專利名稱：：RNAi表達(dá)構(gòu)建體的制作方法RNAi表達(dá)構(gòu)建體
背景技術(shù)：
：利用雙鏈RNA以序列特異性方式抑制基因表達(dá)徹底改革了藥物發(fā)現(xiàn)工業(yè)。在哺乳動(dòng)物中，RNA干擾，或RNAi通過(guò)被稱為小干擾RNAs(RNAi因子)的15到49個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙《連RNA分子介導(dǎo)。RNAi因子可以在細(xì)胞外化學(xué)或酶促合成，并隨后被遞送至細(xì)胞(參見(jiàn)，例如Fire,等人，Nature(自然),391:806-11(1998);Tuschl，等人，GenesandDev(基因與發(fā)育),13:3191-97(1999);和Elbashir，等人，Nature(自然)，411:494-498(2001));或者可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)?shù)妮d體在體內(nèi)表達(dá)(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利6,573,099)。作為有效治療劑應(yīng)用于人類的未^奮飾的RNAi因子的體內(nèi)遞送面臨許多技術(shù)難題。首先，由于細(xì)胞和血清的核酸酶，注射入體內(nèi)的認(rèn)A的半衰期只有約70秒(參見(jiàn)，例如Kurreck，Eur.J.Bioch(歐洲生化雜志).270:1628-44(2003》。通過(guò)使用化學(xué)修飾增加被注射的RNA的穩(wěn)定性的努力也進(jìn)行了嘗試；但是，在許多情況下，化學(xué)改變導(dǎo)致了細(xì)胞毒性效應(yīng)的增加。在一個(gè)具體的例子中，細(xì)胞對(duì)將每個(gè)第二個(gè)磷酸酯替代為硫代磷酸酯的RNAi雙鏈的劑量給藥是不能忍受的(Harborth，等人，AntisenceNucleicAcidRev.(反義4亥酸藥物回顧)13(2):83-105(2003))。其它的困難包括提供組織特異性的遞送，以及能夠遞送足以引發(fā)治療應(yīng)答的而沒(méi)有毒性的劑量的RNAi因子。已經(jīng)開(kāi)發(fā)RNAi的遞送有幾種選^奪，其包括使用以病毒為基礎(chǔ)的和不以病毒為基礎(chǔ)的、可以感染或是以其它方式轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，并遞送和原位表達(dá)RNAi分子的載體系統(tǒng)。通常，小RNAs從病毒或非病毒載體骨架作為短發(fā)夾RNA(shRNA)前體轉(zhuǎn)錄得到。一旦被轉(zhuǎn)錄，假定shRNA^皮核糖核酸降解酶(enzymeDicer)加工成適當(dāng)?shù)幕钚訰NAi因子。以病毒為基礎(chǔ)的遞送的途徑嘗試開(kāi)發(fā)病毒的靶向特性以產(chǎn)生組織特異性，一旦被適當(dāng)?shù)匕蚁?，依靠?jī)?nèi)源性的細(xì)胞機(jī)制產(chǎn)生足夠水平的RNAi因子以達(dá)到治療有效劑量。RNAi治療劑的一種有益用途是用做抗病毒因子。概括而言，RNA病毒依靠RNA依賴性的RNA聚合酶進(jìn)行復(fù)制。該RNA聚合酶以相對(duì)低的保真度復(fù)制病毒基因組，其功能性的后果是產(chǎn)生具有異常大量毒因子的、進(jìn)化了的病毒體后代。因此，與觀察到的小分子治療劑的效應(yīng)相似，RNAi治療劑的相應(yīng)效力和效果作為在長(zhǎng)期治療過(guò)程中病毒進(jìn)化的結(jié)果而降低了。在一個(gè)研究中，在遞送表達(dá)的shRNA35天后，出現(xiàn)了含有單核苷酸改變的HIV逃避變異抹(Boden,等人，LVirol.(病毒學(xué)雜志).77(21):11531-11535(2003))。在另一個(gè)研究中，在被預(yù)先合成的RNAi轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，在細(xì)胞感染短短54小時(shí)以內(nèi)就可以檢測(cè)到脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)逃避變異林(Gitlin等人JLVirol.(病毒學(xué)雜志)2005Jan;79(2):1027-35)。同樣地，其它可能的RNAi耙目標(biāo)，例如涉及肺瘤的基因具有序列可變異性。同時(shí)抗多個(gè)序列的兩種或多種RNAi的遞送可以對(duì)利用基因變異而抗抑制的任何疾病提供更好效果的治療。在本領(lǐng)域需要發(fā)展可以遞送多個(gè)RNAi因子的、穩(wěn)定的、有效的、表達(dá)RNAi因子。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及將RNAi因子遞送到組織、器官，或細(xì)胞以治療各種疾病或功能紊亂的基因構(gòu)建體。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了新型的含有兩種或更多種用于調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的RNAi因子的核酸分子。在另一方面，本發(fā)明提供了含有啟動(dòng)子和兩種或更多種彼此被間隔子結(jié)構(gòu)分隔的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的表達(dá)盒(以下稱為l-xRNA表達(dá)盒)。本發(fā)明在另一個(gè)方面提供了能夠調(diào)節(jié)表達(dá)一種或多種基因的基因構(gòu)建體，其中所述基因構(gòu)建體包括兩種或多種從單個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出的RNAi因子。同時(shí)，本發(fā)明的其它方面包括在組織、細(xì)胞或器官中治療疾病或功能紊亂的方法，所述方法通過(guò)從單個(gè)啟動(dòng)子表達(dá)兩種或多種RNAi因子以調(diào)節(jié)在細(xì)胞組織或器官中的基因表達(dá)?？梢詤⒄崭綀D中描述的實(shí)施例獲得在上文所筒要概括的本發(fā)明的更詳細(xì)的描述，以獲得并詳細(xì)地理解包括本發(fā)明上述的特征、優(yōu)點(diǎn)和目的的方式。但是，應(yīng)該注意的是，附圖只說(shuō)明了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，因此不能被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明范圍的限制，因?yàn)楸景l(fā)明可以包括其它具有等同效果實(shí)施例。圖1是根據(jù)本發(fā)明將l-xRNAi表達(dá)盒遞送到相關(guān)細(xì)胞、組織或器官的一個(gè)實(shí)施方案的簡(jiǎn)化模塊圖。圖2A,2B,和2C顯示根據(jù)本發(fā)明的l-xRNAi表達(dá)盒的三個(gè)實(shí)施方案。圖3A和3B顯示用于產(chǎn)生將含l-xRNAi表達(dá)盒的構(gòu)建體遞送到相關(guān)細(xì)胞、組織或器官的病毒粒子的可選擇的方法。圖4顯示了在本文描述的實(shí)施例中使用的1-3RNAi表達(dá)盒的示意圖。根據(jù)預(yù)先設(shè)定的人為控制(artgovening)的RNA千擾才幾理作用，在每一種構(gòu)建體下面列出了siRNA活性的預(yù)期結(jié)果。圖5顯示了本發(fā)明的1-3RNAi表達(dá)盒構(gòu)建體對(duì)含HCV5'-8靶序列的Luc-HCV融合報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體的抑制結(jié)果。圖6顯示了本發(fā)明的1-3RNAi表達(dá)盒構(gòu)建體對(duì)含HCV編碼-12靶序列的Luc-HCV融合報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體的抑制結(jié)果。圖7顯示了在HCV基因組中所選擇的RNAi靶序列的位置的示意圖。十個(gè)保守的靶序列被鑒定為位于HCVIRES區(qū)，十二個(gè)位于ORF(開(kāi)放閱讀框)內(nèi)，八個(gè)位于3'非編碼區(qū)(3'UTR)。同時(shí)顯示了用于評(píng)價(jià)l-xRNAi抑制的Luc-HCV融合才艮導(dǎo)子構(gòu)建體。圖8顯示了用于評(píng)價(jià)l-xRNAi抑制的Luc-HCV融合報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體。圖9顯示通過(guò)體外產(chǎn)生的被轉(zhuǎn)染的RNA種類抑制一系列含有耙序列的Luc-HCV融合報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體的結(jié)果。使用含有本發(fā)明的1-3RNAi表達(dá)盒構(gòu)建體的DNA模板通過(guò)T7RNA聚合酶從失控轉(zhuǎn)錄(run-offtranscription)反應(yīng)獲得RNA。具體實(shí)施例方式在描述本組合物和方法之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體的方法學(xué)、產(chǎn)物、儀器和因素。因?yàn)?，這樣的方法、儀器和制劑當(dāng)然可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解的是在這里使用的術(shù)語(yǔ)只是出于描述具體實(shí)施方案的用途，并不意在限制本發(fā)明的范圍，只有所附的權(quán)利要求限制本發(fā)明的范圍。如在本文所使用的,單數(shù)形式"一(a)","—(an)"，和"該(the)"包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文另有清楚的指示。因而，例如，所提及的"一因素(afactor)"是指一個(gè)因素或多個(gè)因素的混合。并且所提及的"生產(chǎn)方法"包括是指本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等同的步驟和方法，等等。除非另有限定，在本文使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文所述及的所有出版物通過(guò)引用沒(méi)有限制地被并入本文，以用于描述和公開(kāi)在出版物中所描述的，并可以與所描述的本發(fā)明結(jié)合使用的設(shè)備、制劑和方法。在以下的描述中，提供了大量具體的詳細(xì)資料以便于對(duì)本發(fā)明有更完全的理解。但是，沒(méi)有這些詳細(xì)資料的一種或多種，實(shí)施本發(fā)明對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見(jiàn)的。在另外的情況下，為了避免使本發(fā)明不清楚，沒(méi)有描述公知特征和本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的步驟。本發(fā)明涉及到新型的、活性強(qiáng)烈的基因組合物和使用新型RNAi盒治療疾病或功能紊亂的方法。通常，本發(fā)明應(yīng)用了本
技術(shù)領(lǐng)域：
范圍內(nèi)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)、和病毒學(xué)的方法。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到了全面地解釋，參見(jiàn)，例如Maniatis,Fritsch和Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(1982);DNACloning:APracticalApproach(DNA克隆:實(shí)踐方法)，巻I和II(D.N.Glover,編輯.1985);OligonucleotideSynthesis(寡核苷S羑合成)(M.J.Gait,編輯.1984);NucleicAcidHybridization(核酸雜交)(B.D.Hames和S.J.Higgins，編輯.(1984));AnimalCellCulture(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))(R.I.Freshney,編輯.1986);和脂AViruses:ApracticalApproach(RNA病毒:實(shí)踐方法)，(Alan，J.Cann,編輯，OxfordUniversityPress(牛津大學(xué)出版社),2000)。"載體"為復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體、病毒構(gòu)建體或科斯質(zhì)粒(cosmid),在其上可以連接另一DNA片段。載體被用于在細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)DNA片段。術(shù)語(yǔ)"構(gòu)建體"和"l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體"通常是指與l-xRNAi表達(dá)盒結(jié)合的載體。"啟動(dòng)子"或"啟動(dòng)子序列"是能夠結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶，并且啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄多聚核苷酸或多肽編碼序列的DNA調(diào)節(jié)區(qū)，所述多聚核苷酸或多肽編碼序列例如為信使RNA,核糖體RNA,小核或核仁RNA或由任何種類的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的任何類型的RNA。當(dāng)外源性或異質(zhì)性核酸或載體^^皮導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，例如以與轉(zhuǎn)染試劑混合或被包裝入病毒粒子中方式，則細(xì)胞被這種核酸"轉(zhuǎn)化"，"轉(zhuǎn)導(dǎo)"或"轉(zhuǎn)染"。轉(zhuǎn)化DNA可以(共價(jià)結(jié)合)整合入細(xì)胞的基因組，也可以不整合入細(xì)胞的基因組。對(duì)于真核細(xì)胞而言，穩(wěn)定的被轉(zhuǎn)化細(xì)胞就是在其中轉(zhuǎn)化DNA已經(jīng)整合入宿主細(xì)胞染色體或被保持在染色體外，以使轉(zhuǎn)化DNA在細(xì)胞復(fù)制期間被遺傳給子代細(xì)胞的細(xì)胞，或者是在其中存在穩(wěn)定的游離體的不復(fù)制的，差異的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"RNA干擾"或"RNAi"通常是指一種方法，其中雙鏈RNA分子改變與雙鏈或短發(fā)夾RNA分子享有基本或全部的同源性的核酸序列的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"RNAi因子"是指引發(fā)RNAi的RNA序列；術(shù)語(yǔ)"ddRNAi因子"是指從載體轉(zhuǎn)錄的RNAi因子。術(shù)語(yǔ)"短發(fā)夾RNA"或"shRNA"是指具有一雙鏈區(qū)域和一環(huán)區(qū)的RNA結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，ddRNAi因子起始表達(dá)為shRNA。術(shù)語(yǔ)"l-xRNAi表達(dá)盒"是指根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，具有一個(gè)啟動(dòng)子和xRNAi構(gòu)建體的盒，其中x為二或三或四或五或更多，因而為l-2，1-3,1-4,1-5,等的RNAi表達(dá)盒。RNAi因子被起始表達(dá)為shRNA，并包括兩種或多種被一個(gè)或多個(gè)間隔子區(qū)域分隔開(kāi)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)"l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體"或"l-xRNAi表達(dá)載體"是指含有l(wèi)-xRNAi表達(dá)盒的載體?；蚧蚝塑账嵝蛄械?衍生物"是指含有與基因或核苷酸序列或是其一部分具有顯著的序列相似性的任何單獨(dú)的核酸分子。另外，'嗜亍生物"包括這種含有修飾的核苷酸或天然存在的核香酸的類似物的單獨(dú)的核酸。圖1是顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的方法步驟的簡(jiǎn)單流程圖，其中可以使用l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體。所述方法包括步驟200,在該步驟中，構(gòu)建了靶向疾病或功能紊亂的l-xRNAi表達(dá)盒。然后，在步驟300中，將l-xRNAi表達(dá)盒連接入適當(dāng)?shù)牟《具f送構(gòu)建體內(nèi)。之后在步驟400中將病毒l-xRNAi表達(dá)遞送構(gòu)建體包裝入病毒粒子中，并且在步驟500中將病毒粒子遞送到相關(guān)的細(xì)胞、組織或器官。在下文將提供這些每一個(gè)步驟和所涉及組分的細(xì)節(jié)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的大量不同的方法合成或酶促產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的以病毒為基礎(chǔ)的1—xRNAi表達(dá)構(gòu)建體，并且根據(jù)例如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))第二版，ColdSpringHarborPress(冷泉港出版社)，ColdSpringHarbor(冷泉港)，紐約(1989)的描述，以及^t安照在例如美國(guó)i^康安全服務(wù)部(HHS),國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)關(guān)于重組DNA研究準(zhǔn)則的規(guī)定，使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)進(jìn)行純化。圖2A和圖2B是根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案分別含有三個(gè)和五個(gè)不同的RNAi莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的1-3和1-5RNAi表達(dá)盒的簡(jiǎn)化示意圖。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該懂得本發(fā)明的l-xRNAi表達(dá)盒可以包括兩個(gè)，四個(gè)，六個(gè)或更多個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，并且以在本圖中所顯示出的實(shí)施方案是示例性的。這些圖顯示了含有三個(gè)和五個(gè)由間隔子區(qū)域分隔的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的1-3和1-5RNAi表達(dá)盒的實(shí)施方案。莖區(qū)1-5含有約17-21個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選地為19個(gè)堿基對(duì)。環(huán)區(qū)1-5含有約3-20個(gè)核苦酸，優(yōu)選地為5至9個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地為6個(gè)核苷酸。在RNAi莖之間的間隔子區(qū)域(NPN2.".)在約4-10核苷酸之間，優(yōu)選地為6核苷酸。圖2C顯示了含有三個(gè)具有17-21個(gè)堿基對(duì)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，和一具有含2-17個(gè)之間的堿基對(duì)的更短莖區(qū)的第四莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的本發(fā)明l-xRNAi盒的一個(gè)具體實(shí)施方案。下文是本發(fā)明的多個(gè)發(fā)夾盒的序列的例子ggatccGTGCACGGTCTACGAGACCTCgaagcttgGAGGTCTCGTAGACCGTGCAtgtacaGCGAAAGGCCTTGTGGTACTgaagcttgAGTACCACAAGGCCTTTCGCccatggATTGGAGTGAGTTTAAGCTgaagcttgAGCTTAAACTCACTCCAATtttttctaga(序列號(hào)57).當(dāng)使用l-xRNAi表達(dá)盒時(shí)，含有盒的兩種或多種RNAi因子都具有不同的序列；它們是RNAil，RNAi2，RNAi3,RNAi4和RNAi5，例如它們彼此都不相同。另外，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在l-xRNAi子元件來(lái)源于其所天然存在的同一基因。使用分子技術(shù)，或其它技術(shù)，在本發(fā)明一些實(shí)施方案中使用的啟動(dòng)子可以是組織特異性或細(xì)胞特異性的。術(shù)語(yǔ)"組織特異性"在用于啟動(dòng)子時(shí)是指能夠介導(dǎo)針對(duì)特異類型的組織的相關(guān)核苷酸序列的選擇性表達(dá)，所述核苷酸序列在不同類型的組織(例如腦)中相對(duì)缺乏相關(guān)的同樣核苷酸序列的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞特異性"在用于啟動(dòng)子時(shí)是指能夠介導(dǎo)相關(guān)核苷酸序列在特異類型的細(xì)胞中的選擇性表達(dá)的啟動(dòng)子，在相同組織內(nèi)的不同類型的細(xì)胞中相對(duì)缺乏相關(guān)的同樣核苷酸序列的表達(dá)(參見(jiàn)，例如Higashibata,等人，J.BoneMiner.Res(骨礦研究雜志)Jan19(1):78-88(2004);Hoggatt,等人，Circ.Res.(循環(huán)研究)，Dec.91(12):1151-59(2002);Sohal,等人，Circ.Res.Jul89(l):20-25(2001);和Zhang,等人，GenomeRes(基因組研究).Jan14〖l):79-89(2004))。術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞特異性"在用于啟動(dòng)子時(shí)也意指能夠促進(jìn)相關(guān)核苷酸序列在單一組織內(nèi)的某一區(qū)域內(nèi)的選擇性表達(dá)的啟動(dòng)子?？蛇x擇地，啟動(dòng)子可以是構(gòu)成性的或可調(diào)節(jié)性的。另外，可以修飾啟動(dòng)子以具有不同的特異性。術(shù)語(yǔ)"構(gòu)成性"在用于啟動(dòng)子時(shí)是意指能夠在缺乏特異性刺激(例如熱休克，化學(xué)制劑，光，等)時(shí)，介導(dǎo)可操作地被連接的核酸序列的轉(zhuǎn)錄。通常，構(gòu)成性啟動(dòng)子能夠介導(dǎo)基本上任何細(xì)胞和任何組織中編碼序列的表達(dá)。用于轉(zhuǎn)錄RNAi因子的啟動(dòng)子優(yōu)選地是構(gòu)成性啟動(dòng)子，例如由RNA聚合酶II控制的泛素、CMV、p-肌動(dòng)蛋白、組蛋白H4、EF-1alfa或pgk基因的啟動(dòng)子，或由RNA聚合酶I控制的啟動(dòng)子元件。在其它實(shí)施方案中，使用了PolII啟動(dòng)子，例如CMV、SV40、Ul、(3-肌動(dòng)蛋白或雜合的PolII啟動(dòng)子。在其它實(shí)施方案中，使用了由RNA聚合酶III控制的啟動(dòng)子元件，例如U6啟動(dòng)子(例如U6-1，U6-8,U6-9)、Hl啟動(dòng)子、7SL啟動(dòng)子、人Y啟動(dòng)子(hYl,hY3，hY4(參見(jiàn)Maraia,等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)22(15):3045-52(1994))和hY5(參見(jiàn)Maraia，等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)24(18):3552-59(1994))、人MRP-7-2啟動(dòng)子、腺病毒VA1啟動(dòng)子、人tRNA啟動(dòng)子、5s核糖體RNA啟動(dòng)子，以及這些啟動(dòng)子功能性的雜合和組合。可選擇地，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選選擇可以誘導(dǎo)包含在1-xRNAi表達(dá)盒中的多個(gè)RNAi因子表達(dá)的啟動(dòng)子。在本領(lǐng)域已知大量的使用這種啟動(dòng)子的用于可誘導(dǎo)表達(dá)的系統(tǒng)，包括但不限于四環(huán)素應(yīng)答系統(tǒng)和lac操縱子-抑制子系統(tǒng)(參見(jiàn)出版物WO03/022052Al;和美國(guó)專利出版物2002/0162126Al)、蛻皮素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，或由糖皮質(zhì)激素、黃體酮、雌激素、RU-486、類固醇、甲狀腺激素、環(huán)AMP、細(xì)胞因子、鈣化醇家族調(diào)節(jié)子調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，或金屬硫蛋白啟動(dòng)子(由無(wú)機(jī)金屬調(diào)節(jié))。在l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體中也可以存在一種或多種增強(qiáng)子以增加相關(guān)基因的表達(dá)。適于在本發(fā)明的實(shí)施方案中使用的增強(qiáng)子包括最近被描述的ApoEHCR增強(qiáng)子、CMV增強(qiáng)子(參見(jiàn)，Xia等人，NucleicAcidsRes(核酸研究)31-17(2003))，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它增強(qiáng)子。在本發(fā)明中使用的遞送RNAi因子的l-xRNAi表達(dá)盒具有兩個(gè)或更多個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，在所述結(jié)構(gòu)中，每一個(gè)莖的雙鏈RNA的末端由單鏈、環(huán)RNA連接。由本發(fā)明的l-xRNAi表達(dá)盒編碼的RNAi序列導(dǎo)致表達(dá)小的干擾RNA,所述干擾RNA為短的雙鏈RNA,在通常的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中沒(méi)有毒性。對(duì)本發(fā)明l-xRNAi表達(dá)盒的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限定，只要其不顯示細(xì)胞毒性即可。RNAi的長(zhǎng)度可以是17到21個(gè)bp(堿基對(duì))，并且更優(yōu)選地為19bp的長(zhǎng)度。RNAi雙鏈或莖部分可以是完全同源的，或可以含有由于序列錯(cuò)配而形成的非配對(duì)部分(每一條鏈上的對(duì)應(yīng)核苷酸不互補(bǔ))，凸起(在一條鏈上缺乏相對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)核苷酸)，等等。這種非配對(duì)部分可以容忍至其不顯著干擾RNAi雙《連的形成或功效的程度。shRNA單鏈環(huán)部分的長(zhǎng)度可以是3到20個(gè)核苷酸，并且優(yōu)選地為5到9個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。在本發(fā)明表達(dá)盒中的兩種或多種RNAi因子的莖結(jié)構(gòu)的序列可以是相同或不同的，但是在每一個(gè)l-x表達(dá)盒中的RNAi因子的序列經(jīng)常彼此不同。同樣，在l-xRNAi表達(dá)盒中的不同RNAi因子的莖和環(huán)的長(zhǎng)度可以與1-xRNAi盒中的其它莖和/或環(huán)的長(zhǎng)度相同或不同。本發(fā)明的兩個(gè)或更多個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)被間隔子區(qū)分隔。間隔子區(qū)由核苷酸組成，所述核普酸可以是天然存在的也可以是合成的。在莖-環(huán)結(jié)構(gòu)之間的間隔子區(qū)的長(zhǎng)度可以為約4到10個(gè)核苷酸，并且優(yōu)選地為約6個(gè)核苷酸。在本發(fā)明表達(dá)盒中的三個(gè)或更多個(gè)RNAi因子之間的間隔子區(qū)可以具有相同的序列或不相同的序列，并且可以是相同或不同的長(zhǎng)度。作為本發(fā)明l-xRNAi表達(dá)盒靶向的核酸序列包括病毒基因、癌基因、細(xì)菌基因、發(fā)育基因，并且基于基因序列的遺傳序列進(jìn)行選擇；并且優(yōu)選地基于保守的基因序列區(qū)域。用于對(duì)比的序列對(duì)比(alignment)的方法和RNAi序列選擇的方法在在本領(lǐng)域是公知的?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法確定兩種或多種序列之間的一致性百分比。優(yōu)選地，這種數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)施例是Myers和Miller的算法(1988);Pearson和Lipman的相似性4叟索法(search—for-similarity—method)(1988);以及Karlin和Altschul(1993)的方法。優(yōu)選地，使用計(jì)算機(jī)完成這些數(shù)學(xué)算法。這些操作包括，但是不限于PC/Gene程序中的CLUSTAL(可從Intelligenetics，MountainView,加利福尼亞州獲得)；ALIGN程序(2.0版本)，GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA,Megalign(使用JotunHein,Martinez,Needleman-Wunsch算法),DNAStarLasergene(參見(jiàn)www血astar.com)和威斯康星遺傳學(xué)軟件包(WisconsingeneticsSoftwarePackage)中的TFASTA,第8版(可從GeneticsComputerGroup(GCG)獲得，575ScienceDrive,威斯康星州麥迪遜，美國(guó))?？梢允褂萌笔?shù)或由操作員選擇參數(shù)進(jìn)行使用這些程序的對(duì)比。Higgins詳細(xì)地描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序基于Myers和Miller的算法；BLAST程序基于Karlin和Altschul的算法。用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)公開(kāi)獲4尋。對(duì)于序列比較，通常由一種序列作為檢測(cè)序列被比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將檢測(cè)序列和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，如果需要，指定子序列等同物，并指定序列算法程序參數(shù)。隨后序列比致性百分比。通常，RNAi對(duì)耙序列的抑制需要靶序列和RNAi分子的正義鏈之間具有高度的序列同源性。在一些實(shí)施方案中，這種同源性高于約70%,并且可以高于約75%。優(yōu)選地，同源性高于約80%,并且高于85%或甚至90%。更為優(yōu)選地，在靶序列和RNAi的正義鏈之間的序列同源性高于約90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%。在l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體用于靶向病毒感染的實(shí)施方案中，在病毒的各種亞種的基因組之間，甚至在保守區(qū)之間，15到30個(gè)連續(xù)核苷酸的序列同源性也可以達(dá)不到90%以上或甚至80%以上。在這樣的情況下，在一些亞種的耙序列和RNAi的正義《連之間的序列同源性可以為80%或更低。在另一方面，當(dāng)生物體的靶向基因在種、亞種或變異抹之間不顯示出高度序列同源性時(shí)，本發(fā)明l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體的實(shí)施方案特別有益，因?yàn)樵?-xRNAi表達(dá)盒中的每一個(gè)ddRNAi因子可以用于定位于靶基因或變異抹的亞型、亞種或變異的等位序列的不同部位。當(dāng)前抗病毒療法的主要問(wèn)題的是出現(xiàn)了抗性變異抹，即通常所知的逃逸變異林(Gitlin等人J.ofVirol(病毒學(xué)雜志).79;1027-1035,2005)。本發(fā)明在一個(gè)方面中和了出現(xiàn)的逃逸變異林。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，基于因感染細(xì)胞RNAi單個(gè)序列的治療而出現(xiàn)逃逸變異抹，選擇多個(gè)RNAi序列治療病毒感染。在細(xì)胞被病毒感染后，通過(guò)含RNAi單一序列的表達(dá)構(gòu)建體的治療確定出現(xiàn)的逃逸變異抹。收獲含有出現(xiàn)的抗性病毒的細(xì)胞，并且對(duì)病毒基因組進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序顯示出引起抵抗病毒抑制的重要突變。產(chǎn)生出本發(fā)明的1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體含有基于靶基因的遺傳序列和《1起抗RNAi治療的點(diǎn)突變的另外序列的RNAi序列。除了基于基因的保守區(qū)選擇RNAi序列，可以基于其它因素選擇RNAi序列。盡管基于想定的靶序列的特征，對(duì)在RNAi中有效的識(shí)別序列的選擇標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)進(jìn)行了大量嘗試(例如GC含量百分比，距翻譯起始密碼子的位置，或基于電子序列(silicosequence)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所提出的RNAi的類似物的搜索的序列相似性，熱力學(xué)配對(duì)標(biāo)準(zhǔn))，但目前不可能對(duì)千變?nèi)f化的序列中哪一個(gè)作為相對(duì)于基因的，實(shí)際上是引發(fā)最佳的RNA靜息應(yīng)答的候選RNAi序列作出有把握的預(yù)計(jì)(盡管這種途徑有所進(jìn)展目前Dharmacon公司聲稱有70%的成功率)。取而代之的是，通常合成單獨(dú)的具體的候選RNAi多聚核苷酸序列，并檢測(cè)在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，1-xRNAi表達(dá)盒的ddRNAi因子編碼區(qū)可"t喿作地與終止子元件相連。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用polIII啟動(dòng)子，終止子包括一段四個(gè)或更多個(gè)胸腺嘧咬殘基。其它的終止子包括SV40聚A,AdVAl基因，5S核糖體RNA基因，和人t-RNA。另外，啟動(dòng)子和終止子可以混合和匹配，例如通常將RNApolII啟動(dòng)子和終止子混合和匹配。另外，1-xRNAi表達(dá)盒可以在總體上被配置成分布有多個(gè)克隆位點(diǎn)和/或特定的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以使啟動(dòng)子，ddRNAi因子和終止子元件能被容易地移除或替換。可以使用在總體上分布的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和/或互補(bǔ)粘性末端，由小的寡核香酸組分裝配l-xRNAi表達(dá)盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的一個(gè)方法的基本載體由具有多重連接子的質(zhì)粒構(gòu)成，在所述多重連接子上所有的位點(diǎn)都是唯一的(盡管這并不絕對(duì)必需)。接著，在一皮設(shè)定的各唯一位點(diǎn)之間插入啟動(dòng)子產(chǎn)生具有可以改變方向的啟動(dòng)子的基本盒。接著，將退火引物對(duì)插入唯一的位點(diǎn)之間，所述位點(diǎn)位于產(chǎn)生單個(gè)、兩個(gè)或多個(gè)l-xRNAi表達(dá)盒構(gòu)建體的單體的下游。插入體可以一皮移動(dòng)入，例如^f吏用側(cè)端與單一、兩個(gè)或多個(gè)的l-xRNAi表達(dá)盒插入體相連的兩個(gè)唯一的酶切位點(diǎn)將插入體移動(dòng)入例如載體主鏈中。在圖1的步驟300中，l-xRNAi表達(dá)盒被連接入遞送載體。被插入有l(wèi)-xRNAi表達(dá)盒，并被用于在不同細(xì)胞類型中高效轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)1-xRNAi表達(dá)盒的所述載體可源自于病毒并適合于病毒遞送；可選擇地，可以使用非病毒載體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的任何合適的基因工程技術(shù)完成所產(chǎn)生的含有載體和l-xRNA表達(dá)盒的構(gòu)建體的制備，所述技術(shù)包括但不限于，PCR,寡核香酸合成，限制性核酸內(nèi)切酶消化，連接，轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒純化和DNA測(cè)序的標(biāo)準(zhǔn)纟支術(shù)。如果構(gòu)建體以病毒構(gòu)建體為基礎(chǔ)，載體優(yōu)選地包括，例如，將l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體包裝入病毒粒子的必需序列和/或?qū)-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體整合入靶細(xì)胞基因組的序列。病毒構(gòu)建體也可以包括允許病毒復(fù)制和增殖的基因，盡管在其它實(shí)施方案中，可以以反式(infra似)提供這樣的基因。另外，病毒構(gòu)建體可以包含以天然形式或經(jīng)修飾被整合入的、來(lái)源于任何已知生物體的基因組的基因或遺傳序列。例如，優(yōu)選的病毒構(gòu)建體可以包括用于在細(xì)菌中復(fù)制構(gòu)建體的序列。構(gòu)建體也可以含有另外的遺傳元件?？梢园ㄔ跇?gòu)建體內(nèi)的元件類型沒(méi)有任何形式的限制，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，附加的遺傳元件可以包括報(bào)導(dǎo)基因，例如一種或多種用基因，用于諸如GFP或RFP的熒光標(biāo)記蛋白；易于4全測(cè)的酶，例如(3-半乳糖香酶，熒光素酶，(3-葡萄糖苷酸酶，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶或分泌的胚胎石咸性磷酸酶；或可以容易地獲得用于免疫檢測(cè)的蛋白，例如激素或細(xì)胞因子?？梢杂糜诒景l(fā)明實(shí)施方案的其它遺傳元件包括那些編碼可以賦予細(xì)胞以選擇性生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的遺傳元件，例如腺苷脫氨基酶，氨基糖苦磷酸轉(zhuǎn)移酶，二氫葉酸還原酶，潮霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶，藥物抗性，或提供營(yíng)養(yǎng)缺陷型所丟失的生物合成能力的蛋白的編碼基因。如果一起包括報(bào)導(dǎo)基因與l-xRNAi表達(dá)盒，則可以包括內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列。優(yōu)選地，另外的遺傳元件可操作性地與獨(dú)立的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子連接并被其控制。另外，可以使用在細(xì)菌中用于構(gòu)建體增殖的適合的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起始序列通常與l-x表達(dá)盒和其它要在相關(guān)細(xì)胞，組織，或器官中表達(dá)的序列相分開(kāi)。這樣的復(fù)制起始在本領(lǐng)域是公知的，并且包括pUC，CoIEI,2-微米(2-micron)或SV40復(fù)制起點(diǎn)?；谌魏芜m當(dāng)病毒的病毒遞送系統(tǒng)可以用于遞送本發(fā)明的1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體。另夕卜，也可以使用雜合病毒系統(tǒng)。根據(jù)不同的參數(shù)選擇病毒遞送系統(tǒng)，例如遞送入相關(guān)細(xì)胞，組織，或器官的效率，系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，致病性，相關(guān)的免疫性和毒性，等等。已知沒(méi)有單一的病毒系統(tǒng)適合于所有應(yīng)用。當(dāng)選擇在本發(fā)明中使用的病毒遞送系統(tǒng)時(shí)，選擇系統(tǒng)重要的是，其中，含有1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體的病毒粒子優(yōu)選地為l)可復(fù)制性和可穩(wěn)定增殖；2)可以純化到高滴度；和3)可以介導(dǎo)靶向遞送(將1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體遞送到相關(guān)細(xì)胞，組織，或器官，而沒(méi)有廣泛擴(kuò)散)。通常，在基因治療中五個(gè)最常用的病毒系統(tǒng)種類根據(jù)其基因組是否被整合入宿主細(xì)胞染色質(zhì)(腫瘤逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒)或主要作為染色體外游離體持續(xù)存在于細(xì)胞核中(腺相關(guān)病毒，腺病毒和皰滲病毒)可以被分為兩類。如果在活躍地分裂的細(xì)胞中需要維持穩(wěn)定的遺傳改變，則將選擇整合載體為工具。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用來(lái)自細(xì)小病毒科的病毒。細(xì)小病毒科是小單鏈，非包膜DNA病毒家族，其基因組約為5000核苷酸長(zhǎng)度。包括在該家族中的成員為腺相關(guān)病毒(AAV),依賴型細(xì)小病毒，其根據(jù)定義需要與另一病毒(通常為腺病毒或皰滲病毒)共感染以啟動(dòng)和維持增殖性的感染循環(huán)。在缺乏這種輔助性病毒時(shí)，AAV仍然可以通過(guò)受體介導(dǎo)的結(jié)合和內(nèi)在化而感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，穿入分裂細(xì)胞或非分裂細(xì)胞中的細(xì)胞核。一旦在細(xì)胞核中，病毒去衣殼，并且轉(zhuǎn)基因以不同形式被表達(dá)一最穩(wěn)定的形式為環(huán)狀單體。AAV被整合入1-5%的被穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞基因組中(Nakai,等人，J.Virol.(病毒學(xué)雜志)76:11343-349(2002)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)的表達(dá)可以異常的穩(wěn)定，并且在一個(gè)與AAV—起遞送IX因子的研究中，在一單次與病毒直接融合后，狗模型持續(xù)表達(dá)治療水平的蛋白超過(guò)5.0年。因?yàn)樵谌狈o助病毒時(shí)，AAV感染不產(chǎn)生后代病毒，轉(zhuǎn)導(dǎo)的范圍被限制為僅感染病毒的原始細(xì)胞。正是該特征使AAV成為本發(fā)明優(yōu)選的基因治療載體。另外，與反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，和單純皰滲病毒不同，AAV顯示出缺乏對(duì)人的致病性和毒性(Kay,等人，Nature(自然)424:251(2003)和Thomas,等人，NatureReviews,Genetics(自然綜述，遺傳學(xué))4:346-58(2003))。通常，AAV的基因組只包括兩個(gè)基因。"rep"基因編碼至少四種獨(dú)立的在DNA復(fù)制中使用的蛋白。"cap"基因產(chǎn)物被不同地剪切以產(chǎn)生含有病毒衣殼的3種蛋白。當(dāng)將基因組包裝入新生的病毒時(shí)，只有反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(ITRs)是必需的序列；rep和cap可以從基因組被刪除，并且被所選擇的異質(zhì)序列取代。但是，為了產(chǎn)生復(fù)制和包裝基于AAV的異質(zhì)構(gòu)建體進(jìn)入新生的病毒粒子所需要的蛋白，必需以反式提供rep和cap蛋白。通常通過(guò)與輔助病毒共感染提供輔助功能，例如可以以一種或多種DNA表達(dá)質(zhì)粒的形式以反式提供上文提及的腺病毒或皰滲病毒。由于基因組通常只編碼兩種基因，并不令人吃驚的是，作為遞送載體，AAV包裝能力被限制在單鏈4.5千堿基(kilobases)(kb)。但是，盡管該大小限制可以限制被遞送用于替換基因治療的基因，其對(duì)短序列例如RNAi的包裝和表達(dá)沒(méi)有副作用。在實(shí)驗(yàn)中說(shuō)明了在RNAi應(yīng)用中的AAV的用途，其中AAV被用于將shRNA體外遞送以抑制p53和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)8的表達(dá)(Tomar等人，Oncogene(癌基因)22:5712-15(2003))。在將適當(dāng)?shù)男蛄锌寺∪氡幌拗菩詢?nèi)切酶消化的AAV-2載體后，在HEK293細(xì)胞中產(chǎn)生AAV病毒粒子并用于感染HeLaS3細(xì)胞。結(jié)果表明內(nèi)源性的Caspase8和p53水平呈劑量依賴性降低。Boden等人也使用AAV對(duì)shRNA進(jìn)行體外遞送以抑制HIV在組織培養(yǎng)系統(tǒng)中的復(fù)制(Boden,等人，J.Virol.(病毒學(xué)雜志)77(21):115231-35(2003)),其通過(guò)在耗盡培養(yǎng)基中的p24產(chǎn)生進(jìn)行評(píng)價(jià)。但是，當(dāng)使用AAV作為l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體時(shí)，必須克服技術(shù)障礙。例如，各種百分比的人群可以具有抗特定AAV血清型的中和抗體。但是，由于存在有幾種AAV血清型，對(duì)于其中的一些血清型，具有中和抗體的個(gè)體的百分比大大減少，可以使用其它的血清型，或使用假型包裝(pseudo-typing)。至少存在十種不同的已經(jīng)被鑒定出的血清型(參見(jiàn)De等人MolTher(分子治療).2006Jan;13(l):67-76),還有許多其它被分離出的但是缺少詳細(xì)描述的血清型。另外一個(gè)限制是由于針對(duì)AAV的可能的免疫應(yīng)答的結(jié)果，基于AAV的治療可能只進(jìn)行一次；但是，作為可選擇的使用，非人類來(lái)源的血清型可能重復(fù)被使用。用藥途徑，血清型，被遞送的基因組的成分都影響組織特異性(參見(jiàn)，例如Zhu等人，Circulation(循環(huán)).2005Oct25;112(17):2650-9)。在使用伴有l(wèi)-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體的未修飾的AAV系統(tǒng)的另一個(gè)限制是轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是低效的。在體內(nèi)的穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能在細(xì)胞的5-10%的限度內(nèi)。但是，不同的提升穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)水平的方法在本領(lǐng)域是公知的。一種途徑是使用假型包裝，其中用衍生于其它血清型的cap蛋白包裝AAV-2基因組。例如，通過(guò)用AAV-5cap基因替代其AAV-2副本，Mingozzi等人將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)增加到肝細(xì)胞的約15%(Mingozzi，等人，J.Virol(病毒學(xué)雜志)76(20):10497-502(2002))。Thomas等人，使用AAV8衣殼基因轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞超過(guò)30%(Thomas,等人，JVirol.(病毒學(xué)雜志)2004Mar;78(6):3110-22)。Grimm等人(Blood.(血液)2003-02-0495)用盡用于組織培養(yǎng)研究的AAV-1,AAV-3B，AAV-4,AAV-5,和AAV-6以假型包裝AAV-2。通過(guò)用AAV-6假型包裝的病毒體誘導(dǎo)了最高水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)；產(chǎn)生高于AAV-2幾乎2000%的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。因而，本發(fā)明欲使用假型包裝的AAV病毒以達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化水平，同時(shí)相應(yīng)增加了l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，也可以使用自我互補(bǔ)的AAV載體。在標(biāo)準(zhǔn)AAV載體和自我互補(bǔ)載體之間最顯著的區(qū)別是其基因組的形式和包裝的大小。標(biāo)準(zhǔn)AAV載體具有4.6Kb的單鏈DNA,而自我互補(bǔ)AAV載體具有2.3Kb的雙鏈DNA。通過(guò)在反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(ITR)中的一個(gè)中導(dǎo)入突變/刪除可以將AAV載體轉(zhuǎn)換為自我互補(bǔ)載體。每一個(gè)AAV基因組具有兩個(gè)這樣的位于5'和3'端的重復(fù)。復(fù)制通常在ITR中的一個(gè)處起始并通過(guò)整個(gè)基因組開(kāi)始，并在另一個(gè)ITR解離。正是由于該原因，AAV載體含有正鏈或負(fù)鏈的基因組。最有效控制轉(zhuǎn)錄解離的序列是D-序列和終止解離位點(diǎn)(trs)。這些序列位點(diǎn)位于AAV2基因組的第122-144核苷酸之間(Wang等人(20(B)GeneTherapv(基因治療)10:2106-2111),以及刪除它們不能使轉(zhuǎn)錄在ITR解離。應(yīng)該注意的是，由于AAV載體的ITR幾乎等同，在兩個(gè)ITR中任一個(gè)可以刪除D-序列和trs。刪除ITRD-序列和trs的結(jié)果是，延伸的復(fù)制復(fù)合體不再解離，并且復(fù)合體以相反于原始方向的方向延伸，即，如果復(fù)制復(fù)合體首先產(chǎn)生正鏈，則其在被刪除的ITR處不能解離，并接著產(chǎn)生與正鏈互補(bǔ)的負(fù)鏈。這接著產(chǎn)生將被包裝入AAV載體中的自我互補(bǔ)雙鏈DNA分子，只要其長(zhǎng)度不超過(guò)2.3kb,并且優(yōu)選地更短。應(yīng)該注意的是，由于AAV載體的ITR在復(fù)制過(guò)程中重新結(jié)合，可以產(chǎn)生回復(fù)體表型，即恢復(fù)到野生型序列的兩個(gè)ITR。為了弱化這一問(wèn)題，必需使用不同類型的AAV載體的ITR。例如，AAV2左ITR與AAV4刪除的右ITR,等?？刂七x擇要被結(jié)合的ITR唯一標(biāo)準(zhǔn)在于ITR血清型之間的序列一致性。血清型2和5的ITR幾乎等同，以及血清型2和4的ITR具有81.6%的相似性。在刪除D序列和trs之后，AAV2和AAV4的ITR之間的序列一致性下降到恰好超過(guò)50%。這兩個(gè)ITR的結(jié)合因而產(chǎn)生分化的ITR的良好結(jié)合，并將產(chǎn)生自我互補(bǔ)的、不再重新產(chǎn)生具有野生型ITR的后代的AAV載體。憑借其高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的能力，自我互補(bǔ)載體比單鏈載體具有非常大的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)被AAV8的包膜蛋白假型包裝化后，AAV載體顯示出可以轉(zhuǎn)導(dǎo)95%以上的被耙向的肝細(xì)胞(參見(jiàn)Nakai等人JVirol.(病毒學(xué)雜志)2005Jan;79(l):214-24和Grimm等人，JVirol.(病毒學(xué)雜志)2006Jan;80(l):426-39)。另一個(gè)可用于本發(fā)明l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體的病毒遞送系統(tǒng)是基于來(lái)源于反轉(zhuǎn)錄病毒科的病毒的系統(tǒng)。反轉(zhuǎn)錄病毒包括單鏈RNA動(dòng)物病毒，其具有兩個(gè)獨(dú)特的特征。首先，反轉(zhuǎn)錄病毒的基因組是二倍體，由兩個(gè)拷貝的RNA組成。第二，此RNA通過(guò)病毒體相關(guān)酶反轉(zhuǎn)錄酶被轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA。之后該雙鏈DNA或前病毒被整合入宿主基因組，并作為宿主基因組穩(wěn)定整合的成分從父代細(xì)胞被傳遞至子代細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，慢病毒屬是轉(zhuǎn)錄病毒科的在本發(fā)明中使用的優(yōu)選成員。慢病毒載體經(jīng)常由皰滲性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)假型包裝化，并衍生于人類免疫缺陷性病毒(HIV),即人類獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子；梅迪和維斯納病毒(visan-maedi),其在綿羊中引起腦炎(綿羊脫髓鞘性腦白質(zhì)炎)或肺炎；馬感染性貧血病毒(EIAV),其在馬中引起自身免疫溶血性貧血和腦??；貓免疫缺陷病毒(FIV),其在貓中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其在牛中引起淋巴結(jié)病和淋巴球增多；以及猿免疫缺陷病毒(SIV)，其在非人的靈長(zhǎng)類動(dòng)物中引起免疫缺陷和腦病?；贖IV的載體通常保持<5%的父代基因組，并且<25%的基因組被整合入包裝構(gòu)建體中，其使產(chǎn)生能夠回復(fù)復(fù)制的HIV的可能性最小化。通過(guò)開(kāi)發(fā)自我滅活載體進(jìn)一步增加了生物安全性，所述載體在長(zhǎng)末端重復(fù)序列的下游具有調(diào)節(jié)元件的刪除，除去了對(duì)于載體動(dòng)員是必須的包裝信號(hào)的轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組的反轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生。與C-型反轉(zhuǎn)錄病毒不同，慢病毒屬cDNA與其它病毒因子相復(fù)合一已知的啟始前復(fù)合體—可以穿過(guò)核膜移動(dòng)位置，并轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞。病毒cDNA的結(jié)構(gòu)特征—DNA臂(flap)—似乎帶來(lái)高效的核輸入。所述臂依賴于位于病毒聚合酶基因內(nèi)的中央聚。票呤區(qū)(cPPT)的完整性，所以大多數(shù)慢病毒-衍生載體都保持了該序列。慢病毒具有廣泛的細(xì)胞嗜性，低炎癥潛能，并產(chǎn)生完整的載體。主要的限制是在一些應(yīng)用中整體可能誘導(dǎo)癌形成。應(yīng)用慢病毒載體的主要優(yōu)勢(shì)是基因轉(zhuǎn)移在大多數(shù)組織或細(xì)胞類型中持久。用于表達(dá)ddRNAi因子的以慢病毒為基礎(chǔ)的構(gòu)建體優(yōu)選地包括自慢病毒5'和3'LTR的序列。更優(yōu)選地，病毒構(gòu)建體包括被滅活的或自我滅活的源自慢病毒的3'LTR。可通過(guò)在本領(lǐng)域任何已知方法進(jìn)行3'LTR的自我滅活。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，3'LTR的U3元件包括刪除其增強(qiáng)子序列，優(yōu)選地為TATA盒，Spl和NF-KB位點(diǎn)。作為自我滅活3'LTR的結(jié)果，整合入宿主細(xì)胞基因組的前病毒將包括一皮滅活的5'LTR。LTR序列可以是來(lái)自任何種的慢病毒的LTR序列。以慢病毒為基礎(chǔ)的構(gòu)建體也可以結(jié)合用于MMLV或MSCV,RSV或哺乳動(dòng)物基因的序列。另外，源自慢病毒5'LTR的U3序列可以被病毒構(gòu)建體中的啟動(dòng)子序列所替代。這可以增加從包裝細(xì)胞系獲得的病毒的滴度。也可以包括增強(qiáng)子序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它的病毒或非病毒系統(tǒng)也可以用于將本發(fā)明的1-xRNAi表達(dá)盒遞送至相關(guān)細(xì)胞，組織或器官，包括但不限于基因刪除的腺病毒-轉(zhuǎn)座子載體，所述載體通過(guò)整合入宿主細(xì)胞在體內(nèi)穩(wěn)定地保持病毒編碼的轉(zhuǎn)基因(參見(jiàn)Yant,等人，NatureBiotech(自然生物技術(shù)).20:999-1004(2002));衍生于辛德畢斯(Sindbis)病毒或塞姆利基森林(Semlikiforest)病毒(參見(jiàn)Perri,等人，J.Virol.(病毒學(xué)雜志)74(20):9802-O7(2002))的系統(tǒng)；衍生于新城疫病毒或仙臺(tái)(Sendai)病毒的系統(tǒng);或缺乏細(xì)菌DNA序列的小環(huán)狀DNA(mini-circleDNA)載體(參見(jiàn)Chen,等人，MolecularTherapv(分子治療).8(3):495-500(2003》。如在美國(guó)專利出版物2004/0214329所描述的小環(huán)狀DNA公開(kāi)了提供持續(xù)高水平蛋白的載體。環(huán)狀載體的特征在于缺乏表達(dá)靜息的細(xì)菌序列，并且包括單向的位點(diǎn)特異性的重組產(chǎn)物序列以及表達(dá)盒。另夕卜，雜合病毒系統(tǒng)可以用于將兩種或更多種病毒系統(tǒng)的特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)。例如，野生型AAV的位點(diǎn)特異性的整合機(jī)制可以伴以腺病毒的高效內(nèi)在化和核耙向特點(diǎn)。在存在腺病毒或皰滲病毒時(shí)，AAV經(jīng)歷高產(chǎn)量復(fù)制循環(huán)；但是，在缺乏輔助子功能的情況下，AAV基因組整合入染色體19上的特異性位點(diǎn)。AAV基因組的整合需要AAVrep蛋白的表達(dá)。由于通常的rAAV載體被刪除了病毒包括rep的所有基因，它們不能特異性地整合入染色體19。但是，可以在適當(dāng)?shù)碾s合系統(tǒng)中開(kāi)發(fā)該特征。另外，非病毒遺傳元件可以用于達(dá)到病毒遞送系統(tǒng)中所理想的特性，例如能夠允許進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組的遺傳元件。在圖1步驟400中，l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體被包裝入病毒粒子。本領(lǐng)域任何公知方法可以用于產(chǎn)生感染性病毒粒子，所述病毒粒子的基因組包括病毒l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體的一份拷貝。圖3A和圖3B顯示可選擇用于將本發(fā)明的l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體包裝入病毒粒子以進(jìn)行遞送的方法。圖3A中的方法利用能以反式穩(wěn)定表達(dá)病毒蛋白，以及其它的對(duì)于具體的病毒遞送系統(tǒng)是必需或優(yōu)選的序列(例如，復(fù)制、結(jié)構(gòu)蛋白和病毒裝配所需的序列)，和用于進(jìn)入組織的或衍生于病毒或人工的配體的包裝細(xì)胞，所述病毒蛋白對(duì)于將病毒1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體整合入病毒粒子而言是必需的。在圖3A中，l-xRNAi表達(dá)盒被連接于病毒遞送載體(步驟300),并且生成的病毒l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體被用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞(步驟410)。之后包裝細(xì)胞復(fù)制病毒序列，表達(dá)病毒蛋白，并且將病毒1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體包裝入感染病毒粒子(步驟420)。包裝細(xì)胞系可以是能夠表達(dá)病毒蛋白的任何細(xì)胞系，所述細(xì)胞系包括但不限于293,HeLa,A549,PerC6，D17,MDCK,BHK，bingcherry,phoenix,Cf2Th,或由本領(lǐng)i或4支術(shù)人員所^>知或開(kāi)發(fā)出的任何其它細(xì)胞系。一種包裝細(xì)胞描述在例如美國(guó)專利6,218,181中?？蛇x擇地，不穩(wěn)定表達(dá)必需的病毒蛋白的細(xì)胞系可以與兩種或多種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染以達(dá)到功能粒子的高效生產(chǎn)。構(gòu)建體中的一種包括病毒1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體，其它質(zhì)粒包括編碼蛋白的核酸，所述蛋白對(duì)于細(xì)胞產(chǎn)生功能性病毒(復(fù)制和包裝構(gòu)建體)以及其它輔助功能而言是必需的。在圖3B顯示的方法利用不能穩(wěn)定表達(dá)病毒復(fù)制和包裝基因的細(xì)胞進(jìn)行包裝。在這種情況下，l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體被連接于病毒遞送載體(步驟300),之后與一種或多種表達(dá)對(duì)于感染病毒粒子復(fù)制和生產(chǎn)是必需的序列的載體共轉(zhuǎn)染(步驟415)。細(xì)胞復(fù)制病毒序列，表達(dá)病毒蛋白并將病毒RNAi表達(dá)構(gòu)建體包裝入感染病毒粒子(步驟420)。包裝細(xì)胞系或復(fù)制和包裝構(gòu)建體可以不表達(dá)包膜基因產(chǎn)物。在這些實(shí)施方案中，可以在單獨(dú)的、與病毒l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體上提供編碼包膜基因的基因。包膜蛋白部分負(fù)責(zé)病毒粒子的宿主范圍，病毒可以被假型包裝。如前文所述，"假型包裝，，病毒是這樣一種病毒粒子，它的包膜蛋白來(lái)自不同于產(chǎn)生其基因組的病毒的一種病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)募傩桶b用于所使用的病毒遞送系統(tǒng)和待革巴向的細(xì)胞。除了賦予具體的宿主范圍，所選擇的假型包裝可以允許要被濃縮的病毒達(dá)到非常高的滴度。病毒可選擇地用限制對(duì)具體種類感染的單嗜性包膜蛋白進(jìn)行假型包裝化(例如單嗜性包膜只可以感染，例如鼠細(xì)胞，雙嗜性包膜可以感染，例如人和鼠細(xì)胞)。另外，遺傳修飾的配體可以用于細(xì)胞特異性靶向，例如肝細(xì)胞用脫唾液酸糖蛋白，或用于受體介導(dǎo)結(jié)合用轉(zhuǎn)鐵蛋白。在包裝細(xì)胞系中生產(chǎn)之后，純化和定量(滴定)含有l(wèi)-xRNAi表達(dá)盒的病毒粒子。純化策略包括密度梯度離心，或優(yōu)選地，柱層析方法。在圖l的步驟500中，l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體被遞送至相關(guān)細(xì)胞，組織，或器官。本發(fā)明的1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體可以在體外(&)或離體()被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，之后一皮放入動(dòng)物體內(nèi)以實(shí)現(xiàn)治療，或通過(guò)體內(nèi)用藥直接給藥至生物體，器官或細(xì)胞。通過(guò)病毒感染的遞送是優(yōu)選的遞送方法；但是，可以使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟf送l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體。使用任何常規(guī)的方法可以將含盒的載體用藥于哺乳動(dòng)物宿主，其中在本領(lǐng)域已知有大量不同的這樣的方法。裝配有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和終止子，例如源自T7或T3噬菌體的啟動(dòng)子和終止子，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它的啟動(dòng)子和終止子的1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體可以用于模板的體外轉(zhuǎn)錄。因而，可以在體外生產(chǎn)長(zhǎng)度可變的RNA發(fā)夾分子(具有2,3,4或更多個(gè)功能性的單個(gè)發(fā)夾)，可以根據(jù)下文對(duì)其進(jìn)行純化和給藥?？梢杂懈鞣N技術(shù)用于將核酸遞送入細(xì)胞并且是公知的，例如脂質(zhì)體或膠束-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，用減毒病毒粒子轉(zhuǎn)化細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的細(xì)胞接合，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染步驟或微注射。最普通的轉(zhuǎn)染試劑是能夠穿越細(xì)胞膜的帶電的親脂性化合物。當(dāng)它們與核酸混合時(shí)，它們可以攜帶DNA穿越細(xì)胞膜?？梢陨虡I(yè)獲得大量的這樣的化合物。聚乙烯亞胺(PEI)是一類新的轉(zhuǎn)染試劑，其化學(xué)特性明顯不同于以類似方式作用的親脂性化合物，但是具有可以穿越核膜的優(yōu)勢(shì)。這樣的試劑的一個(gè)實(shí)例是ExGen500(Fermentas)?？梢栽诤铣傻闹|(zhì)體或膠束內(nèi)以線性片段包裝根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建體或合成基因以用于遞送入耙細(xì)胞。使用電穿孔法可以轉(zhuǎn)化組織培養(yǎng)細(xì)胞。這是考慮到在細(xì)胞膜上產(chǎn)生瞬間的孔，DNA或RNA通過(guò)這些孔進(jìn)入細(xì)胞。另夕卜，使用試劑例如PEG或磷酸4丐可以化學(xué)轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞?？蛇x4,地，可以通過(guò)其它途徑，包括樣t注射或嚢泡融合將含有l(wèi)-xRNAi表達(dá)盒的ddRNAi表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入到相關(guān)細(xì)胞，組織或器官。如Furth等人Anal.Biochem.(分析化學(xué))115(205):365-368(1992)所描述，也可以使用注射進(jìn)行肌肉內(nèi)用藥?？梢詫⒑怂嵬糠笤诮鹞⒘Ｗ由希⑼ㄟ^(guò)粒子轟擊裝置經(jīng)皮內(nèi)遞送，或根據(jù)文獻(xiàn)(參見(jiàn)，例如，Tang等人，Nature(自然)356:152-154(1992》中描述的"基因槍，，，其中金微粒被涂敷以DNA,之后被轟擊進(jìn)入相關(guān)細(xì)胞，組織或器官。另一種用于本發(fā)明方法的遞送方法包括使用授權(quán)給Davis等人的美國(guó)專利6,509,323中所描述的CyclosertTM技術(shù)。CyclosertTM技術(shù)平臺(tái)是基于被稱為環(huán)糊精的糖的杯狀環(huán)形重復(fù)分子。環(huán)糊精分子的"杯"可以與其它分子形成"包含復(fù)合體"，使其可以用其它部分結(jié)合Cyclosert聚合物以提高穩(wěn)定性或增加靶向配體。另外，發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精脈內(nèi)用藥藥物的溶解性)，并且可以以低成本大量購(gòu)得制藥級(jí)別的環(huán)糊精。這些聚合物有非常高的水溶性，在治療劑量上甚至重復(fù)用藥時(shí)是非毒性和非免疫原性的。聚合物可以容易地適應(yīng)以顯著高于脂質(zhì)體的藥物荷載攜帶廣范圍的小分子治療劑。含本發(fā)明l-xRNAi表達(dá)盒的載體可配制成注射制劑，或通過(guò)在水性溶劑或非水性溶劑，例如油，合成的脂肪酸甘油酯，高級(jí)脂肪酸或丙二醇的酯中溶解，懸浮或乳化用藥；并且如果需要，伴以常規(guī)的添加劑，例如增溶劑，等滲劑，懸浮劑，乳化劑，穩(wěn)定劑和防腐劑。另外，可以通過(guò)與適當(dāng)?shù)?，制藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑結(jié)合，將含有本發(fā)明RNAi表達(dá)盒的載體制備成藥物組合物。在制藥學(xué)劑型中，含有l(wèi)-xRNAi盒的載體可以被單獨(dú)用藥或與其它制藥學(xué)活性化合物結(jié)合用藥。實(shí)施例為選擇由本發(fā)明1-xRNAi盒定向的候選序列，對(duì)所有發(fā)表的獨(dú)立全長(zhǎng)的或接近全長(zhǎng)的HCV序列進(jìn)行對(duì)比；目前可獲得約100個(gè)這樣的代表所有基因型的序列。目前存在有幾個(gè)用于選擇和開(kāi)發(fā)RNAi治療劑的候選區(qū)域，并且被詳細(xì)地記載5'和3'UTR區(qū)在HCV基因組中屬于最為高度保守的區(qū)域之列。盡管考慮到由于與細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)合體蛋白或調(diào)節(jié)蛋白的空間位阻的可能，這些非編碼序列可能不代表靶向的最佳序列，Yokota等人已經(jīng)鑒定出定向復(fù)制子系統(tǒng)中的5'UTR的高度功能性的RNAi(EMBORep.(歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)報(bào)導(dǎo))4(6):602-608(2003))。盡管其有利于鑒定出在單獨(dú)21個(gè)核苦酸段(在shRNA種類中靶向序列相對(duì)應(yīng)的大小)內(nèi)具有絕對(duì)一致性的幾個(gè)區(qū)域，目前的分析顯示在特定基因型的不同亞型內(nèi)不出現(xiàn)這樣的保守程度，更不用說(shuō)全部的基因型。因而，選擇可以包括基因組的片段，在所述片段中，大于80%的區(qū)域保持絕對(duì)的保守。三個(gè)獨(dú)立的shRNA的表達(dá)補(bǔ)償了序列變異性，可以允許包含在單一遞送載體中的結(jié)合治療。可選擇地，如果沒(méi)有鑒定出在所有HCV基因型分析中滿足選擇標(biāo)準(zhǔn)的保守區(qū)，序列分析可以限定到基因型l(la和lb),其在美國(guó)的感染人群占到近3/4,除非洲外，其在全世界是優(yōu)勢(shì)基因型。另外，當(dāng)前最有效的抗HCV治療，即聚乙二醇干擾素(pegylateinterferon)與利巴韋林(鳥(niǎo)噤呤核苷類似物)的結(jié)合，對(duì)抗基因型l相當(dāng)沒(méi)有效力，但是抗其它基因型具有高度效力。因而，其它可選擇療法的最大需要存在于最多數(shù)的病人群中。由于序列對(duì)比只顯示出同源性，在選擇要進(jìn)行測(cè)試的最終RNAi因子時(shí)，使用其它選擇標(biāo)準(zhǔn)，例如GC相對(duì)含量和查詢序列數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)的交叉特異性的缺乏。例如，對(duì)于一個(gè)實(shí)驗(yàn)，對(duì)來(lái)自HCV亞型la和lb的多個(gè)序列進(jìn)行對(duì)比。鑒定出一些保守區(qū)，從該區(qū)域有足夠的長(zhǎng)度以選擇用于檢測(cè)的RNAi因子(>19核苷酸)。5'NTR和3'NTR區(qū)是最保守的區(qū)域。由于被鑒定出的同源區(qū)相當(dāng)長(zhǎng)，在不同亞型之間也進(jìn)行對(duì)比。結(jié)合兩種對(duì)比可以選擇普遍保守的區(qū)域。去除一些區(qū)域免于考慮，例如A或U,或G和C的長(zhǎng)段區(qū)，剩下"合格的"區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步選擇。在所考慮的HCV的所有基因型的整個(gè)編碼區(qū)(開(kāi)放閱讀框)中只鑒定出一個(gè)普遍保守的區(qū)域；因此，在大多數(shù)情況下所選擇的用于定向的序列是在亞型la和lb中保守的序列。一旦鑒定出"合格的"區(qū)域，應(yīng)用RNAi因子反義鏈5'端的自由能應(yīng)該低于3'端的標(biāo)準(zhǔn)選擇單個(gè)的RNAi序列。使用"鄰近配對(duì)自由能"規(guī)則以計(jì)算迄今為止選擇的所有潛在的RNAi因子的5'和3'兩端的末尾五個(gè)核苷酸的自由能。結(jié)果是，鑒定出56個(gè)潛在的RNAi因子三十個(gè)在5'NTR(5'-n)，十二個(gè)在開(kāi)放閱讀框(c-n),以及十四個(gè)在3'NTR(3'-n)(參見(jiàn)表1)。序列號(hào)1-10和31-50的序列的位置在圖7中示意性地示出。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>C6-C9國(guó)C12-3'1編碼-6,編碼-9,編碼-12,3'1實(shí)施例l:抗疾病或功能紊亂的l-xRNAi表達(dá)盒的選才奪和4企測(cè)用作抗疾病或功能紊亂的治療劑的shRNA的選擇不是一個(gè)直截了當(dāng)?shù)闹黝}。除了在治療病毒感染中出現(xiàn)逃逸變異抹，病毒和癌基因的高突變率在感染個(gè)體的種群中導(dǎo)致相當(dāng)大程度序列分化。例如，感染肝炎病毒的個(gè)體可以攜帶基因型不同的病毒，其核苷酸序列有31-34%的不同，并且亞型(在給定的基因型內(nèi)的種)基于全長(zhǎng)基因組序列的比較可以有20-23%的不同。因而，對(duì)于HCV,鑒定出高度保守的病毒基因組區(qū)域并選擇以保證最廣泛的治療劑應(yīng)用。為選擇候選序列，將所有發(fā)表的獨(dú)立全長(zhǎng)或接近全長(zhǎng)的序列進(jìn)行排列比較?？偨Y(jié)分析結(jié)果，得出候選RNAi序列的列表。為了根據(jù)相對(duì)的力度對(duì)序列進(jìn)行分級(jí)，檢測(cè)單個(gè)的預(yù)合成的RNAi因子抑制靶基因活性的能力。當(dāng)定向癌基因、發(fā)育基因等類似基因時(shí)，使用同樣的方法。為檢測(cè)所選RNAi因子的效力，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和試劑將預(yù)合成的RNAi因子轉(zhuǎn)染入相關(guān)細(xì)胞，組織或器官。不相關(guān)的RNAi種類被轉(zhuǎn)染入平行的一套培養(yǎng)皿中以作為陰性對(duì)照。通過(guò)包含入轉(zhuǎn)染混合物的末端標(biāo)記有熒光素酶或藻紅蛋白的小量非特異性的RNAi監(jiān)控轉(zhuǎn)染效率。在下調(diào)效力分析之前通過(guò)熒光顯微鏡相對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行測(cè)量。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)多種方法之一測(cè)量靶基因活性。單個(gè)地，以及在本發(fā)明的l-xRNAi盒的背景中選擇和測(cè)量高度功能性的ddRNAi因子。在使用l-xRNAi表達(dá)盒的實(shí)施方案中，驗(yàn)證RNAi因子，并且每一相關(guān)shRNA的編碼序列由長(zhǎng)的、互補(bǔ)的自我退火的寡核苷酸產(chǎn)生并一皮克隆入l-xRNAi盒的單個(gè)位點(diǎn)。根據(jù)本文描述的方法，之后該盒被插入進(jìn)病毒載體，并且之后該構(gòu)建體被包裝入病毒粒子。由于l-xRNAi表達(dá)盒每一shRNAi組分的總長(zhǎng)度較短(~70個(gè)核苷酸)；將達(dá)五個(gè)RNAi組分連在一起產(chǎn)生小于等于大約350個(gè)核苦酸的長(zhǎng)度，并且甚至包括l-xRNA表達(dá)盒的啟動(dòng)子和終止子，總長(zhǎng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于例如，自我-互補(bǔ)AAV和其它病毒的有效負(fù)荷極限的上限。在Huh-7細(xì)胞上檢測(cè)病毒粒子的抑制活性。表達(dá)不相關(guān)shRNA種類的l-xRNAi構(gòu)建體的產(chǎn)生用于陰性對(duì)照。通過(guò)上述的分析技術(shù)監(jiān)控shRNA序列的效力。實(shí)施例2:1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體的開(kāi)發(fā)1-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體的構(gòu)建包括啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子驅(qū)使三個(gè)或更多個(gè)單一的shRNA種類以類似充分的水平表達(dá)。由RNA聚合酶III(polIII)在pol111-特異性啟動(dòng)子的控制下指導(dǎo)小核RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)rRNA的合成。由于由這些調(diào)節(jié)元件指導(dǎo)的相對(duì)高豐度的轉(zhuǎn)錄，polIII啟動(dòng)子，包括這些衍生于U6和HI的基因被用于驅(qū)動(dòng)l-xRNAi的表達(dá)。(參見(jiàn)，例如Domitrovich和Kunkel.Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31(9):2344-52(2003);Boden,等人Nucl.AcidsRes.(核酸研究)31(17):5033-38(2003a);和Kawasaki,等人Nucl.AcidsRes.(核酸研究).31(2):700-7(2003))。在圖4顯示了使用U6啟動(dòng)子4全測(cè)1-3RNAi表達(dá)構(gòu)建體(#251-#256)。它們包括三個(gè)定向HCV基因組不同區(qū)域的RNAi因子。在盒中的序列是不同的以為了檢測(cè)siRNA功能所需要的不同結(jié)構(gòu)的要求。在圖4中，根據(jù)預(yù)先建立的控制RNA干擾機(jī)制作用的技術(shù)，在每一構(gòu)建體下方列出了預(yù)期的結(jié)果。預(yù)期的成功的siRNA功能結(jié)果顯示為"+",以及預(yù)期的不成功的siRNA功能結(jié)果顯示為"-"。在預(yù)期結(jié)果產(chǎn)生失敗的情況下，該預(yù)期的原因是由于序列刪除或錯(cuò)配。問(wèn)號(hào)標(biāo)記顯示問(wèn)題可能是或不是足夠顯著以終止發(fā)夾構(gòu)建體的活性。為檢測(cè)所選擇的RNAi序列的效力，本發(fā)明l-xRNAi表達(dá)構(gòu)建體與Luc-HCV報(bào)導(dǎo)子質(zhì)粒一起被直接遞送到培養(yǎng)細(xì)胞。所使用的Luc-HCV質(zhì)粒是在圖7顯示的構(gòu)建體，并且包括與各種100,90,80,70,60，50,40,30或20bp的HCV耙序歹'J(注意對(duì)于在一個(gè)寺艮導(dǎo)子中的多個(gè)草巴，100Bp是正確的，同時(shí)，對(duì)于大多數(shù)單一的草巴報(bào)導(dǎo)子，此序列相應(yīng)于靶在5'和3'端加上5個(gè)核苷酸)融合的熒光酶序列，其中RNAi序列從所述HCV靶序列衍生出。定向于lOObp以內(nèi)的序列片段的RNAi因子，如果有效，將降解HCV-焚光素酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因而降低(可能消除)熒光素酶的表達(dá)。表1列出了RNAi因子，對(duì)其中一些進(jìn)行了檢測(cè)。表2列出了一些相關(guān)的Luc-HCV報(bào)導(dǎo)子質(zhì)粒和所使用的定向HCV靶區(qū)域。圖7顯示了表1中的RNAi因子的靶目標(biāo)的HCV基因組中位置的示意圖。如圖5和6所示，通過(guò)共轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)導(dǎo)子活性的降低在體外評(píng)價(jià)每一個(gè)1-xRNAi構(gòu)建體的相對(duì)強(qiáng)度。使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將測(cè)試和報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入許可的細(xì)胞。在圖8中示出的Luc-融合報(bào)導(dǎo)子質(zhì)粒被與圖4中的編碼三個(gè)發(fā)夾shRNA種類的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入Huh-7細(xì)胞。用于海腎熒光素酶表達(dá)的質(zhì)粒也被包括進(jìn)去用以規(guī)格化樣品到樣品的轉(zhuǎn)染效率。在每一個(gè)狀況下使用總數(shù)薩4的獨(dú)立的轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，收獲樣品并分析螢火蟲(chóng)的熒光素酶活性的相對(duì)水平。含有驅(qū)動(dòng)抗5'-8或C-12靶序列的單一shRNAU6表達(dá)的啟動(dòng)子的質(zhì)粒作為這些實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，含有U6啟動(dòng)子，但沒(méi)有下游shRNA序列的質(zhì)粒，作為陰性對(duì)照，因此被作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)其評(píng)價(jià)由從單一或三個(gè)發(fā)夾質(zhì)粒表達(dá)的shRNA誘導(dǎo)的抑制水平。含有定向于HCV的5'UTR的5'8區(qū)域和編碼12區(qū)域的RNAi的1-3RNAi構(gòu)建體與含有5'8或cl2靶位點(diǎn)的熒光素酶HCV報(bào)導(dǎo)子質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。只有當(dāng)發(fā)夾定向于如預(yù)期形成的相對(duì)應(yīng)的靶位點(diǎn)時(shí)(即在預(yù)期的發(fā)夾中只有一個(gè)或沒(méi)有錯(cuò)配)，熒光素酶的活性才被有效抑制。實(shí)施例3.三個(gè)發(fā)夾的構(gòu)建體的體內(nèi)評(píng)價(jià)使用水力尾靜脈注射方法，通過(guò)鼠肝細(xì)胞與適當(dāng)?shù)膌uc-融合報(bào)導(dǎo)子質(zhì)粒和1-3RNAi構(gòu)建體251，252,253,254,255,256,陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒，或陰性對(duì)照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染體內(nèi)評(píng)價(jià)三個(gè)發(fā)夾的構(gòu)建體。另外，用表達(dá)人al抗胰蛋白酶(a1-AT)的質(zhì)粒注射小鼠，所述al抗胰蛋白酶被用于轉(zhuǎn)染效率的規(guī)格化。注射后48小時(shí)，收集動(dòng)物血清，處死動(dòng)物，收獲肝臟。使用Promega公司熒光素酶試劑盒分析肝裂解物的螢火蟲(chóng)的熒光素酶活性，并且使用ELISA分析血清樣本的al-AT。相對(duì)于陰性對(duì)照評(píng)價(jià)由從發(fā)夾構(gòu)建體表達(dá)的l-xRNAi的誘導(dǎo)的抑制水平。實(shí)施例4l-xRNAi表達(dá)盒也可以用作模板生產(chǎn)RNAi種類，通過(guò)使用前述核酸遞送技術(shù)中的一種可將所述RNAi種類直接定向給藥于細(xì)胞或組織。為顯示這種類型方法的應(yīng)用，將T7啟動(dòng)子導(dǎo)入含有三個(gè)shRNA發(fā)夾的l-xRNAi表達(dá)盒的上游，所述shRNA發(fā)夾,皮定向于含有HCV5'-8，5'6或C-12靶序列的獨(dú)立的報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體。為了使用失控轉(zhuǎn)錄技術(shù)以在體外產(chǎn)生含有RNAi序列的RNA，使用限制性內(nèi)切酶消化制備模板，導(dǎo)致正好在l-xRNAi表達(dá)盒的下游質(zhì)粒被切開(kāi)。T7RNA聚合酶被加入反應(yīng)用于產(chǎn)生含有1-x表達(dá)盒序列的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在當(dāng)前的實(shí)施例中，使用親脂化合物作為轉(zhuǎn)染試劑，失控轉(zhuǎn)錄物被以各種濃度與一套濃度的一系列的相關(guān)熒光素酶報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體一起被導(dǎo)入細(xì)胞。編碼海腎的熒光素酶蛋白的單獨(dú)DNA質(zhì)粒表達(dá)物被用于不同樣品間的轉(zhuǎn)染效率差異的規(guī)格化。在每一狀況下使用總量N=4的轉(zhuǎn)染，并用一套樣品計(jì)算每一報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體的抑制百分比，所述樣品用只包含適當(dāng)?shù)膱?bào)導(dǎo)子構(gòu)建體和海腎質(zhì)粒的混合物轉(zhuǎn)染。結(jié)果如圖9所示，顯示通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的l-x表達(dá)構(gòu)建體所有三個(gè)報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體呈劑量依賴性降低。通過(guò)不可靶向的報(bào)導(dǎo)子構(gòu)建體(C91uc融合)監(jiān)控非特異性的抑制，并且顯示響應(yīng)體外轉(zhuǎn)錄的三重發(fā)夾的抑制非常低。盡管本發(fā)明已經(jīng)參照具體的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該懂得，在不脫離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種變化和等同替代。另外，可以進(jìn)行許多修正以適應(yīng)針對(duì)本發(fā)明的目的、精神和范圍的具體情況、材料或方法。所有這樣的修正都將位于本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本文引用的所有參考文獻(xiàn)是為了幫助理解本發(fā)明，并且被全文并入以用于沒(méi)有限制的所有用途。權(quán)利要求1.一種包含RNAi表達(dá)盒的遺傳構(gòu)建體，所述RNAi表達(dá)盒包含一個(gè)啟動(dòng)子和x個(gè)RNAi構(gòu)建體，其中x為二或更多。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建體，其特征在于，x為2，3,4,或5。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建體，其特征在于,所述xRNAi構(gòu)建體提供x個(gè)RNAi因子，并且所有x個(gè)RNAi因子彼此具有不同的序列。4.才艮據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建體，其特征在于，RNAi構(gòu)建體提供RNAi因子，并且包括兩個(gè)或更多個(gè)由一個(gè)或多個(gè)間隔子區(qū)分隔開(kāi)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的遺傳構(gòu)建體，其特征在于，RNAi因子被表達(dá)為shRNA。6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，RNAi因子耙向保守的基因序列區(qū)域。7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，RNAi因子靶向HCV基因組的多個(gè)區(qū)域。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的遺傳構(gòu)建體，其特征在于，RNAi因子革巴向如序列1-56中任意序列所顯示的一種或多種序列。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳構(gòu)建體，其特征在于，RNAi表達(dá)盒進(jìn)一步包括終止子。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的遺傳構(gòu)建體，其特征在于，啟動(dòng)子和終止取自同一基因。11.一種修飾一種或多種基因的表達(dá)的方法，所述方法包括將包含RNAi表達(dá)盒的遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入相關(guān)細(xì)胞、組織，或器官，所述RNAi表達(dá)盒包含一個(gè)啟動(dòng)子和x個(gè)RNAi構(gòu)建體，其中x為二或更實(shí)夕。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，x為2,3,4,或5。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，將遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入到相關(guān)細(xì)胞、組織，或器官，包括將遺傳構(gòu)建體連接入病毒遞送載體，以形成病毒RNAi表達(dá)構(gòu)建體；將病毒RNAi表達(dá)構(gòu)建體包裝入病毒粒子；以及將病毒粒子遞送到相關(guān)細(xì)胞、組織，或器官。14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，RNAi構(gòu)建體提供RNAi因子，并且包括兩個(gè)或更多個(gè)由一個(gè)或多個(gè)間隔子區(qū)分隔開(kāi)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，RNAi因子靶向保守的基因序列區(qū)域。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，RNAi因子靶向HCV基因組的多個(gè)區(qū)域。17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，RNAi因子靶向如序列1-56中任意序列所顯示的一種或多種序列。18.—種修飾一種或多種基因的表達(dá)的方法，所述方法包括將RNAi因子導(dǎo)入相關(guān)細(xì)胞、組織，或器官，所述RNAi因子是含有RNAi表達(dá)盒的遺傳構(gòu)建體的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，所述RNAi表達(dá)盒包含一個(gè)啟動(dòng)子和x個(gè)RNAi構(gòu)建體，其中x為二或更多。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，RNAi因子靶向如序列1-56中任意序列所顯示的一種或多種序列。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，RNAi因子包括三個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且啟動(dòng)子為T7啟動(dòng)子。全文摘要本發(fā)明提供了適合于表達(dá)在體外或體內(nèi)抗相關(guān)細(xì)胞、組織或器官中的1-xRNAi因子以治療疾病或功能紊亂的組合物和方法。文檔編號(hào)C12N15/113GK101180394SQ200680010811公開(kāi)日2008年5月14日申請(qǐng)日期2006年2月3日優(yōu)先權(quán)日2005年2月3日發(fā)明者A·A·科雷哈洛夫,D·A·蘇海,L·科托,P·W·羅爾溫克申請(qǐng)人:貝尼泰克有限公司