)相關(guān)或分開的另一個(gè)系統(tǒng)的一部分。例如，在某些實(shí)施方式中，添加劑在不需要從系統(tǒng)移除再生細(xì)胞的情況下添加或提供。在其它實(shí)施例中，通過以無菌的方式將包括該添加劑的新的容器或腔室連接到系統(tǒng)的未使用的口內(nèi)來添加或提供添加劑。在再一個(gè)實(shí)施方式中，通過未連接到本發(fā)明的系統(tǒng)的第二系統(tǒng)或設(shè)備添加或提供添加劑。一些添加劑的示例包括如這里所描述的優(yōu)化清洗和分解的制劑、增強(qiáng)在處理期間活性的細(xì)胞群體的生存能力的添加劑、抗微生物劑(例如，抗生素)、溶解脂肪細(xì)胞和/或紅細(xì)胞的添加劑、或富集所關(guān)心的細(xì)胞群體的添加劑(通過有差別地粘附到固相部分或另外促進(jìn)細(xì)胞群體的相當(dāng)大的減少或者富集)。例如，為了獲得同源的再生細(xì)胞群體，可以使用任何適合的方法來分離并且濃縮特定的再生細(xì)胞類型，諸如使用細(xì)胞特定的抗體，其識(shí)別并且結(jié)合存在于例如，干細(xì)胞或祖細(xì)胞，例如，內(nèi)皮前體細(xì)胞上的抗原。這些包括正向選擇(選擇目標(biāo)細(xì)胞)、負(fù)向選擇(選擇性地移除不需要的細(xì)胞)、或它們的結(jié)合。諸如酶的細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記也可以用于使用當(dāng)與特定的酶起作用時(shí)發(fā)熒光的分子的選擇。另外，可以將具有選擇為允許區(qū)別地附著和/或洗脫在最終的細(xì)胞小團(tuán)內(nèi)的特定的再生細(xì)胞群體的附著特性的固相材料插入系統(tǒng)的輸出腔室。此區(qū)別附著方法的替代的實(shí)施例可以包括使用識(shí)別目標(biāo)的再生細(xì)胞和不需要的 細(xì)胞上區(qū)別地表達(dá)的表面分子的抗體和/或抗體的組合?；谔囟?xì)胞表面標(biāo)記(或它們的組合)的表達(dá)的選擇是另一種通常應(yīng)用的技術(shù)，其中抗體被接附(直接地或間接地)到固相支撐結(jié)構(gòu)上(Geiselhart 等人，1996 ；Formanek 等人，1998 ；Graepler 等人，1998 ；Kobari等人，2001 ；Mohr 等人，2001)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞小團(tuán)可以被重新懸浮在流體材料上(或下)分層，該流體材料形成為連續(xù)的或不連續(xù)的密度梯度并且被放置在離心機(jī)內(nèi)以基于細(xì)胞密度分離細(xì)胞群體。在相似的實(shí)施例中，也可以使用連續(xù)流動(dòng)方法，諸如脫落(Smithl997),和淘析(有或沒有逆流)(Lasch 等人,2000) (Ito 和 Shinomiya, 2001 )。如在這里討論的，添加劑的其它示例可以包括附加的生物學(xué)的或結(jié)構(gòu)的成分，諸如細(xì)胞分化因子、生長(zhǎng)促進(jìn)劑、免疫抑制劑、醫(yī)療設(shè)備、或它們的任何組合。例如，可以添加其它細(xì)胞(例如，心球樣細(xì)胞(cardiosphere))、組織(例如,心臟組織)、組織片段、諸如VEGF的生長(zhǎng)因子和其它已知的血管生成的或動(dòng)脈生成的生長(zhǎng)因子、生物活性或惰性化合物(如cardiogenol C)、可再吸收的支架、或其它傾向于增強(qiáng)再生細(xì)胞群體的輸送、功效、可容許性、或功能的添加劑。再生細(xì)胞群體也可以通過插入DNA (例如編碼Id蛋白質(zhì)、WNT家族蛋白、如RXR家族蛋白和gpl30的信號(hào)蛋白和/或如IGF-I的生長(zhǎng)因子，)或通過以改變、增強(qiáng)、或補(bǔ)充再生細(xì)胞的功能以實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)的或治療的目的的方式放置到細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(如在這里所述或本領(lǐng)域內(nèi)已知的)內(nèi)來修飾。例如，基因工程可以用于定制再生細(xì)胞的基本速率(pacing rate),其再輸注到患者內(nèi)之前分化成心肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞樣細(xì)胞以確保最佳心跳速率(beatingrate)。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知用于干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，如在(Morizono等人，2003 ;M0Sca等人，2000)中公開的，并且可以包括病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，并且更特定地，腺相關(guān)的病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，如在(Walther和Stein, 2000)和(Athanasopoulos等人，1998)中公開的。也可以執(zhí)行非基于病毒的技術(shù)，如在(Muramatsu等人，1998)中公開的?？梢蕴砑泳幋a一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞分化因子，例如，生長(zhǎng)因子或細(xì)胞活素，的基因。不同的細(xì)胞分化劑的不例在(Gimble 等人，1995 ； Lennon 等人，1995 ； Majumdar 等人，1998 ； Cap I an 和 Goldberg,1999 ；Ohgushi 和 Cap I an, 1999 ；Pittenger 等人，1999 ； Cap I an 和 Bruder, 2001 ；Fukuda,2001 ;Worster等人，2001 ;Zuk等人，2001)中公開。也可以添加編碼抗凋亡因子或制劑的基因?；?或基因的組合)的添加可以通過本領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)，包括但不限于腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、”基因槍”、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、質(zhì)粒、腺相關(guān)的病毒。這些再生細(xì)胞可以隨后與載有能夠隨著時(shí)間的過去，將基因釋放和/或提供給細(xì)胞的基因輸送媒介物的載體材料一起植入，使得轉(zhuǎn)導(dǎo)可以繼續(xù)或在原位開始。當(dāng)包含細(xì)胞和/或包含細(xì)胞的組織所給藥的患者不是獲得該細(xì)胞和/或組織的患者時(shí)，可以給予接受該細(xì)胞和/或組織的患者一種或多種免疫抑制劑，以減小并且優(yōu)選地防止移植的排斥反應(yīng)。如在這里使用的，術(shù)語“免疫抑制藥品或制劑”傾向于包括抑制或防礙正常的免疫功能的藥劑。這里公開的方法適合的免疫抑制劑的示例包括抑制T細(xì)胞/B細(xì)胞協(xié)同剌激通道的制劑，諸如防礙T細(xì)胞和B細(xì)胞通過CTLA4和B7通道連結(jié)的制劑，如在美國(guó)專利No. 20020182211中所公開的。優(yōu)選的免疫抑制劑為環(huán)抱霉素A。其它示例包括myophenylatemofetil、雷伯霉素和抗胸腺細(xì)胞球蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，免疫抑制藥品與至少一種其它治療試劑一起給藥，免疫抑制藥品以與給藥的路線相容的自己方給藥，并 且給藥受試者足夠的劑量以得到理想的治療效果。在另一個(gè)實(shí)施方式中，免疫抑制藥品瞬時(shí)地給藥足夠的時(shí)間以導(dǎo)致對(duì)本發(fā)明的再生細(xì)胞的耐受性。在這些實(shí)施方式中，再生細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域中認(rèn)可的任何方式接觸、結(jié)合、混合或添加到添加劑，包括諸如攪動(dòng)設(shè)備的設(shè)備和在這里描述的相關(guān)方法。例如，可以使用搖動(dòng)、倒轉(zhuǎn)、壓縮脈沖或運(yùn)動(dòng)的轉(zhuǎn)子。在另一個(gè)方面，細(xì)胞群體可以被放置在受體內(nèi)并且被可重新吸收的塑料護(hù)套或其它材料和諸如那些由MacroPoreBiosurgery公司制造的相關(guān)聯(lián)的部件(參看例如，美國(guó)專利 No. 6，269，716 ;5，919，234 ;6，673，362 ;6，635，064 ;6，653，146 ;6，391，059 ;6，343，531 ；6，280,473)圍繞。在所有前述實(shí)施方式中，分離并且濃縮的再生細(xì)胞的至少一部分可以被低溫貯藏，如在 2002 年 9 月 12 日提出的題目為 “PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROMNON HEMATOPOIETIC TISSUES”的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 10/242，094中所描述的，其要求2001年9月14日提出的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/322,070的優(yōu)先權(quán)，其已經(jīng)共同轉(zhuǎn)讓，并且其內(nèi)容在這里通過參考全文清楚地加入。在處理的結(jié)尾，可以手動(dòng)地從輸出腔室取回再生細(xì)胞。該細(xì)胞可以被裝載到諸如注射器的輸送設(shè)備中，用于通過皮下的、肌肉內(nèi)的或其它允許將細(xì)胞輸送到患者體內(nèi)的目標(biāo)位置的技術(shù)將該細(xì)胞放置到受體內(nèi)。換句話說，可以通過本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員已知的任何方式將細(xì)胞放置到患者體內(nèi)。優(yōu)選的實(shí)施方式包括通過針或?qū)б汗芊胖?，或者通過直接外科手術(shù)植入。在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞可以自動(dòng)地傳送到輸出腔室，其形式可以為容器、注射器或?qū)б汗艿鹊?，其可以用于將?xì)胞放置在患者體內(nèi)。該容器也可以用于存儲(chǔ)細(xì)胞，用于稍后使用或用于低溫貯藏。所有取回方法以無菌的方式執(zhí)行。在外科手術(shù)植入的實(shí)施方式中，細(xì)胞可以與諸如在這里描述的預(yù)形成的基質(zhì)或架子的添加劑聯(lián)合施加。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中(例如，圖4中所示的實(shí)施例)，系統(tǒng)是自動(dòng)的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，系統(tǒng)具有自動(dòng)部件，和手動(dòng)部件。系統(tǒng)可以包括一個(gè)或多個(gè)連接到或安裝在可重復(fù)使用的硬件部件或模塊上的一次性部件。本發(fā)明的自動(dòng)的系統(tǒng)提供屏幕顯示(參看圖16)，其促使正確地操作該系統(tǒng)。自動(dòng)的系統(tǒng)也可以提供屏幕，其提供過程的狀態(tài)和/或逐步的說明，以正確地設(shè)置系統(tǒng)的一次性部件。屏幕也可以指示系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的問題或故障，如果它們發(fā)生的話，并且如果適當(dāng)?shù)脑捥峁迸懦收稀敝笇?dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方式中，屏幕為使用者接口屏幕，其允許使用者通過例如觸摸屏將參數(shù)輸入系統(tǒng)。部分和完全自動(dòng)的系統(tǒng)可以包括處理設(shè)備(例如，微處理器或個(gè)人計(jì)算機(jī))和提供用于系統(tǒng)基于使用者輸入操作和自動(dòng)化過程的一個(gè)或多個(gè)步驟的控制邏輯的相關(guān)的軟件程序。在某些實(shí)施方式中，系統(tǒng)的一種或多種情況可以為使用者能夠通過駐留在處理設(shè)備中的軟件編程序的。處理設(shè)備可以具有一個(gè)或多個(gè)在只讀存儲(chǔ)器(ROM)中的預(yù)編程序的軟件程序。例如，處理設(shè)備可以具有定制為用于處理血液的預(yù)編程序的軟件，用于處理脂肪組織以獲得小體積的再生細(xì)胞的另一個(gè)程序，并且用于處理脂肪組織以獲得較大體積的再生細(xì)胞的另一個(gè)程序。處理設(shè)備也可以具有預(yù)編程序的軟件，其向使用者提供適當(dāng)?shù)膮?shù)以基于使用者輸入的有關(guān)信息優(yōu)化過程，使用者輸入的有關(guān)信息諸如，需要的再生細(xì)胞的量，處理的組織類型，需要的處理后操縱的類型，治療應(yīng)用的類型等等。軟件還可以允許步驟自動(dòng)化，諸如通過控制系統(tǒng)的泵和閥，控制流體和組織沿特 定的管道通道進(jìn)入和外出；控制觸發(fā)的適當(dāng)?shù)捻樞蚝?或方向；用壓力傳感器探測(cè)阻塞；混合機(jī)構(gòu)，使用測(cè)量體積的機(jī)構(gòu)測(cè)量要沿特定的通道運(yùn)動(dòng)的組織和/或流體的量；使用加熱控制設(shè)備維持不同部件的溫度；并且整合分離和濃縮過程與定時(shí)和軟件機(jī)構(gòu)。處理設(shè)備也可以基于處理的組織類型和/或獲取的細(xì)胞群體或子群體，和要執(zhí)行的過程的類型(例如，使用再生細(xì)胞增加的脂肪組織的組織增強(qiáng)，或用于使用再生細(xì)胞涂覆的骨移植物來修復(fù)骨的應(yīng)用的細(xì)胞的處理)，來控制離心機(jī)速度。處理設(shè)備還可以包括標(biāo)準(zhǔn)并行或串行口或其它用于與其它計(jì)算機(jī)或網(wǎng)絡(luò)通信的裝置。因此，處理設(shè)備可以為獨(dú)立單元或者聯(lián)合用于在這里描述的其它處理方法的一種或多種附加的設(shè)備。軟件可以允許自動(dòng)采集”運(yùn)行數(shù)據(jù)”，包括例如，一次性的部件的批號(hào)、溫度和體積測(cè)量結(jié)果、組織體積和細(xì)胞數(shù)量參數(shù)、施加的酶的劑量、培育時(shí)間、操作者身份、數(shù)據(jù)和時(shí)間、患者身份等等。在設(shè)備的優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以整合諸如條形碼讀取系統(tǒng)的字符識(shí)別系統(tǒng)，以允許這些變量(例如一次性的用具批號(hào)和有效期，膠原酶的批號(hào)和有效期，患者/樣品標(biāo)識(shí)符等等)數(shù)據(jù)輸入處理設(shè)備作為處理文件的一部分。這將減小數(shù)據(jù)輸入錯(cuò)誤的可能性?？梢允褂肬SB或本領(lǐng)域中已知的其它接口端口和系統(tǒng)容易地將這樣的條形碼讀取系統(tǒng)加入處理設(shè)備。這樣，設(shè)備可以提供整合控制過程的數(shù)據(jù)輸入和文件。這些參數(shù)的打印出的報(bào)告將作為該系統(tǒng)的編程序的操作的使用者定義的參數(shù)的一部分。自然，這需要整合打印機(jī)部件(硬件和驅(qū)動(dòng)程序)，或軟件中的打印機(jī)驅(qū)動(dòng)程序加上在設(shè)備的硬件中用于打印機(jī)的接口輸出連接器(例如，USB 口)。在某些實(shí)施方式中，系統(tǒng)為完全自動(dòng)的系統(tǒng)。例如，使用者可以初始地選擇要處理的組織的量，將系統(tǒng)接附到患者并且系統(tǒng)可以自動(dòng)地抽吸需要的組織并且在不需要使用者進(jìn)一步輸入的情況下以連續(xù)的順序分離并且濃縮再生細(xì)胞。使用者也可以輸入需要的再生細(xì)胞的量并且允許系統(tǒng)抽吸需要的量的組織并且處理該組織。完全自動(dòng)的系統(tǒng)還包括能夠基于數(shù)個(gè)(例如，兩個(gè)或更多)使用者的輸入?yún)?shù)，例如，清洗循環(huán)的數(shù)量，離心分離速度等等重新配置的系統(tǒng)。系統(tǒng)也可以以半自動(dòng)方式運(yùn)行，期間系統(tǒng)在不需要使用者干涉的情況下經(jīng)過某些步驟，但是在某些過程能夠發(fā)生以前需要使用者干涉。在其它實(shí)施方式中，系統(tǒng)為單一的整合的系統(tǒng)，其顯示說明以引導(dǎo)使用者在預(yù)先確定的時(shí)間執(zhí)行預(yù)先確定的操作。例如，處理設(shè)備可以提示使用者適當(dāng)?shù)夭迦牍艿?、腔室和系統(tǒng)的其它部件所必需的步驟。因此，使用者能夠確保執(zhí)行操作的順序正確。這樣的系統(tǒng)可能附加地需要使用者確認(rèn)每個(gè)操作步驟以防止在過程中無意地觸發(fā)或中止步驟。在再一個(gè)實(shí)施方式中，系統(tǒng)可以開始自動(dòng)地測(cè)試以確保正確地插入管道、腔室、沒有阻塞等等。在再一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的系統(tǒng)能夠編程序以通過自動(dòng)控制組織流動(dòng)通過系統(tǒng)，執(zhí)行多個(gè)分離和濃縮過程。此特征可以是重要的，例如，在對(duì)患者的外科手術(shù)期間，其中否則可能損失的組織被采集到系統(tǒng)內(nèi)，并且來自組織的再生細(xì)胞分離并且濃縮并且將其返回患者體內(nèi)。如上所述，系統(tǒng)的部件可以是一次性的(在這里稱作“一次性用具”)，使得系統(tǒng)的部分可以在單次使用后除掉。此實(shí)現(xiàn)可以幫助確保與患者的組織接觸的任何表面將在使用后適當(dāng)?shù)爻?。圖13示出了示例性的一次性用具。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，系統(tǒng)的一次性部件被預(yù)先殺菌并且封裝，以便能夠“現(xiàn)貸供應(yīng)”地使用，其容易使用并且容易裝載并且其消除了對(duì)許多管道連接和復(fù)雜的管道連接路線的需要。這樣的一次性部件的制造相對(duì)便宜，并且因此，不由于它們的廢棄導(dǎo)致較大的費(fèi)用。在一個(gè)實(shí)施方式中，一次性的系統(tǒng)(在這里 可交換地稱作“一次性用具”)包括，基本上包含，或者包含，采集腔室20、處理腔室30、廢物腔室40、輸出腔室50、過濾器組件36、樣品袋60和相關(guān)的導(dǎo)管12或管道。在系統(tǒng)的一次性用具的優(yōu)選的實(shí)施方式中，采集腔室20和處理腔室30通過容納在剛性框內(nèi)的導(dǎo)管12連接。處理腔室30的旋轉(zhuǎn)密封網(wǎng)絡(luò)(圖7和8)也可以容納在同一個(gè)剛性框內(nèi)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，一次性用具的不同腔室和容器包括必要的接口，該接口能夠與系統(tǒng)的處理設(shè)備連通，使得自動(dòng)化系統(tǒng)的泵、閥、傳感器和其它設(shè)備在沒有使用者干涉的情況下根據(jù)需要被適當(dāng)?shù)赜|發(fā)或停用。該接口還減小了需要設(shè)置系統(tǒng)的時(shí)間和所需要的專業(yè)技術(shù)，并且還通過指示如何正確地設(shè)置系統(tǒng)并且在設(shè)置錯(cuò)誤時(shí)警告使用者減小了錯(cuò)誤。本發(fā)明的大多數(shù)一次性用具可以具有許多通用的元件。然而，本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員可以理解，系統(tǒng)的不同應(yīng)用可能需要附加的部件，其可以為一次性用具的一部分。因此，一次性用具還可以包括適合于從患者獲得脂肪或其它組織并且將再生細(xì)胞返回患者體內(nèi)的一種或多種針或注射器。包括的針和注射器的類型數(shù)和種類將取決于被處理的組織的類型和量。一次性用具還可以包括保持系統(tǒng)中使用的清洗流體和其它處理試劑的一個(gè)或多個(gè)剛性或柔性的容器。例如，一次性用具可以包括用于保持鹽水、酶和過程需要的任何其它處理或置換流體的容器。另外，適合的清洗溶液、重新懸浮流體、添加劑、制劑或移植材料可以與一次性用具一起提供，以與本發(fā)明的系統(tǒng)和方法一起使用。在這里描述的或另外需要用于實(shí)施本發(fā)明的系統(tǒng)部件、裝備或供給源的任何組合可以以成套器具的形式提供。例如，本發(fā)明的成套器具可以包括，例如，用于基于注射器的吸脂的最佳長(zhǎng)度和規(guī)格的針和包含允許處理小體積的組織的優(yōu)選的過濾器介質(zhì)的無菌的注射器。在表II和III中列出了可以與本發(fā)明一起使用并且可以與本發(fā)明的成套器具包括在一起的其它示例性的裝備和供給源。下面的表II列出了能夠用于根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法獲得脂肪來源的再生細(xì)胞的供給源的示例表II
權(quán)利要求
1.包含脂肪來源的干細(xì)胞的濃縮細(xì)胞群體在制備用于心肌梗死后的恢復(fù)灌注和減少心肌疤痕形成的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中，所述包含脂肪來源的干細(xì)胞的濃縮細(xì)胞群體還包含脂肪來源的祖細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中，制成所述藥物用于大劑量給藥。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中，制成所述藥物用于多劑量給藥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物還包含至少一種血管生成因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物還包含至少一種動(dòng)脈 生成因子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述藥物還包含一種或者多種免疫抑制藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中的任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，制成所述藥物用于通過心內(nèi)膜心肌、心肌外膜、心室內(nèi)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)、逆行冠狀竇、動(dòng)脈內(nèi)、心包內(nèi)或者靜脈內(nèi)給藥途徑給藥。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任意一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，包含脂肪來源的干細(xì)胞的濃縮細(xì)胞群體被基因轉(zhuǎn)移所修飾。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中，所述包含脂肪來源的干細(xì)胞的濃縮細(xì)胞群體還包含添加劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中，所述添加劑選自由生長(zhǎng)因子、免疫抑制劑、細(xì)胞再分解抑制劑組成的組。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中，所述包含脂肪來源的干細(xì)胞的濃縮細(xì)胞群體沒有被培養(yǎng)。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其中，所述包含脂肪來源的干細(xì)胞的濃縮細(xì)胞群體被隔離在設(shè)置成維持閉合的無菌的流體/組織通道的系統(tǒng)中。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及使用脂肪組織來源的細(xì)胞治療心血管病癥的方法。本申請(qǐng)?zhí)峁┝税緛碓吹母杉?xì)胞的濃縮細(xì)胞群體在制備用于心肌梗死后的恢復(fù)灌注和減少心肌疤痕形成的藥物中的應(yīng)用。脂肪來源的再生細(xì)胞被用于治療患者，包括患有心血管病癥、疾病或紊亂的患者。治療患者的方法包括處理脂肪組織以為患者提供來自脂肪組織的濃縮量的再生細(xì)胞例如干細(xì)胞和祖細(xì)胞。該方法可以在封閉系統(tǒng)中實(shí)施，這樣在被給藥給患者之前，干細(xì)胞不會(huì)被暴露到外部環(huán)境中。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂肪來源的再生細(xì)胞與對(duì)于促進(jìn)、產(chǎn)生或支持治療性心血管益處必要的添加劑一起被直接置入受體內(nèi)。
文檔編號(hào)A61K35/34GK102861105SQ201210266229
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2005年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月25日
發(fā)明者約翰·K.·弗雷澤, 馬克·H.·赫德里克, 朱敏, 布賴恩·M.·斯特雷姆, 埃里克·丹尼爾斯, 伊莎貝拉·武盧爾 申請(qǐng)人:再生醫(yī)療技術(shù)公司