專利名稱：：顯示出內(nèi)皮細胞特征的脂肪來源的成年基質(zhì)細胞的制作方法顯示出內(nèi)皮細胞特征的脂肪來源的成年基質(zhì)細胞發(fā)明背景人的發(fā)育中新生兒期的特征是存在"干"細胞，其具有沿著多種分化途徑發(fā)育的潛力。這些細胞的最終分化由協(xié)調(diào)器官發(fā)生和組織結構的細胞因子和激素信號決定。已經(jīng)分離并在體外和體內(nèi)廣泛研究了來自小鼠的胚胎干(ES)細胞。使用外源體外刺激，研究人員已經(jīng)誘導了ES細胞沿著多種譜系途徑分化。這些途徑包括神經(jīng)元的、B譜系淋巴樣的和脂肪細胞的途徑(Dani,等人，1997,J.CellSci.110:1279;Remoncourt,等人，1998,Mech.Dev.79:185;O'Shea,1999，Anat.Rec.257:32)。在成年生物的組織中也存在多能干細胞。成年干細胞的最詳細表征的實例是從骨髓和外周血分離的造血祖細胞。不治療時，致死輻射的小鼠死亡，因為它們不能補充它們的循環(huán)血細胞；然而，來自同源的供體動物的骨髓細胞的移植拯救了宿主動物。供體細胞負責恢復循環(huán)的血細胞。自那以后已經(jīng)進行了研究來闡明未分化的造血干細胞能夠在宿主動物中再生不同的血細胞譜系。這些研究己經(jīng)提供了骨髓移植的基礎癌癥和先天性代謝缺陷的廣泛接受的治療形式。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自骨髓的細胞能夠分化成其他細胞類型。骨髓含有至少兩種類型的干細胞造血干細胞和非造血組織的干細胞，其被不同地稱作充質(zhì)干細胞或者髓基質(zhì)細胞(MSCs)或者骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)。這些術語在本文全文同義使用。MSC是重要的，因為它們?nèi)菀讖墓撬璧奈鑫锓蛛x，并且它們?nèi)菀桩a(chǎn)生單細胞來源的集落。單細胞來源的集落可以在約10周內(nèi)增殖多達50群體倍增數(shù)，并且可以分化成成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞(Friedenstein，等人，1970,CellTissueKinet.3:393-403;Castro-Malaspina，等人，1980，Blood56:289-301;Beresford，等人，1992，J.CellSci.102:341-351;Prockop,1997,Science276:71-74)、肌細胞(Wakitani，等人，1995,MuscleNerve18:1417-1426)、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元(Azizi,等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:3908-3913;Kopen,等人，1999,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:10711-10716;Chopp，等人，2000,NeuroreportII,3001-3005;Woodbury,等人，2000，NeuroscienceRes.61:364-370)。此外，MSC產(chǎn)生所有三個胚層的細胞(K叩en，等人，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.96:10711-10716;Liechty,等人，2000,NatureMed.6:1282-1286;Kottonet,等人，2001，Development128:5181-5188;Toma,等人，2002，Circulation105:93-98;Jiang，等人，2002，Nature418:41-49)。體內(nèi)證據(jù)表明未分級分離的骨髓衍生的細胞以及MSC的純?nèi)后w產(chǎn)生上皮細胞類型，包括肺的上皮細胞類型(Krause，等人，2001,Cell105:369-377;Petersen,等人，1999，Science284:1168-1170)，并且?guī)讉€最近的研究已經(jīng)表明通過組織損傷增強MSC的移入(Ferrari，等人，1998，Science279:1528-1530;Okamoto等人，2002，NatureMed.8:1101-1017)。因為這些原因，當前正在測試MSC在許多人類疾病的細胞和基因治療中的潛在用途(Horwitz，等人,1999,Nat.Med.5:309-313;Caplan，等人，2000，Clin.Orthoped.379:567-570)。MSC組成了多能干細胞的備選來源。在生理條件下，它們保持骨髓的結構并且分別在不同細胞黏附分子的幫助下調(diào)節(jié)造血作用和細胞因子的分泌(Clark，等人，1995，Ann.NYAcad.Sci.770:70-78)。通過選擇性附著到組織培養(yǎng)塑料制品從骨髓長出的MSC可以有效擴增(Azizi,等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:3908-3913;Colter,等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:3213-218)并且可以在遺傳上操作(Schwarz,等人，1999,Hum.GeneTher.10:2539-2549)。MSC也稱作充質(zhì)干細胞，因為它們能夠分化成多種中胚層組織，包括骨(Beresford，等人，1992,J.CellSci.102:341-351)、軟骨(Lennon,等人，1995，Exp.CellRes.219:211-222)、脂肪(Beresford，等人，1992，J.CellSci.102:341-351)和肌肉(Wakitani，等人，1995,MuscleNerve18:1417-1426)。此外，已經(jīng)報導了向表達神經(jīng)元標記的神經(jīng)元樣細胞的分化。(Woodbury,等人，2000，J.Neurosci.Res.61:364-370;Sanchez-Ramos,等人，2000，Exp.Neurol.164:247-256;Deng，等人，2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.282:148-152)，提示MSC能夠克服胚層定向?；谶@些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)提出骨髓作為基質(zhì)干細胞的來源用于再生骨、軟骨、肌肉、脂肪組織、肝臟、神經(jīng)元和其他組織。然而，提取骨髓基質(zhì)細胞代表對供體的高水平的風險和不適。相反，成人髓外脂肪組織衍生的基質(zhì)細胞(ADAS)代表了基質(zhì)干細胞來源，其可以常規(guī)地收獲，對患者有最小的風險或者不適。病理學證據(jù)提示脂肪衍生的基質(zhì)細胞能夠沿著多種譜系途徑分化。此外，已經(jīng)闡明來自脂肪組織的基質(zhì)細胞能夠分化成多種中胚層組織。血管發(fā)生是稱作成血管細胞的原始內(nèi)皮祖細胞原位分化成聚集成初級毛細血管叢的內(nèi)皮細胞，負責胚胎發(fā)生期間血管系統(tǒng)的發(fā)育(Peichev,等人，2000,Blood95:952-958)。相反，血管生成定義為通過從先前存在的血管萌發(fā)的過程形成新血管，在發(fā)育和出生后生命期間都發(fā)生(Peichev,等人,2000,Blood95:952-958;Watt,等人，1995,Leuk.Lymphoma17:229-235;Reyes，等人，2001,Blood98:2615-2625)。直到最近都認為出生后生命中血管形成通過從現(xiàn)有血管的內(nèi)皮細胞萌發(fā)介導。然而，最近的研究已經(jīng)表明內(nèi)皮干細胞可以持續(xù)到成年生命，在成年生命中，它們促進新血管形成(Nishikawa，等人，1998，Development125:1747-1757;Gehling,等人，2000,Blood95:3106-3112;Rafii,等人，1994，Blood84:10-18;Asahara,等人，1997，Science275:964-967)。這又提示由于在發(fā)育期間，成體中新血管生成至少部分依賴于血管發(fā)生過程。已經(jīng)從骨髓和外周血分離了內(nèi)皮細胞的前體(Peichev,等人，2000,Blood95:952-958;Watt,等人，1995，Leuk.Lymphoma17:229-235)。這些內(nèi)皮祖細胞的個體發(fā)育還未知。因此，需要用于可以產(chǎn)生內(nèi)皮細胞的祖細胞的容易得到的來源的分離和增殖方法。當前的用于培養(yǎng)和得到大量內(nèi)皮祖細胞的方法還沒有成功。大量內(nèi)皮祖細胞的可得性將在血管移植、組織改造、血管生成的調(diào)節(jié)、血管發(fā)生和包括心臟病的多種病癥的治療中非常有用。因此，長期以來一直需要用于標準化培養(yǎng)條件的方法和組合物，其用于使得到大量用于治療和實驗目的的此類細胞的內(nèi)皮祖細胞的增殖最大化。本發(fā)明滿足了這些需求。發(fā)明簡述本發(fā)明包括用于產(chǎn)生顯示出前內(nèi)皮細胞(pre-endothelialcell)和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的脂肪來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞的組合物和方法。一方面，誘導ADAS細胞在體外分化。另一方面，誘導ADAS細胞在體內(nèi)分化。再一方面，已經(jīng)改造ADAS細胞以表達外源遺傳物質(zhì)。再一方面，ADAS細胞來自人。本發(fā)明還包括被誘導以表達CD34和CD31的至少一種的ADAS細胞。一方面，當分別與來自其他方面相同的、沒有被誘導表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的ADAS細胞的CD34禾卩CD31的表達水平相比時，ADAS細胞以更高水平表達CD34和CD31的至少一種。另一方面，ADAS細胞表達CD34、CD31、CD40、CD63，或者其組合的至少一種。再一方面，當分別與來自其他方面相同的、沒有被誘導表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的CD34、CD31、CD40和CD63的表達水平相比時，ADAS細胞以更高水平表達CD34、CD31、CD40、CD63，或者其組合的至少一種。本發(fā)明還包括分化ADAS細胞以表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的方法，該方法包括將所述細胞在Mil培養(yǎng)基中溫育，接著在MIII培養(yǎng)基中溫育所述細胞。一方面，該方法包括使用來自人的ADAS細胞。另一方面，Mil培養(yǎng)基包含N2補充物、B27補充物、谷氨酰胺和成纖維細胞生長因子(FGF)。再一方面，MII培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度約為2.3mM。再一方面，Mil培養(yǎng)基中FGF的濃度約為10ng/mL。一方面，MIII培養(yǎng)基包含N2補充物、B27補充物、谷氨酰胺，煙酰胺和胎牛血清(FBS)。另一方面，MIII培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度約為2.3mM。再一方面，MIII培養(yǎng)基中煙酰胺的濃度約為10mM。再一方面，Mill培養(yǎng)基中FBS的濃度約為2%。本發(fā)明還包括在動物中誘導血管發(fā)生的方法，該方法包括a)誘導分離的脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞以表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征；和b)對所述動物施用所述這樣誘導的細胞。一方面，ADAS細胞是動物自體的。另一方面，ADAS細胞從同種異體供體分離。另一方面，ADAS細胞從異種供體分離。再一方面，ADAS細胞來自人。本發(fā)明還包括確定化合物實現(xiàn)ADAS細胞分化成前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的能力的方法，該方法包括a)在基質(zhì)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述ADAS細胞一段時間；b)將所述基質(zhì)細胞培養(yǎng)基用包含化合物或者對照載體的分化培養(yǎng)基更換；c)在包含所述化合物或所述對照載體的所述分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述ADAS細胞一段時間；d)使用來自步驟c)的包含所述化合物的所述分化培養(yǎng)基確定分化細胞的數(shù)目或者百分數(shù)；e)使用來自步驟c)的僅含有所述載體的所述分化培養(yǎng)基確定細胞中分化細胞的百分數(shù)；f)比較來自步驟(d)和(e)的分化細胞的數(shù)目或者百分數(shù)；g)與來自步驟(e)的分化細胞的百分數(shù)相比，來自步驟(d)的分化細胞的更大的百分數(shù)表明所述化合物能夠誘導所述ADAS細胞分化成前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞。一方面，ADAS細胞來自人。附圖簡述為了闡明本發(fā)明的目的，在附圖中描繪了本發(fā)明的一些實施方案。然而，本發(fā)明不限于附圖中描繪的實施方案的精確安排和手段。圖1包含圖1A到1F，是一系列描繪未處理的和用MII/MIII處理的ADAS培養(yǎng)物的圖像。圖1A和IB分別描繪了預處理的和未處理的對照ADAS培養(yǎng)物。圖1C和ID描繪了用Mil處理的ADAS培養(yǎng)物。圖IE和IF描繪了用Mill處理的ADAS培養(yǎng)物。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于誘導脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的組合物和方法。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的細胞提供了功能細胞的來源，所述功能細胞可以用于研究、移植和開發(fā)組織改造產(chǎn)物用于治療疾病和組織修復。定義如本文所用的，下面每一個術語具有與它在該部分中相關的含義。本文使用的冠詞"一個"和"一種"指一個或一個以上(即至少一個)該冠詞的語法對象。例如，"一個組分"指一個或一個以上的組分。術語"約"將被本領域普通技術人員理解并且將在它使用的上下文中有一定的不同。本文使用的術語"脂肪來源的基質(zhì)細胞"、"脂肪組織來源的基質(zhì)細胞"或者"脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞"可以互換使用并且指來自脂肪組織的基質(zhì)細胞，其可以用作到多種不同的細胞類型，如骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞的干細胞樣前體。"脂肪"指任一種脂肪組織。脂肪組織可以是褐色或者白色的脂肪組織。優(yōu)選地，脂肪是皮下白色脂肪組織。此類細胞可以包含原代細胞培養(yǎng)物或者永生化的細胞系。脂肪組織可以來自具有脂肪組織的任一種生物。優(yōu)選地，脂肪組織是哺乳動物的、最優(yōu)選脂肪組織是人的。人脂肪組織的方便的來源是來自脂肪抽吸外科手術。然而，脂肪組織的來源或者分離脂肪組織的方法對于本發(fā)明不是關鍵的。"同種異體的"指來自相同物種的不同動物的移植物。本文使用的"同種異體的脂肪來源的成年基質(zhì)細胞"從與受體相同的物種的不同個體得到。"同種異體抗原"是與受體表達的抗原不同的抗原。"供體抗原"指由待移植到受體的供體組織表達的抗原。本文使用的"效應細胞"指介導針對抗原的免疫應答的細胞。在移植物被導入受體的情況下，效應細胞可以是受體自身的細胞，其引起針對供體移植物中存在的抗原的免疫應答。在另一情況下，效應細胞可以是移植物的部分，其中移植物向受體的導入導致移植物中存在的效應細胞引起針對移植物的受體的免疫應答。本文使用的術語"自體的"意指來自相同個體的任何物質(zhì)，其以后再次被導入該個體中。本文使用的術語"血管生成"指從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)和組織產(chǎn)生新血管的過程(Folkman，1995,Nat.Med.1:37-31)。短語"修復或者重塑"指現(xiàn)有血管系統(tǒng)的再形成。組織局部缺血的減輕嚴重依賴于血管生成。新血管的自發(fā)生長提供了局部缺血區(qū)中和周圍的側支循環(huán)，改善了血流，并減輕了局部缺血導致的癥狀。本文使用的術語"血管生成因子"或"血管生成蛋白"指能夠促進從現(xiàn)有的血管系統(tǒng)生長新血管("血管生成")的任何已知的蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明的合適的血管生成因子包括，但不限于，胎盤生長因子、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、神經(jīng)氈蛋白、成纖維細胞生長因子(FGF)-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、血管生成素l、血管生成素2、紅細胞生成素(EPO)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)—2、BMP-4、BMP-7、TGF-卩、IGF-1、骨橋蛋白、多效營養(yǎng)因子、激活蛋白、內(nèi)皮縮血管肽一l和其組合。血管生成因子可以獨立地作用，或者相互組合作用。當組合時，血管生成因子還可以協(xié)同作用，其中因子的組合作用大于單獨施用的個體因子的作用之和。術語"血管生成因子"或者"血管生成蛋白"還包括此類因子的功能類似物。功能類似物包括例如，因子的功能部分。功能類似物還包括抗獨特型抗體，其結合因子的受體并從而在促進血管生成和/或組織重塑中模擬所述因子的活性。用于產(chǎn)生此類抗獨特型抗體的方法是本領域中公知的并且例如在WO97/23510中描述，將其內(nèi)容引入本文作為參考。本文使用的"血管生成因子"可以從任何合適的來源產(chǎn)生或者得到。例如，因子可以從它們的天然來源純化，或者合成產(chǎn)生或者通過重組表達產(chǎn)生。因子可以作為蛋白質(zhì)組合物施用于患者。因子可以以編碼該因子的表達質(zhì)粒的形式施用。合適的表達質(zhì)粒的構建是本領域中公知的。用于構建表達質(zhì)粒的合適的載體包括例如，腺病毒載體、反轉錄病毒載體、腺伴隨病毒載體、RNA載體、脂質(zhì)體、陽離子脂質(zhì)、慢病毒載體和轉座子。本文使用的術語"生物相容的網(wǎng)格"意指可以促進形成有助于組織發(fā)育的三維結構的基質(zhì)。因此，例如，可以在這種生物相容的網(wǎng)格上培養(yǎng)或接種細胞，所述網(wǎng)格為諸如包括細胞外基質(zhì)物質(zhì)、合成聚合物、細胞因子、生長因子等等的網(wǎng)格。該網(wǎng)格可以成型成希望的形式用于促進組織類型的發(fā)育。而且，至少在細胞培養(yǎng)期間的早期，對培養(yǎng)基和/或基質(zhì)補充促進合適的組織類型和結構發(fā)育的因子(例如，生長因子、細胞因子、細胞外基質(zhì)物質(zhì)，等等)。"分化的"在本文中用于指實現(xiàn)了成熟的最終狀態(tài)的細胞，從而該細胞已經(jīng)完全發(fā)育并且顯示出生物學特化和/或適應于特定環(huán)境和/或功能。通常，分化細胞的特征是在給定細胞中表達編碼分化的相關蛋白質(zhì)的基因。例如，內(nèi)皮細胞標志CD31和血管性血友病因子的表達和"鵝卵石"形態(tài)的形成是分化的成熟內(nèi)皮細胞的典型實例。當說細胞是"分化的"時，如該術語在本文使用的，細胞處于分化的過程中。"分化培養(yǎng)基"在本文用于指細胞生長培養(yǎng)基，其包含添加劑或者缺少添加劑，從而當在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時不完全分化的干細胞、脂肪來源的成年基質(zhì)細胞或其他此類祖細胞發(fā)育成具有分化細胞的一些或者全部特征的細胞。"內(nèi)皮ADAS細胞"在本文中用于指表達前內(nèi)皮細胞禾n/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的ADAS細胞。"可擴展性(expandability)"在本文中用于指細胞增殖的能力，例如，數(shù)目擴大或者對于細胞群體的情況，經(jīng)歷群體加倍。"移植物"指用于移植的細胞、組織、器官或者任何生物相容的網(wǎng)格。所謂"生長因子"意指下面的特定因子，包括但不限于，生長激素、紅細胞生成素、血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨噬細胞集落刺激因子、c-kit配體/干細胞因子、護骨蛋白配體、胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板衍生生長因子(PDGF)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白，其濃度為皮克/ml到毫克/ml水平之間。如本文使用的術語"生長培養(yǎng)基"意指促進細胞生長的培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基將通常含有動物血清。在一些情況中，生長培養(yǎng)基可以不含有動物血清。如本文使用的術語"多能的"或者"多能"意指中樞神經(jīng)系統(tǒng)的干細胞能夠分化成一種以上類型的細胞。"增殖"在本文中用于指特別是細胞的類似形式的繁殖或者增殖。艮口，增殖包括產(chǎn)生更大數(shù)目的細胞，并且可以通過特別是簡單地計數(shù)細胞數(shù)、測量3H胸苷向細胞的摻入等等測量。術語"前體細胞"、"祖細胞"和"干細胞"在本領域中和本文中可互換使用，并且指多能的或者譜系未定型(uncommitted)的祖細胞，其潛在能夠不限次數(shù)進行有絲分裂以自我更新或者產(chǎn)生子代細胞，該子代細胞將分化成例如內(nèi)皮細胞或者內(nèi)皮樣細胞；或者譜系定型(committed)的祖細胞和它的子代，該子代能夠自我更新并且能夠分化成內(nèi)皮細胞或者內(nèi)皮樣細胞。不像多能干細胞，譜系定型的祖細胞通常被認為不能產(chǎn)生表型上相互不同的多種細胞類型。實際上，祖細胞產(chǎn)生一種或者可能兩種譜系定型的細胞類型。術語"前內(nèi)皮細胞"指潛在能夠不限次數(shù)有絲分裂以自我更新或者產(chǎn)生將分化成內(nèi)皮細胞或者內(nèi)皮樣細胞的子代細胞的細胞。本文使用的術語"基質(zhì)細胞培養(yǎng)基"指用于培養(yǎng)ADAS細胞的培養(yǎng)基。通常，基質(zhì)細胞培養(yǎng)基包含基本培養(yǎng)基、血清和抗生素/抗真菌劑。然而，可以用沒有抗生素/抗真菌劑并且補充至少一種生長因子的基質(zhì)細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)ADAS細胞。優(yōu)選地，生長因子是人表皮生長因子(hEGF)。hEGF的優(yōu)選濃度為約l-50ng/ml，更優(yōu)選濃度為約5ng/ml。優(yōu)選的基本培養(yǎng)基是DMEM/F12(1:1)。優(yōu)選的血清是胎牛血清(FBS)，但是可以使用其他血清，包括胎牛血清(FCS)、馬血清或者人血清。優(yōu)選向上面的培養(yǎng)基加入多達20%FBS以便支持基質(zhì)細胞的生長。然而，如果鑒定了用于基質(zhì)細胞生長的FBS中的必要的生長因子、細胞因子和激素并且在生長培養(yǎng)基中以合適的濃度提供，那么可以使用確定成分的培養(yǎng)基。還認識到可以向培養(yǎng)基中加入額外的組分。此類組分包括但不限于，抗生素、抗真菌劑、白蛋白、生長因子、氨基酸和本領域中已知的用于細胞培養(yǎng)的其他組分。可以加入培養(yǎng)基的抗生素包括但不限于，青霉素和鏈霉素。培養(yǎng)基中青霉素的濃度為約10到約200單位/ml。培養(yǎng)基中鏈霉素的濃度為約10到約200pg/ml。然而，本發(fā)明決不應被理解為局限于用于培養(yǎng)基質(zhì)細胞的任一種培養(yǎng)基。而是，可以使用能夠支持組織培養(yǎng)中基質(zhì)細胞的任何培養(yǎng)基。"MII/MIII培養(yǎng)基方案"指將ADAS細胞用Mil培養(yǎng)基培養(yǎng)，接著將細胞用MIII培養(yǎng)基培養(yǎng)。"移植物"指將被移植的生物相容的網(wǎng)格或者供體組織、器官或者細胞。本文使用的"治療有效量"是表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的ADAS細胞的量，其足夠為該細胞所施用的受試者提供有益效果。"異源的"指來自不同物種的動物的移植物。本文使用的"內(nèi)源的"指來自或者在生物、細胞或者系統(tǒng)中產(chǎn)生的任何物質(zhì)。"外源的"指從生物、細胞或者系統(tǒng)外面導入或者產(chǎn)生的任何物質(zhì)。"編碼"指多核苷酸，如基因、cDNA或者mRNA中核苷酸的特定序列的內(nèi)在性質(zhì)，其作為合成模板用于在生物過程中合成具有確定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或者確定的氨基酸序列，和從其得到的生物學性質(zhì)的其他聚合物和大分子。因此，如果對應于該基因的mRNA的轉錄和翻譯在細胞或者其他生物系統(tǒng)中產(chǎn)生蛋白質(zhì)，那么該基因編碼蛋白質(zhì)。編碼鏈，即與mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的核苷酸序列和用作基因或者cDNA的轉錄模板的非編碼鏈二者都可以稱作編碼該基因或者cDNA的蛋白質(zhì)或者其他產(chǎn)物。除非另外指出，"編碼氨基酸序列的核苷酸序列"包括相互為簡并形式并且編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子。"分離的核酸"指核酸區(qū)段或者片段，其已經(jīng)與天然存在狀態(tài)下處于它的側翼的序列分離，該序列為例如，已經(jīng)從通常與該片段相鄰的序列除去的DNA片段，例如，與它天然存在的基因組中與該片段相鄰的序列。該術語還應用于已經(jīng)從天然伴隨該核酸的其他組分基本上純化的核酸，例如，在細胞中天然伴隨該核酸的RNA或者DNA或者蛋白質(zhì)。因此，該術語包括例如，重組DNA，其摻入載體中、摻入自主復制的質(zhì)粒或者病毒中，或者摻入原核或者真核生物的基因組DNA中，或者作為單獨的分子(例如，作為cDNA或者基因組或者通過PCR或者限制酶消化產(chǎn)生的cDNA片段)獨立于其他序列存在。它還包括作為編碼額外的多肽序列的雜種基因的部分的重組DNA。在本發(fā)明上下文中，為通常使用的核酸堿基使用下面的縮寫。"A"指腺苷，"C"指胞嘧啶，"G"指鳥苷，"T"指胸苷，"U"指尿苷。，"載體"是物質(zhì)的組合物，其包含分離的核酸并且可以用于遞送分離的核酸到細胞內(nèi)部。許多載體是本領域中已知的，包括但不限于，線性多核苷酸、與離子或者兩親性化合物結合的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因此，術語"載體"包括自主復制質(zhì)?；蛘卟《?。該術語將還可以被解釋成包括非質(zhì)粒和非病毒化合物，其促進核酸轉移到細胞中，如例如聚賴氨酸化合物、脂質(zhì)體，等等。病毒載體的實例包括，但不限于，腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉錄病毒載體等等。"表達載體"指包含重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包含可操作連接于待表達的核苷酸序列的表達控制序列。表達載體包含足夠的用于表達的順式作用元件；用于表達的其他元件可以由宿主細胞或者在體外表達系統(tǒng)中提供。表達載體包括本領域中已知的所有那些表達載體，如摻入重組多核苷酸的黏粒、質(zhì)粒(例如，裸露的或者包含在脂質(zhì)體中的)和病毒。描述脂肪組織提供了骨髓的替代物作為干細胞的來源。脂肪組織容易獲得并且在許多個體中很豐富。來自脂肪組織的干細胞可以通過脂肪抽吸法收獲，所述脂肪抽吸法是相對非侵入性的過程并且可以產(chǎn)生大量脂肪來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞。本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)ADAS細胞可以用成分確定的培養(yǎng)基處理以表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征。這些細胞在本文中稱作"內(nèi)皮ADAS細胞"。因此，基于本文的公開內(nèi)容，可以產(chǎn)生和擴增表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征而保留它們分化成成熟內(nèi)皮細胞的能力的內(nèi)皮ADAS細胞的大群體。同樣地，本發(fā)明包括用于產(chǎn)生大量用于實驗/治療目的的內(nèi)皮ADAS細胞的組合物和方法。I.ADAS的分離和培養(yǎng)可以通過本領域技術人員己知的多種方法分離本發(fā)明的方法中使用的ADAS細胞。例如，此類方法在美國專利號6,153,432中描述，將該專利完整引入本文。在優(yōu)選方法中，從哺乳動物受試者、優(yōu)選人類受試者分離ADAS細胞。在人中，通常從脂肪抽吸法材料分離ADAS細胞。如果本發(fā)明的細胞將移植到人類受試者，那么優(yōu)選從相同的受試者分離ADAS細胞以便提供自體移植物。在本發(fā)明的另一方面，施用的ADAS細胞可以對于受體是同種異體的。同種異體的ADAS細胞從作為與受體相同物種的不同個體的供體分離。分離后，用本文公開的方法培養(yǎng)細胞以產(chǎn)生同種異體產(chǎn)物。本發(fā)明還包括對于受體是異源的ADAS細胞。不以任何方式限制本發(fā)明，可以使用本文公開的方法從脂肪組織分離基質(zhì)細胞。簡言之，通過脂肪抽吸外科手術從皮下儲存的脂肪移去人脂肪組織。然后將該脂肪組織從吸脂杯轉移到500ml無菌燒杯中并允許靜置約IO分鐘。通過抽吸除去沉淀的血液。將約125ml體積(或更少)的組織轉移到250ml離心管中，并接著將管用Krebs-Ringer緩沖液充滿。讓組織和緩沖液靜置約3分鐘或者直到實現(xiàn)明顯分離，然后通過抽吸除去緩沖液。可以將組織用Krebs-Ringer緩沖液另外洗滌4到5次或者直到組織顏色變成橙黃色和直到緩沖液顏色變成淡褐色。使用膠原酶處理可以解離脂肪組織的基質(zhì)細胞。簡言之，從組織除去緩沖液并用約2mg膠原酶/mlKrebs緩沖液(Worthington，ME)溶液以lml膠原酶溶液/ml組織的比例更換。將管在37"C水浴溫育約30到35分鐘，間斷搖動。通過室溫下以500xg離心5分鐘從脂肪組織的其他成分分離基質(zhì)細胞。通過抽吸除去油和脂肪細胞層?？梢詫⑹Ｓ嗟募壏滞ㄟ^劇烈回蕩重懸浮在約100ml磷酸緩沖鹽水(PBS)中，分到50ml管中并以500xg離心5分鐘。通過抽吸除去緩沖液，留下基質(zhì)細胞。然后將基質(zhì)細胞重懸浮在基質(zhì)細胞培養(yǎng)基中，并以合適的細胞密度平板接種并在37'C下5。/。C02中過夜溫育。一旦附著到組織培養(yǎng)皿或者瓶上，可以立即使用培養(yǎng)的基質(zhì)細胞或者保持培養(yǎng)一段時間或者多次傳代后誘導分化成希望的細胞，例如，如實施例部分中描述的表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的細胞。然而，決不應將本發(fā)明理解為局限于任一種分離基質(zhì)細胞的方法。相反，分離ADAS細胞的任一種方法都應該包括在本發(fā)明內(nèi)。能夠支持細胞培養(yǎng)物中成纖維細胞生長的任何培養(yǎng)基可以用以培養(yǎng)ADAS。支持成纖維細胞生長的培養(yǎng)基制劑包括，但不限于，Eagle極限必需培養(yǎng)基、ADC-1、LPM(無牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI1640、BGJ培養(yǎng)基(有和沒有Fitton-Jackson改良的)、Eagle基礎培養(yǎng)基(BME，加入Earle鹽堿)、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM，無血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良的Eagle培養(yǎng)基(GMEM)、LeibovitzL-15培養(yǎng)基、McCoy's5A培養(yǎng)基、培養(yǎng)基M199(M199E-具有Earle鹽堿)、培養(yǎng)基M199(M199H-具有Hank鹽堿)、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-E-具有Earle鹽堿)、Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-H-具有Hank鹽堿)和Eagle極限必需培養(yǎng)基(MEM-NAA，具有非必需氨基酸)、等等。用于培養(yǎng)ADAS的優(yōu)選培養(yǎng)基是DMEM，更優(yōu)選DMEM/F12(1:1)。用于本發(fā)明方法中的培養(yǎng)基的另外的非限制性實例可以含有?；蛘咂渌锓N的胎兒血清，其濃度為至少1%到約30%，優(yōu)選至少約5%到15%，最優(yōu)選約10%。雞或者其他物種的胚胎提取物可以以約1%到30%，優(yōu)選至少約5%到15%，最優(yōu)選約10%的濃度存在。分離后，將ADAS細胞在培養(yǎng)裝置中基質(zhì)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間或者直到細胞達到匯合，然后細胞進入另一個培養(yǎng)裝置。培養(yǎng)裝置可以是通常用于體外培養(yǎng)細胞的任何培養(yǎng)裝置。優(yōu)選的培養(yǎng)裝置是培養(yǎng)瓶，更優(yōu)選的培養(yǎng)裝置是T-225培養(yǎng)瓶。ADAS細胞可以用基質(zhì)細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述基質(zhì)細胞培養(yǎng)基沒有抗生素/抗真菌劑并且補充至少一種生長因子。優(yōu)選地，生長因子是人表皮生長因子(hEGF)。hEGF的優(yōu)選濃度為約1-50ng/ml，更優(yōu)選地濃度為約5ng/ml。可以在補充hEGF、不存在抗生素/抗真菌劑的基質(zhì)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)ADAS細胞一段時間或者直到細胞達到一定的匯合水平。優(yōu)選地，匯合水平大于70%。更優(yōu)選地，匯合水平大于90%。一段時間可以是適于在體外培養(yǎng)細胞的任何時間。在ADAS細胞培養(yǎng)期間的任何時間可以更換基質(zhì)細胞培養(yǎng)基。優(yōu)選地，每3到4天更換基質(zhì)細胞培養(yǎng)基。然后從培養(yǎng)裝置收獲ADAS細胞，其中可以立即使用ADAS細胞或者冷藏貯存以在以后的時間使用。通過胰蛋白酶消化、EDTA處理或者用于從培養(yǎng)裝置收獲細胞的任何其他步驟收獲ADAS細胞。II.ADAS細胞的處理本發(fā)明包括處理ADAS細胞以誘導它們表達前內(nèi)皮和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征(這些細胞稱作內(nèi)皮ADAS細胞)。盡管不希望被任何具體理論束縛，認為用含有血清、胚胎提取物，優(yōu)選非人胚胎提取物、純化的或者重組生長因子、細胞因子、激素、和/或化學劑的組合的確定成分培養(yǎng)基，在二維或者三維生物相容的網(wǎng)格中處理ADAS細胞以誘導ADAS細胞分化。MII培養(yǎng)基新鮮分離的或者冷藏的ADAS細胞可以用于用分化培養(yǎng)基進行下面的處理以便誘導ADAS細胞來顯示前內(nèi)皮和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征。在任一生長培養(yǎng)基，例如包含DMEM/F12(1:1)、10%FBS、5ng/mLhEGF和1ng/mLhFGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)未處理的ADAS細胞以便比較用分化培養(yǎng)基處理其他方面相同的ADAS細胞的效果。例如，可以用包含DMEM/F12、N2補充物、B27補充物、谷氨酰胺和FGF的Mil培養(yǎng)基培養(yǎng)治療組中的ADAS細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，MII培養(yǎng)基不含有血清。優(yōu)選地，MII培養(yǎng)基中谷氮酰胺的濃度為至少0.5mM到約25mM，優(yōu)選至少約lmM到20mM，更優(yōu)選地，至少約1.5mM到15mM，甚至更優(yōu)選地至少約1.5mM到10mM，最優(yōu)選地至少約2mM到5mM。在本發(fā)明的一方面，谷氨酰胺的濃度為約2.3mM。Mil培養(yǎng)基中hFGF的濃度為至少0.5ng/mL到約100ng/mL,優(yōu)選至少約1ng/mL到75ng/mL、更優(yōu)選至少約1.5ng/mL到50ng/mL、甚至更優(yōu)選至少約2ng/mL到25ng/mL、最優(yōu)選至少約3ng/mL到15ng/mL。在本發(fā)明的一方面，Mil培養(yǎng)基中hFGF的濃度為約10ng/mL?？梢杂肕il培養(yǎng)基處理ADAS細胞一段時間，該段時間足以改變ADAS的表型/形態(tài)以顯示出前內(nèi)皮和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征。優(yōu)選地，ADAS細胞進行逐步處理方案，最初以MII培養(yǎng)基起始處理約6天，在第1、3和5天用Mil培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，接著開始平板接種?；诒竟_內(nèi)容，本領域技術人員將明白可以用Mil培養(yǎng)基處理ADAS細胞多于6天，例如，可以處理ADAS細胞約一周、兩周、一個月、兩個月、或者甚至六個月；并且在處理期間任一時間可以改變Mil培養(yǎng)基。將ADAS細胞在MII培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間或者直到細胞達到一定的匯合水平。優(yōu)選地，匯合水平大于70%。更優(yōu)選地，匯合水平大于90%。細胞在Mil培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間可以是適合在體外培養(yǎng)細胞的任何時間。不希望被任何具體理論束縛，認為用Mil培養(yǎng)基處理ADAS細胞改變ADAS細胞的表型和形態(tài)。例如，當與未處理的或者預處理的ADAS細胞比較時，用Mil培養(yǎng)基處理ADAS細胞顯示出較少的成纖維細胞形態(tài)并且形態(tài)上更圓，形成細胞一細胞連接的網(wǎng)絡。用Mil培養(yǎng)基處理ADAS細胞后，可以收獲ADAS細胞立即用于實驗/治療用途或者冷藏以在以后的時間使用。在本發(fā)明的一方面，用Mil培養(yǎng)基處理的ADAS細胞用如下面更充分描述的Mil培養(yǎng)基進一步處理。MIII培養(yǎng)基用Mil培養(yǎng)基處理ADAS細胞后，可以用Mill培養(yǎng)基進一步處理細胞，所述MIII培養(yǎng)基包含DMEM/F12、N2補充物、B27補充物、谷氨酰胺、煙酰胺、FBS。Mil后用Mill培養(yǎng)基處理ADAS細胞也稱作MII/MIII培養(yǎng)基。不希望被任何具體理論束縛，認為用Mil培養(yǎng)基處理ADAS細胞后用Mill培養(yǎng)基處理ADAS細胞進一步使細胞向內(nèi)皮譜系分化。用Mil處理和使用PBS的洗滌步驟后通常接著進行用Mill培養(yǎng)基處理ADAS細胞。使用PBS的洗滌步驟用于從細胞培養(yǎng)物除去Mil培養(yǎng)基的組分，然后用Mill培養(yǎng)基培養(yǎng)ADAS細胞。然而，本發(fā)明將不限于用Mil培養(yǎng)基處理ADAS后用Mill培養(yǎng)基處理ADAS細胞。本發(fā)明將包括在任何時間使用Mill培養(yǎng)基以使ADAS細胞向內(nèi)皮譜系分化。優(yōu)選地，Mill培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度為至少0.5mM到約25mM，優(yōu)選至少約1mM到20mM，更優(yōu)選至少約1.5mM到15mM，甚至更優(yōu)選至少約1.5mM到10mM，最優(yōu)選地至少約2mM到5mM。在本發(fā)明的一方面，谷氨酰胺的濃度為約2.3mM。Mill培養(yǎng)基中煙酰胺的濃度為至少0.5mM到約100mM，更優(yōu)選至少約1mM到75mM，更優(yōu)選至少約1.5mM到50mM，甚至更優(yōu)選至少約2mM到25mM，最優(yōu)選至少約3mM到15mM。在本發(fā)明的一方面，Mill培養(yǎng)基中煙酰胺的濃度為約10mM。Mill培養(yǎng)基中FBS的濃度為至少0.5%到約20%，優(yōu)選至少約0.75%到15%,更優(yōu)選至少約1%或10%，甚至更優(yōu)選至少約1.5%到7.5%，更優(yōu)選至少約1.75%到5%。在本發(fā)明的一方面，Mill培養(yǎng)基中FBS的濃度為約2。％?？梢杂肕ill培養(yǎng)基處理ADAS細胞一段時間，該時間足以改變每種細胞類型的表型以顯示出前內(nèi)皮和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征。優(yōu)選地，ADAS細胞用Mill培養(yǎng)基處理約4天?；诒竟_內(nèi)容，本領域技術人員將理解可以用MIII培養(yǎng)基處理細胞任一段時間。例如，可以用MIII培養(yǎng)基處理細胞4天以上(即，可以處理細胞約l周、2周、l個月、2個月或者甚至6個月)。此外，可以用MIII培養(yǎng)基處理細胞少于4天(即，可以處理細胞約1天、2天、或者甚至3天)?？梢栽谔幚砥陂g任何時間改變MIII培養(yǎng)基。將ADAS細胞在Mill培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間或者直到細胞達到一定水平的匯合。優(yōu)選地，匯合水平大于70%。更優(yōu)選地，匯合水平大于90%。在MIII培養(yǎng)基中的時間期限可以是適于體外細胞培養(yǎng)的任何時間。用Mill培養(yǎng)基處理ADAS細胞進一步改變細胞的表型和形態(tài)以顯示出前內(nèi)皮和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征。當與未處理/預處理的ADAS細胞相比時，用Mil培養(yǎng)基接著用Mill培養(yǎng)基處理的ADAS細胞顯示出培養(yǎng)細胞的總體形態(tài)的改變，例如，產(chǎn)生與在MII處理期間觀察到的細胞相似的細胞和與培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞相似的形成"鵝卵石"型區(qū)域的細胞的異質(zhì)混合物。表征在用MII/MIII培養(yǎng)基方案處理細胞期間的任何時間點，可以通過胰蛋白酶消化收獲本發(fā)明的細胞，并收集用于立即實驗/治療用途或者冷藏用于在以后的時間使用。如本文別處討論的，MII/MIII培養(yǎng)基方案指用MII培養(yǎng)基培養(yǎng)ADAS細胞，接著用Mill培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。在本發(fā)明的一方面，在ADAS細胞的培養(yǎng)或者處理方案期間的任何步驟冷藏細胞。冷藏是本領域中常見的步驟并且如本文使用的包括當前用于冷藏細胞用于將來分析和使用的所有步驟。在另一方面，可以收獲細胞并進行流式細胞術以評估細胞表面標記以評估根據(jù)治療方案的細胞的表型的改變。可以用本領域中多種方法和本文公開的方法的任一種表征ADAS細胞和/或內(nèi)皮ADAS細胞。通過鑒定指示細胞分化以表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的表面和細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、基因和/或其他標記，可以表征細胞。這些方法將包括，但不限于，(a)通過細胞表面蛋白如CD80、CD86、CD14、CD45、CD34、CD133、CD卯、CD105、HLA-DR、CD63、CD166、I類MHC;CD44、CD73、CD54;CD31、CD13、CD40;CD29、CD49a、CDll、CD44、CD146的免疫熒光測定法如流式細胞術或者原位免疫染色檢測細胞表面蛋白；(b)通過免疫熒光方法，如流式細胞術或者使用特異單克隆抗體的原位免疫染色檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)；(c)通過諸如聚合酶鏈式反應、原位雜交和/或其他印跡分析的方法檢測表達mRNAs。目的細胞的表型標記是本領域技術人員公知的。額外的表型標記不斷被公開或者可以不用過度實驗鑒定。這些標記的任一種可以用于證實ADAS細胞顯示出前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征。譜系特異性表型特征可以包括細胞表面蛋白、細胞骨架蛋白、細胞形態(tài)和分泌產(chǎn)物。內(nèi)皮細胞特征包括內(nèi)皮細胞標記如CD29、CD31、CD34、CD54、CD61、CD62E、CD105、CD144、CD184/CXC4、CD202b和Mad-CAM-l的表達。本領域普通技術人員根據(jù)本公幵內(nèi)容將認識到已知的量熱法、熒光、免疫化學、聚合酶鏈式反應、化學或者放射化學方法可以容易地確定前內(nèi)皮或內(nèi)皮細胞特異標記的存在或不存在。本發(fā)明包括溫育根據(jù)本文公開的方案培養(yǎng)ADAS細胞產(chǎn)生的細胞群體。例如，本發(fā)明包括包含內(nèi)皮ADAS細胞的細胞群體，所述內(nèi)皮ADAS細胞已經(jīng)根據(jù)MII/MIII培養(yǎng)基方案培養(yǎng)。在本發(fā)明的一方面，內(nèi)皮ADAS細胞在MII/MIII培養(yǎng)基中培養(yǎng)后至少對于CD34是陽性的，如使用本文公開的方法測量。在另一方面，當與來自不根據(jù)MII/MIII培養(yǎng)基方案培養(yǎng)的其他方面相同的ADAS的CD34的表達水平比較時，內(nèi)皮ADAS細胞以較高水平表達至少CD34。在本發(fā)明的另一方面，內(nèi)皮ADAS細胞在MII/MIII培養(yǎng)基中培養(yǎng)后至少對于CD34和CD31之一是陽性的。在另一方面，當分別與來自不根據(jù)MII/MIII培養(yǎng)基方案培養(yǎng)的其他方面相同的ADAS的CD34和CD31的表達水平比較時，內(nèi)皮ADAS細胞以較高水平表達CD34和CD31的至少一種。在本發(fā)明的一方面，內(nèi)皮ADAS細胞至少對于CD34、CD31、CD40、CD63或者其組合的一種是陽性的。在另一方面，當分別與來自不根據(jù)MII/MIII培養(yǎng)基方案培養(yǎng)的其他方面相同的ADAS的CD34、CD31、CD40、CD63或者其組合的表達水平比較時，內(nèi)皮ADAS細胞以較高水平表達CD34、CD31、CD40、CD63或者其組合的至少一種。本發(fā)明還提供了鑒定和研究增強ADAS細胞向表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的細胞分化的化合物的方法。因此，提供了確定化合物影響ADAS細胞向表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的ADAS分化的能力的方法，其包括a)在基質(zhì)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)ADAS細胞一段時間；b)用包含化合物或者對照載體的分化培養(yǎng)基更換基質(zhì)細胞培養(yǎng)基；c)在包含化合物或者對照載體的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)ADAS細胞一段時間；d)使用包含來自步驟c)的化合物的所述分化培養(yǎng)基確定分化的細胞的數(shù)目或者百分數(shù)；e)使用含有僅來自步驟(c)的所述載體的所述分化培養(yǎng)基確定細胞中分化細胞的百分比數(shù)目；f)比較來自步驟(d)和(e)的分化細胞的數(shù)目或者百分數(shù)；g)與來自步驟(e)的分化細胞的百分比數(shù)目相比，來自步驟(d)的分化細胞的更大的百分比數(shù)目表明所述化合物能夠誘導所述ADAS細胞分化成表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的ADAS細胞。使用ADAS細胞的方法在根據(jù)MII/MIII培養(yǎng)基方案培養(yǎng)ADAS細胞以誘導ADAS細胞表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征后，內(nèi)皮ADAS細胞可以用于治療患有與血管發(fā)生和/或血管生成中損傷有關的病癥或者疾病的患者。本發(fā)明包括在使用內(nèi)皮ADAS細胞用于細胞療法以改善需要其的患者中血管發(fā)生和/或血管生成中的組合物和方法。根據(jù)本文的方法產(chǎn)生的內(nèi)皮ADAS細胞可以用于修復或者替代損傷的/破壞的內(nèi)皮組織，以改善現(xiàn)有的內(nèi)皮組織、導入新的或者改變的組織，修飾人工假體，或者連接生物組織或者結構。例如，細胞可以用于替代心瓣膜細胞。此外，細胞可以用于在心肌梗塞后治療心肌缺血。不希望被任何具體理論束縛，認為內(nèi)皮ADAS細胞通過調(diào)節(jié)血管發(fā)生和肌發(fā)生、心肌細胞程序性細胞死亡和缺血心臟組織中的重塑，促進缺血心肌的再生。本發(fā)明的細胞還可以用于治療心血管疾病和病癥。通過本發(fā)明的方法得到的細胞具有幾種性質(zhì)，其可以促進減輕和/或使損傷最少化并促進損傷后心肌或心血管修復和再生。這些性質(zhì)包括但不限于，合成和分泌刺激新血管形成的生長因子的能力、合成和分泌血管生成因子的能力、合成和分泌刺激細胞存活和增殖的生長因子的能力、增殖和分化成直接參與新血管形成的細胞的能力，和移入損傷的心肌和抑制瘢痕形成(膠原沉積和交聯(lián))的能力。本發(fā)明的細胞可以表達在血管形成和血管發(fā)育中起作用的多種生血管生長因子，包括但不限于，胎盤生長因子(PGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，支持缺血組織存活，誘導下肢的阻塞/再灌注損傷后的再灌注，當心臟損傷后注射到動物時返回到心臟，和分化成表達標記的細胞，與它們分化成參與血管發(fā)生和血管生成的細胞相一致。本領域技術人員將明白本發(fā)明的細胞可以在例如四肢、視網(wǎng)膜和心肌中組織缺血后摻入血管生成部位。本發(fā)明還包括使用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的內(nèi)皮ADAS細胞治療多種疾病的方法。技術人員基于本文提供的公開內(nèi)容將理解，再生性藥物在治療多種疾病，包括但不限于局部缺血、心臟病，包括動脈粥樣硬化性心血管疾病、冠狀動脈疾病、閉塞性動脈病、心肌缺血、周圍血管閉塞病等等中的價值和潛力。本發(fā)明包括對動物，包括人施用內(nèi)皮ADAS細胞以便治療疾病的方法，其中新的、未損傷的細胞的導入將提供某種形式的治療緩解。技術人員將容易理解可以對動物施用內(nèi)皮ADAS細胞，從而當接受來自周圍環(huán)境的信號和信息時，細胞可以通過周圍細胞環(huán)境的指導進一步在體內(nèi)分化成成熟的內(nèi)皮細胞。在體外分化ADAS細胞以表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的方法在本文中公開，并且可以以本文描述的方式對動物施用內(nèi)皮ADAS細胞。備選地，內(nèi)皮ADAS細胞可以進一步在體外分化成更成熟的內(nèi)皮細胞并且可以對需要其的動物施用成熟的內(nèi)皮細胞?？梢灾苽鋬?nèi)皮ADAS細胞用于移植以確保在體內(nèi)環(huán)境中長期存活。例如，在用于生長和保持細胞的合適的培養(yǎng)基中增殖細胞并允許其生長至匯合。使用例如，緩沖液，如含有0.05%胰蛋白酶、補充lmg/ml葡萄糖；0.1mg/mlMgCl2、0.1mg/mlCaCl2(完全PBS)加上用于失活胰蛋白酶的5%血清的磷酸緩沖鹽水(PBS)，可以從培養(yǎng)基質(zhì)釋放細胞。細胞可以用PBS通過離心洗滌然后以用于注射所選的密度重懸浮在沒有胰蛋白酶的完全PBS中。除了PBS，與宿主受試者生理相容的任何滲透平衡的溶液可以用于懸浮和向宿主中注射供體細胞。適于腸胃外施用的藥物組合物的制劑包含與藥用載體如無菌水或者無菌等滲鹽水組合的細胞?？梢砸赃m于快速濃注施用或者連續(xù)施用的形式制備、包裝或者銷售此類制劑?？梢砸詥挝粍┬停绾蟹栏瘎┑陌碴郴蛘叨鄤┝咳萜髦苽?、包裝或者銷售可注射的制劑。本發(fā)明還包括與其他治療方法組合移植內(nèi)皮ADAS細胞以治療身體，包括CNS、皮膚、肝臟、腎臟、心臟、胰腺等等中的疾病或者創(chuàng)傷。因此，本發(fā)明的內(nèi)皮ADAS細胞可以與對患者發(fā)揮有益效果的其他細胞，遺傳修飾的和非遺傳修飾的細胞兩者，共同移植。因此，如本領域技術人員根據(jù)本文提供的教導將理解的，本文公開的方法可以與其他治療方法組合。本發(fā)明的內(nèi)皮ADAS細胞可以作為內(nèi)皮ADAS細胞本身移植到患者中，使用本領域中公知的技術，如即美國專利號5,082,670和5,618,531中公開的技術，將這些專利的每一個引入本文作為參考，或者移植到身體中任何其他合適的部位。本發(fā)明的細胞的移植可以使用本領域中公知的技術以及本文描述的或者如在將來開發(fā)的技術完成。本發(fā)明包括向哺乳動物、優(yōu)選人中移植(transplanting)、移植(grafting)、灌注或者導入細胞的方法。本文中示例的是向多種哺乳動物的心血管組織中移植細胞的方法，但是本發(fā)明不限于此類解剖部位或那些哺乳動物。而且，涉及骨移植的方法是本領域中公知的并且例如在美國專利號4,678,470中描述，胰腺細胞移植物在美國專利號6，342,479和美國專利號5,571,083中描述，其教導了將細胞移植到身體中的任一解剖部位的方法。根據(jù)己知的包封技術，包括微囊化(見，例如美國專利號4,352,883;4,353,888;和5,084,350，引入本文作為參考)，或者巨囊化(macroencapsulation)(見例如，美國專利號5，284，761;5,158,881;4,976,859;和4,968,733;和國際公布號WO92/19195;WO95/05452，將它們?nèi)慷家氡疚淖鳛閰⒖?，細胞還可以被包封并用于遞送生物活性分子。對于巨囊化，裝置中的細胞數(shù)可以改變；優(yōu)選地，每個裝置含有103-109個細胞，最優(yōu)選地，約105到107個細胞?？梢詫⒁恍┚弈一b置植入患者中。細胞巨囊化和植入方法是本領域中公知的并且在例如美國專利6,498,018中描述。在本發(fā)明的一方面，從供體的脂肪組織提取ADAS細胞并使用本文公開的方法培養(yǎng)以施用于需要其的患者以引起對患者中損傷的或變性的心肌或者其他心血管組織的治療益處。此外，將導入個體的細胞可以來自不同的供體(同種異體的)或者它們可以是從將治療的個體得到的細胞(自體的)。此外，將導入個體的細胞可以從完全不同的物種得到(異源的)。在優(yōu)選實施方案中，從將植入的人的脂肪組織提取細胞，從而減小與對植入物的抗原性和/或免疫原性反應有關的潛在并發(fā)癥。內(nèi)皮ADAS細胞的劑量可以在寬范圍內(nèi)改變并且可以在每個具體情況中根據(jù)個體的需要調(diào)節(jié)。使用的細胞的數(shù)目取決于受體的體重和狀況、施用的數(shù)目和/或頻率，和本領域技術人員已知的其他變量。將施用于患者的內(nèi)皮ADAS細胞的數(shù)目可以涉及例如脂肪組織處理后的細胞產(chǎn)率。細胞總數(shù)的一部分可以保留用于以后使用或者冷藏。此外，遞送的劑量取決于細胞遞送于患者的路徑。當使用心外膜或者心內(nèi)遞送系統(tǒng)時，需要較少的細胞，因為這些系統(tǒng)和方法可以提供用于治療心血管疾病的最直接的途徑。在本發(fā)明的一個實施方案中，將遞送于患者的細胞數(shù)目預期為約5.5"04個細胞。然而，可以以數(shù)量級調(diào)節(jié)該數(shù)目以實現(xiàn)所希望的治療效果?？梢詫€體施用每100kg體重約105到約1013個內(nèi)皮ADAS細胞。在一些實施方案中，每100kg體重施用約1.5xl()S到約1.5xl0"個細胞。在一些實施方案中，每100kg體重施用約lxl(^到約5xlO"個細胞。在一些實施方案中，每100kg體重施用約4xl(^到約2xl()U個細胞。在一些實施方案中，每100kg體重施用約5><109細胞到約lxlO"個細胞?？梢詫μ幱谛募」δ苁軗p的任何背景下的患者施用內(nèi)皮ADAS細胞。此類背景的實例包括，但不限于，急性心肌梗塞(心臟病發(fā)作)、充血性心力衰竭(作為療法或者移植物的橋)、和冠狀動脈旁路搭橋術(coronaryarterybypassgraftsurgery)的補充?？梢蕴崆疤崛〖毎⒁岳洳胤绞奖４婊蛘咚鼈兛梢栽诨蛘叽蟾旁诖_定需要的時間時提取。如本文公開的，可以將細胞施用于患者，或者直接應用于損傷的組織，或者損傷組織附近，不用進一步處理或者進行額外的步驟以進一步純化、修飾、刺激或者改變該細胞后施用。例如，在施用于需要其的患者前，使用本文公開的方法體外培養(yǎng)細胞。本發(fā)明的細胞施用于患者的方式可以取決于幾種因素而變，這些因素包括治療的疾病的類型、哺乳動物的年齡、細胞是否分化、細胞中是否導入異源DNA，等等。可以通過直接注射，或者通過本領域中使用的用于導入將施用于患有心血管疾病或者病癥的患者的化合物的任何其他方法，將細胞導入目的部位。可以以多種方法施用內(nèi)皮ADAS細胞到宿主中。優(yōu)選的施用方式是血管內(nèi)、大腦內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、硬膜外、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)(intrastemal)、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、動脈內(nèi)、心內(nèi)或者肌內(nèi)方式。在一些實施方案中，通過直接移植對心血管組織施用內(nèi)皮ADAS細胞。在其他實施方案中，通過簡單的注射對心血管組織，即血管系統(tǒng)施用內(nèi)皮ADAS細胞。還可以用添加劑應用內(nèi)皮ADAS細胞以增強、控制或者指導預期的治療效果。例如，在一個實施方案中，通過使用抗體介導的陽性和/或陰性細胞選擇富集細胞群體可以進一步純化細胞以增強功效、減少發(fā)病率或者促進方法的容易性。類似地，可以用生物相容的基質(zhì)應用細胞，所述基質(zhì)通過支持和/或指導植入的細胞的命運有利于體內(nèi)組織改造。對患者施用內(nèi)皮ADAS細胞前，使用質(zhì)粒、病毒或者備選的載體策略，可以用目的核酸穩(wěn)定或者瞬時轉染或者轉導細胞?？梢栽谶z傳操作后施用細胞，使得它們表達基因產(chǎn)物，該產(chǎn)物意在促進細胞提供的治療應答。操作的實例包括控制(增加或者減少)促進血管生成或者血管發(fā)生的因子(即VEGF)的表達、促進分化成特定細胞譜系的發(fā)育基因(即MyoD)的表達，或者刺激細胞生長和增殖的因子(即bFGF-l)的表達的操作。內(nèi)皮ADAS細胞在植入前還可以在支架材料上進行細胞培養(yǎng)。從而，可以在天然或者合成的基質(zhì)或者支架上，在插入或者植入受體前，使用細胞合成組織改造的瓣膜、心室片、心包膜、血管和其他結構。還可以與生血管因子組合施用本發(fā)明的細胞以誘導或者促進受試者中新毛細血管或者血管形成。表達前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的ADAS可以在注射生血管因子之前、同時或者之后施用。此外，本發(fā)明的細胞可以在生血管因子施用部位緊鄰處、相同部位或者遠處施用。此外，本發(fā)明的細胞可以用于例如在體外篩選化合物、變應原、生長/調(diào)節(jié)因子、藥物化合物等等對前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的功效和/或細胞毒性，以通過確定細胞的生物活性的改變(例如，增殖能力、黏附、產(chǎn)生生血管因子)闡明某些疾病的機理，研究藥物和/或生長因子借以發(fā)揮作用以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞生物活性的機理，診斷和監(jiān)視患者中的疾病，用于基因療法、基因遞送或者蛋白質(zhì)遞送，和產(chǎn)生生物活性產(chǎn)物。通過分析體外活細胞數(shù)，例如，通過總細胞計數(shù)、和差異細胞計數(shù)，可以評估生長/調(diào)節(jié)因子對前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的影響。這可以使用標準細胞學和/或組織學技術，包括使用免疫細胞化學技術，使用確定類型特異性細胞抗原的抗體來完成。多種藥物對本發(fā)明細胞的作用可以在混懸培養(yǎng)物或者三維系統(tǒng)中評估。本發(fā)明的細胞還可以用于分離和評估與內(nèi)皮細胞的分化和成熟有關的因子。從而，表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的ADAS細胞可以用于測定中以確定培養(yǎng)基，如條件培養(yǎng)基的活性，評價流體的細胞生長活性，參與特定譜系的貢獻，等等?？梢詰貌⑶铱梢栽O計多種系統(tǒng)來基于多種生理脅迫誘導前內(nèi)皮細胞的分化。使用內(nèi)皮ADAS細胞治療影響心血管系統(tǒng)的疾病、病癥或者狀況提供了額外的優(yōu)點，因為可以將內(nèi)皮ADAS細胞導入受體中而不需要免疫抑制劑。認為細胞的成功移植需要永久移入供體細胞而不誘導受體產(chǎn)生的移植物排斥免疫反應。通常，為了防止宿主排斥反應，使用非特異免疫抑制劑，如環(huán)胞菌素A、甲氨蝶呤、類固醇和FK506。這些藥劑每天施用并且如果停止施用，通常導致移植物排斥。然而，使用非特異免疫抑制劑的不希望的結果是它們通過抑制免疫應答的所有方面(一般性免疫抑制)起作用，從而極大地增加了受體對感染和其他疾病的易感性。本發(fā)明通過將內(nèi)皮ADAS細胞導入受體中而不需要免疫抑制劑，提供了治療影響心血管系統(tǒng)的疾病、病癥或者狀況的方法。本發(fā)明包括向受體中施用同種異體或者異源內(nèi)皮ADAS細胞，或者與受體在遺傳上不同的內(nèi)皮ADAS細胞，以為受體提供益處。本發(fā)明提供了當向受體施用內(nèi)皮ADAS細胞時，使用內(nèi)皮ADAS細胞治療疾病、病癥或者狀況而不需要使用免疫抑制劑的方法。因此移植的內(nèi)皮ADAS細胞引起受體對感染和其他疾病，包括和與免疫移植療法相關的狀況有關的癌癥的易感性降低。遺傳修飾本發(fā)明的細胞還可以用于表達外源蛋白或者分子用于治療目的或者用于追蹤它們在患者組織中的整合和分化的方法中。因此，本發(fā)明包括用于將外源DNA導入細胞，同時在所述細胞中表達該外源DNA的表達載體和方法，如例如在Sambrook等人(2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork),禾卩Ausubel等人(1997,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork沖所述的那些。分離的核酸可以編碼分子，一旦將它們置于患者中，所述分子用于追蹤細胞的遷移、整合和存活，或者它們可以用于在患者中表達突變的、缺陷或者功能異常的蛋白質(zhì)。用于追蹤的蛋白質(zhì)可以包括，但不限于綠色熒光蛋白(GFP)、任一種其他熒光蛋白(例如，增強的綠色、藍綠色、黃色、藍色和紅色熒光蛋白；Clontech，PaloAlto,CA))，或者本文別處公開的其他標記蛋白(例如，LacZ、FLAG-tag、Myc、His6，等等)。備選地，導入細胞中的分離的核酸可以包括，但不限于CFTR、氨基己糖苷酶、和本領域中公知的或者將在將來研發(fā)的其他基因治療策略。追蹤本發(fā)明細胞的遷移、分化和整合不限于使用從載體或者病毒表達的可檢測的分子。使用將允許定位移植的內(nèi)皮ADAS細胞的一系列探針可以確定細胞的遷移、整合、和分化。此類探針包括人特異性Alu的探針，Alu是豐富的轉座元件，每5000個堿基對中約存在一個，從而使得技術人員可以追蹤移植細胞的進展。通過使用本文別處詳述的細胞特異性標記，如，但不限于CD34、CD31、CD40、CD63等等的抗體或者核酸探針，可以進一步完成追蹤移植的細胞。本發(fā)明還包括內(nèi)源ADAS細胞，當向其中導入分離的核酸，并且由希望的核酸編碼的蛋白質(zhì)在該細胞中表達，其中該蛋白質(zhì)以前不存在于該細胞或者不在該細胞中表達或者其中它目前與導入分離的核酸之前相比以不同的水平或者在不同的環(huán)境下表達時，得到益處。這種益處可以包括這一事實，即提供了這樣的系統(tǒng)，其中可以在實驗室中在體外或者在細胞所處的哺乳動物中研究所希望的核酸的表達；這樣的系統(tǒng)，其中包含導入的核酸的細胞可以用作研究、診斷和治療工具，和系統(tǒng)，其中產(chǎn)生了哺乳動物模型，該模型用于開發(fā)在哺乳動物中針對所選疾病狀態(tài)的新的診斷和治療工具。表達目的分離的核酸的細胞可以用于為另一種細胞、組織或者完整哺乳動物提供分離的核酸的產(chǎn)物，其中較高水平的基因產(chǎn)物可以用于治療或者減輕與異常表達和/或活性有關的疾病、病癥或者狀況。因此，本發(fā)明包括表達目的分離核酸的內(nèi)皮ADAS細胞，其中增加的目的蛋白質(zhì)的表達、蛋白質(zhì)水平和/或活性可以用于治療或減輕與血管發(fā)生和/或血管生成有關的疾病、病癥或者狀況。內(nèi)皮ADAS細胞可以被遺傳改造以表達生血管因子，例如，VEGF，然后將改造的ADAS細胞施用到受體中。改造的ADAS細胞與沒有經(jīng)過遺傳修飾以表達這樣的因子的ADAS細胞相比，以更大量表達和分泌VEGF。在疾病、病癥或狀況的治療中使用影響血管發(fā)生和/或血管生成的遺傳修飾的內(nèi)皮ADAS細胞的益處是增強受體中存在的內(nèi)皮ADAS細胞的治療效果。增強的治療效果歸因于VEGF從改造的內(nèi)皮ADAS細胞的增加的分泌。隨著VEGF從被改造的內(nèi)皮ADAS細胞的增加的分泌，更大量的VEGF存在于鄰近細胞或者遠基細胞以從VEGF受益。此外，在受體中存在增加量的VEGF允許患者接受治療的時間范圍的縮短。將理解本文描述的方法可以以多種方式進行并且其具有本領域中公知的多種改變和更改。還理解作為細胞類型之間的作用或者相互作用方式給出的任何理論應當不被理解為以任何方式限制本發(fā)明，而是給出使得可以更充分地理解本發(fā)明的方法。下面的實施例進一步闡明本發(fā)明的方面。然而，它們決不以任何方式限制如本文給出的本發(fā)明的教導或者公開內(nèi)容。實施例l:建立原代ADAS培養(yǎng)物將來自通過吸脂得到的白色脂肪組織的基質(zhì)血管級分(SVF)用含有0.5。/。BSA和125口g/mLI型膠原酶(終濃度)的Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液在37X:消化80分鐘，以10分鐘間隔劇烈振動。消化后，將混懸液以1,200rpm在室溫離心5分鐘，劇烈振動然后再次以1,200rpm在室溫離心5分鐘。吸出脂質(zhì)/脂肪細胞層并丟棄，不擾動SVF沉淀。將沉淀用基質(zhì)細胞培養(yǎng)基(DMEM/F121:1，10%FBS，1X抗生素/抗真菌劑)重懸浮/洗滌，并重懸浮在總體積40mL的基質(zhì)細胞培養(yǎng)基中。將10mL該混懸液加入含有40mL基質(zhì)培養(yǎng)基的T-225瓶中。接種后1到3天洗出非貼壁細胞，并將培養(yǎng)基用補充5ng/mL人EGF、不存在抗生素/抗真菌劑的基質(zhì)細胞培養(yǎng)基替換。該培養(yǎng)基每3到4天更換。接種后14天收獲匯合的培養(yǎng)物并冷藏。將這些細胞稱作ADASO代(P0)。實施例2:處理ADAS細胞在兩個單獨的實驗中，將來自單個供體的ADAS(PO)細胞以約6xl03個細胞/cm2的密度接種在T-83瓶中(1代)。將對照ADAS細胞培養(yǎng)在包含DMEM/F12(1:1)、10%FBS、5ng/mLhEGF和1ng/mLhFGF的擴增培養(yǎng)基中，每2到4天更換培養(yǎng)基。將處理組中的ADAS細胞進行逐步處理方案，該方案開始6天在Mil培養(yǎng)基(DMEM/F12、N2補充物、B27補充物、2.3mM谷氨酰胺、10ng/mLhFGF)中，在接種后1、3和5天更換培養(yǎng)基。在第7天，將培養(yǎng)物用D-PBS漂洗兩次，然后將ADAS細胞在MIII培養(yǎng)基(DMEM/F12、N2補充物(Invitrogen,Carlsbad,CA)，B27補充物(Invitrogen，Carlsbad,CA),2.3mM谷氨酰胺、10mM煙酰胺、2%FBS)中培養(yǎng)4天。在第10天更換MIII并在第11天通過胰蛋白酶消化收獲對照和處理的ADAS細胞并進行流式細胞術。流式細胞術對對照和MII/MIII處理的細胞進行流式細胞術以進行表型表征并鑒定對MII/Min培養(yǎng)基處理方案的可能的細胞應答。對于接合的單克隆，將細胞用lmL流動洗滌緩沖液(lXDPBS，0.5%BSA禾卩0.1%疊氮化鈉)洗滌一次，并以約6000xg離心20秒。將細胞懸浮在1.3ml封閉緩沖液(含有25口g/ml小鼠Ig的洗滌緩沖液)中，在冰上溫育10分鐘，然后等分成100口L等分試樣。向它們各自的等分試樣中加入合適的單克隆抗體。包括合適的同種型對照組合以對應于實驗中使用的單克隆同種型組合。每個試管包括三種單克隆抗體。實驗中使用的抗體的濃度為銷售商推薦的濃度。用于ADAS細胞表型的抗體包括(除非另外指出，所有抗體都來自BD-Pharmingen,SanJose,CA):CD80(Caltag，Burlingame，CA),CD86(Caltag)、CD14;CD45、CD34、CD133(MiltenyiBiotech,Auburn,CA);CD90、CD105(Caltag)、HLA-DR;CD63、CD166、I類固C;CD44(CellSciences,Canton,MA)、CD73、CD54;CD31、CD13、CD40;CD29(Caltag)、CD49a、CDlla。所有試管都在冰上避光溫育30分鐘。將細胞用2mL洗滌緩沖液洗滌一次(約650xg5分鐘)，然后在200口L1X低聚甲醛中固定。對于未綴合的單克隆抗體，如本文別處描述的收獲、洗滌和封閉ADAS細胞。加入一級抗體(VEGFR2[KDR]和血管性血友病因子)(10口g/mL)并將細胞在冰上溫育約30分鐘。將細胞用2mL洗滌緩沖液洗滌一次(650xg5分鐘)并重懸浮在IOO口L洗滌緩沖液中。向含有一級抗體以及"僅二級抗體"對照的混懸液中加入濃度為0.5口g/mL的山羊抗小鼠PE綴合的二級抗體并將細胞在冰上避光溫育15分鐘。進行用2mL流動洗漆緩沖液的最終洗滌(650xg5分鐘)并如上述固定細胞。使用CELLQuest采集軟件(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)，在BectonDickinsonFACSCaliber流式細胞儀上設置的每種抗體獲得IO，OOO個事件(細胞)，并用FlowJo分析軟件(TreeStar,Ashland,OR)分析數(shù)據(jù)。形態(tài)學圖1顯示了未處理的和MII/MIII處理的ADAS培養(yǎng)物的顯微照片表示。在預處理的和未處理的對照培養(yǎng)物中觀察到紡錘形的成纖維細胞樣形態(tài)(圖1A和圖1B)，而在開始處理后4天，在Mil處理的培養(yǎng)物中觀察到形態(tài)學改變(圖1C和圖ID)。Mil處理的細胞在外觀上較不像成纖維細胞，有許多貼壁和不貼壁的圓形的相明亮的細胞。此外，在該階段的細胞似乎形成細胞與細胞連接的"網(wǎng)絡"。用Min進一步處理細胞再次改變了培養(yǎng)物的總體形態(tài)，得到與Mil處理期間看到的細胞相像的細胞和與培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞相像的形成"鵝卵石"型區(qū)域的細胞的異質(zhì)混合物(圖1E和IF)。表型表征使用針對通常由基質(zhì)、造血或內(nèi)皮譜系的細胞表達的多種分子的抗體，對對照和MII/MIII處理的ADAS細胞在表型上表征表面標記表達。表1顯示了該表征的結果(值為所列的表面標記的陽性染色細胞的百分比)。培養(yǎng)11天后，未處理的1代ADAS細胞表達CD13、CD29、CD31、CD40、CD44、CD49a、CD54、CD63、CD73、CD80、CD90、CD105、CD133、CD166、I類MHC、和VEGF受體2(flk-l)。當用MII/MIII方案處理時，在表達表面標記CD31(+56,5%)、CD34(+67.9%)、CD40(+27.4%)、CD63(+38.0%)、CD105(-25.3%)和CD166(-36.1%)的細胞的平均百分比中注意到顯著改變(>20%)。表l對照和MII/MIII處理的ADAS細胞的表型表征<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>*BG=背景_本文的公開內(nèi)容闡明了使用培養(yǎng)基處理方案處理未分化的ADAS細胞以得到內(nèi)皮ADAS細胞群體的新方法。盡管本文給出的細胞表型表征不包括所有潛在的內(nèi)皮細胞表面標記，但是觀察到通過本文公開的方法產(chǎn)生的細胞群體對于CD34(前內(nèi)皮細胞和造血干細胞的標記)和CD31(成熟內(nèi)皮細胞)是強陽性的，并且對于CD40和CD63是陽性的，這與對向內(nèi)皮細胞類型定型的表型表征相一致。本文給出的數(shù)據(jù)表明使用本文公開的方法從容易擴增的內(nèi)皮ADAS產(chǎn)生大量CD34+、CD31+前內(nèi)皮細胞以在臨床上使用。此外，本公開內(nèi)容允許使用本文所述的處理誘導內(nèi)皮細胞標記陽性表型在大規(guī)模環(huán)境中擴增內(nèi)皮ADAS細胞和生產(chǎn)前內(nèi)皮細胞的有吸引力的方法。此外，在處理的ADAS細胞上CD34和CD40以及CD80(程度較低)的表達提示還可以誘導造血前體細胞。將本文引用的每個專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容都完整引入本文作為參考。盡管參考具體實施方案公開了本發(fā)明，顯然本領域其它技術人員可以設計本發(fā)明的其他實施方案和變通方案而不背離本發(fā)明的真實精神和范圍。意在理解后附權利要求包括所有此類實施方案和等價變通方案。權利要求1.分離的脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞，其經(jīng)誘導而表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征。2.權利要求1的細胞，其中所述細胞經(jīng)誘導在體外分化。3.權利要求l的細胞，其中所述細胞經(jīng)誘導在體內(nèi)分化。4.權利要求l的細胞，其中已經(jīng)向所述細胞中導入外源遺傳物質(zhì)。5.權利要求l的細胞，其中所述細胞來自人。6.權利要求1的細胞，其中所述細胞表達CD34和CD31的至少一種。7.權利要求l的細胞，其中當與CD34和CD31各自從未經(jīng)誘導以表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的其他方面相同的ADAS細胞的表達水平相比時，所述細胞以更高水平表達CD34和CD31的至少一種。8.權利要求1的細胞，其中所述細胞表達CD34、CD31、CD40、CD63或其組合的至少一種。9.權利要求1的細胞，其中當與CD34、CD31、CD40和CD63各自從未經(jīng)誘導以表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的其他方面相同的ADAS細胞的表達水平相比時，所述細胞以更高水平表達CD34、CD31、CD40、CD63或其組合的至少一種。10.分化分離的脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞以表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的方法，該方法包括將所述細胞在Mil培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接著將所述細胞在MIII培養(yǎng)基中培養(yǎng)。11.權利要求10的方法，其中所述細胞來自人。12.權利要求10的方法，其中所述MII培養(yǎng)基包含N2補充物、B27補充物、谷氨酰胺和成纖維細胞生長因子(FGF)。13.權利要求12的方法，其中所述谷氨酰胺的濃度為約2.3mM。14.權利要求12的方法，其中所述FGF的濃度為約10ng/mL。15.權利要求10的方法，其中所述MIII培養(yǎng)基包含N2補充物、B27補充物、谷氨酰胺、煙酰胺和胎牛血清(FBS)。16.權利要求15的方法，其中所述谷氨酰胺的濃度為約2.3mM。17.權利要求15的方法，其中所述煙酰胺的濃度為約10mM。18.權利要求15的方法，其中所述FBS的濃度為約2X。19.用于將分離的脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞分化成顯示前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的細胞的分化培養(yǎng)基，其中向所述培養(yǎng)基補充N2補充物、B27補充物、谷氨酰胺和成纖維細胞生長因子(FGF)，此外其中將所述培養(yǎng)基稱作Mil培養(yǎng)基。20.權利要求19的培養(yǎng)基，其中所述谷氨酰胺的濃度為約2.3mM。21.權利要求19的培養(yǎng)基，其中所述FGF的濃度為約10ng/mL。22.用于將分離的脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞分化成顯示前內(nèi)皮細胞的至少一種特征的細胞的分化培養(yǎng)基，其中向所述培養(yǎng)基補充N2補充物、B27補充物、谷氨酰胺、煙酰胺和胎牛血清(FBS)，此外其中將所述培養(yǎng)基稱作Mill培養(yǎng)基。23.權利要求22的培養(yǎng)基，其中所述谷氨酰胺的濃度為約2.3mM。24.權利要求22的培養(yǎng)基，其中所述煙酰胺的濃度為約10mM。25.權利要求22的培養(yǎng)基，其中所述FBS的濃度為約2X。26.在動物中誘導血管發(fā)生的方法，其包括a)誘導分離的脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞以表達前內(nèi)皮細胞的至少一種特征；和b)對所述動物施用這樣誘導的所述細胞。27.權利要求26的方法，其中所述ADAS細胞從所述動物分離。28.權利要求26的方法，其中所述ADAS細胞從同種異體供體分離。29.權利要求26的方法，其中所述ADAS細胞從異源供體分離。30.權利要求26的方法，其中所述ADAS細胞來自人。31.確定化合物實現(xiàn)分離的脂肪組織來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞分化成前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的能力的方法，該方法包括-a)在基質(zhì)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述ADAS細胞一段時間；b)將所述基質(zhì)細胞培養(yǎng)基用包含化合物或者對照載體的分化培養(yǎng)基更換；c)在包含所述化合物或所述對照載體的所述分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述ADAS細胞一段時間；d)使用來自步驟C)的包含所述化合物的所述分化培養(yǎng)基確定分化細胞的數(shù)目或者百分數(shù)；e)使用來自步驟c)的僅含有所述載體的所述分化培養(yǎng)基確定細胞中分化細胞的百分數(shù)；f)比較來自步驟(d)和(e)的分化細胞的數(shù)目或百分數(shù)；g)與來自步驟(e)的分化細胞的百分數(shù)相比，來自步驟(d)的分化細胞的更大的百分數(shù)表明所述化合物能夠誘導所述ADAS細胞分化成前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞。32.權利要求31的方法，其中所述細胞來自人。全文摘要本發(fā)明包括脂肪來源的成年基質(zhì)(ADAS)細胞，其顯示出前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征。本發(fā)明還包括用于產(chǎn)生顯示出前內(nèi)皮細胞和/或內(nèi)皮細胞的至少一種特征的脂肪來源的成年基質(zhì)的組合物和方法。還包括在血管移植、組織改造、血管生成的調(diào)節(jié)、血管發(fā)生和包括心臟病的多種病癥的治療中使用所述細胞的方法。文檔編號C12N5/02GK101155912SQ200680010928公開日2008年4月2日申請日期2006年1月27日優(yōu)先權日2005年1月31日發(fā)明者詹姆斯·B·米切爾二世,詹姆斯·K·亨德里克斯申請人:同源治療公司