專利名稱：規(guī)定部位發(fā)光量測定方法、規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置、表達(dá)量測定方法及測定裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定來自活的樣本內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量的規(guī)定部位發(fā) 光量測定方法以及規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置。本發(fā)明涉及將導(dǎo)入了解析對象的基因的活細(xì)胞作為對象，將熒光測 定和發(fā)光測定組合起來，辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段并且測定解析對象的基因 的表達(dá)量的表達(dá)量測定方法。本發(fā)明涉及拍攝標(biāo)本像來觀察標(biāo)本的測定裝置，特別涉及適用于被 賦予了發(fā)出微弱光的發(fā)光標(biāo)識以及被激勵而發(fā)出熒光的熒光標(biāo)識的標(biāo)本 的觀察的優(yōu)選的測定裝置。
背景技術(shù)：
[I]ATP是細(xì)胞內(nèi)的能量供給源，是與生命現(xiàn)象密切相關(guān)的物質(zhì)。另 一方面，螢的熒光素酶在ATP、 02、 Mg^的存在下，將D-熒光素作為發(fā) 光基質(zhì)，催化生成氧化熒光素、C02、 AMP、焦磷酸的反應(yīng)，并通過該反 應(yīng)而發(fā)光。并且，熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)依賴于ATP量。因此，以往一直利用熒光素酶的發(fā)光反應(yīng)對ATP進(jìn)行定量，在生物、 臨床檢查、食品衛(wèi)生等領(lǐng)域中，開發(fā)出使用熒光素酶的細(xì)胞內(nèi)的ATP量 的測定方法。例如，細(xì)胞內(nèi)的ATP量的測定通常利用以下的(1-1) (1-3)的 工序來進(jìn)行。(1-1)溶解細(xì)胞或細(xì)菌來提取ATP。(1-2)在包含熒光素和熒光素酶的反應(yīng)液中添加該提取液。 (1-3)根據(jù)添加了提取液的反應(yīng)液來測定發(fā)光量，從而對細(xì)胞內(nèi)的 ATP進(jìn)行定量。
并且，沒有分裂的細(xì)胞內(nèi)的ATP量的測定通常利用以下的(2-1) (2-3)的工序來進(jìn)行。(2-1)在細(xì)胞中導(dǎo)入熒光素酶基因來表達(dá)。 (2-2)在包含細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入熒光素。(2-3)根據(jù)加入了熒光素的培養(yǎng)液來測定發(fā)光量，從而對細(xì)胞內(nèi)的 ATP進(jìn)行定量。進(jìn)而，活細(xì)胞內(nèi)的規(guī)定部位(具體而言是線粒體)中的ATP量的經(jīng) 時測定利用以下的(3-1)和(3-2)的工序來進(jìn)行(非專利文獻(xiàn)l)。(3-1)在熒光素酶基因中融合線粒體轉(zhuǎn)移信號基因，將該融合后的 基因?qū)氲郊?xì)胞。(3-2)在熒光素酶局部存在于細(xì)胞內(nèi)的線粒體中的前提下，通過經(jīng) 時測定來自細(xì)胞的發(fā)光量，從而測定細(xì)胞內(nèi)的線粒體中的ATP量的變動。 另外，因為從細(xì)胞內(nèi)發(fā)出的發(fā)光的強度非常微弱，所以為了識別一 個細(xì)胞，利用安裝了影像增強器的CCD照相機(jī)進(jìn)行光子計數(shù)。并且，利用不同于測定了發(fā)光量的細(xì)胞的其他細(xì)胞，來確認(rèn)熒光素酶是否局部存 在于細(xì)胞內(nèi)的線粒體中。具體而言，固定該其他細(xì)胞，在固定的細(xì)胞中 使抗熒光素酶抗體反應(yīng)，利用熒光抗體法觀察細(xì)胞，從而確認(rèn)局部存在。 由此，表示來自所測定的細(xì)胞的發(fā)光量與來自線粒體的發(fā)光量對應(yīng)。[II]細(xì)胞增殖是生物在生命維持中基本且重要的特征之一。而且， 細(xì)胞周期是由細(xì)胞成長、DNA復(fù)制、染色體分配以及細(xì)胞分裂等構(gòu)成的 多個連續(xù)反應(yīng)，在細(xì)胞周期的各個階段中，充分考慮各種基因的表達(dá)的 變動。并且，認(rèn)為細(xì)胞周期的異常和失敗與許多慢性疾病和癌變有關(guān)(參 照專利文獻(xiàn)l)。另外，專利文獻(xiàn)1公開了涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的活性 的測定方法和使用該測定方法的癌癥的診斷方法的技術(shù)。但是，在將熒光素酶基因作為報告基因?qū)氲郊?xì)胞，以熒光素酶活 性為指標(biāo)調(diào)查熒光素酶基因的表達(dá)強度時，在熒光素酶基因的上游和下 游連接目標(biāo)DNA片段，從而能夠調(diào)查該DNA片段對熒光素酶基因的轉(zhuǎn) 錄造成的影響。并且，將被認(rèn)為對熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄造成影響的轉(zhuǎn)錄 因子等基因連接到表達(dá)載體上，與熒光素酶基因一起表達(dá)，從而能夠調(diào)
查該基因的基因產(chǎn)物對熒光素酶基因的表達(dá)造成的影響。另外，將熒光 素酶基因等報告基因?qū)氲郊?xì)胞的方法，例如有磷酸鈣法、陽離子脂質(zhì)體(lipofectin)法和電穿孔(electroporation)法等，根據(jù)目的和細(xì)胞種 類的差異，區(qū)分使用各個方法。并且，導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)并表達(dá)的熒光素酶的活性的測定(監(jiān)視)按照 以下步驟進(jìn)行首先使溶解了細(xì)胞的細(xì)胞溶解液與包含熒光素、ATP和 鎂等在內(nèi)的基質(zhì)溶液進(jìn)行反應(yīng)，接著，利用使用了光電子增倍管的光度 計對來自與基質(zhì)溶液反應(yīng)的細(xì)胞溶解液的發(fā)光量進(jìn)行定量。即，在溶解 細(xì)胞后測定發(fā)光量。由此，能夠?qū)⒛硞€時刻的熒光素酶基因的表達(dá)量作 為細(xì)胞整體的平均值來進(jìn)行測定。并且，隨著時間經(jīng)過捕捉熒光素酶基因的表達(dá)量時，需要經(jīng)時測定 來自活細(xì)胞的發(fā)光量。而且，來自活細(xì)胞的發(fā)光量的經(jīng)時測定按照以下步驟進(jìn)行首先，培養(yǎng)細(xì)胞的培育箱具有光度計的功能，接著，對于來 自全部細(xì)胞集團(tuán)的發(fā)光量， 一邊進(jìn)行培養(yǎng)， 一邊利用光度計按照一定時 間進(jìn)行定量。由此，能夠測定具有一定的周期性的表達(dá)節(jié)律等，從而， 能夠捕捉細(xì)胞整體的熒光素酶基因的表達(dá)量的經(jīng)時變化。但是，在上述以往的報告檢測中，細(xì)胞周期的階段不同的多個細(xì)胞 混合存在，各種階段的細(xì)胞作為一組數(shù)據(jù)來處理。因此，對與細(xì)胞周期 有關(guān)的基因進(jìn)行解析時，進(jìn)行同步培養(yǎng)等操作，使細(xì)胞周期的階段一致。[III]以往，廣泛利用能在高倍率和低倍率之間切換標(biāo)本像的成像倍 率來觀察標(biāo)本的顯微鏡裝置。在這種顯微鏡裝置中，近年來提出了如下 的顯微鏡裝置低倍率的觀察視場不受高倍率的物鏡限制，能夠在更寬 的范圍內(nèi)把握標(biāo)本的整體像(例如參照專利文獻(xiàn)2)。在專利文獻(xiàn)2所公 開的顯微鏡裝置中，以低倍率觀察標(biāo)本時，不通過高倍率物鏡，就可以使用焦點深度比以往更深、即標(biāo)本側(cè)的數(shù)值孔徑(NA: Numerical Aperture)比以往更小的低倍率專用的成像透鏡來成像標(biāo)本像。專利文獻(xiàn)1:日本特開2002-335997號公報專利文獻(xiàn)2:日本特開平10-339845號公報非專利文獻(xiàn)1: H丄Ke匿dy， A. E. Pouli， E. K. Ainscow, L. S， Jouaville，R.Rizzuto, G.A.Rutter， " Glucose generates sub-plasma membrane ATP microdomains in single islet P -cells." ， Journal of Biological Chemistry, vol. 274， pp. 13281-13291， 1999發(fā)明內(nèi)容[I]但是，在現(xiàn)有技術(shù)中，利用不同于測定了發(fā)光量的細(xì)胞的其他細(xì) 胞，來確認(rèn)發(fā)光蛋白質(zhì)是否局部存在于細(xì)胞內(nèi)的規(guī)定部位，而且利用熒光抗體法確認(rèn)時，因為細(xì)胞已經(jīng)死亡，所以存在如下問題在作為發(fā)光 量的測定對象的活細(xì)胞中，不一定明確發(fā)光蛋白質(zhì)是否局部存在于該細(xì) 胞內(nèi)的規(guī)定部位，從而也不一定明確來自該細(xì)胞的發(fā)光量是來自規(guī)定部 位的發(fā)光量。特別是在相對于多個細(xì)胞的瞬時性的基因?qū)氲那闆r下，并不是在 所有的細(xì)胞中導(dǎo)入基因，所以對于與作為發(fā)光量的測定對象的活細(xì)胞相 同的細(xì)胞，需要確認(rèn)基因是否已導(dǎo)入到細(xì)胞中，并確認(rèn)在導(dǎo)入有基因的 細(xì)胞內(nèi)的規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)。本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于提供一種規(guī)定部位發(fā) 光量測定方法和規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置，在測定來自活的樣本內(nèi)的規(guī) 定部位的發(fā)光量時，對于與該樣本相同的樣本，能夠確認(rèn)在規(guī)定部位是 否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)。[n]但是，因為以往技術(shù)中的同步培養(yǎng)的操作煩雜，所以具有對于實驗者來說作業(yè)負(fù)擔(dān)大的問題。本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于提供一種表達(dá)量測定 方法，在導(dǎo)入到細(xì)胞的解析對象的基因的表達(dá)量的測定中，不進(jìn)行同步 培養(yǎng)的操作，就能夠辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段，其結(jié)果，能夠減輕實驗者的 作業(yè)負(fù)擔(dān)。[III]但是近年來，在細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等的研究領(lǐng)域中，使作為綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP: Green Fluorescent Protein)和生物發(fā)光酶的 熒光素酶基因發(fā)揮表達(dá)報告的作用，對細(xì)胞內(nèi)的指定部位和功能蛋白質(zhì) 賦予熒光標(biāo)識和發(fā)光標(biāo)識，來觀察活體細(xì)胞的必要性提高。在這樣的細(xì)
胞觀察中，通常為了捕捉表達(dá)量的經(jīng)時變化，在時間序列上需要持續(xù)觀 察細(xì)胞。另外，在使用GFP的觀察中，GFP是根據(jù)激勵光的照射發(fā)出熒光的 蛋白質(zhì)，為了向使GFP作用的標(biāo)本照射大強度的激勵光來獲得熒光，容 易對標(biāo)本造成損傷，觀察限于1 2小時左右。與此相對，在使用熒光素 酶基因的觀察中，熒光素酶基因是自身發(fā)光酶，不會對標(biāo)本造成損傷， 可進(jìn)行幾天 幾周左右的觀察。因此，優(yōu)選使用熒光素酶基因進(jìn)行經(jīng)過 觀察，根據(jù)該觀察結(jié)果適當(dāng)?shù)厍袚Q為使用GFP的觀察，來捕捉標(biāo)本的經(jīng) 時變化。但是，因為從熒光素酶基因發(fā)出的光極其微弱，所以在觀察來自GFP 的熒光時等的熒光觀察中通常使用的高倍率的成像光學(xué)系統(tǒng)、以及標(biāo)本 側(cè)和像側(cè)的NA都很小的以往的低倍率的成像光學(xué)系統(tǒng)中，無法觀察來 自熒光素酶基因的微弱光，至今沒有實現(xiàn)同時進(jìn)行熒光觀察和基于微弱 光的微弱光觀察雙方的顯微鏡裝置。并且，也沒有開發(fā)出根據(jù)基于微弱 光觀察的經(jīng)過觀察的結(jié)果，來即時切換為熒光觀察的顯微鏡裝置。本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于提供一種測定裝置， 能夠適當(dāng)?shù)厍袚Q微弱光觀察和熒光觀察，并且能夠根據(jù)微弱光觀察的觀 察結(jié)果即時切換為熒光觀察。[I]為了解決上述課題并達(dá)成目的，本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定 方法通過測定來自導(dǎo)入了融合基因的活的樣本的發(fā)光量，獲得來自規(guī)定 部位的發(fā)光量，所述融合基因融合了使發(fā)光蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到樣本內(nèi)的所述 規(guī)定部位的轉(zhuǎn)移堿基排列和表達(dá)該發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因，其特征 在于，所述融合基因除了所述轉(zhuǎn)移堿基排列和所述發(fā)光關(guān)聯(lián)基因之外， 還融合了表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因，該規(guī)定部位發(fā)光量測定方法 包括熒光圖像攝像步驟，其對導(dǎo)入有該融合基因的樣本的熒光圖像進(jìn) 行拍攝；判定步驟，其根據(jù)所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像， 判定規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)；以及發(fā)光量測定步驟，其在所 述判定步驟的判定結(jié)果是判定為局部存在的情況下，測定來自樣本的發(fā) 的特征在于，在上述記載 的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法中，當(dāng)導(dǎo)入有所述融合基因的活的樣本在攝 像范圍中存在多個的情況下，該規(guī)定部位發(fā)光量測定方法還包括發(fā)光 圖像攝像步驟，其對多個所述樣本的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝；以及選定步驟， 其通過使所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像和所述發(fā)光圖像攝像 步驟所拍攝的發(fā)光圖像重合，從所述判定步驟的判定結(jié)果是判定為局部 存在的樣本中選定測定對象的樣本，所述熒光圖像攝像步驟對多個所述 樣本的熒光圖像進(jìn)行拍攝，所述判定步驟根據(jù)所述熒光圖像，按照每個 樣本來判定規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)，所述發(fā)光量測定步驟對 來自所述選定步驟所選定的樣本的發(fā)光量進(jìn)行測定。并且，本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法的特征在于，在上述記載 的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法中，通過重復(fù)執(zhí)行所述熒光圖像攝像步驟、 所述判定步驟、所述發(fā)光圖像攝像步驟、所述選定步驟以及所述發(fā)光量 測定步驟，經(jīng)時地獲得來自樣本內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量。并且，本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法的特征在于，在上述記載 的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法中，該規(guī)定部位發(fā)光量測定方法還包括發(fā)光 分離步驟，該步驟按照發(fā)光色的不同分離來自所述樣本的發(fā)光，導(dǎo)入到 所述樣本中的融合基因存在多個，并預(yù)先制作成使按照所述轉(zhuǎn)移堿基排 列所轉(zhuǎn)移的發(fā)光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移目的地部位、從所述發(fā)光蛋白質(zhì)發(fā)出的發(fā) 光的發(fā)光色、以及從所述熒光蛋白質(zhì)發(fā)出的熒光的熒光色的組合分別不 同，所述判定步驟根據(jù)所述熒光圖像，按照每個熒光色判定規(guī)定部位是 否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)，在所述判定步驟的判定結(jié)果是判定為局部存在 的情況下，所述發(fā)光量測定步驟從所述發(fā)光分離步驟所分離的多個發(fā)光 中，指定來自該被判定為局部存在的部位的發(fā)光，測定所指定的發(fā)光的 發(fā)光量。并且，本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法的特征在于，在上述記載 的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法中，所述樣本為試樣、組織、細(xì)胞、個體中 的任意一種。并且，本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法的特征在于，在上述記載
的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法中，該規(guī)定部位發(fā)光量測定方法還包括ATP 定量步驟，該步驟根據(jù)所述發(fā)光量測定步驟所測定的發(fā)光量，對所述選定步驟所選定的樣本內(nèi)規(guī)定部位中的ATP進(jìn)行定量，所述樣本是細(xì)胞，所述規(guī)定部位是線粒體，所述轉(zhuǎn)移堿基排列是線粒體轉(zhuǎn)移信號，所述發(fā) 光蛋白質(zhì)是熒光素酶，所述熒光蛋白質(zhì)是綠色熒光蛋白質(zhì)，除了所述熒 光圖像攝像步驟、所述判定步驟、所述發(fā)光圖像攝像步驟、所述選定步驟以及所述發(fā)光量測定歩驟以外，還重復(fù)執(zhí)行所述ATP定量步驟，由此 經(jīng)時地對來自樣本內(nèi)的規(guī)定部位的ATP進(jìn)行定量。并且，本發(fā)明涉及規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置，本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā) 光量測定裝置通過測定來自導(dǎo)入有融合基因的活的樣本的發(fā)光量，獲得 來自規(guī)定部位的發(fā)光量，所述融合基因融合了使發(fā)光蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到樣本 內(nèi)的所述規(guī)定部位的轉(zhuǎn)移堿基排列和表達(dá)該發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基 因，其特征在于，使用除了所述轉(zhuǎn)移堿基排列和所述發(fā)光關(guān)聯(lián)基因之外， 還融合了表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因的融合基因，該規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置具有熒光圖像攝像單元，其對導(dǎo)入有該融合基因的樣本的熒光圖像進(jìn)行拍攝；判定單元，其根據(jù)所述熒光圖像攝像單元所拍攝的 熒光圖像，判定規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)；以及發(fā)光量測定單 元，其在所述判定單元的判定結(jié)果是判定為局部存在的情況下，測定來 自樣本的發(fā)光量。[II]為了解決上述課題并達(dá)成目的，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法包括發(fā)光測定步驟，其將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、表達(dá)熒光 蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因的活的細(xì)胞作為對象，測定從細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度；熒光測定步驟，其測定從細(xì)胞發(fā)出的熒光 的熒光強度；以及表達(dá)量測定步驟，其根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的 發(fā)光強度或所述熒光測定步驟所測定的熒光強度，測定所述解析對象的 基因的表達(dá)量，其特征在于，所述細(xì)胞除了所述發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、所述熒 光關(guān)聯(lián)基因和所述解析對象的基因之外，還導(dǎo)入了在細(xì)胞周期的規(guī)定階 段中所表達(dá)的細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因，該表達(dá)量測定方法還包括階段辨認(rèn)步 驟，該步驟在所述表達(dá)量測定步驟中使用發(fā)光強度的情況下，根據(jù)所述 熒光測定步驟所測定的熒光強度來判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)， 在所述表達(dá)量測定步驟中使用熒光強度的情況下，根據(jù)所述發(fā)光測定步 驟所測定的發(fā)光強度來判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此辨認(rèn)細(xì) 胞周期的階段。并且，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法的特征在于，在上述記載的表達(dá)量 測定方法中，當(dāng)所述細(xì)胞在攝像范圍中存在多個的情況下，該表達(dá)量測 定方法還包括熒光圖像攝像步驟，其對多個細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行拍攝; 以及發(fā)光圖像攝像步驟，其對所述多個細(xì)胞的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝，所述 發(fā)光測定步驟根據(jù)所述發(fā)光圖像攝像步驟拍攝的發(fā)光圖像，分別測定從 各個細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，所述熒光測定步驟根據(jù)所述熒光圖像 攝像步驟所拍攝的熒光圖像，分別測定從各個細(xì)胞發(fā)出的熒光的熒光強 度，所述表達(dá)量測定步驟根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度或所 述熒光測定步驟所測定的熒光強度，按照每個細(xì)胞測定所述解析對象的 基因的表達(dá)量，所述階段辨認(rèn)步驟在所述表達(dá)量測定步驟中使用發(fā)光強 度的情況下，根據(jù)所述熒光測定步驟所測定的熒光強度，按照每個細(xì)胞 判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，在所述表達(dá)量測定步驟中使用熒光 強度的情況下，根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度，按照每個細(xì) 胞判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此按照每個細(xì)胞辨認(rèn)細(xì)胞周期 的階段。并且，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法的特征在于，在上述記載的表達(dá)量 測定方法中，該表達(dá)量測定方法還包括選擇步驟，該步驟從在所述階段 辨認(rèn)步驟中辨認(rèn)了階段的細(xì)胞中，選擇測定對象的細(xì)胞，所述表達(dá)量測 定步驟根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度或所述熒光測定步驟所 測定的熒光強度，測定導(dǎo)入到所述選擇步驟所選擇的細(xì)胞中的解析對象 的基因的表達(dá)量。并且，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法的特征在于，在上述記載的表達(dá)量 測定方法中，通過重復(fù)執(zhí)行所述發(fā)光圖像攝像步驟、所述熒光圖像攝像 步驟、所述發(fā)光測定步驟、所述熒光測定步驟、 為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊經(jīng)時地測定所述解析對象的基 因的表達(dá)量。并且，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法的特征在于，在上述表達(dá)量測定方 法中，所述表達(dá)量測定步驟將所述選擇步驟所選擇的細(xì)胞作為對象，根 據(jù)所述熒光測定步驟所測定的熒光強度，測定所述解析對象的基因的表 達(dá)量，并且根據(jù)所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像，辨認(rèn)所述解 析對象的基因的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。并且，本發(fā)明涉及表達(dá)量測定方法，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法包括 發(fā)光測定步驟，其將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象 的基因的活的細(xì)胞作為對象，測定從細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度；以及 表達(dá)量測定步驟，其根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度，測定所 述解析對象的基因的表達(dá)量，其特征在于，所述細(xì)胞利用熒光物質(zhì)對其 規(guī)定部位進(jìn)行染色，該表達(dá)量測定方法還包括熒光圖像攝像步驟，其 對該細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行拍攝；以及階段辨認(rèn)步驟，其根據(jù)所述熒光圖 像攝像步驟所拍攝的熒光圖像，判定細(xì)胞的形狀是否發(fā)生了變化，由此 辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。并且，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法的特征在于，在上述記載的表達(dá)量 測定方法中，在所述細(xì)胞在攝像范圍中存在多個的情況下，該表達(dá)量測 定方法還包括發(fā)光圖像攝像步驟，其對多個細(xì)胞的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝， 所述熒光圖像攝像步驟對所述多個細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行拍攝，所述發(fā)光 測定步驟根據(jù)所述發(fā)光圖像攝像步驟所拍攝的發(fā)光圖像，分別測定從各 個細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，所述表達(dá)量測定步驟根據(jù)所述發(fā)光測定 步驟所測定的發(fā)光強度，按照每個細(xì)胞測定所述解析對象的基因的表達(dá) 量，所述階段辨認(rèn)步驟根據(jù)所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像， 按照每個細(xì)胞判定細(xì)胞的形狀是否發(fā)生了變化，由此按照每個細(xì)胞辨認(rèn) 細(xì)胞周期的階段。并且，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法的特征在于，在上述記載的表達(dá)量 測定方法中，該表達(dá)量測定方法還包括選擇步驟，該步驟從在所述階段 辨認(rèn)步驟中辨認(rèn)了階段的細(xì)胞中，選擇測定對象的細(xì)胞，所述表達(dá)量測
定步驟根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度，測定導(dǎo)入到所述選擇 步驟所選擇的細(xì)胞中的解析對象的基因的表達(dá)量。并且，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法的特征在于，在上述記載的表達(dá)量 測定方法中，通過重復(fù)執(zhí)行所述發(fā)光圖像攝像步驟、所述熒光圖像攝像 步驟、所述發(fā)光測定步驟、所述階段辨認(rèn)步驟、所述選擇步驟以及所述 表達(dá)量測定步驟，將所述選擇步驟所選擇的細(xì)胞作為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì) 胞周期的階段， 一邊經(jīng)時地測定所述解析對象的基因的表達(dá)量。[III]為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的測定裝置具有成像光學(xué)系統(tǒng)， 其成像標(biāo)本的標(biāo)本像，該標(biāo)本被賦予發(fā)出微弱光的發(fā)光標(biāo)識和被激勵而 發(fā)出熒光的熒光標(biāo)識并由保持單元保持；以及對該標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的攝 像單元，其特征在于，所述成像光學(xué)系統(tǒng)具有微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)， 其將來自所述發(fā)光標(biāo)識的微弱光成像作為所述標(biāo)本像的微弱光標(biāo)本像； 以及熒光成像光學(xué)系統(tǒng)，其將來自所述熒光標(biāo)識的熒光成像作為所述標(biāo) 本像的熒光標(biāo)本像，所述攝像單元對所述微弱光標(biāo)本像和所述熒光標(biāo)本 像進(jìn)行拍攝。另外，本發(fā)明的測定裝置包含計測裝置，該計測裝置具有 顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述熒光成 像光學(xué)系統(tǒng)具有對所述標(biāo)本進(jìn)行照明的照明單元。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，該測定裝置 具有攝像切換控制單元，該單元根據(jù)所述攝像單元所拍攝的微弱光標(biāo)本 像的像特征，進(jìn)行切換該微弱光標(biāo)本像的拍攝和所述熒光標(biāo)本像的拍攝 的控制。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述像特征 是所述微弱光標(biāo)本像的像強度，在所述像強度大于規(guī)定閾值的情況下， 所述攝像切換控制單元從所述微弱光標(biāo)本像的拍攝切換為所述熒光標(biāo)本 像的拍攝。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述像強度 是所述微弱光標(biāo)本像的整體或部分的像強度，是從規(guī)定時刻到當(dāng)前時刻 的累計的像強度或當(dāng)前時刻的像強度。
并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述熒光成 像光學(xué)系統(tǒng)具有熒光物鏡，其將來自所述熒光標(biāo)識的各點的熒光轉(zhuǎn)換 為大致平行光束；熒光成像透鏡，其聚集由所述熒光物鏡轉(zhuǎn)換為大致平 行光束后的熒光，成像所述熒光標(biāo)本像；熒光單元，其配置在所述熒光 物鏡和所述熒光成像透鏡之間，并具有選擇性地透射用于激勵所述熒 光標(biāo)識的激勵光的激勵光透射濾光器、選擇性地透射來自所述熒光標(biāo)識 的熒光的熒光透射濾光器、和反射所述激勵光并透射所述熒光的二色鏡;以及激勵光照射單元，其具有發(fā)出所述激勵光的激勵光源，通過所述二 色鏡反射來自該激勵光源的激勵光并使其照射到所述標(biāo)本上。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)具有微弱光物鏡，其將來自所述發(fā)光標(biāo)識的各點的微弱 光轉(zhuǎn)換為大致平行光束；微弱光成像透鏡，其聚集由所述微弱光物鏡轉(zhuǎn)換為大致平行光束后的微弱光，成像所述微弱光標(biāo)本像。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述微弱光 成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)相對于所述標(biāo)本配置在相反側(cè)， 所述激勵光照射單元具有不向所述標(biāo)本照射激勵光的未照射單元，所述攝像切換控制單元進(jìn)行如下控制在所述攝像單元拍攝微弱光標(biāo)本像的 情況下，使所述未照射單元不照射激勵光，在所述攝像單元拍攝熒光標(biāo) 本像的情況下，使所述激勵光照射單元照射激勵光。 '并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，該測定裝置 具有視場移動單元，該單元使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像 光學(xué)系統(tǒng)的各視場相對平行移動。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述保持單 元具有標(biāo)本移動單元，該單元使所述標(biāo)本在所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和 所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場內(nèi)移動。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述微弱光 物鏡和所述熒光物鏡是相同的物鏡，所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒 光成像光學(xué)系統(tǒng)共用所述物鏡。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，該測定裝置
具有反射鏡，該反射鏡可插拔地配置在所述物鏡和所述熒光單元之間的 瞳空間，當(dāng)配置在該瞳空間的情況下，將來自所述物鏡的微弱光向所述 微弱光成像透鏡反射，所述激勵光照射單元具有不向所述標(biāo)本照射激勵 光的未照射單元，所述攝像切換控制單元進(jìn)行如下控制在所述攝像單 元拍攝微弱光標(biāo)本像的情況下，將所述反射鏡配置在瞳空間并且使所述 未照射單元不照射激勵光，在所述攝像單元拍攝熒光標(biāo)本像的情況下， 不將所述反射鏡配置在瞳空間并且使所述激勵光照射單元照射激勵光。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述微弱光 成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)相對于所述標(biāo)本配置在相同側(cè)， 所述保持單元具有標(biāo)本移動單元，該單元使所述標(biāo)本在所述微弱光成像 光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場內(nèi)移動，所述攝像切換控制 單元進(jìn)行如下控制在所述攝像單元拍攝微弱光標(biāo)本像的情況下，通過 所述標(biāo)本移動單元使所述標(biāo)本在所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)移 動，在所述攝像單元拍攝熒光標(biāo)本像的情況下，通過所述標(biāo)本移動單元 使所述標(biāo)本在所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)移動。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，該測定裝置 具有光學(xué)系統(tǒng)移動單元，該單元使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光 成像光學(xué)系統(tǒng)移動，以使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué) 系統(tǒng)的各視場包含所述標(biāo)本，所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像 光學(xué)系統(tǒng)相對于所述標(biāo)本配置在相同側(cè)，所述攝像切換控制單元進(jìn)行如 下控制在所述攝像單元拍攝微弱光標(biāo)本像的情況下，通過所述光學(xué)系 統(tǒng)移動單元使該微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)移動，以使所述微弱光成像光學(xué)系 統(tǒng)的視場包含所述標(biāo)本，在所述攝像單元拍攝熒光標(biāo)本像的情況下，通 過所述光學(xué)系統(tǒng)移動單元使該熒光成像光學(xué)系統(tǒng)移動，以使所述熒光成 像光學(xué)系統(tǒng)的視場包含所述標(biāo)本。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述光學(xué)系 統(tǒng)移動單元具有旋轉(zhuǎn)軸，該旋轉(zhuǎn)軸通過連接所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和 所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場的大致中心點的線段的中點，并與所述 微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各光軸大致平行，所述
光學(xué)系統(tǒng)移動單元以該旋轉(zhuǎn)軸為中心，使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所 述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)移動。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述攝像單 元具有對所述微弱光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的微弱光攝像單元；以及對所述 熒光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的熒光攝像單元。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述攝像單 元具有對所述微弱光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的微弱光攝像單元；以及對所述 熒光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的熒光攝像單元，所述光學(xué)系統(tǒng)移動單元使所述微 弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述微弱光攝像單元、以及所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng) 和所述熒光攝像單元分別一體移動。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述微弱光 標(biāo)本像和所述熒光標(biāo)本像分別通過所述微弱光成像透鏡和所述熒光成像 透鏡在大致相同位置上成像，所述攝像單元固定為與所述微弱光標(biāo)本像 和所述熒光標(biāo)本像成像的位置大致一致。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，該測定裝置 具有照明單元，該單元對應(yīng)于所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像 光學(xué)系統(tǒng)中的至少一方，對所述標(biāo)本進(jìn)行透射照明。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述透射照 明是明視場觀察用照明、暗視場觀察用照明、微分干涉觀察用照明以及 相位差觀察用照明中的至少一種。并且，本發(fā)明的測定裝置的特征在于，在上述發(fā)明中，所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)將該微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的標(biāo)本側(cè)的數(shù)值孔徑設(shè)為NAo， 將成像所述微弱光標(biāo)本像的倍率設(shè)為P ，則通過(NAo/e ) 2運算的值大 于等于0.01 (引用本申請人的專利申請即日本特愿2004—342940。)[I]根據(jù)本發(fā)明，通過測定來自導(dǎo)入有融合基因的活的樣本的發(fā)光 量，獲得來自規(guī)定部位的發(fā)光量，該融合基因融合了使發(fā)光蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移 到樣本內(nèi)的規(guī)定部位的轉(zhuǎn)移堿基排列和表達(dá)該發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基 因，融合基因除了轉(zhuǎn)移堿基排列和發(fā)光關(guān)聯(lián)基因之外，還融合了表達(dá)熒 光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因，對導(dǎo)入有該融合基因的樣本的熒光圖像進(jìn)行
拍攝，根據(jù)所拍攝的熒光圖像判定在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)， 在判定結(jié)果是判定為局部存在的情況下，測定來自樣本的發(fā)光量。由此 發(fā)揮如下效果在測定來自活的樣本內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量時，對于與 該樣本相同的樣本，能夠確認(rèn)在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)。并且，根據(jù)本發(fā)明，在導(dǎo)入有融合基因的活的樣本在攝像范圍中存 在多個的情況下，對多個樣本的熒光圖像進(jìn)行拍攝，根據(jù)熒光圖像按照 每個樣本判定在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)，對多個樣本的發(fā)光 圖像進(jìn)行拍攝，通過使所拍攝的熒光圖像和所拍攝的發(fā)光圖像重合，從 判定結(jié)果是判定為局部存在的樣本中選定測定對象的樣本，測定來自所 選定的樣本的發(fā)光量。由此發(fā)揮如下效果能夠從多個樣本中識別各個 樣本，測定來自單一樣本內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量。并且，根據(jù)本發(fā)明，通過重復(fù)執(zhí)行熒光圖像的拍攝、局部存在的判 定、發(fā)光圖像的拍攝、測定對象的樣本的選定以及發(fā)光量的測定，經(jīng)時 獲得來自樣本內(nèi)規(guī)定部位的發(fā)光量。由此發(fā)揮如下效果能夠經(jīng)時地測 定樣本內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量的變動。并且，根據(jù)本發(fā)明，導(dǎo)入到樣本中的融合基因也可以存在多個，并 預(yù)先制作成使按照轉(zhuǎn)移堿基排列所轉(zhuǎn)移的發(fā)光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移目的地部 位、從發(fā)光蛋白質(zhì)發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光色、以及從熒光蛋白質(zhì)發(fā)出的熒光 的熒光色的組合分別不同，按照發(fā)光色的不同分離來自樣本的發(fā)光，根 據(jù)熒光圖像按照每個熒光色判定在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)， 在判定結(jié)果是判定為局部存在的情況下，從分離的多個發(fā)光中指定來自 該被判定為局部存在的部位的發(fā)光，來測定所指定的發(fā)光的發(fā)光量。由 此發(fā)揮如下效果例如能夠同時測定來自一個樣本內(nèi)的多個部位的發(fā)光并且，根據(jù)本發(fā)明，因為樣本為試樣、組織、細(xì)胞、個體中的任意 一種，所以發(fā)揮如下效果能夠?qū)⒏鞣N樣本作為對象。并且，根據(jù)本發(fā)明，樣本是細(xì)胞，規(guī)定部位是線粒體，轉(zhuǎn)移堿基排 列是線粒體轉(zhuǎn)移信號，發(fā)光蛋白質(zhì)是熒光素醇，熒光蛋白質(zhì)是綠色熒光 蛋白質(zhì)，根據(jù)所測定的發(fā)光量，對所選定的樣本內(nèi)的規(guī)定部位中的ATP
進(jìn)行定量，除了熒光圖像的拍攝、局部存在的判定、發(fā)光圖像的拍攝、 測定對象的樣本的選定以及發(fā)光量的測定，還重復(fù)執(zhí)行ATP的定量，由 此經(jīng)時地對來自樣本內(nèi)的規(guī)定部位的ATP進(jìn)行定量。由此發(fā)揮如下效果:能夠經(jīng)時地測定指定的細(xì)胞內(nèi)的線粒體中的ATP量的變動。[II]根據(jù)本發(fā)明，將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、表達(dá) 熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因的活細(xì)胞作為對象，測定 從細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，測定從細(xì)胞發(fā)出的熒光的熒光強度，根 據(jù)所測定的發(fā)光強度或所測定的熒光強度來測定解析對象的基因的表達(dá) 量時，細(xì)胞除了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、熒光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因之外， 還導(dǎo)入了在細(xì)胞周期的規(guī)定階段中所表達(dá)的細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因，在表達(dá) 量的測定中使用發(fā)光強度的情況下，根據(jù)所測定的熒光強度，判定有無 細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，在表達(dá)量的測定中使用熒光強度的情況下， 根據(jù)所測定的發(fā)光強度，判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。由此發(fā)揮如下效果在導(dǎo)入到細(xì)胞中的解析對象的基 因表達(dá)量的測定中，不進(jìn)行同步培養(yǎng)的操作，就能夠?qū)υ摷?xì)胞進(jìn)行細(xì)胞 周期的階段的辨認(rèn)，其結(jié)果，能夠減輕實驗者的作業(yè)負(fù)擔(dān)。并且發(fā)揮如 下效果能夠評價解析對象的基因和細(xì)胞周期的階段之間的關(guān)聯(lián)性。具 體而言，關(guān)于與細(xì)胞周期的直接關(guān)系不明確的解析對象的基因，因為能 夠與細(xì)胞周期的階段一起獲得藥劑投放和溫度變化等刺激引起的表達(dá)量 的變化，所以發(fā)揮如下效果能夠驗證該解析對象的基因和細(xì)胞周期之 間的關(guān)系。并且，關(guān)于揭示了與細(xì)胞周期的直接關(guān)系的解析對象的基因， 因為能夠一起取得該解析對象的基因的表達(dá)量和細(xì)胞周期的階段，所以 發(fā)揮如下效果能夠評價該解析對象的基因作為細(xì)胞周期標(biāo)記是否有用。 并且，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)細(xì)胞在攝像范圍中存在多個的情況下，對多 個細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行拍攝，對多個細(xì)胞的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝，根據(jù)所 拍攝的發(fā)光圖像分別測定從各細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，根據(jù)所拍攝 的熒光圖像分別測定從各細(xì)胞發(fā)出的熒光的熒光強度，根據(jù)所測定的發(fā) 光強度或所測定的熒光強度，按照每個細(xì)胞測定解析對象的基因的表達(dá) 量，在表達(dá)量的測定中使用發(fā)光強度的情況下，根據(jù)所測定的熒光強度，
按照每個細(xì)胞判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，在表達(dá)量的測定中使 用熒光強度的情況下，根據(jù)所測定的發(fā)光強度，按照每個細(xì)胞判定有無 細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此按照每個細(xì)胞辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。由 此發(fā)揮如下效果能夠?qū)⒍鄠€細(xì)胞作為對象，按照每個細(xì)胞測定解析對 象的基因的表達(dá)量，并且按照每個細(xì)胞辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。并且發(fā)揮 如下效果能夠按照每個細(xì)胞評價解析對象的基因和細(xì)胞周期的階段之 間的關(guān)聯(lián)性。并且，根據(jù)本發(fā)明，從辨認(rèn)了階段的細(xì)胞中選擇測定對象的細(xì)胞， 根據(jù)所測定的發(fā)光強度或所測定的熒光強度，測定導(dǎo)入到所選擇的細(xì)胞 中的解析對象的基因的表達(dá)量。由此發(fā)揮如下效果能夠從多個細(xì)胞中 識別各個細(xì)胞，將單一細(xì)胞作為對象，測定解析對象的基因的表達(dá)量， 并且辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。并且，根據(jù)本發(fā)明，通過重復(fù)執(zhí)行發(fā)光圖像的拍攝、熒光圖像的拍 攝、發(fā)光強度的測定、熒光強度的測定、階段的辨認(rèn)、細(xì)胞的選擇和表 達(dá)量的測定，將所選擇的細(xì)胞作為對象， 一 邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段，一 邊經(jīng)時地測定解析對象的基因的表達(dá)量。由此發(fā)揮如下效果能夠?qū)?--的細(xì)胞作為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊經(jīng)時地測定解析對 象的基因的表達(dá)量的變動。并且，根據(jù)本發(fā)明，在表達(dá)量的測定中，將所選擇的細(xì)胞作為對象， 根據(jù)所測定的熒光強度來測定解析對象的基因的表達(dá)量，并且根據(jù)所拍 攝的熒光圖像辨認(rèn)解析對象的基因的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。由此發(fā)揮如下 效果不僅能夠評價解析對象的基因和細(xì)胞周期的階段之間的關(guān)聯(lián)性， 而且能夠獲得解析對象的基因的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。并且，根據(jù)本發(fā)明，將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解 析對象的基因的活細(xì)胞作為對象，測定從細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度， 根據(jù)所測定的發(fā)光強度來測定解析對象的基因的表達(dá)量時，細(xì)胞利用熒 光物質(zhì)對其規(guī)定部位(具體而言為核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)進(jìn)行染色， 對該細(xì)胞的熒光圖像迸行拍攝，根據(jù)所拍攝的熒光圖像判定細(xì)胞的形狀 是否發(fā)生了變化，由此辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。由此發(fā)揮如下效果在導(dǎo)
入到細(xì)胞中的解析對象的基因表達(dá)量的測定中，不進(jìn)行同步培養(yǎng)的操作， 就能夠辨認(rèn)該細(xì)胞的細(xì)胞周期的階段，其結(jié)果，能夠減輕實驗者的作業(yè) 負(fù)擔(dān)。并且發(fā)揮如下效果能夠評價解析對象的基因和細(xì)胞周期的階段 之間的關(guān)聯(lián)性。具體而言，關(guān)于與細(xì)胞周期的直接關(guān)系不明確的解析對 象的基因，因為能夠與細(xì)胞周期的階段一起獲得藥劑投放和溫度變化等 刺激引起的表達(dá)量的變化，所以發(fā)揮如下效果能夠驗證該解析對象的 基因和細(xì)胞周期之間的關(guān)系。并且，關(guān)于揭示了與細(xì)胞周期的直接關(guān)系 的解析對象的基因，因為能夠一起取得該解析對象的基因的表達(dá)量和細(xì) 胞周期的階段，所以發(fā)揮如下效果能夠評價該解析對象的基因作為細(xì) 胞周期標(biāo)記是否有用。并且，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)細(xì)胞在攝像范圍中存在多個的情況下，對多 個細(xì)胞的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝，對多個細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行拍攝，根據(jù)所 拍攝的發(fā)光圖像分別測定從各細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，根據(jù)所測定 的發(fā)光強度，按照每個細(xì)胞測定解析對象的基因的表達(dá)量，根據(jù)所拍攝 的熒光圖像按照每個細(xì)胞判定細(xì)胞的形狀是否發(fā)生了變化，由此按照每 個細(xì)胞辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。由此發(fā)揮如下效果能夠?qū)⒍鄠€細(xì)胞作為 對象，按照每個細(xì)胞測定解析對象的基因的表達(dá)量，并且按照每個細(xì)胞 辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。并且發(fā)揮如下效果能夠按照每個細(xì)胞評價解析 對象的基因和細(xì)胞周期的階段之間的關(guān)聯(lián)性。并且，根據(jù)本發(fā)明，從辨認(rèn)了階段的細(xì)胞中選擇測定對象的細(xì)胞， 根據(jù)所測定的發(fā)光強度，測定導(dǎo)入到所選擇的細(xì)胞中的解析對象的基因 的表達(dá)量。由此發(fā)揮如下效果能夠從多個細(xì)胞中識別各個細(xì)胞，將單 一細(xì)胞作為對象，測定解析對象的基因的表達(dá)量，并且辨認(rèn)細(xì)胞周期的 階段。并且，根據(jù)本發(fā)明，通過重復(fù)執(zhí)行發(fā)光圖像的拍攝、熒光圖像的拍 攝、發(fā)光強度的測定、階段的辨認(rèn)、細(xì)胞的選擇和表達(dá)量的測定，將所 選擇的細(xì)胞作為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊經(jīng)時地測定解析 對象的基因的表達(dá)量。由此發(fā)揮如下效果能夠?qū)我坏募?xì)胞作為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊經(jīng)時地測定解析對象的基因的表達(dá)量的變動。[III]根據(jù)本發(fā)明的測定裝置，能夠針對由保持單元保持的同一標(biāo)本， 單獨執(zhí)行微弱光觀察和熒光觀察，并且能夠根據(jù)微弱光觀察的觀察結(jié)果 即時切換為熒光觀察。


圖1是表示規(guī)定部位發(fā)光圖2是表示規(guī)定部位發(fā)光 的結(jié)構(gòu)的一例的圖。圖3是表示規(guī)定部位發(fā)光 的結(jié)構(gòu)的另-一例的圖。圖4是表示規(guī)定部位發(fā)光 構(gòu)的一例的框圖。圖5是表示規(guī)定部位發(fā)光圖。圖6是表示熒光圖像攝像單元108所拍攝的明視場像和熒光像的一 例的圖。圖7是表示發(fā)光圖像攝像單元106所拍攝的明視場像和熒光像的一 例的圖。圖8是以時間序列表示發(fā)光圖像攝像單元106和熒光圖像攝像單元 108所拍攝的重合圖像的一例的圖。圖9是表示所指定的細(xì)胞的發(fā)光強度的經(jīng)時變動的一例的圖。圖10是表示融合了 GFP-線粒體轉(zhuǎn)移信號-熒光素酶的質(zhì)粒載體的圖。圖11是表示熒光圖像攝像單元108所拍攝的、導(dǎo)入了質(zhì)粒載體的 HeLa細(xì)胞的明視場像和熒光像的圖。圖12是表示發(fā)光圖像攝像單元106所拍攝的、導(dǎo)入了質(zhì)粒載體的 HeLa細(xì)胞的明視場像和發(fā)光像的圖。圖13是表示所指定的HeLa細(xì)胞的發(fā)光強度的經(jīng)時變動的圖。量測定裝置100的整體結(jié)構(gòu)的一例的圖。 量測定裝置100的發(fā)光圖像攝像單元106量測定裝置100的發(fā)光圖像攝像單元106量測定裝置100的信息通信終端110的結(jié)量測定裝置100進(jìn)行的處理的一例的流程
圖14是表示規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100的整體結(jié)構(gòu)的一例的圖。圖15是表示規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100的整體結(jié)構(gòu)的一例的圖。 圖16是表示規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100的整體結(jié)構(gòu)的一例的圖。 圖17是表示導(dǎo)入EGFP-Luc基因后的HeLa細(xì)胞的熒光圖像的圖。 圖18是表示對導(dǎo)入EGFP-Luc基因后的HeLa細(xì)胞的明視場圖像和熒光圖像進(jìn)行了重合的圖像的圖。圖19是表示導(dǎo)入EGFP-Luc基因后的HeLa細(xì)胞的發(fā)光圖像的圖。圖20是表示表達(dá)量測定裝置1000的整體結(jié)構(gòu)的一例的圖。圖21是表示表達(dá)量測定裝置1000的發(fā)光圖像攝像單元1060的結(jié)構(gòu)的一例的圖。圖22是表示表達(dá)量測定裝置1000的發(fā)光圖像攝像單元1060的結(jié)構(gòu)的另一例的圖。圖23是表示表達(dá)量測定裝置1000的信息通信終端1100的結(jié)構(gòu)的一 例的框圖。圖24是表示表達(dá)量測定裝置1000進(jìn)行的處理的一例的流程圖。 圖25是表示本發(fā)明實施方式1的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的圖。 圖26是表示圖25所示的顯微鏡裝置切換微弱光觀察和熒光觀察的 攝像切換處理的處理步驟的流程圖。圖27是表示本發(fā)明實施方式2的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的圖。圖28是表示本發(fā)明實施方式2的顯微鏡裝置的變形例的結(jié)構(gòu)的圖。圖29是表示本發(fā)明實施方式3的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的圖。圖30是表示本發(fā)明實施方式4的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的圖。圖31是表示本發(fā)明實施方式5的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的圖。圖32是表示本發(fā)明實施方式5的顯微鏡裝置的變形例的結(jié)構(gòu)的圖。圖33是表示本發(fā)明實施方式5的顯微鏡裝置的變形例的結(jié)構(gòu)的圖。圖34是表示本發(fā)明實施方式5的顯微鏡裝置的變形例的結(jié)構(gòu)的圖。標(biāo)號說明100規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置 102樣本103容器104載置臺106發(fā)光圖像攝像單元106a物鏡(發(fā)光觀察用)106b 二色鏡106c CCD照相機(jī)106d裂像單元106e濾光輪106f成像透鏡 108熒光圖像攝像單元108a物鏡(熒光觀察用)108b 二色鏡108c光源I08d CCD照相機(jī)108e成像透鏡108f快門108g激勵用分光濾光器108h光纖108i聚束透鏡108j發(fā)光/熒光分光用濾光器 IIO信息通信終端 112控制部112a熒光圖像攝像指示部 112b熒光圖像取得部 112c判定部112d發(fā)光圖像攝像指示部112e發(fā)光圖像取得部112f選定部112g發(fā)光量測定部 U2h關(guān)聯(lián)物質(zhì)定量部 114時鐘產(chǎn)生部 116存儲部U8通信接口部120輸入輸出接口部122輸入部124輸出部 1000表達(dá)量測定裝置 1020細(xì)胞 1030容器 1040載置臺1060發(fā)光圖像攝像單元1060a物鏡(發(fā)光觀察用)1060b 二色鏡1060c CCD照相機(jī)1060d裂像單元1060e濾光輪 1080熒光圖像攝像單元1080a物鏡(熒光觀察用)1080b 二色鏡1080c氤氣燈1080d CCD照相機(jī) IIOO信息通信終端1120控制部1120a熒光圖像攝像指示部 1120b發(fā)光圖像攝像指示部 1120c熒光圖像取得部 1120d發(fā)光圖像取得部 U20e判定部
1120f熒光測定部 1120g發(fā)光測定部1120h階段辨認(rèn)部1120i選擇部1120J表達(dá)量測定部1140時鐘產(chǎn)生部1160存儲部1180通信接口部1200輸入輸出接口部1220輸入部1240輸出部1、 11物鏡2、 12、 32成像透鏡3、 13攝像裝置 4激勵光源 5透鏡6熒光立方體 6a激勵濾光器 6b吸收濾光器 6c 二色鏡7、 17保持部 7a保持部件7b、 17b可動載置臺8、 18載置臺驅(qū)動部 9監(jiān)視器14旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置15a、 15b固定軸21、 22、 23、 24、 25、 26殼體33、 43快門34反射鏡35光路切換驅(qū)動部44白色光源 45照明透鏡系統(tǒng) 45a聚光透鏡(collector lens) 45b聚束透鏡(condenser lens ) 46照明驅(qū)動部100a、 200、 300、 400、 500、 600、 700、 800、卯0顯微鏡裝置101、 201熒光顯微鏡單元102a、 202微弱光顯微鏡單元103a透射照明單元104a、 105熒光照明單元PC1 PC9控制裝置S標(biāo)本具體實施方式
[I]以下根據(jù)附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法和規(guī) 定部位發(fā)光量測定裝置的實施方式。另外，該實施方式不限定本發(fā)明。首先，參照圖1 圖3說明實現(xiàn)本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置 100的結(jié)構(gòu)。圖1是表示規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100的整體結(jié)構(gòu)的一例 的圖。如圖1所示，規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100由樣本102、收納樣本 102的容器103 (具體為培養(yǎng)皿、載玻片、微板、凝膠支持體、微粒子載 體等)、配置容器103的載置臺104、發(fā)光圖像攝像單元106、熒光圖像 攝像單元108以及信息通信終端110構(gòu)成。并且，在規(guī)定部位發(fā)光量測 定裝置100中，如圖所示，發(fā)光圖像攝像單元106中包含的物鏡106a和 熒光圖像攝像單元108中包含的物鏡108a隔著樣本102、容器103和載 置臺104配置在上下對置的位置上。另外，如圖14所示，也可以調(diào)換發(fā) 光圖像攝像單元106和熒光圖像攝像單元108的配置。通過將用于測定 比熒光更微弱的發(fā)光的發(fā)光圖像攝像單元106配置在下側(cè)，能夠通過蓋 開閉而完全遮蔽來自樣本上方的干擾光，能夠增加發(fā)光圖像的S/N比。獨立于發(fā)光圖像攝像單元106的熒光圖像攝像單元108也可以是激光掃 描式的光學(xué)系統(tǒng)。再返回圖l，樣本102是導(dǎo)入了融合基因的樣本，該融合基因除了使 發(fā)光蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到樣本102內(nèi)的規(guī)定部位(例如線粒體、細(xì)胞質(zhì)、核等) 的轉(zhuǎn)移堿基排列和表達(dá)該發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因之外，還融合了表 達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因。并且，樣本102是活的樣本，例如為試 樣、組織、細(xì)胞、個體等。另外，樣本102具體而言也可以是導(dǎo)入了混 入有該融合基因的質(zhì)粒載體的樣本。發(fā)光圖像攝像單元106具體而言是正立型發(fā)光顯微鏡，對樣本102 的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝。如圖所示，發(fā)光圖像攝像單元106由物鏡106a、 二色鏡106b、 CCD照相機(jī)106c和成像透鏡106f構(gòu)成。物鏡106a具體而 言是(數(shù)值孔徑/倍率)2的值大于等于0.01的物鏡。二色鏡106b按照 顏色的不同來分離從樣本102發(fā)出的發(fā)光，用于使用二色的發(fā)光按照顏 色的不同來測定發(fā)光量的情況。CCD照相機(jī)106c對經(jīng)由物鏡106a、 二 色鏡106b和成像透鏡106f投影到該CCD照相機(jī)106c的芯片面上的樣本 102的發(fā)光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍攝。并且，CCD照相機(jī)106c以有線 或無線的方式與信息通信終端110可通信地連接。這里，當(dāng)樣本102在 攝像范圍中存在多個的情況下，CCD照相機(jī)106c也可以對包含在該攝像 范圍中的多個樣本102的發(fā)光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍攝。成像透鏡106f 成像經(jīng)由物鏡106a和二色鏡106b入射到該成像透鏡106f的像(具體而 言為包含樣本102的像)。另外，在圖1中，示出利用2臺CCD照相機(jī) 106c分別對與二色鏡106b所分離的2個發(fā)光對應(yīng)的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的 情況的一例，使用1個發(fā)光的情況下，發(fā)光圖像攝像單元106也可以由 物鏡106a、 1臺CCD照相機(jī)106c和成像透鏡106f構(gòu)成。這里，在使用二色的發(fā)光按照顏色的不同測定發(fā)光量的情況下，如 圖2所示，發(fā)光圖像攝像單元106也可以由物鏡106a、 CCD照相機(jī)106c、 裂像單元106d和成像透鏡106f構(gòu)成。而且，CCD照相機(jī)106c也可以對
經(jīng)由裂像單元106d和成像透鏡106f投影到該CCD照相機(jī)106c的芯片面 上的樣本102的發(fā)光圖像(裂像)和明視場像進(jìn)行拍攝。裂像單元106d 按照顏色的不同來分離從樣本102發(fā)出的發(fā)光，與二色鏡106b同樣，用 于使用二色的發(fā)光按照顏色的不同來測定發(fā)光量的情況。并且，在使用多色的發(fā)光按照顏色的不同來測定發(fā)光量的情況下(即 使用多色的發(fā)光的情況)，如圖3所示，發(fā)光圖像攝像單元106也可以由 物鏡106a、 CCD照相機(jī)106c、濾光輪106e和成像透鏡106f構(gòu)成。而且， CCD照相機(jī)106c也可以對經(jīng)由濾光輪106e和成像透鏡106f投影到該 CCD照相機(jī)106c的芯片面上的樣本102的發(fā)光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍 攝。濾光輪106e通過過濾交換按照顏色的不同來分離從樣本102發(fā)出的 發(fā)光，用于使用多色的發(fā)光按照顏色的不同來測定發(fā)光量的情況。再返回圖1，熒光圖像攝像單元108具體而言是倒立型熒光顯微鏡， 對樣本102的熒光圖像進(jìn)行拍攝。如圖所示，熒光圖像攝像單元108由 物鏡108a、 二色鏡108b、光源108c、 CCD照相機(jī)108d、成像透鏡108e 和快門108f構(gòu)成。物鏡108a具體而言是(數(shù)值孔徑/倍率)2的值大于 等于0.01的物鏡。二色鏡108b透射來自樣本102的熒光，并且改變激勵 光的方向，以使從光源108c照射的激勵光向樣本102照射。光源108c 用于照射激勵光，具體而言是氙氣燈、鹵素等的燈、激光器、LED等。 CCD照相機(jī)108d對經(jīng)由物鏡108a、 二色鏡108b和成像透鏡108e投影 到該CCD照相機(jī)108d的芯片面上的樣本102的熒光圖像和明視場圖像 進(jìn)行拍攝。并且，CCD照相機(jī)108d以有線或無線的方式與信息通信終端 IIO可通信地連接。這里，當(dāng)樣本102在攝像范圍中存在多個的情況下， CCD照相機(jī)108d也可以對包含在該攝像范圍中的多個樣本102的熒光圖 像和明視場圖像進(jìn)行拍攝。成像透鏡108e成像經(jīng)由物鏡108a和二色鏡 108b入射到該成像透鏡108e上的像(具體而言為包含樣本102的像)。 快門108f切換從光源108c照射的激勵光。換言之，快門108f通過透射 或遮蔽從光源108c照射的激勵光，來切換向樣本102照射的激勵光。這里，發(fā)光圖像攝像單元106和熒光圖像攝像單元108具體而言也 可以分別是倒立型發(fā)光顯微鏡和倒立型熒光顯微鏡，載置臺104也可以旋轉(zhuǎn)。并且，圖1和圖14所示的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100是分別具有發(fā)光圖像攝像單元106和熒光圖像攝像單元108的結(jié)構(gòu)，但是如圖15所 示，規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100也可以是僅具有熒光圖像攝像單元108 的結(jié)構(gòu)。換言之，規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100也可以是僅利用熒光圖 像攝像單元108進(jìn)行熒光觀察和發(fā)光觀察這雙方的結(jié)構(gòu)。另外，在利用 圖15所示的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100進(jìn)行熒光/發(fā)光觀察的情況下， 規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100優(yōu)選為如下結(jié)構(gòu)拍攝發(fā)光圖像(進(jìn)行發(fā) 光檢測)時，可以自動或手動地進(jìn)行快門108f的切換，并且可以自動或 手動地將二色鏡108b移動到偏離光路(圖15中的點劃線)的位置上。 由此能夠減小發(fā)光圖像中的噪聲。并且，在圖15所示的規(guī)定部位發(fā)光量 測定裝置100的情況下，物鏡108a具體而言優(yōu)選滿足"(數(shù)值孔徑/倍率)2的值大于等于o.or的條件。并且如圖16所示，規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100也可以為從樣本102 的上方進(jìn)行激勵光的照射，并且從樣本102的下方進(jìn)行熒光/發(fā)光觀察的 結(jié)構(gòu)。這里僅說明圖16所示的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100的結(jié)構(gòu)中之 前沒有說明的結(jié)構(gòu)。激勵用分光濾光器108g將從光源108c發(fā)出的激勵 光分離為波長區(qū)域不同的多個激勵光。光纖108h將激勵用分光濾光器 108g所分離的各激勵光導(dǎo)向樣本102。聚束透鏡108i是用于均等地對樣 本102進(jìn)行照明的透鏡，聚集由光纖108h引導(dǎo)的各激勵光。發(fā)光/熒光分 光用濾光器108j利用強度和波長等的差異分離從樣本102放出的熒光和 發(fā)光。另外，在圖16所示的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置IOO的情況下，物 鏡108a具體而言優(yōu)選滿足"(數(shù)值孔徑/倍率)2的值大于等于0.01"的 條件。再返回圖1，信息通信終端110具體而言是個人計算機(jī)。并且如圖4 所示，信息通信終端IIO大體由控制部112、對系統(tǒng)的時刻進(jìn)行計時的時 鐘產(chǎn)生部114、存儲部116、通信接口部118、輸入輸出接口部120、輸 入部122和輸出部124構(gòu)成，這些各部經(jīng)由總線連接。存儲部116是存儲單元，具體而言能夠使用RAM和ROM等的存儲器裝置、硬盤這樣的固定磁盤裝置、軟盤和光盤等。而且，存儲部116 存儲由控制部112的各部的處理而得到的數(shù)據(jù)等。通信接口部118是信息通信終端110、 CCD照相機(jī)106c和CCD照 相機(jī)108d之間的通信的媒介。即，通信接口部118具有經(jīng)由有線或無線 的通信線路與其他終端進(jìn)行數(shù)據(jù)通信的功能。輸入輸出接口部120與輸入部122和輸出部124連接。這里，輸出 部124除了監(jiān)視器(包含家庭用電視機(jī))以外，還可以使用揚聲器和打 印機(jī)(另夕卜，以下有時將輸出部124記載為監(jiān)視器。)。并且，輸入部122 除了鍵盤、鼠標(biāo)和麥克風(fēng)之外，還可以使用與鼠標(biāo)協(xié)作來實現(xiàn)指示裝置 功能的監(jiān)視器?？刂撇?12具有用于存儲0S (Operating System)等的控制程序、規(guī) 定各種處理步驟等的程序和所需要的數(shù)據(jù)的內(nèi)部存儲器，根據(jù)這些程序 來執(zhí)行各種處理。而且，控制部102大體由熒光圖像攝像指示部112a、 熒光圖像取得部112b、判定部112c、發(fā)光圖像攝像指示部112d、發(fā)光圖 像取得部U2e、選定部112f、發(fā)光量測定部112g和關(guān)聯(lián)物質(zhì)定量部112h 構(gòu)成。熒光圖像攝像指示部112a經(jīng)由通信接口部116向CCD照相機(jī)108d 指示熒光圖像和明視場圖像的拍攝。熒光圖像取得部112b經(jīng)由通信接口 部116取得由CCD照相機(jī)108d拍攝的熒光圖像和明視場圖像。判定部112c根據(jù)熒光圖像取得部112b取得的熒光圖像和明視場圖 像，判定在樣本102中是否導(dǎo)入了融合基因，或判定在規(guī)定部位是否局 部存在發(fā)光蛋白質(zhì)。這里，在熒光圖像取得部112b取得的熒光圖像和明 視場圖像中存在多個樣本102的情況下，判定部112c也可以根據(jù)熒光圖 像和明視場圖像，按照每個樣本102判定在樣本102中是否導(dǎo)入了融合 基因，或按照每個樣本102判定在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)。判定發(fā)光圖像攝像指示部112d經(jīng)由通信接口部116向CCD照相機(jī) 106c指示發(fā)光圖像和明視場圖像的拍攝。發(fā)光圖像取得部112e經(jīng)由通信 接口部116取得由CCD照相機(jī)06c拍攝的發(fā)光圖像和明視場圖像。選定部U2f使熒光圖像取得部112b取得的熒光圖像和明視場圖像、
與發(fā)光圖像取得部112e取得的發(fā)光圖像和明視場圖像重合，從而從判定 部112c的判定結(jié)果是判定為局部存在的樣本102中選定測定對象的樣本 102。發(fā)光量計測部112g根據(jù)發(fā)光圖像測定來自判定部112c的判定結(jié)果 是判定為局部存在的樣本102和選定部112f所選定的樣本102的發(fā)光量。 關(guān)聯(lián)物質(zhì)定量部112g根據(jù)發(fā)光量計測部112g測定的發(fā)光量，對與該發(fā) 光量的增減直接或間接關(guān)聯(lián)的物質(zhì)的量進(jìn)行定量。例如，在發(fā)光蛋白質(zhì) 是熒光素酶的情況下，關(guān)聯(lián)物質(zhì)定量部112g例如對與該熒光素酶的發(fā)光 量的增減直接關(guān)聯(lián)的物質(zhì)即ATP的量進(jìn)行定量。即，關(guān)聯(lián)物質(zhì)定量部112g 能夠用作根據(jù)發(fā)光量計測部U2g測定的發(fā)光量對ATP進(jìn)行定量的ATP 定量單元。在以上的結(jié)構(gòu)中，參照圖5說明規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100進(jìn)行 的處理的一例。另外，以下說明在多個樣本102中導(dǎo)入相同的融合基因， 經(jīng)時測定多個樣本102中指定的樣本102中的規(guī)定部位的發(fā)光量時的處理的一例。首先，信息通信終端110在熒光圖像攝像指示部110a的處理中，經(jīng) 由通信接口部116向CCD照相機(jī)108d指示熒光圖像和明視場圖像的拍 攝(步驟SA-1)。接著，CCD照相機(jī)108d對攝像范圍中存在的多個樣本 102的熒光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍攝(步驟SA-2:參照圖6)，發(fā)送給 信息通信終端110 (步驟SA-3)。另外，激勵光僅在拍攝熒光圖像時向樣 本102照射。接著，信息通信終端110在熒光圖像取得部112b的處理中， 經(jīng)由通信接口部116取得由CCD照相機(jī)108d拍攝的熒光圖像和明視場 圖像，存儲在存儲部116的規(guī)定存儲區(qū)域內(nèi)(步驟SA-4)。接著，信息通信終端110在判定部112c的處理中，通過比較熒光圖 像和明視場圖像，按照每個樣本102判定是否導(dǎo)入了融合基因，并對判 定為導(dǎo)入了融合基因的樣本102進(jìn)一步判定在該樣本102的規(guī)定部位是 否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)(步驟SA-5)。由此，如圖6所示，例如能夠從多 個樣本102 (細(xì)胞1 細(xì)胞5)中，確認(rèn)導(dǎo)入了融合基因并且在規(guī)定部位 局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)的樣本(細(xì)胞l)。
接著，在存在有導(dǎo)入了融合基因并且在規(guī)定部位局部存在發(fā)光蛋白 質(zhì)的樣本102的情況下(步驟SA-6:"是")，信息通信終端110在發(fā)光圖像攝像指示部112d的處理中，經(jīng)由通信接口部116向CCD照相機(jī)106c 指示發(fā)光圖像和明視場圖像的拍攝(步驟SA-7)。接著，CCD照相機(jī)106c 對攝像范圍中存在的多個樣本102的發(fā)光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍攝(步 驟SA-8:參照圖7)，發(fā)送給信息通信終端110 (步驟SA-9)。另外，在 圖7所示的發(fā)光圖像中，作為一例示出細(xì)胞2的發(fā)光最強的情況。接著，信息通信終端110在發(fā)光圖像取得部112e的處理中，經(jīng)由通 信接口部116取得由CCD照相機(jī)106c拍攝的發(fā)光圖像和明視場圖像， 并且在控制部112的處理中，從時鐘產(chǎn)生部114取得時刻(與后述的圖8 中的T,對應(yīng))，將發(fā)光圖像和明視場圖像以及時刻進(jìn)一步與已經(jīng)存儲的熒 光圖像和明視場圖像對應(yīng)起來，存儲在存儲部116的規(guī)定存儲區(qū)域內(nèi)(步 驟SA陽IO)。接著，信息通信終端110在選定部112f的處理中，使明視場圖像、 熒光圖像和發(fā)光圖像重合，從而從判定部112c的判定結(jié)果是判定為局部 存在的樣本中選定(指定)測定對象的樣本(步驟SA-ll)。另外，在圖 6所示的例子中，因為導(dǎo)入了融合基因并且在規(guī)定部位局部存在發(fā)光蛋白 質(zhì)的細(xì)胞僅是細(xì)胞l，所以在步驟SA-11中，如圖8所示，細(xì)胞l自動被 指定。接著，信息通信終端IIO在發(fā)光量計測部112g的處理中，根據(jù)發(fā)光 圖像測定與所選定的樣本102對應(yīng)的發(fā)光量(發(fā)光強度)，將識別所選定 的樣本102 (例如圖8中的細(xì)胞1)的識別信息和該發(fā)光量進(jìn)一步與已經(jīng) 存儲的熒光圖像、發(fā)光圖像、明視場圖像和時刻對應(yīng)起來，存儲在存儲 部116的規(guī)定存儲區(qū)域內(nèi)(步驟SA-12)。而且，信息通信終端110在控制部112的處理中，以例如預(yù)先設(shè)定 的時間間隔重復(fù)執(zhí)行規(guī)定次數(shù)的上述步驟SA-1 步驟SA-12 (步驟 SA-13)，從而如圖9所示，經(jīng)時地(例如按照圖8和圖9所示的時刻T, T4)獲得所選定的樣本102 (例如圖6、圖7和圖8所示的細(xì)胞1)內(nèi)規(guī) 定部位的發(fā)光量的變動。
如以上詳細(xì)說明的那樣，根據(jù)規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，導(dǎo)入到 樣本102的融合基因除了轉(zhuǎn)移堿基排列和發(fā)光關(guān)聯(lián)基因之外，還融合了 表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因，對導(dǎo)入有該融合基因的樣本102的熒 光圖像進(jìn)行拍攝，根據(jù)所拍攝的熒光圖像判定在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)，在判定結(jié)果是判定為局部存在的情況下，測定來自樣本102 的發(fā)光量。由此，在測定來自活的樣本102內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量時， 對于與該樣本102相同的樣本，能夠確認(rèn)在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光 蛋白質(zhì)。并且，因為對于導(dǎo)入有融合基因的活的樣本，確認(rèn)發(fā)光蛋白質(zhì) 的局部存在，并且測定來自該樣本的發(fā)光量，所以來自樣本的發(fā)光量與 來自規(guī)定部位的發(fā)光量明確地對應(yīng)起來，能夠確保所測定的發(fā)光量是來 自規(guī)定部位的發(fā)光量的可靠性。另外，樣本102例如是細(xì)胞的情況下， 不對沒有取入發(fā)光成分的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，能夠進(jìn)行準(zhǔn)確的統(tǒng)計解析。并 且，規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100例如能夠適當(dāng)?shù)赜糜诟鞣N反應(yīng)(例如 藥物刺激和光照射等)的檢査和治療等。并且，根據(jù)規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，在導(dǎo)入有融合基因的活的 樣本102在攝像范圍中存在多個的情況下，對多個樣本102的熒光圖像 進(jìn)行拍攝，根據(jù)熒光圖像按照每個樣本102判定在規(guī)定部位是否局部存 在發(fā)光蛋白質(zhì)，對多個樣本102的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝，通過使所拍攝的 熒光圖像和所拍攝的發(fā)光圖像重合，從判定結(jié)果是判定為局部存在的樣 本102中選定測定對象的樣本102，測定來自所選定的樣本102的發(fā)光量。 由此，能夠從多個樣本102中識別各個樣本102，測定來自單一樣本102 內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量。并且，在圖像中取得熒光和發(fā)光，從而能夠獲 得與測定對象的樣本102相同的樣本102中的發(fā)光蛋白質(zhì)的局部存在、 和從該樣本102發(fā)出的發(fā)光強度。因此，能夠進(jìn)行如下的解析，即排 除基因的導(dǎo)入效率和細(xì)胞周期引起的各個細(xì)胞的生理狀態(tài)的差異的影 響。這里，在本實施方式的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100中，如圖5所 示，作為一例，進(jìn)行如下處理拍攝熒光圖像后，進(jìn)行在規(guī)定部位是否 局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)的判定，然后在判定為局部存在的情況下拍攝發(fā)光 圖像，但是，發(fā)光圖像的拍攝也可以與熒光圖像的拍攝一起進(jìn)行。換言
之，規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置ioo也可以在拍攝熒光圖像和發(fā)光圖像后，進(jìn)行局部存在的判定。具體而言，規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100也可以 是，在導(dǎo)入有融合基因的活的樣本102在攝像范圍中存在多個的情況下， 對多個樣本102拍攝熒光圖像和發(fā)光圖像，根據(jù)熒光圖像按照每個樣本 102判定在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)，通過使所拍攝的熒光圖像 和所拍攝的發(fā)光圖像重合，從判定結(jié)果是判定為局部存在的樣本102中 選定測定對象的樣本102，測定來自所選定的樣本102的發(fā)光量。進(jìn)而，根據(jù)規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，通過重復(fù)執(zhí)行熒光圖像的 拍攝、局部存在的判定、發(fā)光圖像的拍攝、測定對象的樣本102的選定 以及發(fā)光量的測定，從而經(jīng)時獲得來自樣本102內(nèi)規(guī)定部位的發(fā)光量。 由此，能夠經(jīng)時地測定例如指定的樣本102內(nèi)規(guī)定部位的發(fā)光量的變動。這里，在規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100中，導(dǎo)入到樣本中的融合基 因也可以存在多個，并預(yù)先制作成使按照轉(zhuǎn)移堿基排列所轉(zhuǎn)移的發(fā)光蛋 白質(zhì)的轉(zhuǎn)移目的地部位、從發(fā)光蛋白質(zhì)發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光色、以及從熒 光蛋白質(zhì)發(fā)出的熒光的熒光色的組合分別不同。而且，在該情況下，規(guī) 定部位發(fā)光量測定裝置100也可以按照發(fā)光色的不同來分離來自樣本102的發(fā)光，根據(jù)拍攝的熒光圖像按照每個熒光色來判定在規(guī)定部位是否局 部存在發(fā)光蛋白質(zhì)，在判定結(jié)果是判定為局部存在的情況下，從分離的 多個發(fā)光中指定來自該被判定為局部存在的部位的發(fā)光，來測定所指定 的發(fā)光的發(fā)光量。由此，例如能夠同時測定來自一個樣本102內(nèi)的多個 部位的發(fā)光量，或者能夠按照每個樣本102同時測定來自樣本102內(nèi)的 多個部位的發(fā)光量。具體而言，在樣本102是細(xì)胞《的情況下，制作兩個導(dǎo)入到細(xì)胞的融 合基因， 一個通過在線粒體轉(zhuǎn)移信號中轉(zhuǎn)移的綠色熒光素酶的轉(zhuǎn)移目的 地部位即線粒體、從綠色熒光素酶發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光色(綠色)和從GFP 發(fā)出的熒光的熒光色(綠色)的組合來制作，另一個通過從在細(xì)胞質(zhì)中 表達(dá)的紅色熒光素酶發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光色(紅色)和從GFP發(fā)出的熒光 的熒光色(青色)的組合來制作。而且，該情況下，規(guī)定部位發(fā)光量測 定裝置100也可以按照發(fā)光色(綠色、紅色)的不同分離來自細(xì)胞的發(fā) 光，根據(jù)所拍攝的熒光圖像，利用從GFP發(fā)出的熒光色(綠色)來判定 線粒體是否局部存在綠色熒光素酶，利用從GFP發(fā)出的熒光色(青色) 來判定細(xì)胞質(zhì)是否局部存在紅色熒光素酶，在判定結(jié)果是判定為局部存 在的情況下，從分離的2個發(fā)光(綠色、紅色)中指定來自該被判定為 局部存在的部位的發(fā)光，來測定所指定的發(fā)光的發(fā)光量。換言之，對于 細(xì)胞內(nèi)的線粒體，也可以選擇線粒體轉(zhuǎn)移信號作為轉(zhuǎn)移堿基排列，選擇綠色熒光素酶作為發(fā)光蛋白質(zhì)，選擇GFP作為熒光蛋白質(zhì)，另一方面，對于該細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞質(zhì)，也可以不使用轉(zhuǎn)移堿基排列，選擇紅色熒光素酶作為發(fā)光蛋白質(zhì)，選擇GFP作為熒光蛋白質(zhì)，單獨并且同時地測定線 粒體和細(xì)胞質(zhì)中的發(fā)光量(還有ATP量等)的變動作為發(fā)光強度的變化。 并且，在規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100中，也可以根據(jù)所測定的發(fā) 光量，對與該發(fā)光量的增減直接或間接關(guān)聯(lián)的物質(zhì)的量進(jìn)行定量。具體 而言，在發(fā)光蛋白質(zhì)是熒光素酶的情況下，例如也可以對與該熒光素酶 的發(fā)光量的增減直接關(guān)聯(lián)的物質(zhì)即ATP的量進(jìn)行定量。由此，能夠例如 經(jīng)時地測定指定的樣本102內(nèi)規(guī)定部位的關(guān)聯(lián)物質(zhì)(例如ATP等)的量 的變動。并且，作為其他實施方式，例如也可以制作包含表達(dá)量和/或局部存 在部位按照細(xì)胞周期變化的熒光蛋白質(zhì)和發(fā)光蛋白質(zhì)的細(xì)胞，經(jīng)時測定 從該細(xì)胞發(fā)出的熒光和發(fā)光，由此利用熒光蛋白質(zhì)的表達(dá)量和/或局部存 在部位的變化來確認(rèn)細(xì)胞周期，并且經(jīng)時地測定細(xì)胞的發(fā)光量的變動。并且，在將多個神經(jīng)細(xì)胞作為對象的情況下，也可以制作融合了表 達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、將該發(fā)光蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到其他神經(jīng)細(xì)胞的 轉(zhuǎn)移堿基排列和表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因的融合基因，作為導(dǎo)入 到神經(jīng)細(xì)胞的融合基因，利用從神經(jīng)細(xì)胞發(fā)出的熒光色來確認(rèn)發(fā)光蛋白 質(zhì)從導(dǎo)入了該融合基因的神經(jīng)細(xì)胞向其他神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程，經(jīng)時地 測定該轉(zhuǎn)移過程中的神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)光量的變動。(附記) 一種熒光/發(fā)光測定方法，其特征在于，該方法包括熒光測定步驟，其測定從導(dǎo)入了融合基因的樣本發(fā)出的熒光的熒光 強度，該融合基因融合了表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因和表達(dá)發(fā)光蛋
白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因；位置指定步驟，其根據(jù)所述熒光測定步驟所測定的熒光強度來指定 樣本的位置；發(fā)光測定步驟，其測定從該樣本發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度；以及發(fā)光量定量步驟，其根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度，對 發(fā)光量進(jìn)行定量。[II]以下，根據(jù)附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的表達(dá)量測定方法的實施方式。 另外，該實施方式不限定本發(fā)明。首先，參照圖20 圖22說明用于實施本發(fā)明的裝置即表達(dá)量測定裝 置1000的結(jié)構(gòu)。圖20是表示表達(dá)量測定裝置1000的整體結(jié)構(gòu)的一例的圖。如圖20所示，表達(dá)量測定裝置1000由細(xì)胞1020、收納細(xì)胞1020 的容器1030 (具體為培養(yǎng)皿、載玻片、微板、凝膠支持體、微粒子載體 等)、配置容器1030的載置臺1040、發(fā)光圖像攝像單元1060、熒光圖像 攝像單元1080以及信息通信終端1100構(gòu)成。并且，在表達(dá)量測定裝置 1000中，如圖所示，發(fā)光圖像攝像單元1060中包含的物鏡1060a和熒光 圖像攝像單元1080中包含的物鏡1080a隔著細(xì)胞1020、容器1030和載 置臺1040配置在上下對置的位置上。另外，也可以調(diào)換發(fā)光圖像攝像單 元1060和熒光圖像攝像單元1080的配置。細(xì)胞1020是活細(xì)胞，除了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)(具體而言是熒光素酶) 的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、表達(dá)熒光蛋白質(zhì)(具體而言是GFP)的熒光關(guān)聯(lián)基因 和解析對象的基因之外，還導(dǎo)入了以細(xì)胞周期中的規(guī)定階段來表達(dá)的細(xì) 胞周期關(guān)聯(lián)基因。這里，在本說明書中，發(fā)光是包含生物發(fā)光和化學(xué)發(fā) 光的概念。另外，細(xì)胞1020也可以是導(dǎo)入了融合基因的活細(xì)胞，該融合基因融 合了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、熒光關(guān)聯(lián)基因、解析對象的基因和細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基 因。具體而言，細(xì)胞1020也可以是導(dǎo)入了載體的活細(xì)胞，該載體融合了 發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、熒光關(guān)聯(lián)基因、解析對象的基因和細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因。 并且，與發(fā)光關(guān)聯(lián)基因或熒光關(guān)聯(lián)基因組合而導(dǎo)入到細(xì)胞1020中的解析
對象的基因的數(shù)量也可以是多個。換言之，對細(xì)胞1020也可以導(dǎo)入多個 解析對象的基因和發(fā)光關(guān)聯(lián)基因或熒光關(guān)聯(lián)基因的組。由此，能夠辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段，并且一起測定導(dǎo)入到細(xì)胞1020中的多個解析對象的基 因的表達(dá)量。這里，在利用熒光辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段、利用發(fā)光測定解析對象的 基因的表達(dá)量的情況下，細(xì)胞1020也可以是將熒光關(guān)聯(lián)基因和細(xì)胞周期 關(guān)聯(lián)基因關(guān)聯(lián)起來導(dǎo)入、并且將發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因關(guān)聯(lián)起 來導(dǎo)入的活細(xì)胞。具體而言，細(xì)胞1020也可以是如下的活細(xì)胞導(dǎo)入融 合了熒光關(guān)聯(lián)基因和細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的載體(熒光關(guān)聯(lián)基因?qū)胼d 體)，并且導(dǎo)入融合了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因的載體(發(fā)光關(guān)聯(lián) 基因?qū)胼d體)。并且，也可以將導(dǎo)入了細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因催化劑的載體 導(dǎo)入到細(xì)胞1020中。具體而言，也可以將導(dǎo)入了作為細(xì)胞周期標(biāo)記而被 知曉的CyclinBl催化劑的GFP傳感器(Amersham Biosciences公司制) 導(dǎo)入到細(xì)胞1020中。并且，也可以將HaloTag (注冊商標(biāo))載體(Promega 公司制)導(dǎo)入到細(xì)胞1020中，在細(xì)胞1020中添加HaloTag (注冊商標(biāo)) 配合基(Promega公司制)，對細(xì)胞1020進(jìn)行熒光標(biāo)識。并且，也可以將 導(dǎo)入了解析對象的基因催化劑的熒光素酶載體導(dǎo)入到細(xì)胞1020中來表 達(dá)。并且，也可以將HaloTag (注冊商標(biāo))載體(Promega公司制)導(dǎo)入 到細(xì)胞1020中，在細(xì)胞1020中添加HaloTag(注冊商標(biāo))配合基(Promega 公司制)，對細(xì)胞1020進(jìn)行熒光素酶標(biāo)識。并且，在利用熒光辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段、利用發(fā)光測定解析對象的 基因的表達(dá)量的情況下，細(xì)胞1020也可以是導(dǎo)入發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對 象的基因、并利用熒光物質(zhì)對細(xì)胞1020的規(guī)定部位(具體而言為核、細(xì) 胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)進(jìn)行染色的活細(xì)胞。具體而言，細(xì)胞1020也可以是如 下的活細(xì)胞導(dǎo)入融合了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因的融合基因(具 體而言為融合了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因的載體)，并利用熒光物 質(zhì)對細(xì)胞1020的規(guī)定部位(具體而言為核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)進(jìn)行染 色。這里，也可以使用活細(xì)胞核染色試劑"DRAQ5" (Biostatus公司鬼lJ) 對細(xì)胞1020的核進(jìn)行染色。并且，也可以使用"PKHLinkerKits"(SIGMA
公司制)對細(xì)胞1020的細(xì)胞膜進(jìn)行染色(其中，在該情況下，使用可以根據(jù)其形狀辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段的細(xì)胞(具體而言為PC12等)。)。并且，在利用發(fā)光辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段、利用熒光測定解析對象的基因的表達(dá)量的情況下，細(xì)胞1020也可以是將發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和細(xì)胞周期 關(guān)聯(lián)基因關(guān)聯(lián)起來導(dǎo)入、并且將熒光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因關(guān)聯(lián)起來導(dǎo)入的活細(xì)胞。具體而言，細(xì)胞1020也可以是如下的活細(xì)胞導(dǎo)入融合了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的載體(發(fā)光關(guān)聯(lián)基因?qū)胼d 體)，并且導(dǎo)入融合了熒光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因的載體(熒光關(guān)聯(lián) 基因?qū)胼d體)。并且，也可以將導(dǎo)入了細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因催化劑的載體導(dǎo)入到細(xì)胞1020中。具體而言，也可以制作導(dǎo)入了 Cyclin Bl催化劑的 熒光素酶載體并導(dǎo)入到細(xì)胞1020中。并且，也可以將HaloTag (注冊商 標(biāo))載體(Promega公司制)導(dǎo)入到細(xì)胞1020中，在細(xì)胞1020中添加 HaloTag (注冊商標(biāo))配合基(Promega公司制)，對細(xì)胞1020進(jìn)行熒光 素酶標(biāo)識。并且，也可以將導(dǎo)入了解析對象的基因催化劑的熒光蛋白質(zhì) 載體導(dǎo)入到細(xì)胞1020中來表達(dá)。并且，也可以將HaloTag (注冊商標(biāo)) 載體(Promega公司制)導(dǎo)入到細(xì)胞1020中，在細(xì)胞1020中添加HaloTag (注冊商標(biāo))配合基(Promega公司制)，對細(xì)胞1020進(jìn)行熒光標(biāo)識。并 且，也可以將P —lactanase基因作為報告基因?qū)氲郊?xì)胞1020中。另外，作為細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因，可以應(yīng)用細(xì)胞周期蛋白(具體而言 為CyclinAl、 CyclinA2、 CyclinBl、 CyclinB2、 CyclinB3、 CyclinC、 CyclinDl、 CyclinD2、 CyclinD3、 CyclinEl、 CyclinE2、 CyclinF、 Cyclin Gl、 Cyclin G2、 Cyclin H、 Cyclin I、 CyclinTl、 Cyclin T2a、 Cyclin T2b 等)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(具體而言為CDK2、 CDK28等)等。并 且，作為解析對象的基因，可以應(yīng)用上述的細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因、晝夜節(jié) 律調(diào)節(jié)基因(具體而言為period基因、Kai基因、timeless基因、per基因、 clock基因等)、其他與細(xì)胞周期的關(guān)聯(lián)性不明確的基因等。再返回圖20的說明，發(fā)光圖像攝像單元1060具體而言是正立型發(fā) 光顯微鏡，對細(xì)胞1020的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝。如圖所示，發(fā)光圖像攝像 單元1060由物鏡畫a、 二色鏡1060b和CCD照相機(jī)1060c構(gòu)成。物鏡
1060a具體而言是(數(shù)值孔徑/倍率)2的值大于等于0.01的物鏡。二色 鏡1060b按照顏色的不同來分離從細(xì)胞1020發(fā)出的發(fā)光，用于使用二色 的發(fā)光按照顏色的不同來測定發(fā)光強度的情況。CCD照相機(jī)1060c對經(jīng) 由物鏡1060a投影到該CCD照相機(jī)1060c的芯片面上的細(xì)胞1020的發(fā) 光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍攝。并且，CCD照相機(jī)1060c以有線或無線 的方式與信息通信終端1100可通信地連接。這里，當(dāng)細(xì)胞1020在攝像 范圍中存在多個的情況下，CCD照相機(jī)1060c也可以對包含在攝像范圍 中的多個細(xì)胞1020的發(fā)光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍攝。另外，在圖20 中，示出利用2臺CCD照相機(jī)1060c分別對與二色鏡1060b所分離的2 個發(fā)光對應(yīng)的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的情況的一例，使用1個發(fā)光的情況下， 發(fā)光圖像攝像單元1060也可以由物鏡1060a和1臺CCD照相機(jī)1060c 構(gòu)成。這里，在使用二色的發(fā)光按照顏色的不同來測定發(fā)光強度的情況下， 如圖21所示，發(fā)光圖像攝像單元1060也可以由物鏡1060a、 CCD照相 機(jī)1060c和裂像單元1060d構(gòu)成。而且，CCD照相機(jī)1060c也可以對經(jīng) 由裂像單元l060d投影到該CCD照相機(jī)1060c的芯片面上的樣本1020 的發(fā)光圖像(裂像)和明視場像進(jìn)行拍攝。裂像單元1060d按照顏色的 不同來分離從細(xì)胞1020發(fā)出的發(fā)光，與二色鏡1060b同樣，用于使用二 色的發(fā)光按照顏色的不同來測定發(fā)光強度的情況。并且，在使用多色的發(fā)光按照顏色的不同來測定發(fā)光強度的情況下 (即，使用多色的發(fā)光的情況)，如圖22所示，發(fā)光圖像攝像單元1060 也可以由物鏡1060a、 CCD照相機(jī)1060c和濾光輪1060e構(gòu)成。而且， CCD照相機(jī)1060c也可以對經(jīng)由濾光輪1060e投影到該CCD照相機(jī) 1060c的芯片面上的細(xì)胞102的發(fā)光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍攝。濾光輪 1060e通過過濾交換按照顏色的不同分離從細(xì)胞1020發(fā)出的發(fā)光，用于 使用多色的發(fā)光按照顏色的不同來測定發(fā)光強度的情況。再返回圖20，熒光圖像攝像單元1080具體而言是倒立型熒光顯微 鏡，對細(xì)胞1020的熒光圖像進(jìn)行拍攝。如圖所示，熒光圖像攝像單元1080 由物鏡1080a、 二色鏡1080b、氙氣燈1080c和CCD照相機(jī)1080d構(gòu)成。CCD照相機(jī)1080d對經(jīng)由物鏡1080a投影到該CCD照相機(jī)1080d的芯片 面上的細(xì)胞1020的熒光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍攝。并且，CCD照相機(jī) 1080d以有線或無線的方式與信息通信終端IIOO可通信地連接。這里， 當(dāng)細(xì)胞1020在攝像范圍中存在多個的情況下，CCD照相機(jī)1080d也可以 對包含在攝像范圍中的多個細(xì)胞1020的熒光圖像和明視場圖像進(jìn)行拍 攝。二色鏡1080b透射來自細(xì)胞102的熒光，并且改變激勵光的方向， 以使從氙氣燈1080c照射的激勵光向細(xì)胞1020照射。氙氣燈1080c照射 激勵光。這里，發(fā)光圖像攝像單元1060和熒光圖像攝像單元1080具體而言 也可以分別是倒立型的發(fā)光顯微鏡和倒立型的熒光顯微鏡，載置臺1040 也可以旋轉(zhuǎn)。信息通信終端1100具體而言是個人計算機(jī)。并且如圖23所示，信 息通信終端1100大體由控制部1120、對系統(tǒng)的時刻進(jìn)行計時的時鐘產(chǎn)生 部1140、存儲部1160、通信接口部1180、輸入輸出接口部1200、輸入 部1220和輸出部1240構(gòu)成，這些各部經(jīng)由總線連接。存儲部1160是存儲單元，具體而言能夠使用RAM和ROM等的存 儲器裝置、硬盤這樣的固定磁盤裝置、軟盤和光盤等。而且，存儲部1160 存儲由控制部1120的各部的處理而得到的數(shù)據(jù)等。通信接口部1180是信息通信終端1100、 CCD照相機(jī)1060c和CCD 照相機(jī)1080d之間的通信的媒介。gP，通信接口部1180具有經(jīng)由有線或無線的通信線路與其他終端進(jìn)行數(shù)據(jù)通信的功能。輸入輸出接口部1200與輸入部1220和輸出部1240連接。這里，輸 出部1240除了監(jiān)視器(包含家庭用電視機(jī))以外，還可以使用揚聲器和 打印機(jī)(另外，以下有時將輸出部1240記載為監(jiān)視器。)。并且，輸入部 1220除了鍵盤、鼠標(biāo)和麥克風(fēng)之外，還可以使用與鼠標(biāo)協(xié)作來實現(xiàn)指示 裝置功能的監(jiān)視器?？刂撇?120具有用于存儲OS (Operating System)等的控制程序、規(guī)定各種處理步驟等的程序和所需要的數(shù)據(jù)的內(nèi)部存儲器，根據(jù)這些程 序來執(zhí)行各種處理。而且，控制部1020大體由熒光圖像攝像指示部1120a、
發(fā)光圖像攝像指示部1120b、熒光圖像取得部1120C、發(fā)光圖像取得部1120d、判定部1120e、熒光測定部1120f、發(fā)光測定部1120g、階段辨認(rèn) 部1120h、選擇部1120i和表達(dá)量測定部1120J構(gòu)成。熒光圖像攝像指示部1120a經(jīng)由通信接口部1160向CCD照相機(jī) 1080d指示熒光圖像和明視場圖像的拍攝。發(fā)光圖像攝像指示部1120b經(jīng) 由通信接口部1160向CCD照相機(jī)1060c指示發(fā)光圖像和明視場圖像的 拍攝。熒光圖像取得部1120c經(jīng)由通信接口部1160取得由CCD照相機(jī) 1080d拍攝的熒光圖像和明視場圖像。發(fā)光圖像取得部1120d經(jīng)由通信接 口部1160取得由CCD照相機(jī)1060c拍攝的發(fā)光圖像和明視場圖像。判定部1120e根據(jù)熒光圖像和/或發(fā)光圖像，按照每個細(xì)胞1020判定 是否導(dǎo)入了各基因。熒光測定部1120f根據(jù)CCD照相機(jī)1080d所拍攝的 熒光圖像，分別測定從各細(xì)胞1020發(fā)出的熒光的熒光強度。發(fā)光測定部 1120g根據(jù)CCD照相機(jī)1060c所拍攝的發(fā)光圖像，分別測定從各細(xì)胞1020 發(fā)出的發(fā)光強度。階段辨認(rèn)部1120h根據(jù)熒光測定部1120f所測定的熒光強度或發(fā)光 測定部U20g所測定的發(fā)光強度，按照每個細(xì)胞1020判定有無細(xì)胞周期 關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此按照每個細(xì)胞1020辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。另外，在將導(dǎo)入發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因、并利用熒光物質(zhì) 對其規(guī)定部位(具體而言為核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)進(jìn)行染色的活細(xì)胞 1020作為對象的情況下，也可以根據(jù)CCD照相機(jī)1080d拍攝的熒光圖像， 判定細(xì)胞1020的形狀是否發(fā)生了變化，由此辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。選擇 部1120i從由階段辨認(rèn)部1120h辨認(rèn)了階段的細(xì)胞1020中，選擇測定對 象的細(xì)胞1020。表達(dá)量測定部1120j將選擇部1120i所選擇的細(xì)胞1020作為對象， 在階段辨認(rèn)部1120h中使用發(fā)光強度的情況下，根據(jù)熒光測定部1120f 所測定的熒光強度，測定解析對象的基因的表達(dá)量；在階段辨認(rèn)部1120h 中使用熒光強度或熒光圖像的情況下，根據(jù)發(fā)光測定部1120g所測定的 發(fā)光強度，測定解析對象的基因的表達(dá)量。另外，表達(dá)量測定部1120j 也可以將多個細(xì)胞1020或選擇部1120i所選擇的細(xì)胞1020作為對象，根
據(jù)熒光測定部1120f所測定的熒光強度，測定解析對象的基因的表達(dá)量，并且根據(jù)CCD照相機(jī)1080d所拍攝的熒光圖像，辨認(rèn)解析對象的基因的 細(xì)胞1020內(nèi)的表達(dá)部位。在以上的結(jié)構(gòu)中，參照圖24說明表達(dá)量測定裝置1000進(jìn)行的處理 的一例。另外，以下說明在多個細(xì)胞1020中導(dǎo)入融合了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和 細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的載體、以及融合了熒光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因 的載體，并將已導(dǎo)入的多個細(xì)胞1020中指定的細(xì)胞1020作為對象，一 邊利用發(fā)光強度辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊利用熒光強度經(jīng)時測定解析 對象的基因的表達(dá)量，并且，利用熒光圖像經(jīng)時地辨認(rèn)解析對象的基因 的細(xì)胞1020內(nèi)的表達(dá)部位時的處理的一例。首先，信息通信終端1100在熒光圖像攝像指示部1100a的處理中， 經(jīng)由通信接口部1160向CCD照相機(jī)1080d指示熒光圖像的拍攝，在發(fā) 光圖像攝像指示部1120b的處理中，經(jīng)由通信接口部1160向CCD照相 機(jī)1060c指示發(fā)光圖像的拍攝(步驟SB-1)。接著，CCD照相機(jī)1080d 對攝像范圍中存在的多個細(xì)胞1020的熒光圖像進(jìn)行拍攝(步驟SB-2)， 將該熒光圖像發(fā)送給信息通信終端1100 (步驟SB-3)。另-一方面，CCD 照相機(jī)1060c對攝像范圍中存在的多個細(xì)胞1020的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝 (步驟SB-4),將該發(fā)光圖像發(fā)送給信息通信終端1100 (步驟SB-5)。另 外，熒光圖像的拍攝指示和發(fā)光圖像的拍攝指示也可以以不同的時刻或 時間間隔來進(jìn)行。例如，可以每隔幾小時進(jìn)行一次用于辨認(rèn)細(xì)胞周期的 階段的發(fā)光圖像的拍攝，每隔幾分鐘進(jìn)行一次用于測定解析對象的基因 的表達(dá)量的熒光圖像的拍攝。并且激勵光僅在拍攝熒光圖像時向細(xì)胞 1020照射。接著，信息通信終端1100， (a)在熒光圖像取得部1120c的處理中， 經(jīng)由通信接口部1160取得熒光圖像，(b)在發(fā)光圖像取得部1120d的處 理中，經(jīng)由通信接口部1160取得發(fā)光圖像，(c)在控制部1120的處理中， 從時鐘產(chǎn)生部1140取得時刻，(d)將取得的熒光圖像、發(fā)光圖像和時刻 對應(yīng)起來，存儲在存儲部1160的規(guī)定存儲區(qū)域內(nèi)(步驟SB-6)。接著，信息通信終端1100在判定部1120e的處理中，根據(jù)熒光圖像 和/或發(fā)光圖像，按照每個細(xì)胞1020判定是否導(dǎo)入了載體(步驟SB-7)。 接著，在導(dǎo)入了載體的細(xì)胞1020至少存在一個的情況下(步驟SB-8: "是")，信息通信終端IIOO在熒光測定部1120f的處理中，根據(jù)熒光圖 像，分別測定從各細(xì)胞1020發(fā)出的熒光的熒光強度，并且，在發(fā)光測定 部1120g的處理中，根據(jù)發(fā)光圖像，分別測定從各細(xì)胞1020發(fā)出的發(fā)光 的發(fā)光強度(步驟SB-9)。接著，信息通信終端1100在階段辨認(rèn)部1120h的處理中，根據(jù)發(fā)光 強度按照每個細(xì)胞1020判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此按照每 個細(xì)胞1020辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段(步驟SB-IO)。另外，在將融合了熒光 關(guān)聯(lián)基因和細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的載體、以及融合了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析 對象的基因的載體導(dǎo)入到細(xì)胞1020中的情況下，也可以根據(jù)熒光強度按 照每個細(xì)胞1020判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此按照每個細(xì)胞 1020辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。并且，在將融合了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象 的基因的載體導(dǎo)入到細(xì)胞1020中、并利用熒光物質(zhì)對其規(guī)定部位(具體 而言為核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)進(jìn)行染色的情況下，也可以根據(jù)熒光圖 像按照每個細(xì)胞1020判定細(xì)胞1020的形狀是否發(fā)生了變化，由此按照 每個細(xì)胞1020辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。接著，信息通信終端1100在選擇部1120i的處理中，從在步驟SA-10 中辨認(rèn)了階段的細(xì)胞1020中，選擇測定對象的細(xì)胞1020 (步驟SB-ll)。 接著，信息通信終端1100在表達(dá)量測定部1120j的處理中，將在步驟SB-11 中選擇的細(xì)胞1020作為對象，根據(jù)熒光強度來測定解析對象的基因的表 達(dá)量，并且根據(jù)熒光圖像來辨認(rèn)解析對象的基因的細(xì)胞1020內(nèi)的表達(dá)部 位(步驟SB-12)。另外，在步驟SB-10中使用熒光強度或熒光圖像的情 況下，在步驟SB-12中，也可以根據(jù)發(fā)光強度來測定解析對象的基因的 表達(dá)量。而且，信息通信終端1100在控制部1120的處理中，以例如預(yù)先設(shè) 定的時間間隔重復(fù)執(zhí)行規(guī)定次數(shù)的上述步驟SB-1 步驟SB-12的處理， 在規(guī)定次數(shù)結(jié)束時(步驟SB-13:"是")，結(jié)束處理。這里，也可以僅重復(fù)執(zhí)行發(fā)光圖像和熒光圖像的拍攝和取得，在解 析的時刻，進(jìn)行發(fā)光強度的測定、熒光強度的測定、階段的辨認(rèn)、細(xì)胞 1020的選擇和表達(dá)量的測定。g卩，僅統(tǒng)一取得作為解析所需要的原數(shù)據(jù) 的發(fā)光圖像和熒光圖像，然后在解析的時刻，進(jìn)行發(fā)光強度的測定、熒光強度的測定、階段的辨認(rèn)、細(xì)胞1020的選擇和表達(dá)量的測定。具體而 言，也可以在取得發(fā)光圖像和熒光圖像后，在解析的時刻，進(jìn)行細(xì)胞1020 的選擇和表達(dá)量的測定。并且，也可以在進(jìn)行發(fā)光圖像和熒光圖像的取 得后，在解析的時刻，進(jìn)行階段的辨認(rèn)和細(xì)胞1020的選擇。并且，也可 以在取得發(fā)光圖像和熒光圖像后，在解析的時刻，進(jìn)行細(xì)胞1020的選擇。 并且，也可以在取得熒光圖像后，選擇測定對象的細(xì)胞1020，然后 取得發(fā)光圖像。如以上詳細(xì)說明的那樣，根據(jù)表達(dá)量測定裝置1000，將導(dǎo)入了發(fā)光 關(guān)聯(lián)基因、熒光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因的活細(xì)胞1020作為對象，測 定從細(xì)胞1020發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，測定從細(xì)胞1020發(fā)出的熒光的 熒光強度，當(dāng)根據(jù)所測定的發(fā)光強度或所測定的熒光強度來測定解析對 象的基因的表達(dá)量時，細(xì)胞除了發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、熒光關(guān)聯(lián)基因和解析對 象的基因之外，還導(dǎo)入了細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因，在表達(dá)量的測定中使用發(fā) 光強度的情況下，根據(jù)所測定的熒光強度，判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因 的表達(dá)，在表達(dá)量的測定中使用熒光強度的情況下，根據(jù)所測定的發(fā)光 強度，判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。 由此，在導(dǎo)入到細(xì)胞1020中的解析對象的基因表達(dá)量的測定中，不進(jìn)行 同步培養(yǎng)的操作，就能夠辨認(rèn)該細(xì)胞1020的細(xì)胞周期的階段，其結(jié)果， 能夠減輕實驗者的作業(yè)負(fù)擔(dān)。并且，能夠評價解析對象的基因和細(xì)胞周 期的階段之間的關(guān)聯(lián)性，具體而言，關(guān)于與細(xì)胞周期的直接關(guān)系不明確 的解析對象的基因，因為能夠與細(xì)胞周期的階段一起獲得藥劑投放和溫 度變化等刺激引起的表達(dá)量的變化，所以，能夠驗證該解析對象的基因 和細(xì)胞周期之間的關(guān)系。并且，關(guān)于揭示了與細(xì)胞周期的直接關(guān)系的解 析對象的基因，因為能夠一起取得該解析對象的基因的表達(dá)量和細(xì)胞周 期的階段，所以，能夠評價該解析對象的基因作為細(xì)胞周期標(biāo)記是否有 用。另外，在將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基
因、并利用熒光物質(zhì)對其規(guī)定部位(具體而言為核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)進(jìn)行染色的活細(xì)胞1020作為對象的情況下，表達(dá)量測定裝置1000也可 以測定從細(xì)胞1020發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，根據(jù)所測定的發(fā)光強度來測 定解析對象的基因的表達(dá)量，對該細(xì)胞1020的熒光圖像進(jìn)行拍攝，根據(jù) 所拍攝的熒光圖像來判定細(xì)胞1020的形狀是否發(fā)生了變化，由此辨認(rèn)細(xì) 胞周期的階段。另外，除去用于確認(rèn)發(fā)光誘導(dǎo)蛋白基因的取入的方法， 還可以使用熒光色素來代替熒光融合基因，但是為了使激勵光產(chǎn)生的光 毒性的影響成為最小限度，熒光色素的拍攝與僅利用熒光拍攝的情況相 比，能夠減少拍攝次數(shù)。并且，表達(dá)量測定裝置IOOO例如能夠適當(dāng)?shù)赜?于各種反應(yīng)(例如藥物刺激和光照射等)的檢査和治療等。這里，至今為止，在進(jìn)行報告檢測時，將各種細(xì)胞周期階段的細(xì)胞 作為一組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。細(xì)胞周期是由細(xì)胞成長、DNA復(fù)制、染色體分 配以及細(xì)胞分裂等構(gòu)成的多個連續(xù)反應(yīng)，充分考慮各種基因的表達(dá)由于 其階段而變動的情況。所以，如果利用表達(dá)量測定裝置1000，則關(guān)于與 細(xì)胞周期的直接關(guān)系不明確的基因，希望檢測出藥劑和溫度變化等某些 刺激引起的基因表達(dá)量的變化時，通過對照細(xì)胞周期數(shù)據(jù)，能夠得到更 加詳細(xì)的解析結(jié)果。并且，如果利用表達(dá)量測定裝置1000，則關(guān)于揭示 了與細(xì)胞周期的直接關(guān)系的基因，也能夠判別各細(xì)胞的細(xì)胞周期的階段， 所以，不需要進(jìn)行以往進(jìn)行的同步培養(yǎng)等的操作，就能僅選擇出希望進(jìn) 行解析的階段的細(xì)胞，來作為觀察對象。并且，根據(jù)表達(dá)量測定裝置1000，當(dāng)細(xì)胞1020在攝像范圍中存在 多個的情況下，對多個細(xì)胞1020的熒光圖像進(jìn)行拍攝，對多個細(xì)胞1020 的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝，根據(jù)所拍攝的發(fā)光圖像分別測定從各細(xì)胞1020發(fā) 出的發(fā)光的發(fā)光強度，根據(jù)所拍攝的熒光圖像分別測定從各細(xì)胞1020發(fā) 出的熒光的熒光強度，根據(jù)所測定的發(fā)光強度或所測定的熒光強度，按 照每個細(xì)胞1020來測定解析對象的基因的表達(dá)量，在表達(dá)量的測定中使 用發(fā)光強度的情況下，根據(jù)所測定的熒光強度，按照每個細(xì)胞1020判定 有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，在表達(dá)量的測定中使用熒光強度的情況 下，根據(jù)所測定的發(fā)光強度，按照每個細(xì)胞1020判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)
基因的表達(dá)，由此按照每個細(xì)胞1020辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。由此，能夠?qū)⒍鄠€細(xì)胞1020作為對象，按照每個細(xì)胞1020來測定解析對象的基因 的表達(dá)量，并且按照每個細(xì)胞1020辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。并且，能夠按 照每個細(xì)胞1020評價解析對象的基因和細(xì)胞周期的階段之間的關(guān)聯(lián)性。 另外，在將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因、 并利用熒光物質(zhì)對其規(guī)定部位(具體而言為核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)進(jìn) 行染色的活細(xì)胞1020作為對象的情況下，表達(dá)量測定裝置1000也可以 對在攝像范圍中存在的多個細(xì)胞1020的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝，對多個細(xì)胞 1020的熒光圖像進(jìn)行拍攝，根據(jù)所拍攝的發(fā)光圖像分別測定從各細(xì)胞 1020發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，根據(jù)所測定的發(fā)光強度按照每個細(xì)胞1020 來測定解析對象的基因的表達(dá)量，根據(jù)所拍攝的熒光圖像按照每個細(xì)胞 1020來判定細(xì)胞1020的形狀是否發(fā)生了變化，由此按照每個細(xì)胞1020 來辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。并且，通過按照細(xì)胞周期進(jìn)行比較，也可以進(jìn) 行條件相等的細(xì)胞之間的比較評價。并且，根據(jù)表達(dá)量測定裝置1000，從辨認(rèn)了階段的細(xì)胞1020中選擇 測定對象的細(xì)胞1020，根據(jù)所測定的發(fā)光強度或所測定的熒光強度，測 定導(dǎo)入到所選擇的細(xì)胞1020的解析對象的基因的表達(dá)量。由此，能夠從 多個細(xì)胞1020中識別各個細(xì)胞1020，將單一細(xì)胞1020作為對象，測定 解析對象的基因的表達(dá)量，并且辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。并且，根據(jù)表達(dá)量測定裝置1000，通過重復(fù)執(zhí)行發(fā)光圖像的拍攝、 熒光圖像的拍攝、發(fā)光強度的測定、熒光強度的測定、階段的辨認(rèn)、細(xì) 胞1020的選擇和表達(dá)量的測定，將所選擇的細(xì)胞1020作為對象， 一邊 辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊經(jīng)時地測定解析對象的基因的表達(dá)量。由此， 能夠?qū)我坏募?xì)胞1020作為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊經(jīng)時 地測定解析對象的基因的表達(dá)量的變動。另外，在將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋 白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因、并利用熒光物質(zhì)對其規(guī)定部位 (具體而言為核、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)進(jìn)行染色的活細(xì)胞1020作為對象 的情況下，表達(dá)量測定裝置IOOO也可以通過重復(fù)執(zhí)行發(fā)光圖像的拍攝、 熒光圖像的拍攝、發(fā)光強度的測定、階段的辨認(rèn)、細(xì)胞1020的選擇和表 達(dá)量的測定，將所選擇的細(xì)胞1020作為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊經(jīng)時地測定解析對象的基因的表達(dá)量。并且，在與各個細(xì)胞周期對 應(yīng)的定時拍攝的連續(xù)拍攝影像或一個圖像上，同時對同一視場內(nèi)的不同 的細(xì)胞進(jìn)行圖像再現(xiàn)，由此可以進(jìn)行使細(xì)胞周期一致的動態(tài)圖像(或幀 傳送)或1個圖像的顯示。并且，根據(jù)表達(dá)量測定裝置1000，在表達(dá)量測定中，將所選擇的細(xì)胞1020作為對象，根據(jù)所測定的熒光強度來測定解析對象的基因的表達(dá) 量，并且根據(jù)所拍攝的熒光圖像來辨認(rèn)解析對象的基因的細(xì)胞1020內(nèi)的 表達(dá)部位。由此，不僅能夠評價解析對象的基因和細(xì)胞周期的階段之間 的關(guān)聯(lián)性，而且能夠獲得解析對象的基因的細(xì)胞1020內(nèi)的表達(dá)部位。并且，如果利用表達(dá)量測定裝置1000，具體而言，能夠進(jìn)行抗癌劑 及其先導(dǎo)化合物的評價。特別能夠同時監(jiān)視抗癌劑是否具有對細(xì)胞分裂 的效率有害的作用的判斷、和該先導(dǎo)化合物對解析對象基因的轉(zhuǎn)錄活性 是否產(chǎn)生影響。并且，如果利用表達(dá)量測定裝置1000，具體而言，能夠 調(diào)査細(xì)胞周期和細(xì)胞形態(tài)之間的關(guān)聯(lián)。特別在PC12細(xì)胞等中，已知形態(tài) 根據(jù)細(xì)胞周期階段和分化階段而發(fā)生變化，但在其他神經(jīng)細(xì)胞中，能夠 根據(jù)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行詳細(xì)的階段辨認(rèn)，能夠?qū)⒓?xì)胞形態(tài)本身用作細(xì)胞周期 或分化的階段標(biāo)記。并且，如果利用表達(dá)量測定裝置1000，具體而言， 在可能與細(xì)胞周期有關(guān)的某些基因中， 一邊利用發(fā)光檢測監(jiān)視細(xì)胞周期， 一邊利用熒光檢測來辨認(rèn)表達(dá)時期/局部存在性，由此，能夠評價與細(xì)胞 周期有無關(guān)聯(lián)性或作為細(xì)胞周期標(biāo)記的有用性。[III]以下，參照附圖詳細(xì)說明作為本發(fā)明的測定裝置的顯微鏡單元 和顯微鏡裝置的優(yōu)選實施方式。另外，該實施方式不限定本發(fā)明。并且 在附圖的記載中，對相同部分賦予相同標(biāo)號。 (實施方式1)首先，說明作為本發(fā)明的實施方式l的顯微鏡裝置。圖25是表示本 實施方式1的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的示意圖。如圖25所示，該實施方式1 的顯微鏡裝置100a具有進(jìn)行熒光觀察的熒光顯微鏡單元101;進(jìn)行微 弱光觀察的微弱光顯微鏡單元102a;保持賦予了發(fā)光標(biāo)識和熒光標(biāo)識的
標(biāo)本S的作為保持單元的保持部7;顯示通過各顯微鏡單元101、 102a 所拍攝的標(biāo)本S的標(biāo)本像等的監(jiān)視器9;以及控制顯微鏡裝置100a的整 體處理和動作的控制裝置PC1。熒光顯微鏡單元101和微弱光顯微鏡單 元102a相互鄰接配置。熒光顯微鏡單元101具有高倍率的熒光成像光學(xué)系統(tǒng)，其具有作 為熒光物鏡的物鏡1和作為熒光成像透鏡的成像透鏡2;作為熒光攝像單元的攝像裝置3，其拍攝通過該熒光成像光學(xué)系統(tǒng)成像的標(biāo)本S的標(biāo)本像 即熒光標(biāo)本像；激勵光源4，其發(fā)出激勵標(biāo)本S的激勵光；聚集來自激勵 光源4的激勵光的透鏡5;以及作為熒光單元的熒光立方體6。物鏡1在標(biāo)本側(cè)具有大的NA，將從賦予標(biāo)本S的熒光標(biāo)識的各點 發(fā)出的熒光轉(zhuǎn)換為大致平行光束。成像透鏡2聚集由物鏡1轉(zhuǎn)換為大致 平行光束后的熒光，成像標(biāo)本S的標(biāo)本像即熒光標(biāo)本像。熒光成像光學(xué) 系統(tǒng)以40倍以上的高倍率來成像熒光標(biāo)本像。攝像裝置3具有CCD、 CMOS等的固體攝像元件，拍攝成像于該固體攝像元件的攝像面上的熒 光標(biāo)本像，生成圖像數(shù)據(jù)并輸出到控制裝置PC1。熒光立方體6 —體地具有作為激勵光透射濾光器的激勵濾光器6a， 其選擇性地透射用于激勵標(biāo)本S的激勵光；作為熒光透射濾光器的吸收 濾光器6b，其選擇性地透射從由該激勵光激勵的標(biāo)本S發(fā)出的熒光；以 及反射激勵光并透射熒光的二色鏡6c。激勵濾光器6a是從由激勵光源4 發(fā)出的各種波長的光中提取規(guī)定波長域的激勵光的帶通濾光器，吸收濾 光器6b是具有規(guī)定截止波長的長波通濾光器。另外，吸收濾光器6b也 可以是提取規(guī)定波長范圍的熒光的帶通濾光器。帶通濾光器在從標(biāo)本S 發(fā)出的微弱光和熒光的波長接近的情況下有效。激勵光源4通過汞燈、氙氣燈、激光器等來實現(xiàn)，透鏡5和作為激 勵光照射單元的激勵光源4將來自激勵光源4的激勵光經(jīng)由激勵濾光器 6a，由二色鏡6c反射來照射到標(biāo)本S上。另外，激勵光源4根據(jù)來自控 制裝置PC1的指示進(jìn)行點亮和熄滅。微弱光顯微鏡單元102a具有低倍率的微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)，其具 有作為微弱光物鏡的物鏡11和作為微弱光成像透鏡的成像透鏡12;以及
作為微弱光攝像單元的攝像裝置13，其拍攝通過該微弱光成像光學(xué)系統(tǒng) 成像的標(biāo)本S的標(biāo)本像即微弱光標(biāo)本像。物鏡11在標(biāo)本側(cè)具有大的NA，將從賦予標(biāo)本S的發(fā)光標(biāo)識的各點通過自身發(fā)光而發(fā)出的微弱光轉(zhuǎn)換為大致平行光束。成像透鏡12聚集由物鏡11轉(zhuǎn)換為大致平行光束后的微弱光，成像標(biāo)本s的標(biāo)本像即微弱光標(biāo)本像。微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)以比熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的成像倍率低的成 像倍率來成像微弱光標(biāo)本像。此時，微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)優(yōu)選將標(biāo)本側(cè)的NA設(shè)為NAo，將成像倍率設(shè)為3時，滿足(NAo/ P) 2^0.01。攝像裝置13具有CCD、 CMOS等的固體攝像元件，拍攝成像于該 固體攝像元件的攝像面上的微弱光標(biāo)本像，生成圖像數(shù)據(jù)并輸出到控制 裝置PC1。另外，攝像裝置13具有的固體攝像元件可以使用高感光度的 單色CCD、即(TC左右的冷卻CCD。保持部7具有直接載置標(biāo)本S的標(biāo)本瓶、載玻片、微板、凝膠支 持體、微粒子載體、培育箱等的保持部件7a;以及使標(biāo)本S與該保持部 件7a —起二維移動的可動載置臺7b?？蓜虞d置臺7b根據(jù)來自控制裝置 PC1的指示由載置臺驅(qū)動部8驅(qū)動?？刂蒲b置PC1通過具有CPU的計算機(jī)等的處理裝置來實現(xiàn)，將攝像 裝置3、 13、激勵光源4、載置臺驅(qū)動部8和監(jiān)視器9電連接，來控制這 些各個結(jié)構(gòu)部位的動作?？刂蒲b置PC1特別是作為攝像切換控制單元， 根據(jù)攝像裝置13所拍攝的微弱光標(biāo)本像的像特征，進(jìn)行攝像切換處理的 控制，即切換微弱光顯微鏡單元102a進(jìn)行的微弱光標(biāo)本像的拍攝和熒 光顯微鏡單元101進(jìn)行的熒光標(biāo)本像的拍攝。這里，說明控制裝置PC1控制的攝像切換處理。圖26是表示攝像切 換處理的處理步驟的流程圖。如圖26所示，控制裝置PC1通過攝像裝置 13來拍攝通過可動載置臺7b在微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)移動的標(biāo)本 S的微弱光標(biāo)本像(步驟S101)?？刂蒲b置PC1根據(jù)該拍攝結(jié)果，判斷在 微弱光標(biāo)本像內(nèi)是否存在作為微弱光標(biāo)本像的像特征的像強度比預(yù)先設(shè) 定的閾值大的區(qū)域(步驟S103)。在判斷為沒有像強度比閾值大的區(qū)域的 情況下(步驟S103:"否")，控制裝置PC1重復(fù)從步驟S101起的處理。
另一方面，在判斷為存在像強度比閾值大的區(qū)域的情況下(步驟 S103 :"是")，控制裝置PC 1記錄在步驟S101中拍攝的微弱光標(biāo)本像(步驟S105)，通過可動載置臺7b使標(biāo)本S在熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)移 動(步驟S107)。而且，控制裝置PC1通過攝像裝置3拍攝與微弱光標(biāo) 本像的像強度比閾值大的區(qū)域相對應(yīng)的熒光標(biāo)本像，并對其進(jìn)行記錄(步 驟S109)，結(jié)束攝像切換處理。另外，進(jìn)行標(biāo)本S的經(jīng)過觀察時，控制裝 置PC1也可以控制成，在步驟S109后，通過可動載置臺7b使標(biāo)本S再 次在微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)移動，重復(fù)從步驟S101起的處理。并 且，步驟S109的拍攝可以是連續(xù)拍攝或1個圖像的拍攝中的任一種。并 且，在與各個細(xì)胞周期對應(yīng)的定時拍攝的連續(xù)拍攝影像或一個圖像上， 同時對同一視場內(nèi)的不同細(xì)胞進(jìn)行圖像再現(xiàn)，由此可以進(jìn)行使細(xì)胞周期 一致的動態(tài)圖像(或幀傳送)或l個圖像的顯示。控制裝置PC1在步驟S105和S109中，將所拍攝的微弱光標(biāo)本像和 熒光標(biāo)本像存儲在本裝置內(nèi)具有的RAM等的存儲部內(nèi)。并且，控制裝置 PC1也可以在步驟S101和S109中，在監(jiān)視器9上逐次顯示所拍攝的微 弱光標(biāo)本像和熒光標(biāo)本像。進(jìn)而，控制裝置PC1也可以控制成，在步驟 S101 S105的期間、即通過微弱光顯微鏡單元102進(jìn)行標(biāo)本S的微弱光 觀察的期間，熄滅激勵光源4，在步驟S109中進(jìn)行標(biāo)本S的熒光觀察時， 點亮激勵光源4?；蛘?，在從激勵光源4到熒光單元6的光路上設(shè)置快門 等遮光裝置，控制裝置PC1作為未照射單元，代替點亮或熄滅激勵光源 4，通過開閉遮光裝置來控制激勵光的照射。另外，控制裝置PC1在步驟S103中，根據(jù)微弱光標(biāo)本像內(nèi)的部分 區(qū)域的像強度，判斷向熒光觀察的切換，但是，也可以根據(jù)微弱光標(biāo)本 像的整體的像強度來判斷切換。并且，控制裝置PC1可以將這些像強度 例如作為從規(guī)定時刻到當(dāng)前時刻的累計的像強度來取得，或者也可以作 為當(dāng)前時刻的瞬間的像強度來取得。另外，在取得微弱光標(biāo)本像的整體 像強度的情況下，也可以代替攝像裝置13，使用光電倍增管等高感光度 的受光元件。如以上說明的那樣，根據(jù)本實施方式1的顯微鏡裝置，因為相鄰地
具有熒光觀察用的熒光顯微鏡單元101和微弱光觀察用的微弱光顯微鏡單元102a，并且具有使標(biāo)本S在熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光成像光學(xué)系 統(tǒng)的各視場內(nèi)移動的可動載置臺7b，所以能夠適當(dāng)?shù)厍袚Q熒光觀察和微 弱光觀察，并且能夠根據(jù)作為微弱光標(biāo)本像的像特征的像強度，即時地 從微弱光觀察向熒光觀察切換。另外，微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)作為通過物鏡11和成像透鏡12成像標(biāo) 本像的無限遠(yuǎn)校正光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行了說明，但是也可以作為僅通過物鏡成 像標(biāo)本像的有限校正光學(xué)系統(tǒng)。并且，在上述的攝像切換處理中，根據(jù)微弱光標(biāo)本像的像強度等的 像特征，從微弱光觀察切換為熒光觀察，但是，在熒光觀察中向標(biāo)本S 照射的激勵光強度和從標(biāo)本S發(fā)光的熒光強度弱、通過激勵光和熒光對 標(biāo)本S造成的損傷小等情況下，也可以根據(jù)熒光標(biāo)本像的像強度等的像 特征，從熒光觀察切換為微弱光觀察。 (實施方式2)接著，說明本發(fā)明的實施方式2。在上述的實施方式l中，通過可動 載置臺7b使標(biāo)本S在熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場 內(nèi)移動，但是在本實施方式2中，通過使熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光成 像光學(xué)系統(tǒng)移動，從而將標(biāo)本S配置在各視場內(nèi)。圖27是表示本發(fā)明的實施方式2的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的示意圖。如 圖27所示，本實施方式2的顯微鏡裝置200與顯微鏡裝置100a同樣， 具有熒光顯微鏡單元201和微弱光顯微鏡單元202，并且在這些各顯微鏡 單元201、 202的中間位置具有作為光學(xué)系統(tǒng)移動單元的旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14 和保持軸15a、 15b。進(jìn)而，顯微鏡裝置200代替顯微鏡裝置100a所具有 的保持部7，而具有保持部17，該保持部17具有減小可動范圍的可動載 置臺17b，并且代替控制裝置PC1，而具有控制裝置PC2。其他結(jié)構(gòu)與實 施方式1相同，對相同的結(jié)構(gòu)部分賦予相同標(biāo)號。熒光顯微鏡單元201具有殼體21，該殼體21 —體地保持與熒光顯 微鏡單元101相同的各結(jié)構(gòu)部位，微弱光顯微鏡單元202具有殼體22， 該殼體22 —體地保持與微弱光顯微鏡單元102a相同的各結(jié)構(gòu)部位。
旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14具有旋轉(zhuǎn)軸，該旋轉(zhuǎn)軸通過連接熒光顯微鏡單元201具有的熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光顯微鏡單元202具有的微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場的大致中心點的線段的中點，并與各光學(xué)系統(tǒng)的光軸大致平行，以該旋轉(zhuǎn)軸為中心，使多個保持軸15a、 15b所保持的熒光顯 微鏡單元201和微弱光顯微鏡單元202旋轉(zhuǎn)移動。這里，固定軸15a、 15b 分別保持殼體21、 22。可動載置臺17b使標(biāo)本S在與微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場大致相等 的范圍內(nèi)移動。并且，可動載置臺17b根據(jù)來自控制裝置PC2的指示由 載置臺驅(qū)動部18驅(qū)動?？刂蒲b置PC2除了與控制裝置PC1同樣地控制攝像裝置3、 13、激 勵光源4和載置臺驅(qū)動部18的動作之外，還控制旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14的動 作。控制裝置PC2在切換微弱光觀察和熒光觀察時，控制旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置 14，來切換熒光顯微鏡單元201和微弱光顯微鏡單元202的配置。這樣，根據(jù)本實施方式2的顯微鏡裝置200，因為通過旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝 置14使熒光顯微鏡單元201和微弱光顯微鏡單元202旋轉(zhuǎn)移動，來切換 熒光觀察和微弱光觀察，所以即使在將例如被浸泡在培養(yǎng)液中的標(biāo)本等 不能高速移動的標(biāo)本作為觀察對象的情況下，也能夠即時切換熒光觀察 和微弱光觀察。另外，在顯微鏡裝置200中，通過旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14使各顯微鏡單元 201、 202的整體旋轉(zhuǎn)移動，但是也可以以一個攝像裝置共用攝像裝置3、 13，使從熒光顯微鏡單元201中除去攝像裝置3的部分、和從微弱光顯 微鏡單元202除去攝像裝置13的部分旋轉(zhuǎn)移動，來相互切換配置。圖28是表示這種情況下的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的示意圖。如圖28所 示，作為該實施方式2的變形例的顯微鏡裝置300從顯微鏡裝置200中 取下攝像裝置13，代替一體地保持微弱光顯微鏡單元202的整體的殼體 22，而具有一體地保持微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的殼體24，并且代替一體地 保持熒光顯微鏡單元201的整體的殼體21，而具有一體地保持除去了攝 像裝置3的部分的殼體23。并且，顯微鏡裝置300代替控制裝置PC2而 具有控制裝置PC3。其他結(jié)構(gòu)與顯微鏡裝置200相同，對相同的結(jié)構(gòu)部
分賦予相同標(biāo)號?？刂蒲b置PC3與控制裝置PC2同樣地控制攝像裝置3、激勵光源4、 載置臺驅(qū)動部18和旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14的動作。但是控制裝置PC2根據(jù)熒 光觀察和微弱光觀察來切換攝像裝置3、 13的控制，與此相對，控制裝 置PC3在熒光觀察和微弱光觀察雙方的情況下，控制攝像裝置3來拍攝 標(biāo)本像。此時，控制裝置PC3根據(jù)熒光觀察和微弱光觀察，切換由攝像 裝置3拍攝的標(biāo)本像的范圍、成像倍率等來進(jìn)行識別。另外，旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14通過固定軸15a、 15b來保持殼體23、 24， 按照來自控制裝置PC3的指示，根據(jù)微弱光觀察和熒光觀察，來切換殼 體23、 24的配置。這樣，根據(jù)作為本實施方式2的變形例的顯微鏡裝置300，因為通過 旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14使從熒光顯微鏡單元201和微弱光顯微鏡單元202除去 攝像裝置3、 13的部分旋轉(zhuǎn)移動，來切換熒光觀察和微弱光觀察，所以 使移動部分輕量化，能夠更加快速地進(jìn)行移動和切換。并且，在顯微鏡 裝置300中，相比顯微鏡裝置100a、 200，因為削減了攝像裝置的數(shù)量， 所以能夠簡化與攝像裝置關(guān)聯(lián)的電路結(jié)構(gòu)，并且能夠減輕控制裝置PC3 的處理負(fù)荷，實現(xiàn)處理的高速化。并且能夠降低裝置的成本。另外，在顯微鏡裝置200、 300中，通過旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14使熒光顯 微鏡單元201和微弱光顯微鏡單元202、或者這些各單元的一部分旋轉(zhuǎn)移 動，但是不限于旋轉(zhuǎn)移動，例如也可以使熒光顯微鏡單元201和微弱光 顯微鏡單元202沿著可動載置臺17b平行移動，來切換各單元201、 202 的配置。(實施方式3)接著，說明本發(fā)明的實施方式3。在上述的實施方式1和實施方式2 中，具有配置在標(biāo)本S的相同側(cè)的獨立的熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光成 像光學(xué)系統(tǒng)，但是在本實施方式3中，具有共用光學(xué)系統(tǒng)的--部分的熒 光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)。圖29是表示本發(fā)明的實施方式3的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的示意圖。如 圖29所示，本實施方式3的顯微鏡裝置400具有共用顯微鏡裝置100a獨立具有的熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的物鏡而一體化的顯微鏡單元。具體而言，顯微鏡裝置400具有與顯微鏡裝置100a所具有 的熒光顯微鏡單元101同樣的顯微鏡單元，還具有反射鏡34，該反射鏡 34可在該顯微鏡單元所具有的物鏡1和熒光立方體6之間插拔，在通過 該反射鏡34而向圖上左側(cè)彎曲大約90度的光軸上，具有攝像裝置13和 代替成像透鏡12的成像透鏡32。這樣，顯微鏡裝置400共用物鏡1并具備具有物鏡1和成像透鏡2 的熒光成像光學(xué)系統(tǒng)、和具有物鏡1和成像透鏡32的微弱光成像光學(xué)系 統(tǒng)的。并且，顯微鏡裝置400具有顯微鏡裝置200所具有的保持部17和 載置臺驅(qū)動部18，并且在激勵光源4和透鏡5之間具有作為未照射單元 的快門33;使該快門33和反射鏡34動作的光路切換驅(qū)動部35;以及控 制裝置PC4。其他結(jié)構(gòu)與實施方式1或?qū)嵤┓绞?相同，對相同的結(jié)構(gòu) 部分賦予相同標(biāo)號。控制裝置PC4除了與控制裝置PC2同樣地控制攝像裝置3、 13和載 置臺驅(qū)動部18的動作之外，還通過光路切換驅(qū)動部35控制快門33和反 射鏡34的動作。在從微弱光觀察切換為熒光觀察時，控制裝置PC4從物 鏡1和熒光立方體6之間去除反射鏡34，打開快門33使來自激勵光源4 的激勵光向標(biāo)本S照射。另一方面，在從熒光觀察切換為微弱光觀察時， 控制裝置PC4關(guān)閉快門33，遮蔽來自激勵光源4的激勵光，不向標(biāo)本S 照射激勵光，并且在物鏡1和熒光立方體6之間的光路上插入配置反射 鏡34，使來自標(biāo)本S的微弱光向成像透鏡32反射。另外，成像透鏡32具有比成像透鏡2短的焦點距離，具有成像透鏡 32的微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)以比具有成像透鏡2的熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的成 像倍率低的成像倍率來成像微弱光標(biāo)本像。并且，具有成像透鏡32的微 弱光成像光學(xué)系統(tǒng)優(yōu)選將標(biāo)本側(cè)的NA設(shè)為NAo'，將成像倍率設(shè)為P '， 并滿足(NAo， ，) 2^0.01。這樣，根據(jù)本實施方式3的顯微鏡裝置400，因為具有通過共用物 鏡的熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)而一體化的顯微鏡單元， 所以，能夠使顯微鏡裝置整體小型化和簡單化，并且，伴隨著切換熒光
觀察和微弱光觀察的移動部分為單一的光學(xué)元件而輕量化，所以能夠更 加快速地進(jìn)行移動和切換。另外，來自激勵光源4的激勵光和來自標(biāo)本S的熒光、與來自標(biāo)本S的微弱光的波長帶域不同時，代替反射鏡34，也可以使用透射激勵光 和熒光并反射微弱光的二色鏡。該情況下，控制裝置PC4在切換熒光觀 察和微弱光觀察時不需要插拔二色鏡。并且，使用二色鏡時，控制裝置 PC4也可以控制成同時進(jìn)行熒光觀察和微弱光觀察。 (實施方式4)接著，說明本發(fā)明的實施方式4。在上述的實施方式l中，熒光顯微 鏡單元101和微弱光顯微鏡單元102a相對于標(biāo)本S配置在相同側(cè)，但是 在本實施方式4中，熒光顯微鏡單元和微弱光顯微鏡單元相對于標(biāo)本S 配置在相反側(cè)。圖30是表示本發(fā)明的實施方式4的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的示意圖。如 圖30所示，本實施方式4的顯微鏡裝置500具有顯微鏡裝置100a所具 有的熒光顯微鏡單元101和微弱光顯微鏡單元102a，并且具有顯微鏡裝 置200所具有的保持部17和載置臺驅(qū)動部18，進(jìn)而還具有控制裝置PC5 和監(jiān)視器9。與實施方式1或?qū)嵤┓绞?相同的結(jié)構(gòu)部分賦予相同標(biāo)號。在圖30所示的顯微鏡裝置500中，熒光顯微鏡單元101在圖上配置 在標(biāo)本S的下側(cè)，微弱光顯微鏡單元102a配置在標(biāo)本S的上側(cè)。另外， 這些各單元IOI、 102a的上下配置關(guān)系也可以相反?？刂蒲b置PC5與控制裝置PC2同樣地控制攝像裝置3、 13、激勵光 源4和載置臺驅(qū)動部18的動作。在從微弱光觀察切換為熒光觀察時，控 制裝置PC5點亮激勵光源4，向標(biāo)本S照射激勵光，在從熒光觀察切換 為微弱光觀察時，控制裝置PC5熄滅激勵光源4，不向標(biāo)本S照射激勵 光。另外，在從激勵光源4經(jīng)由二色鏡6c到標(biāo)本S的光路上設(shè)置快門 33等遮光裝置，控制裝置PC5作為未照射單元，代替點亮或熄滅激勵光 源4，通過開閉遮光裝置來控制照射和不照射激勵光。另外，來自激勵光源4的激勵光和來自標(biāo)本S的熒光、與來自標(biāo)本 S的微弱光的波長帶域不同時，例如在成像透鏡12和攝像裝置13之間， 設(shè)置透射微弱光并遮蔽激勵光和熒光的波長提取濾光器，控制裝置PC5也可以切換熒光觀察和微弱光觀察，而不熄滅激勵光源4?；蛘撸撉闆r 下，控制裝置PC5也可以控制成同時進(jìn)行熒光觀察和微弱光觀察。這樣，根據(jù)本實施方式4的顯微鏡裝置500，因為熒光顯微鏡單元 101和微弱光顯微鏡單元102a相對于標(biāo)本S配置在相反側(cè)，所以完全不 進(jìn)行機(jī)械驅(qū)動，就可以即時切換熒光觀察和微弱光觀察。另外，控制裝置PC5也可以通過未圖示的驅(qū)動裝置使熒光顯微鏡單 元101相對于微弱光顯微鏡單元102a沿著可動載置臺17b相對移動。該 情況下，能夠一邊通過微弱光顯微鏡單元102a繼續(xù)觀察標(biāo)本S的廣范圍 區(qū)域， 一邊通過熒光顯微鏡單元101觀察該廣范圍區(qū)域內(nèi)的任意微小區(qū) 域的放大像，并且完全不移動標(biāo)本S就能夠進(jìn)行熒光觀察和微弱光觀察。 (實施方式5)接著，說明本發(fā)明的實施方式5。在上述的實施方式1 4中，通過 來自發(fā)光標(biāo)識和熒光標(biāo)識的微弱光和熒光來觀察標(biāo)本S，但是在本實施方 式5中，還通過透射照明來觀察標(biāo)本S。圖31是表示本發(fā)明的實施方式5的顯微鏡裝置的結(jié)構(gòu)的示意圖。如 圖31所示，本實施方式5的顯微鏡裝置600除了實施方式1的顯微鏡裝 置100a以外，還具有進(jìn)行透射照明的作為照明單元的透射照明單元 103a;驅(qū)動該透射照明單元103a所具有的快門43等的照明驅(qū)動部46; 以及代替控制裝置PC1的控制裝置PC6。其他結(jié)構(gòu)與實施方式1相同， 對相同的結(jié)構(gòu)部分賦予相同標(biāo)號。透射照明單元103a具有發(fā)出透射照明用的白色光的鹵素?zé)舻劝咨?光源44;切換白色光的照射和不照射的快門43;以及將來自白色光源44 的白色光聚集在標(biāo)本S上的照明透鏡系統(tǒng)45，透射照明單元103a相對于 標(biāo)本S配置在熒光顯微鏡單元101的相反側(cè)。照明透鏡系統(tǒng)45具有聚光 透鏡45a和聚束透鏡45b，對標(biāo)本S進(jìn)行臨界照明。另外，照明透鏡系統(tǒng) 45也可以對標(biāo)本S進(jìn)行科勒照明。照明驅(qū)動部46根據(jù)來自控制裝置PC6的指示，驅(qū)動快門43和熒光
照明單元104a。這里，熒光照明單元104a具有由殼體26 —體保持的激 勵光源4、透鏡5和熒光立方體6。照明驅(qū)動部46開閉快門43來切換向 標(biāo)本S照射和不照射白色光，并且使熒光照明單元104a移動，以使熒光 立方體6在物鏡1和成像透鏡2之間的光路上插拔?？刂蒲b置PC6除了與控制裝置PC1同樣地控制攝像裝置3、 13、激 勵光源4和載置臺驅(qū)動部8的動作之外，還控制照明驅(qū)動部46的動作。 在從熒光觀察切換為基于透射照明的觀察時，控制裝置PC6使熒光照明 單元104a移動，以使從物鏡1和成像透鏡2之間去除熒光立方體6，并 熄滅激勵光源4，打開快門43來進(jìn)行透射照明。在從基于透射照明的觀 察切換為熒光觀察時，控制裝置PC6關(guān)閉快門43，使熒光照明單元104a 移動，以使熒光立方體6配置在物鏡1和成像透鏡2之間，點亮激勵光 源4。并且，在從微弱光觀察切換為基于透射照明的觀察時，控制裝置PC6 除了從熒光觀察切換為基于透射照明的觀察時的控制之外，還進(jìn)行如下 控制通過載置臺驅(qū)動部8驅(qū)動可動載置臺7b，使標(biāo)本S在熒光成像光 學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)移動。另外，代替開閉快門43,控制裝置PC6也可以點 亮和熄滅白色光源44。另外，關(guān)于透射照明單元103a，示出了進(jìn)行明視場觀察用的照明的 情況，但不限于明視場觀察用，也可以進(jìn)行暗視場觀察用、微分干涉觀 察用或相位差觀察用的照明。并且，也可以切換這些各種觀察用的照明。 另外，在進(jìn)行微分干涉觀察用的照明時，透射照明單元103a也可以在聚 束透鏡45b的光源側(cè)具有偏光器和偏光分離棱鏡，在熒光成像光學(xué)系統(tǒng) 中，在物鏡1的瞳側(cè)配置偏光合成棱鏡和驗光器。并且，在進(jìn)行相位差 觀察用的照明時，透射照明單元103a也可以在聚束透鏡45b的光源側(cè)具 有環(huán)狀光闌，在熒光成像光學(xué)系統(tǒng)中，在物鏡1的大致瞳位置配設(shè)相位 板，或者將物鏡1切換為具有相位板的物鏡。進(jìn)而，在進(jìn)行暗視場觀察 用的照明時，透射照明單元103a也可以在聚束透鏡45b的光源側(cè)具有環(huán) 狀光闌等。并且，關(guān)于透射照明單元103a，示出了為了以高倍率進(jìn)行基于透射
照明的觀察而與熒光成像光學(xué)系統(tǒng)對應(yīng)地配置的情況，但也可以為了以 低倍率進(jìn)行觀察而與微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)對應(yīng)地配置?；蛘?，也可以與 這些成像光學(xué)系統(tǒng)雙方對應(yīng)地配置，相對于各成像光學(xué)系統(tǒng)適當(dāng)切換配 置。但是，在顯微鏡裝置600中，示出了在顯微鏡裝置100a的結(jié)構(gòu)上還 具有透射照明單元103a和照明驅(qū)動部46的情況，但不限于此，例如如 圖32 圖34所示，也可以在顯微鏡裝置200、 300、 400的各結(jié)構(gòu)上還具 有透射照明單元103a和照明驅(qū)動部46或照明驅(qū)動部47。圖32所示的顯微鏡裝置700是在顯微鏡裝置200的結(jié)構(gòu)上還具有透 射照明單元103a和照明驅(qū)動部46的情況，控制裝置PC7與控制裝置PC2 同樣地控制攝像裝置3、 13、激勵光源4、旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14和載置臺驅(qū) 動部1S，并且與控制裝置PC6同樣地通過照明驅(qū)動部46控制透射照明 單元103a和熒光照明單元104a。圖33所示的顯微鏡裝置800是在顯微鏡裝置300的結(jié)構(gòu)上還具有透 射照明單元103a和照明驅(qū)動部46的情況，控制裝置PC8與控制裝置PC3 同樣地控制攝像裝置3、激勵光源4、旋轉(zhuǎn)驅(qū)動裝置14和載置臺驅(qū)動部 18,并且與控制裝置PC6同樣地通過照明驅(qū)動部46控制透射照明單元 103a和熒光照明單元104a。圖34所示的顯微鏡裝置900是在顯微鏡裝置300的結(jié)構(gòu)上還具有透 射照明單元103a和照明驅(qū)動部47的情況，控制裝置PC9與控制裝置PC4 同樣地控制攝像裝置3、 13和載置臺驅(qū)動部18，并且通過照明驅(qū)動部47 控制透射照明單元103a、反射鏡34和熒光照明單元105。即，'在從熒光觀察或微弱光觀察切換為基于透射照明的觀察時，控 制裝置PC9使熒光照明單元105移動，以使從物鏡1和成像透鏡2之間 去除反射鏡34和熒光立方體6，關(guān)閉快門33不照射激勵光，打開快門 43進(jìn)行透射照明。在從基于透射照明的觀察切換為熒光觀察或微弱光觀 察時，控制裝置PC9關(guān)閉快門43，使熒光照明單元105或反射鏡34移 動，以使熒光立方體6或反射鏡34配置在物鏡1和成像透鏡2之間。進(jìn) 行熒光觀察時，還打開快門33向標(biāo)本S照射熒光。 這樣，根據(jù)本實施方式5的顯微鏡裝置600、 700、 800、卯0，因為 對應(yīng)于熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)中的至少一方，具有對 標(biāo)本S進(jìn)行透射照明的透射照明單元，所以，不僅是熒光觀察和微弱光 觀察，還能夠進(jìn)行各種基于透射照明的觀察，能夠多角度地觀察標(biāo)本S。另外，示出了上述顯微鏡裝置100a、 200、 300、 400、 600、 700、 800、 900分別為正立型顯微鏡裝置的情況，但也可以是倒立型顯微鏡裝置。并 且，上述顯微鏡裝置例如能夠適當(dāng)?shù)赜糜诟鞣N反應(yīng)(例如藥物刺激和光 照射等)的檢查和治療等。以上，詳細(xì)說明了實施方式，但在本發(fā)明中，發(fā)光是指能夠通過化 學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光，特別是作為優(yōu)選的例子包含生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的用語。 與此相對，熒光是指能夠通過激勵光而產(chǎn)生光。這里，通過生物發(fā)光產(chǎn) 生的光能所激勵的BRET (生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)是與基質(zhì)溶液發(fā)生化 學(xué)反應(yīng)的要因，在本發(fā)明中包含在發(fā)光內(nèi)。從樣本產(chǎn)生的光稱為電磁放 射線，其對活細(xì)胞的危害特別小，具有大約400nm 大約900nm之間的 波長。發(fā)光的樣本的拍攝需要使用如下的光檢測器檢測極低電平的光 (通常為單一光子事件)，能夠?qū)庾臃派溥M(jìn)行積分，直到能夠構(gòu)筑圖像。 在這種高感光度光檢測器的例子中，能夠例示具有放大單一光子事件后， 針對檢測系統(tǒng)固有的背景噪聲能夠檢測單一光子的照相機(jī)或照相機(jī)組， 例如具有CCD這樣的攝像元件組的CCD照相機(jī)。 一般為了獲得高感光 度，有時利用液體氮等來冷卻CCD照相機(jī)。本發(fā)明者確認(rèn)了使用高數(shù) 值孔徑(NA)，特別是使用數(shù)值孔徑(NA) /投影倍率(3)的平方來 表示的光學(xué)條件為0.01以上的物鏡時，冷卻溫度為負(fù)5'C 負(fù)20。C，優(yōu) 選為負(fù)5。C 常溫時能夠圖像化。進(jìn)而，進(jìn)一步研究的結(jié)果查明了在上 述光學(xué)條件(NA / P )的平方為0.071以上時，在5分鐘以內(nèi)，根據(jù)場 合，能夠提供可視認(rèn)一分鐘左右且能夠解析的細(xì)胞圖像。 一般情況下， 因為活的樣本的形狀或發(fā)光部位的變化，在攝像時間超過30分鐘時大多 難以獲得鮮明的發(fā)光圖像。因此，在本發(fā)明中，提供一種以短時間、特 別是在30分鐘以內(nèi)、優(yōu)選1分鐘 10分鐘取得一個發(fā)光圖像，有利于與 攝像時間快的熒光測定的合作的方法和裝置。
例如，作為關(guān)聯(lián)的方式，為了記錄針對所選擇的生物適合成份的分 布和/或局部存在的某些處理的效果，希望經(jīng)時跟蹤熒光信號的局部存在 和/或發(fā)光信號的強度時，以所選擇的時間間隔反復(fù)進(jìn)行光子放射的測定 或拍攝，由此能夠構(gòu)筑一系列的圖像。間隔可以是幾分鐘左右的短間隔, 也可以是幾天或幾周左右的長間隔。發(fā)光圖像或熒光(或透射光)發(fā)光 的重合圖像能夠以畫面顯示、被印刷的紙、被圖形加工的影像等各種形 式來表現(xiàn)。作為其他關(guān)聯(lián)的方式，本發(fā)明包含如下方法檢測出利用誘導(dǎo)性催 化劑的控制下包含的構(gòu)筑物使束縛發(fā)光性蛋白質(zhì)的基因成為轉(zhuǎn)基因或嵌 合體的動物中的催化劑誘導(dǎo)事件的存在后，監(jiān)視催化劑誘導(dǎo)事件的活性 度。催化劑誘導(dǎo)事件具有對該催化劑進(jìn)行直接活性化的物質(zhì)的投放、 刺激內(nèi)因性催化劑活性化因子的產(chǎn)生的物質(zhì)的投放(例如RNA病毒感染 的干擾素產(chǎn)生的刺激)、處于具有內(nèi)因性催化劑活性化因子的產(chǎn)生的狀態(tài) 等(例如熱沖擊或應(yīng)力)。作為另一個方式，本發(fā)明包含如下方法辨認(rèn)對抑制病原體引起的 感染的嚴(yán)重化有效的治療用化合物。在該方法中，將病原體、熒光成份 和發(fā)光成份的復(fù)合體投放到對照動物和實驗動物或培養(yǎng)它們的組織(或 細(xì)胞)中，利用治療用化合物候選來處理該實驗動物。然后，通過上述 方法，確認(rèn)了作為測定對象的樣本內(nèi)的熒光信號的局部存在后，僅從被 確認(rèn)了局部存在的樣本中，連續(xù)測定發(fā)光信號(生物發(fā)光或化學(xué)發(fā)光)。 由此，能夠監(jiān)視該化合物在治療上的有效性。作為又一個方式，本發(fā)明包含如下方法利用熒光信號選擇了通過 具有各種不透明度的介質(zhì)而局部存在的樣本后，僅從被確認(rèn)了局部存在 的樣本中，連續(xù)進(jìn)行發(fā)光測定。在該方法中，能夠?qū)ν干浒l(fā)光信號的介 質(zhì)的光子進(jìn)行積分來制作圖像，但是也可以進(jìn)行方法的改良，僅將被確 認(rèn)了局部存在的樣本從介質(zhì)(例如臟器組織)以外科的方式取出，在適 宜的培養(yǎng)環(huán)境下對取出的樣本進(jìn)行發(fā)光測定。被限定的外科手術(shù)(例如 活組織檢査)具有以下優(yōu)點使對基礎(chǔ)生物(例如哺乳類、特別是人) 的身體負(fù)擔(dān)成為最小限度，在穩(wěn)定的檢査環(huán)境下僅移動必要的樣本，就
能夠長期執(zhí)行各種期望的對藥劑的反應(yīng)、治療后的經(jīng)過管理和預(yù)防醫(yī)學(xué) 試驗。作為又一個方式，本發(fā)明包含如下方法在某生物內(nèi)的指定部位， 測定所選擇的物質(zhì)(例如溶解的氧或鈣)的濃度。在以上的說明中，在本發(fā)明中，也能夠提供如下所示的生物發(fā)光的 圖像解析(或成像分析)中的分析試劑。特別是在本發(fā)明的優(yōu)選實施方 式中，能夠提供用于分析不包含不透明組織的、主要包含被離析的細(xì)胞 或細(xì)胞群的生物學(xué)試樣的任意的生物學(xué)活性(酶活性、免疫學(xué)活性、分 子生物學(xué)活性、遺傳學(xué)活性、內(nèi)科活性等)的方法、試劑以及裝置。這 里，因為在主要由光透射性高的材質(zhì)構(gòu)成的收容容器(例如樣本池、培 養(yǎng)皿、顯微鏡載玻片、微型射流技術(shù)用芯片)中長時間保持被離析的細(xì) 胞或細(xì)胞群，所以能夠提供用于進(jìn)行拍攝的獨特的試劑或試劑環(huán)境，而 使細(xì)胞內(nèi)活性損失最小，或?qū)嶋H上不失去活性。1.與基質(zhì)的長期使用有關(guān)的試劑及其處理利用長時間培養(yǎng)等的技術(shù)，使試樣的細(xì)胞內(nèi)活性持續(xù)例如幾小時到 24小時、2天到6天、 一周到幾周或超過幾周時，為了具有發(fā)光，具有以下特征的處理是很重要的。以下敘述的幾種方法和/或試劑可以單獨使 用，但有時組合多個方法更好，所以在本發(fā)明中不進(jìn)行限定。(第1處理方法)現(xiàn)在銷售或報告的生物發(fā)光用試劑有可觀察24小 時的基質(zhì)，然而，如果是該時間以上、例如數(shù)周，需要追加基質(zhì)。優(yōu)選 對于配置細(xì)胞或細(xì)胞群的培養(yǎng)基定期地或與測定的開始同步地添加基質(zhì)的方法。作為適于進(jìn)行多次添加的試劑配件，優(yōu)選具有包含發(fā)光性試劑的收容單元(容器或袋)，該發(fā)光性試劑包含封入相同包裝內(nèi)的發(fā)光蛋白；和將與發(fā)光性試劑對應(yīng)的量的基質(zhì)溶液(或含有基質(zhì)的培養(yǎng)液)進(jìn) 行多次分割來收容以滿足多次使用的收容單元(容器或袋)。(第2處理方法)另一方面，長期執(zhí)行PH調(diào)整。因此，是將例如作為氣體環(huán)境的二氧化碳?xì)怏w的濃度保持在一定量以上的方法。更詳細(xì) 地講，能夠使比細(xì)胞維持生命所需的最低量濃度高的氣體存在。另一方 面，將裝置設(shè)計成，將足夠大容量的氣體環(huán)境蓄積在大氣壓以上的蓄積
容器(例如儲氣罐)內(nèi)，定期或逐漸地從該容器向細(xì)胞(或細(xì)胞群)移 動。這種氣體環(huán)境的局部的移動優(yōu)選為，與細(xì)胞(或細(xì)胞群)相對于氣 體的代謝速度對應(yīng)的速度。(第3處理方法和試劑)添加已知將PH長時間保持為恒定的HEPES。在用于添加HEPES的方法中，在上述氣體環(huán)境的情況下，能夠 根據(jù)與細(xì)胞(或細(xì)胞群)消耗的固體、液體、氣體的整體的消耗速度相 關(guān)聯(lián)的HEPES濃度，來供給HEPES。 HEPES優(yōu)選封入到公知的徐放性 膠囊中，使有效數(shù)量的膠囊與細(xì)胞(或細(xì)胞群) 一起包含在溶液中或培 養(yǎng)基內(nèi)。主要包含封入了有效數(shù)量的HEPES (或與HEPES等效的PH維 持用化合物)的徐放性膠囊的溶液或培養(yǎng)基，能夠成為達(dá)成本發(fā)明的目 的的有效的試劑。(第4處理方法、裝置或試劑)根據(jù)本發(fā)明的主旨，能夠提供保溫 用裝置和/或試劑，用于將細(xì)胞或細(xì)胞群的內(nèi)部溫度調(diào)節(jié)為不引起致命變 化的程度。(第5處理方法或試劑)涉及用于長期降低發(fā)光檢測的背景的方法 和/或試劑。S卩，能夠提供除去作為與生物發(fā)光(或化學(xué)發(fā)光)的背景的 增加相關(guān)聯(lián)的要素的組織片、有色物(例如發(fā)光性色素物質(zhì)、特別是酚 紅色素)的方法，或者能夠提供預(yù)先充分地除去這些要素的培養(yǎng)基或溶 液來作為試劑。(第6處理方法或試劑)使基質(zhì)相對于細(xì)胞特別是細(xì)胞群流通對于 發(fā)光的穩(wěn)定性和測定精度來說是重要的。作為方法，能夠連續(xù)地、間斷 地或根據(jù)細(xì)胞的老化來執(zhí)行有助于基質(zhì)的細(xì)胞膜透射的處理(例如壓力 沖擊、電沖擊)。作為試劑，能夠提供包含輔助或促進(jìn)細(xì)胞膜透射性的添 加物(例如作為膜溶解物質(zhì)的界面活性劑、作為膜浸透壓變?nèi)菸镔|(zhì)的鹽 類)的基質(zhì)或其他用途緩沖溶液。這些方法和/或試劑優(yōu)選設(shè)定為，相對 于新鮮的細(xì)胞外的基質(zhì)透射性連續(xù)或透射性臨時變高，以使在長期測定 中，細(xì)胞中具有活性的基質(zhì)不會不足。(第7處理方法)涉及達(dá)成均一染色方法的方法。預(yù)先添加磁珠， 幾小時或一天攪拌--次。因為通常情況下在用于收容的容器的底面上粘
貼細(xì)胞，所以優(yōu)選從上方進(jìn)行攪拌。(第8處理方法或試劑)涉及如下的方法和試劑在進(jìn)行長期觀察 時，除去通過對于同一細(xì)胞(或細(xì)胞群)重復(fù)多次發(fā)光反應(yīng)而產(chǎn)生的副 產(chǎn)物所導(dǎo)致的光學(xué)或化學(xué)阻礙的影響。即，根據(jù)追加基質(zhì)這樣的處理來 蓄積伴隨發(fā)光反應(yīng)的反應(yīng)副產(chǎn)物。為了除去該伴隨發(fā)光反應(yīng)的副產(chǎn)物(焦 磷酸)等，添加副產(chǎn)物排除用物質(zhì)(例如具有沉淀作用的金屬離子)。(第9處理方法或試劑)涉及使作為發(fā)光成分的熒光素再生的方法 或試劑。提供以下的方法熒光素發(fā)光后成為氧化熒光素，根據(jù)熒光素 的老化或消耗向細(xì)胞(或細(xì)胞群)供給用于使氧化熒光素再生為熒光素 的試劑。通過螢可知檢測氧化熒光素轉(zhuǎn)換為二腈后，為了合成使用而 與體內(nèi)的半胱氨酸反應(yīng)，從而再生熒光素。也能夠提供包含再生這種發(fā) 光成份的活性低下的再生物質(zhì)的基質(zhì)、或其他用途的緩沖液。作為基質(zhì)還包含月空腸素(coelenterazine)。(第IO處理方法或試劑)涉及作為新試劑的膠囊封入型基質(zhì)。預(yù)先 在規(guī)定時間經(jīng)過后或以一定的時間間隔溶出或放出的膠囊中封入適當(dāng)?shù)?基質(zhì)(例如熒光素)，使基質(zhì)保持一定濃度。并且，能夠提供如下的方法 或作為混合狀態(tài)的膠囊含有溶液的試劑，該方法同時提供沒有被封入膠 囊的基質(zhì)(例如熒光素)和封入膠囊的同種基質(zhì)。并且，與細(xì)胞(或細(xì) 胞群)同時添加(或與培養(yǎng)基接觸)在徐放速度不同的2個以上的膠囊 中含有同種基質(zhì)(例如熒光素)的試劑，由此具有在不同的放出時機(jī)自 動提供新鮮的基質(zhì)的優(yōu)點。這樣，能夠使激勵光照射時機(jī)與基質(zhì)的放出 時機(jī)相聯(lián)系。 實施例1這里，使用上述實施方式的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，將導(dǎo)入 了圖10所示的質(zhì)粒載體的多個HeLa細(xì)胞作為對象，經(jīng)時測定來自指定 的HeLa細(xì)胞內(nèi)的線粒體的發(fā)光量和ATP量。首先，說明本實施例1的實驗草案。 (1)制作融合有熒光蛋白質(zhì)(GFP)、線粒體轉(zhuǎn)移信號和熒光素酶 的融合基因。 (2) 將融合基因進(jìn)入的質(zhì)粒載體(參照圖10)導(dǎo)入到HeLa細(xì)胞。(3) 使用上述實施方式的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100 (具體而言 是構(gòu)成本裝置的倒立熒光顯微鏡)，判定線粒體中是否局部存在GFP，由 此確認(rèn)線粒體中是否局部存在熒光素酶(參照圖11)。另外，圖11是表 示構(gòu)成規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100的熒光圖像攝像單元108所拍攝的、 導(dǎo)入了質(zhì)粒載體的HeLa細(xì)胞的明視場像和熒光像的圖。(4) 在HeLa細(xì)胞中投放組胺，通過(^2+引起線粒體的ATP量的變動。(5) 使用上述實施方式的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，經(jīng)時取得 從線粒體發(fā)出的發(fā)光作為圖像(參照圖12)。另外，圖12是表示構(gòu)成規(guī) 定部位發(fā)光量測定裝置100的發(fā)光圖像攝像單元106所拍攝的、導(dǎo)入了 質(zhì)粒載體的HeLa細(xì)胞的明視場像和發(fā)光像的圖。(6) 使用上述實施方式的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，通過重合 明視場像、熒光像和發(fā)光像，選定要測定的細(xì)胞。(7) 使用上述實施方式的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，經(jīng)時測定 所選定的細(xì)胞或區(qū)域的發(fā)光強度(參照圖13)，監(jiān)視ATP量的變動。另 外，圖13是表示規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100測定的、所指定的序號1 的HeLa細(xì)胞的發(fā)光強度的經(jīng)時變動的圖。接著，說明實驗結(jié)果。如圖11所示，在序號1的HeLa細(xì)胞中，通 過質(zhì)粒載體能夠確認(rèn)導(dǎo)入有融合基因并且線粒體中局部存在熒光素酶， 并且，在序號2和序號4的HeLa細(xì)胞中，通過質(zhì)粒載體能夠確認(rèn)沒有導(dǎo) 入融合基因，進(jìn)而，在序號3的HeLa細(xì)胞中，通過質(zhì)粒載體能夠確認(rèn)導(dǎo) 入有融合基因但線粒體中沒有局部存在熒光素酶。另外，因為通過質(zhì)粒 載體能夠確認(rèn)導(dǎo)入有融合基因并且線粒體中局部存在熒光素酶的HeLa 細(xì)胞只有序號1的細(xì)胞，所以測定對象的HeLa細(xì)胞被指定為序號1的 HeLa細(xì)胞。并且，如圖12所示，能夠確認(rèn)來自序號3的HeLa細(xì)胞的發(fā) 光最強，來自序號1的HeLa細(xì)胞的發(fā)光次強，來自序號2和序號4的 HeLa細(xì)胞的發(fā)光是再次一級的同等強度。而且，如圖13所示，通過使 用規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，能夠監(jiān)視來自序號1的HeLa細(xì)胞的線 粒體的發(fā)光強度的經(jīng)時變動。 實施例2這里，使用上述實施方式的圖16所示的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，將導(dǎo)入了熒光素酶基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的HeLa細(xì)胞 作為對象，進(jìn)行該HeLa細(xì)胞的發(fā)光觀察和熒光觀察。 首先，說明本實施例2的實驗草案。(1) 通過陽離子脂質(zhì)體法將縱列配置了熒光素酶基因和綠色熒光蛋 白(GFP)基因的載體(EGFP-Luc， Clonetech公司制)導(dǎo)入到HeLa細(xì) 胞中。(2) 在載體導(dǎo)入后大約24小時后，在包含導(dǎo)入了載體的HeLa細(xì)胞 的培養(yǎng)液(D-MEM、 GIBCO， Invitrogen公司制)中添加500 " M熒光素。(3) 在圖16所示的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100的載置臺104上， 設(shè)置加入了培養(yǎng)液的容器，使用規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，拍攝HeLa 細(xì)胞的明視場圖像、熒光圖像和發(fā)光圖像。另外，在拍攝熒光圖像時， 放入激勵用分光濾光器108g和發(fā)光/熒光分光用濾光器108j，設(shè)該拍攝的 曝光時間為0.7秒。并且，在拍攝發(fā)光圖像時，取下發(fā)光/熒光分光用濾 光器108j，設(shè)該拍攝的曝光時間為5分鐘。這里，在本實施例2中，作 為物鏡108a，使用焦點距離(f)為9mm，數(shù)值孔徑(NA)為0.75的奧 林巴斯公司制的"Uapo20X"。并且，作為成像透鏡108e，使用焦點距離(f)為18mm，數(shù)值孔徑(NA)為0.25， "(NA+P ) 2"的值為0.035 的奧林巴斯公司制的"LMPlanFL IOX"。并且，作為光源108c,使用奧 林巴斯公司制的鹵素光源"LG-PSs"。并且，作為CCD照相機(jī)108d，使 用奧林巴斯公司制的"DP-30BW"。并且，作為激勵用分光濾光器108g， 使用奧林巴斯公司制的"BP470-4卯"。并且，作為發(fā)光/熒光分光用濾光 器108j，使用歐米茄(Omega)公司制的"510AF23"。接著，說明觀察結(jié)果。圖17是表示導(dǎo)入了載體(EGFP-Luc基因) 后的HeLa細(xì)胞的熒光圖像的圖。并且，圖18是表示使導(dǎo)入了載體(EGFP-Luc基因)后的HeLa細(xì)胞的熒光圖像和明視場圖像重合的圖像 的圖。并且，圖19是表示導(dǎo)入了載體(EGFP-Luc基因)后的HeLa細(xì)胞
的發(fā)光圖像的圖。如圖17、圖18和圖19所示，使用規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置100，能夠通過熒光觀察來指定能夠?qū)牖虻腍eLa細(xì)胞，進(jìn)而 能夠?qū)⒃撝付ǖ腍eLa細(xì)胞放入視場，然后進(jìn)行發(fā)光圖像的拍攝。 實施例3這里，使用上述實施方式的表達(dá)量測定裝置1000， 一邊利用熒光辨 認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊利用發(fā)光測定解析對象的基因的表達(dá)量(解析 對象的基因的催化劑檢測)。首先，制作導(dǎo)入到細(xì)胞中的載體。具體而言，制作細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基 因催化劑導(dǎo)入熒光素酶(綠)表達(dá)載體。另外，使用的細(xì)胞是PC12。接 著，將制作的載體導(dǎo)入到細(xì)胞中(轉(zhuǎn)染)。接著，使用"PKH LinkCTKits (紅)"(SIGMA公司制)對細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)行染色。接著，使用表達(dá)量 測定裝置1000， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段，--邊進(jìn)行解析對象基因即細(xì) 胞周期關(guān)聯(lián)基因的催化劑檢測。由此，能夠調(diào)査細(xì)胞周期與細(xì)胞形態(tài)的 關(guān)聯(lián)。實施例4這里，使用上述實施方式的表達(dá)量測定裝置1000， 一邊利用發(fā)光辨 認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊利用熒光進(jìn)行解析對象的基因的表達(dá)量的測定 和表達(dá)時期/該基因的局部存在的辨認(rèn)。首先，制作導(dǎo)入到細(xì)胞中的載體。具體而言，制作導(dǎo)入了解析對象 基因催化劑的熒光蛋白質(zhì)載體。接著，將HaloTag (注冊商標(biāo))載體(Promega公司制)導(dǎo)入到細(xì)胞中。另外，使用的細(xì)胞是PC12。接著， 在細(xì)胞中添加HaloTag (注冊商標(biāo))配合基(Promega公司制)，對細(xì)胞 進(jìn)行熒光素酶標(biāo)識。即，通過對于HaloTag (注冊商標(biāo))(Promega公司 制)的配合基結(jié)合，對細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶標(biāo)識。接著，使用表達(dá)量測定 裝置1000， 一邊監(jiān)視細(xì)胞周期的階段， 一邊進(jìn)行可能與細(xì)胞周期相關(guān)的 解析對象基因的表達(dá)時期/局部存在的辨認(rèn)。由此，能夠評價該解析對象 基因與細(xì)胞周期有無關(guān)聯(lián)性、和該解析對象基因作為細(xì)胞周期標(biāo)記的有 用性。產(chǎn)業(yè)上的可利用性
如上所述，本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法、規(guī)定部位發(fā)光量測 定裝置和測定裝置，在測定來自活的樣本內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量時是有 用的，并且，本發(fā)明的表達(dá)量測定方法，在測定導(dǎo)入到活細(xì)胞中的解析 對象的基因的表達(dá)量、并且辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段時是有用的，能夠適當(dāng) 地用于生物、制藥、醫(yī)療等各種領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種規(guī)定部位發(fā)光量測定方法，通過測定來自導(dǎo)入了融合基因的活的樣本的發(fā)光量，獲得來自規(guī)定部位的發(fā)光量，所述融合基因融合了使發(fā)光蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到樣本內(nèi)的所述規(guī)定部位的轉(zhuǎn)移堿基排列和表達(dá)該發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因，其特征在于，所述融合基因除了所述轉(zhuǎn)移堿基排列和所述發(fā)光關(guān)聯(lián)基因之外，還融合了表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因，該規(guī)定部位發(fā)光量測定方法包括熒光圖像攝像步驟，其對導(dǎo)入了該融合基因的樣本的熒光圖像進(jìn)行拍攝；判定步驟，其根據(jù)所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像，判定規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)；以及發(fā)光量測定步驟，其在所述判定步驟的判定結(jié)果是判定為局部存在的情況下，測定來自樣本的發(fā)光量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法，其特征在于， 當(dāng)導(dǎo)入了所述融合基因的活的樣本在攝像范圍中存在多個的情況下，該規(guī)定部位發(fā)光量測定方法還包括發(fā)光圖像攝像步驟，其對多個所述樣本的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝；以及 選定步驟，其通過使所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像和所述發(fā)光圖像攝像步驟所拍攝的發(fā)光圖像重合，從所述判定步驟的判定結(jié)果是判定為局部存在的樣本中選定測定對象的樣本，所述熒光圖像攝像步驟對多個所述樣本的熒光圖像進(jìn)行拍攝， 所述判定步驟根據(jù)所述熒光圖像，按照每個樣本來判定規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)，所述發(fā)光量測定步驟對來自所述選定步驟所選定的樣本的發(fā)光量進(jìn)行測定。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法，其特征在于， 通過重復(fù)執(zhí)行所述熒光圖像攝像步驟、所述判定步驟、所述發(fā)光圖像攝像步驟、所述選定步驟以及所述發(fā)光量測定步驟，經(jīng)時地獲得來自 樣本內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法，其特征在于， 該規(guī)定部位發(fā)光量測定方法還包括發(fā)光分離步驟，該步驟按照發(fā)光色的不同分離來自所述樣本的發(fā)光，導(dǎo)入到所述樣本中的融合基因存在多個，并預(yù)先制作成使按照所述 轉(zhuǎn)移堿基排列所轉(zhuǎn)移的發(fā)光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移目的地部位、從所述發(fā)光蛋白 質(zhì)發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光色、以及從所述熒光蛋白質(zhì)發(fā)出的熒光的熒光色的 組合分別不同，所述判定步驟根據(jù)所述熒光圖像，按照每個熒光色判定規(guī)定部位是 否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)，在所述判定步驟的判定結(jié)果是判定為局部存在的情況下，所述發(fā)光 量測定步驟從所述發(fā)光分離步驟所分離的多個發(fā)光中，指定來自該被判 定為局部存在的部位的發(fā)光，測定所指定的發(fā)光的發(fā)光量。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項所述的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法， 其特征在于，所述樣本為試樣、組織、細(xì)胞、個體中的任意一種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的規(guī)定部位發(fā)光量測定方法，其特征在于， 該規(guī)定部位發(fā)光量測定方法還包括ATP定量步驟，該步驟根據(jù)所述發(fā)光量測定步驟所測定的發(fā)光量，對所述選定步驟所選定的樣本內(nèi)規(guī)定 部位中的ATP進(jìn)行定量，所述樣本是細(xì)胞，所述規(guī)定部位是線粒體，所述轉(zhuǎn)移堿基排列是線 粒體轉(zhuǎn)移信號，所述發(fā)光蛋白質(zhì)是熒光素酶，所述熒光蛋白質(zhì)是綠色熒 光蛋白質(zhì)，除了所述熒光圖像攝像步驟、所述判定步驟、所述發(fā)光圖像攝像步 驟、所述選定步驟以及所述發(fā)光量測定步驟以外，還重復(fù)執(zhí)行所述ATP 定量步驟，由此經(jīng)時地對來自樣本內(nèi)的規(guī)定部位的ATP進(jìn)行定量。
7. —種規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置，通過測定來自導(dǎo)入了融合基因的 活的樣本的發(fā)光量，獲得來自規(guī)定部位的發(fā)光量，所述融合基因融合了　使發(fā)光蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到樣本內(nèi)的所述規(guī)定部位的轉(zhuǎn)移堿基排列和表達(dá)該發(fā) 光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因，其特征在于，使用除了所述轉(zhuǎn)移堿基排列和所述發(fā)光關(guān)聯(lián)基因之外，還融合了表 達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因的融合基因，該規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置具有-熒光圖像攝像單元，其對導(dǎo)入了該融合基因的樣本的熒光圖像進(jìn)行拍攝；判定單元，其根據(jù)所述熒光圖像攝像單元所拍攝的熒光圖像，判定規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)；以及發(fā)光量測定單元，其在所述判定單元的判定結(jié)果是判定為局部存在 的情況下，測定來自樣本的發(fā)光量。
8. —種表達(dá)量測定方法，該表達(dá)量測定方法包括發(fā)光測定步驟， 其將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān) 聯(lián)基因和解析對象的基因的活的細(xì)胞作為對象，測定從細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光 的發(fā)光強度；熒光測定步驟，其測定從細(xì)胞發(fā)出的熒光的熒光強度；以 及表達(dá)量測定步驟，其根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度或所述 熒光測定步驟所測定的熒光強度，測定所述解析對象的基因的表達(dá)量， 其特征在于，所述細(xì)胞除了所述發(fā)光關(guān)聯(lián)基因、所述熒光關(guān)聯(lián)基因和所述解析對 象的基因之外，還導(dǎo)入了在細(xì)胞周期的規(guī)定階段中所表達(dá)的細(xì)胞周期關(guān) 聯(lián)基因，該表達(dá)量測定方法還包括階段辨認(rèn)步驟，其中，在所述表達(dá)量測定 歩驟中使用發(fā)光強度的情況下，根據(jù)所述熒光測定步驟所測定的熒光強 度來判定有無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，在所述表達(dá)量測定步驟中使用 熒光強度的情況下，根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度來判定有 無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的表達(dá)量測定方法，其特征在于， 當(dāng)所述細(xì)胞在攝像范圍中存在多個的情況下，該表達(dá)量測定方法還包括　 熒光圖像攝像步驟，其對多個細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行拍攝；以及 發(fā)光圖像攝像步驟，其對所述多個細(xì)胞的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝， 所述發(fā)光測定步驟根據(jù)所述發(fā)光圖像攝像步驟所拍攝的發(fā)光圖像，分別測定從各個細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，所述熒光測定步驟根據(jù)所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像，分別測定從各個細(xì)胞發(fā)出的熒光的熒光強度，所述表達(dá)量測定步驟根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度或所述熒光測定步驟所測定的熒光強度，按照每個細(xì)胞測定所述解析對象的基因的表達(dá)量，所述階段辨認(rèn)步驟在所述表達(dá)量測定步驟中使用發(fā)光強度的情況 下，根據(jù)所述熒光測定步驟所測定的熒光強度，按照每個細(xì)胞判定有無 細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，在所述表達(dá)量測定步驟中使用熒光強度的情 況下，根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度，按照每個細(xì)胞判定有 無細(xì)胞周期關(guān)聯(lián)基因的表達(dá)，由此按照每個細(xì)胞辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的表達(dá)量測定方法，其特征在于，該表達(dá)量測定方法還包括選擇步驟，該步驟從在所述階段辨認(rèn)步驟 中辨認(rèn)了階段的細(xì)胞中，選擇測定對象的細(xì)胞，所述表達(dá)量測定步驟根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度或所 述熒光測定步驟所測定的熒光強度，測定導(dǎo)入到所述選擇步驟所選擇的 細(xì)胞中的解析對象的基因的表達(dá)量。
11. 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的表達(dá)量測定方法，其特征在于， 通過重復(fù)執(zhí)行所述發(fā)光圖像攝像步驟、所述熒光圖像攝像步驟、所述發(fā)光測定步驟、所述熒光測定步驟、所述階段辨認(rèn)步驟、所述選擇步 驟以及所述表達(dá)量測定步驟，將所述選擇步驟所選擇的細(xì)胞作為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段， 一邊經(jīng)時地測定所述解析對象的基因的表達(dá)
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的表達(dá)量測定方法，其特征在于， 所述表達(dá)量測定步驟將所述選擇步驟所選擇的細(xì)胞作為對象，根據(jù)所述熒光測定步驟所測定的熒光強度，測定所述解析對象的基因的表達(dá) 量，并且根據(jù)所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像，辨認(rèn)所述解析 對象的基因的細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。
13. —種表達(dá)量測定方法，該表達(dá)量測定方法包括發(fā)光測定步驟， 其將導(dǎo)入了表達(dá)發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光關(guān)聯(lián)基因和解析對象的基因的活的細(xì) 胞作為對象，測定從細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度；以及表達(dá)量測定步驟， 其根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度，測定所述解析對象的基因 的表達(dá)量，其特征在于，所述細(xì)胞利用熒光物質(zhì)對其規(guī)定部位進(jìn)行染色， 該表達(dá)量測定方法還包括熒光圖像攝像步驟，其對該細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行拍攝；以及 階段辨認(rèn)步驟，其根據(jù)所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像， 判定細(xì)胞的形狀是否發(fā)生了變化，由此辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的表達(dá)量測定方法，其特征在于， 當(dāng)所述細(xì)胞在攝像范圍中存在多個的情況下，該表達(dá)量測定方法還包括發(fā)光圖像攝像步驟，該步驟對多個細(xì)胞的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝， 所述熒光圖像攝像步驟對所述多個細(xì)胞的熒光圖像進(jìn)行拍攝， 所述發(fā)光測定步驟根據(jù)所述發(fā)光圖像攝像步驟所拍攝的發(fā)光圖像，分別測定從各個細(xì)胞發(fā)出的發(fā)光的發(fā)光強度，所述表達(dá)量測定步驟根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度，按照每個細(xì)胞測定所述解析對象的基因的表達(dá)量，所述階段辨認(rèn)步驟根據(jù)所述熒光圖像攝像步驟所拍攝的熒光圖像，按照每個細(xì)胞判定細(xì)胞的形狀是否發(fā)生了變化，由此按照每個細(xì)胞辨認(rèn)細(xì)胞周期的階段。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的表達(dá)量測定方法，其特征在于， 該表達(dá)量測定方法還包括選擇步驟，該步驟從在所述階段辨認(rèn)步驟中辨認(rèn)了階段的細(xì)胞中，選擇測定對象的細(xì)胞，所述表達(dá)量測定步驟根據(jù)所述發(fā)光測定步驟所測定的發(fā)光強度，測 定導(dǎo)入到所述選擇步驟所選擇的細(xì)胞中的解析對象的基因的表達(dá)量。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的表達(dá)量測定方法，其特征在于，通過重復(fù)執(zhí)行所述發(fā)光圖像攝像步驟、所述熒光圖像攝像步驟、所 述發(fā)光測定步驟、所述階段辨認(rèn)步驟、所述選擇步驟以及所述表達(dá)量測 定步驟，將所述選擇步驟所選擇的細(xì)胞作為對象， 一邊辨認(rèn)細(xì)胞周期的 階段， 一邊經(jīng)時地測定所述解析對象的基因的表達(dá)量。
17. —種測定裝置，該測定裝置具有成像光學(xué)系統(tǒng)，其成像標(biāo)本的 標(biāo)本像，該標(biāo)本被賦予發(fā)出微弱光的發(fā)光標(biāo)識和被激勵而發(fā)出熒光的熒 光標(biāo)識并由保持單元保持；以及對該標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的攝像單元，其特 征在于，所述成像光學(xué)系統(tǒng)具有微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)，其將來自所述發(fā)光標(biāo)識的微弱光成像作為所 述標(biāo)本像的微弱光標(biāo)本像；以及熒光成像光學(xué)系統(tǒng)，其將來自所述熒光標(biāo)識的熒光成像作為所述標(biāo) 本像的熒光標(biāo)本像，所述攝像單元對所述微弱光標(biāo)本像和所述熒光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的測定裝置，其特征在于， 所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)具有對所述標(biāo)本進(jìn)行照明的照明單元。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的測定裝置，其特征在于， 該測定裝置具有攝像切換控制單元，該單元根據(jù)所述攝像單元所拍攝的微弱光標(biāo)本像的像特征，進(jìn)行切換該微弱光標(biāo)本像的拍攝和所述熒 光標(biāo)本像的拍攝的控制。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的測定裝置，其特征在于， 所述像特征是所述微弱光標(biāo)本像的像強度，在所述像強度大于規(guī)定閾值的情況下，所述攝像切換控制單元從所 述微弱光標(biāo)本像的拍攝切換為所述熒光標(biāo)本像的拍攝。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的測定裝置，其特征在于， 所述像強度是所述微弱光標(biāo)本像的整體或部分的像強度，是從規(guī)定時刻到當(dāng)前時刻的累計的像強度或當(dāng)前時刻的像強度。
22. 根據(jù)權(quán)利要求19 21中任一項所述的測定裝置，其特征在于， 所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)具有熒光物鏡，其將來自所述熒光標(biāo)識的各點的熒光轉(zhuǎn)換為大致平行光束；熒光成像透鏡，其聚集由所述熒光物鏡轉(zhuǎn)換為大致平行光束后的熒 光，成像所述熒光標(biāo)本像；熒光單元，其配置在所述熒光物鏡和所述熒光成像透鏡之間，并具有選擇性地透射用于激勵所述熒光標(biāo)識的激勵光的激勵光透射濾光器、 選擇性地透射來自所述熒光標(biāo)識的熒光的熒光透射濾光器、和反射所述激勵光并透射所述熒光的二色鏡；以及激勵光照射單元，其具有發(fā)出所述激勵光的激勵光源，通過所述二 色鏡反射來自該激勵光源的激勵光并使其照射到所述標(biāo)本上。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的測定裝置，其特征在于，所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)具有微弱光物鏡，其將來自所述發(fā)光標(biāo)識的各點的微弱光轉(zhuǎn)換為大致平 行光束；以及微弱光成像透鏡，其聚集由所述微弱光物鏡轉(zhuǎn)換為大致平行光束后 的微弱光，成像所述微弱光標(biāo)本像。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的測定裝置，其特征在于， 所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)相對于所述標(biāo)本配置在相反側(cè)，所述激勵光照射單元具有不向所述標(biāo)本照射激勵光的未照射單元， 所述攝像切換控制單元進(jìn)行如下控制在所述攝像單元拍攝微弱光 標(biāo)本像的情況下，使所述未照射單元不照射激勵光，在所述攝像單元拍 攝熒光標(biāo)本像的情況下，使所述激勵光照射單元照射激勵光。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的測定裝置，其特征在于， 該測定裝置具有視場移動單元，該單元使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場相對平行移動。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的測定裝置，其特征在于， 所述保持單元具有標(biāo)本移動單元，該單元使所述標(biāo)本在所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場內(nèi)移動。
27. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的測定裝置，其特征在于，所述微弱光物鏡和所述熒光物鏡是相同的物鏡， 所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)共用所述物鏡。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的測定裝置，其特征在于， 該測定裝置具有反射鏡，該反射鏡可插拔地配置在所述物鏡和所述熒光單元之間的瞳空間，當(dāng)配置在該瞳空間的情況下，將來自所述物鏡 的微弱光向所述微弱光成像透鏡反射，所述激勵光照射單元具有不向所述標(biāo)本照射激勵光的未照射單元，所述攝像切換控制單元進(jìn)行如下控制在所述攝像單元拍攝微弱光標(biāo)本像的情況下，將所述反射鏡配置在瞳空間并且使所述未照射單元不 照射激勵光，在所述攝像單元拍攝熒光標(biāo)本像的情況下，不將所述反射 鏡配置在瞳空間并且使所述激勵光照射單元照射激勵光。
29. 根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的測定裝置，其特征在于， 所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)相對于所述標(biāo)本配置在相同側(cè)，所述保持單元具有標(biāo)本移動單元，該單元使所述標(biāo)本在所述微弱光 成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場內(nèi)移動，所述攝像切換控制單元進(jìn)行如下控制在所述攝像單元拍攝微弱光標(biāo)本像的情況下，通過所述標(biāo)本移動單元使所述標(biāo)本在所述微弱光成像 光學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)移動，在所述攝像單元拍攝熒光標(biāo)本像的情況下，通 過所述標(biāo)本移動單元使所述標(biāo)本在所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場內(nèi)移 動。
30. 根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的測定裝置，其特征在于， 該測定裝置具有光學(xué)系統(tǒng)移動單元，該單元使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)移動，以使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所 述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場包含所述標(biāo)本，所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)相對于所述標(biāo)本 配置在相同側(cè)，所述攝像切換控制單元進(jìn)行如下控制在所述攝像單元拍攝微弱光標(biāo)本像的情況下，通過所述光學(xué)系統(tǒng)移動單元使該微弱光成像光學(xué)系統(tǒng) 移動，以使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場包含所述標(biāo)本，在所述攝像 單元拍攝熒光標(biāo)本像的情況下，通過所述光學(xué)系統(tǒng)移動單元使該熒光成 像光學(xué)系統(tǒng)移動，以使所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的視場包含所述標(biāo)本。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的測定裝置，其特征在于，所述光學(xué)系統(tǒng)移動單元具有旋轉(zhuǎn)軸，該旋轉(zhuǎn)軸通過連接所述微弱光 成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各視場的大致中心點的線段的 中點，并與所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)的各光軸 大致平行，所述光學(xué)系統(tǒng)移動單元以該旋轉(zhuǎn)軸為中心，使所述微弱光成 像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)移動。
32. 根據(jù)權(quán)利要求17和權(quán)利要求19 29中任一項所述的測定裝置， 其特征在于，所述攝像單元具有對所述微弱光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的微弱光攝像單元；以及 對所述熒光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的熒光攝像單元。
33. 根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的測定裝置，其特征在于， 所述攝像單元具有對所述微弱光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的微弱光攝像單元；以及 對所述熒光標(biāo)本像進(jìn)行拍攝的熒光攝像單元，所述光學(xué)系統(tǒng)移動單元使所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述微弱光攝 像單元、以及所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)和所述熒光攝像單元分別一體移動。
34. 根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的測定裝置，其特征在于， 所述微弱光標(biāo)本像和所述熒光標(biāo)本像分別通過所述微弱光成像透鏡和所述熒光成像透鏡在大致相同位置上成像，所述攝像單元被固定為與所述微弱光標(biāo)本像和所述熒光標(biāo)本像成像 的位置大致一致。
35. 根據(jù)權(quán)利要求27 31中任一項所述的測定裝置，其特征在于，該測定裝置具有照明單元，該照明單元對應(yīng)于所述微弱光成像光學(xué) 系統(tǒng)和所述熒光成像光學(xué)系統(tǒng)中的至少一方，對所述標(biāo)本進(jìn)行透射照明。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的測定裝置，其特征在于，所述透射照明是明視場觀察用照明、暗視場觀察用照明、微分干涉 觀察用照明以及相位差觀察用照明中的至少一種。
37.根據(jù)權(quán)利要求17和權(quán)利要求19 35中任一項所述的測定裝置， 其特征在于，所述微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)將該微弱光成像光學(xué)系統(tǒng)的標(biāo)本側(cè)的數(shù)值 孔徑設(shè)為NAo，將成像所述微弱光標(biāo)本像的倍率設(shè)為e ，則通過(NAo/ P ) 2運算的值大于等于0.01。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供一種規(guī)定部位發(fā)光量測定方法、規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置、表達(dá)量測定方法及測定裝置，在測定來自活的樣本內(nèi)的規(guī)定部位的發(fā)光量時，對于與該樣本相同的樣本，能夠確認(rèn)在規(guī)定部位是否局部存在發(fā)光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的規(guī)定部位發(fā)光量測定裝置(100)由以下部分構(gòu)成樣本(102)，其導(dǎo)入了融合基因，該融合基因除了轉(zhuǎn)移堿基排列和發(fā)光關(guān)聯(lián)基因之外，還融合了表達(dá)熒光蛋白質(zhì)的熒光關(guān)聯(lián)基因；收納樣本(102)的容器(103)；配置容器(103)的載置臺(104)；拍攝樣本(102)的發(fā)光圖像的發(fā)光圖像攝像單元(106)(物鏡106a～CCD照相機(jī)106c、成像透鏡106f)；拍攝樣本(102)的熒光圖像的熒光圖像攝像單元(108)(物鏡108a～快門108f)；以及信息通信終端(110)。
文檔編號C12Q1/68GK101151378SQ20068001059
公開日2008年3月26日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月30日
發(fā)明者吉川晃彥, 大橋陽子, 小山健一, 小島清嗣, 川崎健司, 鈴木浩文 申請人:奧林巴斯株式會社