專利名稱：上皮癌的診斷和預(yù)后方法
上皮癌的診斷和預(yù)后方法 相關(guān)申請的交互參考
本申請根據(jù)35U.S.C. §119問條，要求2005年1月28曰 提交的美國臨時(shí)專利申請?zhí)?0/648,110的權(quán)益。政府支持
本工作受的美國國家衛(wèi)生研究所的支持，資助號(hào)(grant number) 2R37 CA37393。政府對本發(fā)明擁有一定的權(quán)利。發(fā)明背景
癌癥生存中的最重要的因素之一是在早期階段被檢測。測 定癌癥早期事件的臨床分析提供干預(yù)和預(yù)防癌癥發(fā)展的機(jī)會(huì)。隨著 基因i普(gene profilmg)和蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)的發(fā)展，可用于診斷 和預(yù)測疾病的結(jié)局的特異性癌癥的分子標(biāo)記物或"生物標(biāo)記物"的 鑒定取得顯著進(jìn)展。例如，在前列腺癌的病例中，抗原PSA(針對前列腺的特異性抗原)可在血液中被測定出并為前列腺癌存在的指示 物。因而，可對處于前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)的人的血液進(jìn)行PSA水平升高的快速、容易和安全的篩查。
即使在癌癥檢測領(lǐng)域已經(jīng)取得顯著進(jìn)展，但是在該領(lǐng)域仍 然存在可易于應(yīng)用于臨床的對于多種癌癥的新的生物標(biāo)記物鑒定的 需求。例如，目前使用可易于測定的生物標(biāo)記物診斷乳腺癌的可利 用選項(xiàng)相當(dāng)?shù)厣佟GFR的過度表達(dá)，尤其是與向下調(diào)節(jié)的雌激素受 體偶合的EGFR的過度表達(dá)，是乳腺癌患者中預(yù)后差的標(biāo)記物。乳 腺癌的其它已知標(biāo)記物包括血液中的高水平的M2丙酮酸激酶(M2 PK)(美國專利號(hào)6,358,683)、血液中的高的2NF217蛋白質(zhì)水平(WO98/02539)和用于診斷的、乳腺癌中的新近鑒定的蛋白質(zhì)PDEBC的分 化表達(dá)(美國專利申請?zhí)?0030124543)。細(xì)胞表面標(biāo)記物諸如CEA、 CA-125和HCG在局部晚期和轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者的血清中常常是升 高的(Izes等，JUrol.Jun; 165(6 Ptl):1908-13, 2001),并且涉及肺瘤誦 相關(guān)蛋白質(zhì)諸如基質(zhì)金屬蛋白酶-2循環(huán)水平(Gohji等，Cancer Research 56:3196,1996)、肝細(xì)胞生長因子(Gohji等，J. Clin. Oncol. 18:2963, 2000)和組織多肽抗原(Maulard-Durdux等，J. Clin. Oncol. 15:3446, 1997)的研究已經(jīng)顯示其前景。這些生物標(biāo)記物提供備選的診斷方法， 然而，它們并沒有被廣泛應(yīng)用。此外，除了應(yīng)用一些組織化學(xué)、遺 傳學(xué)和免疫學(xué)的標(biāo)記物，臨床醫(yī)生仍然難以預(yù)測腫瘤將轉(zhuǎn)移至其它 器官。
癌癥生物標(biāo)記物的鑒定與改善疾病的診斷、預(yù)后和治療尤 其相關(guān)。這樣，本領(lǐng)域需要鑒定可快速、容易和安全地測定的備選 的生物標(biāo)記物。這樣的生物標(biāo)記物可用于診斷、分階段或監(jiān)測膀胱 癌(尤其是侵襲性)患者，該疾病的潛在轉(zhuǎn)移階段患者的發(fā)展或治療。發(fā)明簡述
本發(fā)明基于以下驚奇的發(fā)現(xiàn)，即三種蛋白質(zhì)，半胱氨酸蛋 白酶抑制劑B、伴侶蛋白lO和肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(Profilin)(也被稱為 "上皮癌標(biāo)記物")，存在于膀胱癌(一種上皮源性癌癥)患者的尿中。 因此，本發(fā)明涉及用于上皮源性癌癥的預(yù)后性評價(jià)的方法和涉及用 于通過監(jiān)測生物樣品中這些標(biāo)記物的存在使上皮源性癌癥的診斷更 容易的方法。本發(fā)明還涉及用于治療學(xué)功效的標(biāo)記物。特別是，尿 中測定的半胱氨酸蛋白酶抑制剤B的量與疾病狀態(tài)相關(guān)，這樣，半 胱氨酸蛋白酶抑制劑B水平可用于預(yù)測侵襲性膀胱癌的存在。因而， 檢測尿中半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白10和/或肌動(dòng)蛋白抑制 蛋白的水平，提供可用于在患者中診斷和預(yù)后膀胱癌的快速、容易和安全的篩查?；蛘?，這些標(biāo)記物缺乏可提供患者沒有患膀胱癌的 指示。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供易于在患者中診斷上皮源性癌癥的方法。所述方法包括從患者獲得生物樣品，優(yōu)選為凈排尿(voided urine)樣品和測定樣品中存在或缺乏至少 一種上皮癌生物標(biāo)記物(半胱 氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白IO或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)，其中至少 一種上皮癌生物標(biāo)記物的存在表示上皮源性癌癥。
生物樣品，例如，可從血液、組織(如腫瘤或乳腺)、血清、 糞便、尿、唾液、腦脊髓液、乳頭抽吸液(nipple aspirates)和細(xì)胞溶解 產(chǎn)物上清液得到。 一種優(yōu)選的生物樣品是尿。
如在本文中所用的，"上皮源性癌癥"指由上皮細(xì)胞引起 的癌癥，包括，但不限于，乳腺癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、胃腸癌、 唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌和胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、 胰腺癌、卯巢癌、宮頸癌、肺癌、乳腺癌以及皮膚癌，諸如鱗狀細(xì) 胞癌和基底細(xì)胞癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌和其它已知的影響全身上 皮細(xì)"包的癌癥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供易于在患者中診斷膀胱癌的方 法。所述方法包括從患者獲得生物樣品，優(yōu)選為凈排尿樣品和測定 尿樣品中存在或缺乏至少一種上皮癌生物標(biāo)記物(半胱氨酸蛋白酶抑 制劑B、伴侶蛋白IO或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)，其中至少一種上皮癌生 物標(biāo)記物的存在表示膀胱癌。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供診斷上皮源性癌癥的方法。 包括檢測存在于來自患者的生物樣品(測試樣品)中的至少一種上皮癌 生物標(biāo)記物的水平，并且將觀測到的至少一種標(biāo)記物(半胱氨酸蛋白 酶抑制劑B、伴侶蛋白IO或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)水平與存在于同樣類 型的對照樣品中的標(biāo)記物水平比較。與對照樣品比較，測試樣品中 的較高水平的標(biāo)記物表示上皮源性癌癥。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明方法用于癌癥的早期 檢測。例如，可由醫(yī)師在體^r期間對患者進(jìn)行篩查。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供診斷膀胱癌的方法。所述方法 包括檢測存在于來自患者的生物樣品(測試樣品)中的至少一種上皮癌 生物標(biāo)記物(半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白IO或肌動(dòng)蛋白抑制 蛋白)的水平，并且將觀測到的至少 一種標(biāo)記物水平與存在于同樣類 型的對照樣品中的標(biāo)記物水平比較。與對照樣品比較，測試樣品中 的較高水平的標(biāo)記物表示膀胱癌。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供在患者中診斷侵襲性膀胱癌方 法。所述方法包括檢測存在于來自患者的生物樣品(測試樣品)中的半 胱氨酸蛋白酶抑制劑B上皮癌生物標(biāo)記物的水平，并且將測試樣品 中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B水平與存在于非侵襲性癌癥對照樣品 中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B水平比較。與對照樣品中的半胱氨酸 蛋白酶抑制劑B水平比較，測試樣品中的較高水平的半胱氨酸蛋白 酶抑制劑B表示侵襲性膀胱癌。
術(shù)語"對照樣品"指得自相信沒有患癌癥的"正常"或 "健康"個(gè)體的生物樣品(如血液、尿、肺瘤)?？刹捎帽绢I(lǐng)域熟知的 方法選擇對照品。 一旦對于對照人群的水平已經(jīng)確立，可將得自測 試生物樣品的陣列結(jié)果與已知的水平直接比較。
術(shù)語"非侵襲性對照樣品"指得自患有非侵襲性形式的 癌癥個(gè)體的生物樣品。 一旦對于對照人群的水平已經(jīng)確立，可將得 自測試生物樣品的陣列結(jié)果與已知的水平直接比較。
術(shù)語"測試樣品"指得自被用于測試上皮源性癌癥患者 的生物樣品。
本發(fā)明還預(yù)期評估存在于得自同一患者的多個(gè)測試樣品 中的上皮癌生物標(biāo)記物水平，在整個(gè)時(shí)間中的標(biāo)記物的量不斷增加 表示癌癥腫瘤的侵襲性(如轉(zhuǎn)移的可能)增強(qiáng)。這樣，上皮癌生物標(biāo)記 物水平作為疾病狀態(tài)和階段的預(yù)測信號(hào)。
本發(fā)明還預(yù)期評估上皮癌生物標(biāo)記物以監(jiān)測設(shè)計(jì)用于治 療上皮源性癌癥(如膀胱癌)患者的治療方案的治療功效。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過使測試樣品或其制備物與特 異性結(jié)合上皮癌生物標(biāo)記物或其部分的基于抗體的結(jié)合部分接觸， 檢測存在于測試生物樣品中的上皮癌生物標(biāo)記物水平(如(半胱氨酸蛋 白酶抑制劑B、伴侶蛋白IO或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)。
基于抗體的免疫分析為檢測生物標(biāo)記物水平的優(yōu)選方 法。然而，對于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的任何方法均可用于評估 生物標(biāo)記物水平。例如，可用包括SELDI質(zhì)譜的質(zhì)鐠法評估生物標(biāo) 記物水平。
在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括檢測生物樣品中 至少 一種上皮癌生物標(biāo)記物的方法的試劑盒。所述試劑盒包括裝生 物樣品(如尿樣品)的容器和至少一種特異性結(jié)合上皮癌生物標(biāo)記物的 抗體
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的試劑盒包括特異性結(jié)合上皮 癌生物標(biāo)記物的兩個(gè)抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中， 一種抗體固定在固 相上和一種抗體被可檢測性地標(biāo)記。試劑盒可包括抗-半胱氨酸蛋白 酶抑制劑B、抗-伴侶蛋白10和/或抗-肌動(dòng)蛋白抑制蛋白抗體。
本發(fā)明的其它部分在下文^^開。圖的簡述
結(jié)合并構(gòu)成本說明書部分的附圖，對本發(fā)明實(shí)施方案進(jìn) 行說明，與描述一起，對本發(fā)明的目標(biāo)、優(yōu)點(diǎn)和原理進(jìn)行解釋。


圖1是顯示上皮癌生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)途徑的流程圖。
圖2顯示侵襲性膀胱肺瘤組織和正常的膀胱組織的比對 二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D page)揭示許多可能的斑點(diǎn)。經(jīng)質(zhì)語儀 鑒定，環(huán)形斑點(diǎn)為半胱氨酸蛋白酶抑制劑B。 .
圖3顯示描述在凈排尿樣品中測定的半胱氨酸蛋白酶抑 制劑B的半定量蛋白質(zhì)印跡分析的結(jié)果圖。發(fā)明詳述
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，三種蛋白質(zhì)，半胱氨酸蛋白酶抑制 劑B、伴侶蛋白IO和肌動(dòng)蛋白抑制蛋白(在本文稱為"上皮癌標(biāo)記物") 存在于患有上皮源性癌癥的患者尿中。存在于患者的尿樣品中的半 胱氨酸蛋白酶抑制劑B的水平與膀胱癌，尤其是侵襲性膀胱癌的存 在相關(guān)聯(lián)。
術(shù)語"侵入性"或"侵襲性"涉及癌癥時(shí)，指腫瘤的突 破自己的邊界向鄰近組織擴(kuò)散的傾向(Daraell, J. (1990), Molecular Cell Biology,第3版，W. H. Freeman, NY)。侵襲性癌癥可與限制在器官 中的癌癥(其中胂瘤被限制在特定的器官中)作對比。腫瘤的侵襲性特 性常常伴有蛋白水解酶，諸如膠原酶的出現(xiàn)，其使基質(zhì)物質(zhì)和基底 膜物質(zhì)降解以使腫瘤能夠突破包嚢的邊界和突破腫瘤所在的特定的 組織的限制而擴(kuò)張。侵襲性膀胱癌包括侵襲入固有肌層和/或固有層 (Lamina Propria)。
如在本文中所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)移"，指癌癥從原發(fā)器官擴(kuò) 散至患者的其它末梢部位的情況。腫瘤轉(zhuǎn)移的過程是多階段事件， 包括局部入侵和破壞細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)，內(nèi)滲到血管、淋巴或其它傳輸通 道，在循環(huán)中殘存，在第二個(gè)部位溢出管腔并且在新的場所生長 (Fidler,等，Adv. Cancer Res. 28, 149-250 (1978), Liotta,等，Cancer Treatment Res. 40, 223-238 (1988), Nicolson, Biochim. Biophy. Acta 948, 175-224 (1988)和Zetter, N. Eng. J. Med. 322, 605-612 (1990》。增加的惡性細(xì)胞活動(dòng)力與動(dòng)物以及人肺瘤中的增強(qiáng)轉(zhuǎn)移潛力相關(guān) (Hosaka，等，Gann 69, 273-276 (1978)和Haemmerlin,等，Int. J. Cancer 27， 603-610 (1981))。
如在本文中所用的"生物樣品"指得自患者的尿樣品。 生物樣品，例如，可從血液、組織(如腫瘤或乳腺)、血清、糞便、尿、 唾液、腦脊髓液、乳頭抽吸液和細(xì)胞溶解產(chǎn)物的上清液得到。 一種 優(yōu)選的生物樣品是尿。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對生物樣品處理以預(yù)防上皮癌生 物標(biāo)記物降解。抑制或預(yù)防降解的方法包括，但不限于，用蛋白酶 處理樣品，將樣品冷凍或?qū)悠贩旁诒?。?yōu)選地，在進(jìn)行分析前， 經(jīng)常性地將樣品保持在預(yù)防標(biāo)記物降解的條件下。
如在本文中所用的，"腫瘤樣品"指腫瘤的小部分、片、 部分、節(jié)或分片，所述腫瘤例如，從患者，優(yōu)選為患者處得到或切 下的腫瘤(如，從患者的組織切片或提取物)。
如在本文中所用的，半胱氨酸蛋白酶抑制劑B指Genebank (基因庫)索取號(hào)NM—000100.2、 NP—OOOOW (Homos叩iens)的蛋白質(zhì)。 該術(shù)語還包括種類的變異、同源物、等位基因形式、突變形式及其 等價(jià)物。
如在本文中所用的，伴侶蛋白10指Genebank (基因庫)索 取號(hào)(蛋白質(zhì))AAA50953 (Homosapiens)的蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括種類 的變異、同源物、等位基因形式、突變形式及其等價(jià)物。
如在本文中所用的，肌動(dòng)蛋白抑制蛋白指Genebank (基 因庫)索取號(hào)(蛋白質(zhì))A28622 (Homosapiens)的蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括 種類的變異、同源物、等位基因形式、突變形式及其等價(jià)物。
本發(fā)明涉及易于在患者中診斷上皮源性癌癥的方法。在 一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包4舌從患者獲得生物樣品和測定樣品中 存在或缺乏至少一種上皮癌生物標(biāo)記物(半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、 伴侶蛋白10或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)，其中至少一種標(biāo)記物的存在為上 皮源性癌癥的指示物(mdicative)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法涉及測定來自正檢測癌 癥的患者的測試樣品中至少 一種上皮癌生物標(biāo)記物(半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白IO或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)的水平，并且將觀測到 的水平與對照樣品，例如得自單個(gè)患者的樣品或未患癌癥的單個(gè)患 者的群體樣品中發(fā)現(xiàn)的上皮癌生物標(biāo)記物的水平進(jìn)行比較。比在正 常對照組中觀測到的水平高的至少 一種上皮癌生物標(biāo)記物的水平， 表示上皮源性癌癥的存在。生物標(biāo)記物水平可以任意單位表示，例如以如從光密度計(jì)、照度計(jì)或Elisa讀板機(jī)得到的單位表示。
如在本文中所用的，"與對照樣品中的水平比較，測試 樣品中的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的較高水平"指至少一種生物 標(biāo)記物的量大于存在于對照樣品中相同生物標(biāo)記物的量。術(shù)語"較 高水平"指在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的或顯著地高于對照樣品中發(fā)現(xiàn)的水平。 "較高水平"可為例如為1.2倍至1.9倍高。優(yōu)選地，"較高水平" 至少為2倍甚或3倍高。
術(shù)語"有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的"或"顯著地"指有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 并且一般意指標(biāo)記物濃度為正常的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(2SD)或更高。
為了比4交的目的，測試樣品和對照樣品為同樣類型，即 得自相同的生物來源。對照樣品也可為含在得自健康個(gè)體的生物樣 品中正常發(fā)現(xiàn)的、相同濃度的上皮癌生物標(biāo)記物的標(biāo)準(zhǔn)樣品。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，可進(jìn)行第二診斷步驟。例如，如 果發(fā)現(xiàn)至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的水平表示癌癥的存在，那么可 進(jìn)行測定癌癥的其它的方法以確定癌癥的存在?？墒褂萌魏味喾N其 它的診斷步驟，諸如超聲波、PET掃描、MPI或任何其它的成像技 術(shù)、活檢、臨床檢查、乳管攝影(ductogram)或任何其它方法。
本發(fā)明還提供對懷1€患上上皮源性癌癥的患者進(jìn)行預(yù)后 性評價(jià)的方法。所述方法包括沖全測存在于來自患者的測試生物樣品 中的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物(半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴倡蛋 白IO或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)的水平，并且將將觀測到的水平與在健康 個(gè)體的生物樣品(同樣類型)中正常發(fā)現(xiàn)的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物 水平的范圍進(jìn)行比較。例如，高水平表示較大可能轉(zhuǎn)移活性并且對應(yīng)于差的預(yù)后，而較低水平表示腫瘤的較低的侵襲性并且對應(yīng)于比 較好的預(yù)后。
再有，可通過跟蹤個(gè)體患者中的至少一種上皮癌生物標(biāo) 記物水平，評估疾病的發(fā)展。例如，可通過比4支整個(gè)時(shí)間內(nèi)患者的 半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白IO或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白表達(dá)水 平的變化，監(jiān)測患者病情的變化。至少一種上皮癌生物標(biāo)記物水平 的進(jìn)行性增加表示胂瘤入侵和轉(zhuǎn)移可能性增加。
本發(fā)明的預(yù)后的方法還用于確定癌癥患者的適當(dāng)?shù)寞?程。所述療程指用于患者的診斷癌癥后或治療癌癥后所采取的治療 措施。例如，確定癌癥復(fù)發(fā)、擴(kuò)散或患者生存的可能性，可幫助確 定是否應(yīng)該采用更保守或更激進(jìn)的治療方法，或治療藥征(modalities) 是否應(yīng)該組合。例如，當(dāng)癌癥4艮可能復(fù)發(fā)時(shí)，有利地是可在手術(shù)治 療之前或之后，伴用化學(xué)療法、放射療法、免疫療法、生物調(diào)節(jié)劑 療法、基因療法、疫苗等或調(diào)整患者在治療期間的時(shí)間范圍。
本發(fā)明的方法適宜^^斷或預(yù)后任何上皮源性癌癥，包括， 但不限于，乳腺癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口腔癌、 食道癌、小腸癌和胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卯巢癌、 宮頸癌、肺癌、乳腺癌以及皮^UI，諸如鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌、 前列腺癌、腎細(xì)胞癌和其它已知的影響全身上皮細(xì)胞的癌癥。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方案，上皮源性癌癥是膀胱癌。發(fā)浙i,一神J:乂蕃i浙赤記# ^;^乎
如在本文中描述的，可采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員已知的 任何方法，檢測至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的水平。在本發(fā)明中， 通常優(yōu)選使用抗體或抗體等價(jià)物測定生物樣品中的至少一種上皮癌 生物標(biāo)記物蛋白的水平。
在一個(gè)實(shí)施方案中，通過將生物樣品與特異性結(jié)合到至 少一種上皮癌生物標(biāo)記物或至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的片段的基 于抗體的結(jié)合部分接觸，檢測至少一種上皮癌生物標(biāo)記物蛋白的水平。然后在檢測上皮癌生物標(biāo)記物水平時(shí)，測定抗體-上皮癌生物標(biāo)記復(fù)合物的結(jié)構(gòu)(Formation)。
術(shù)語"基于抗體的結(jié)合部分"或"抗體"包括免疫球蛋白 分子和免疫球蛋白分子的免疫活性決定簇，如，含特異性結(jié)合(與之 起免疫反應(yīng))至上皮癌生物標(biāo)記物以測定如半胱氨酸蛋白酶抑制劑 B、伴侶蛋白IO或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子。術(shù)語 "基于抗體的結(jié)合部分"意欲包括如，任何同工型(IgG、 IgA、 IgM、 IgE等)的全部抗體，以及包括其也特異性反應(yīng)的上皮癌生物標(biāo)記物 蛋白的片段?？刹捎贸Ｒ?guī)技術(shù)使抗體成片段。因而，術(shù)語包括可選 擇性地與某些蛋白質(zhì)反應(yīng)的抗體分子的蛋白水解-裂解或重組-制備部 分的片段。這樣的蛋白水解和/或重組片段的非限制性實(shí)例包括Fab、 F(ab')2、 Fab'、 Fv、 dAbs和含被肽接頭(peptide linker)連接的VL和VH 域的單鏈抗體(scFv)。 scFv's可通過共價(jià)或非共價(jià)連接以形成具有兩 個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體。因而，"基于抗體的結(jié)合部分"包括 多克隆抗體、單克隆抗體或其它抗體和重組抗體的純化制備物。術(shù) 語"基于抗體的結(jié)合部分，，還意欲包括人源化抗體、雙特異抗體和 具有至少 一種源于抗體分子的抗原結(jié)合決定簇的嵌合分子。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，可測定地標(biāo)記所述基于抗體的結(jié)合部分。
如在本文中所用的"標(biāo)記抗體"，包括由可測定的方法 標(biāo)記的抗體，所述抗體包括， <旦不限于，酶標(biāo)抗體、放射性物質(zhì)標(biāo) 記的抗體、熒光標(biāo)記的抗體和化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記的抗體。也可用可測 定的標(biāo)記物諸如c-Myc、 HA、 VSV-G、 HSV、 FLAG、 V5或HIS標(biāo) 記抗體。
在采用檢測至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的基于抗體的結(jié) 合部分的本發(fā)明的診斷和預(yù)后方法中，存在于生物樣品中的至少一 種上皮癌生物標(biāo)記物的水平與乂人可測定的標(biāo)記的抗體發(fā)射的信號(hào)強(qiáng) 度相關(guān)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使抗體與酶連接，使基 于抗體的結(jié)合部分可測定地標(biāo)記。當(dāng)所述酶暴露于其底物時(shí)，則依 次將與底物反應(yīng)，以此方法產(chǎn)生可由例如分光光度法、焚光分光光 度法或可見光的方法測定的化學(xué)部分?？捎糜诳蓽y定的標(biāo)記本發(fā)明 抗體的酶包括，但不限于，蘋果酸脫氬酶、葡萄球菌核酸酶、S-V-類 固醇異構(gòu)酶、酵母醇(yeast alcohol)脫氫酶、ot-甘油磷酸脫氫酶、磷酸 丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、門冬酰胺酶、葡萄糖 氧化酶、(3-半乳糖普酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氪酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶?；瘜W(xué)發(fā)光是另一個(gè)可用 于測定基于抗體的結(jié)合部分的方法。
也可使用多種其它克疫分析的任何一種進(jìn)行檢測。例如， 通過放射性標(biāo)記抗體，可通過〗吏用放射免疫分析法測定抗體。采用 這樣的方法，使用Y計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或通過放射自顯影可探測放 射性同位素。特別用于本發(fā)明目的的同位素為W、 1311、 35S、 14C, 并且優(yōu)選為125I。
還可能用焚光化合物標(biāo)記抗體。當(dāng)焚光標(biāo)記抗體暴露于 適當(dāng)波長的光下，則可由于焚光性測定其存在。最常用的焚光標(biāo)記 化合物為CYE染料、異硫氰酸熒光素、藍(lán)光堿性蕊香紅(rhoda皿ne)、 藻紅蛋白(phycoerytherin)、藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白、鄰苯二曱醛(o-phthaldehyde)和焚光胺。
也可使用發(fā)射熒光的金屬諸如^Eu或其它的鑭系元素可 測定地標(biāo)記抗體。使用這樣的金屬螯合基團(tuán)如二乙烯三胺五乙酸 (DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)使這些金屬可連接抗體。
也可通過將抗體與化學(xué)發(fā)光的化合物偶合可測定地標(biāo)記 抗體。然后通過測定在化學(xué)反應(yīng)期間產(chǎn)生的發(fā)光的存在，確定化學(xué) 發(fā)光-抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例為魯米諾、 熒光素、異魯米諾(isoluminol)、 theromatic吖啶鏡酯、咪唑、吖咬鏡 鹽和草酸酯。
如以上提及的，可用免疫分析諸如酶聯(lián)免疫吸附分析 (ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)、蛋白質(zhì)印跡 或免疫組織化學(xué)，測定至少一種上皮癌生物標(biāo)記物蛋白的水平，以 上每種方法在下文詳述。免疫分析諸如ELISA或RIA,可為非常快 速的，通常是更優(yōu)選的。也可使用抗體陣列或蛋白質(zhì)芯片(protein chips),參見，例如美國專利申請?zhí)?0030013208A1; 20020155493A1; 20030017515和美國專利號(hào):6,329,209; 6,365,418,其全文通過引用 結(jié)合于本文。
"放射免疫分析"是采用抗原的標(biāo)記(如放射性標(biāo)記)的形 式測定和檢測抗原、要探測的生物標(biāo)記物濃度的技術(shù)。用于抗原的 放射性標(biāo)記的實(shí)例包括311、 "C和1251。通過使生物樣品中的抗原與 用于結(jié)合特異性結(jié)合抗原的抗體的標(biāo)記的(如放射性)抗原竟?fàn)?，檢測 生物樣品中的抗原濃度。為了確^床標(biāo)記的抗原和未標(biāo)記的抗原之間 的竟?fàn)幮越Y(jié)合，標(biāo)記的抗原以足夠使抗體的結(jié)合位點(diǎn)飽和的濃度存 在。樣品中抗原濃度越高，將結(jié)合抗體的標(biāo)記抗原的濃度越低。
在放射免疫分析中，為了測定結(jié)合抗體的標(biāo)記抗原的濃 度，必須將抗原-抗體復(fù)合物與游離抗原分開。將抗原-抗體復(fù)合物與 游離抗原分開的 一種方法是，用抗-同位型抗血清使抗原-抗體復(fù)合物 沉淀。將抗原-抗體復(fù)合物與游離抗原分開的另一種方法是，用福爾 馬林殺死的金黃色葡萄球菌(S.做^M》使抗原-抗體復(fù)合物沉淀。將抗 原-抗體復(fù)合物與游離抗原分開的再一種方法是，進(jìn)行"固相放射免 疫分析"，其中的抗體連接(如，共價(jià)連接)至瓊脂糖珠(Sepharose beads)、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔或微滴定孔。通過將結(jié)合至抗體的 標(biāo)記的抗原濃度與基于含有已知濃度的抗原的樣品所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線 進(jìn)行比較，可確定生物樣品中的抗原濃度。
"免疫放射分析"(IRMA)是其中抗體試劑為放射標(biāo)記的 免疫分析法。IRMA需要通過諸如結(jié)合至蛋白質(zhì)如，兔血清白蛋白(RSA)技術(shù)，產(chǎn)生多價(jià)抗原綴合物。多價(jià)抗原結(jié)合物每個(gè)分子必須具 有至少2個(gè)抗原殘基并且抗原殘基必須間隔足夠距離以允許至少兩 個(gè)抗體結(jié)合于抗原。例如，在IRMA中多價(jià)抗原綴合物可連接至固 體表面諸如塑料球。將未標(biāo)記"樣品"抗原和結(jié)合至經(jīng)放射標(biāo)記的 抗原的抗體加至含多價(jià)抗原綴合物包被的球的試管中。樣品中的抗 原與多價(jià)抗原綴合物竟?fàn)幙乖贵w結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆跤诤螅?通過洗滌將未結(jié)合的反應(yīng)物除去，測定固相上放射活性的量。結(jié)合 的放射性抗體的量與樣品中的抗原濃度成反比。
最常用的酶免疫分4斤是"酶if關(guān)免疫吸附分析(ELISA)"。 ELIS A是采用抗體的標(biāo)記(如酶聯(lián))形式測定和檢測抗原濃度的技術(shù)。 有不同形式的ELISA，其為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所熟悉。本領(lǐng)域已 ^口的ELISA才示準(zhǔn)4支術(shù)在"Methods in Immunodiagnosis",第2 X反，Rose 和Bigazzi編著.John Wiley & Sons, 1980; Campbell等，"Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964;和Oellerich， M. 1984, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 22:895-904中有描述。
在"夾心ELISA"中，抗體(如抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑 B、抗-伴侶蛋白lO或抗-肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)連接至固相(即微滴定板) 上并且暴露于含抗原(如半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白10和/ 或肌動(dòng)蛋白抑制蛋白)的生物樣品。然后洗滌固相除去未結(jié)合的抗原。 然后使標(biāo)記抗體(如酶聯(lián))結(jié)合至結(jié)合的抗原(如果存在)上，形成抗體-抗原-抗體夾心模式?？蛇B接至抗體的酶的實(shí)例為堿性磷酸酶、辣根 過氧化物酶、熒光素酶、脲酶和卩-半乳糖苷酶。酶聯(lián)抗體與底物反 應(yīng)，產(chǎn)生可檢測的有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物。
在"竟?fàn)幮訣LISA"中，將抗體與含抗原(即至少一種上 皮癌生物標(biāo)記物)的樣品一起孵育。然后使抗原-抗體混合物與用抗原 (即，至少一種上皮癌生物標(biāo)記物)包被的固相(如微滴定板)接觸。存 在于樣品中的抗原越多，將可用于結(jié)合固相的游離抗體越少。然后將標(biāo)記的(如，酶聯(lián))笫二抗體加至固相以測定結(jié)合至固相的第 一抗體 的量。
在"免疫組織化學(xué)分析"中，通過將組織暴露于對被分 析的蛋白質(zhì)為特異性的抗體，^H"組織切片進(jìn)行特異性蛋白質(zhì)的測試。 然后通過許多方法中的任何方法使抗體顯現(xiàn)，以確定所存在的蛋白 質(zhì)的存在和量。用于使抗體顯現(xiàn)的方法實(shí)例，例如，通過酶聯(lián)接抗 體(如，熒光素酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或f3-半乳糖苷酶)或 化學(xué)方法(如，DAB/底物chromagen)。還可預(yù)期的是，可將組織微陣列用于本發(fā)明的方法中。
依據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師基于本公開的偏愛，其它技術(shù)可用于測定 至少 一種上皮癌生物標(biāo)記物。 一種這樣的技術(shù)是蛋白質(zhì)印跡(Towbin 等，Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979》,其中將適合的經(jīng)處理的樣 品過SDS-PAGE凝膠，然后轉(zhuǎn)移至固體載體諸如硝化纖維素濾器上。 然后可測定的標(biāo)記的抗-生物標(biāo)記物抗體可用于評估至少一種上皮癌 生物標(biāo)記物的水平，其中可測定的標(biāo)記物的信號(hào)強(qiáng)度與存在的生物 標(biāo)記物的量相當(dāng)。例如可用光密度分析法對所述水平定量。
再有，可采用質(zhì)譜法諸如MALDI/TOF(飛行時(shí)間)、 SELDI/TOF、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)、氣相色語-質(zhì)譜法(GC-MS)、 高效液相色i脊-質(zhì)譜(HPLC-MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法、核磁共振光譜 法或串聯(lián)質(zhì)i普法(如，MS/MS、 MS/MS/MS、 ESI-MS/MS等)，測定 至少一種上皮癌生物標(biāo)記物。參見，例如，美國專利申請?zhí)?20030199001、 20030134304、 20030077616，這些通過引用結(jié)合于本 文。
質(zhì)i普方法為本領(lǐng)域所熟悉并且已經(jīng)用于定量和/或鑒定生 物分子，諸如蛋白質(zhì)(參見，如，Li鄰OOO) Tibtech 18:151-160; Rowley 等(2000) Methods 20: 383-397;和Kuster和Mann (1998) Curr. Opin. Structural Biol. 8: 393-400)。此外，質(zhì)i普技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為允許至少部分分離的蛋白質(zhì)重新測序。Chait等，Science 262:89-92 (1993); Keough 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:7131-6 (1999);在Bergman, EXS 88:133-44 (2000)的綜述。
在某些實(shí)施方案中，使用氣相離子分光光度計(jì)。在其它 實(shí)施方案中，使用激光解吸/電離質(zhì)譜以分析樣品?，F(xiàn)代激光解吸/電 離質(zhì)譜("LDI-MS")可實(shí)施兩個(gè)主要變化基質(zhì)輔助激光解吸/電離 ("MALDI")質(zhì)譜和表面加強(qiáng)的激光解吸/電離("SELDr)。在MALDI 中，將被分析物與含基質(zhì)的溶液混合并將一滴液體置于底物的表面。 然后將基質(zhì)溶液與生物分子共結(jié)晶。將底物插入質(zhì)譜儀。激光能量 直接施加在底物表面，在那兒生物分子被解吸和電離，而不使它們 明顯片段化。然而，MALDI作為分析工具有局限性。它不提供可干 擾檢測的使樣品和基質(zhì)物質(zhì)，特別是低分子量被分析物分級分離的 方法。參見，如，美國專利號(hào)5,118,937 (Hillenkamp等)和美國專利 號(hào)5，045,694 (Beavis & Chait)。
在SELDI中，將底物表面修飾，以使其為解吸過程中的 活性參與者。在一個(gè)變化中，用選擇性結(jié)合所涉及的蛋白質(zhì)的吸附 劑和/或捕捉劑使表面衍化。在另一個(gè)變化中，用當(dāng)激光穿擊時(shí)不解 吸的能量吸收分子使表面衍化。在另一個(gè)變化中，用結(jié)合所涉及的 蛋白質(zhì)和含應(yīng)用激光會(huì)斷裂的光解結(jié)合劑(photolytic bond)的分子使 表面衍化。在這些方法的每個(gè)方法中，衍化劑一般局限在施用樣品 的底物表面上的特異性位置。參見，如，美國專利號(hào)5,719,060和WO 98/59361。此兩個(gè)方法可通過例如，使用SELDI親合力表面捕獲被 分析物和加入含基質(zhì)的液體以捕獲被分析物合并，而提供能量吸收 物質(zhì)。
有關(guān)質(zhì)譜儀的更多信息，參見，如Principles of Instrumental Analysis,第3版,Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985; 和Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,第4增 補(bǔ)版。第15巻(John Wiley & Sons, New York 1995),第1071-1094頁。
探測標(biāo)記物的存在將典型地包括探測信號(hào)強(qiáng)度。此依次 可反映結(jié)合于底物的多肽的量和特征。例如，在某些實(shí)施方案中， 可比較第一樣品和第二樣品的光譜峰值的信號(hào)強(qiáng)度(如，目測，通過 電腦分析等)，以確定具體生物分子的相對的量。軟件程序諸如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems， Inc., Fremont, Calif.)可用于幫助分析質(zhì)譜。質(zhì)譜儀及其技術(shù)為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員熟悉。
本領(lǐng)域任何專業(yè)技術(shù)人員理解，可將質(zhì)譜儀的任何組成 部分(如，解吸源、質(zhì)譜分析器、探測等)和各種樣品制品與本文或本 領(lǐng)域已知的那些其它適宜成分或制品組合。例如，在一些實(shí)施方案 中，對照樣品可含重原子(如13C),從而在同一質(zhì)譜測量中允許測試 樣品與已知對照樣品混合。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用激光解吸飛行時(shí)間(TOF) 質(zhì)譜儀。在激光解吸質(zhì)譜中，將結(jié)合標(biāo)記物的底物導(dǎo)入進(jìn)樣系統(tǒng)。 通過自電離源的激光使標(biāo)記物解吸和電離為氣相。產(chǎn)生的離子由離 子光學(xué)集合(系統(tǒng))收集，然后在飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀中，使離子通過 短的高壓場加速并任其漂流進(jìn)入高真空室。在高真空室的遠(yuǎn)端，力口 速的離子在不同時(shí)間撞擊靈敏探測器表面。由于飛行時(shí)間是離子質(zhì) 量的函數(shù)，離子形成和離子探測器撞擊之間的消逝時(shí)間可用于確定 特異性質(zhì)量與電荷比的分子的存在或缺乏。
在一些實(shí)施方案中，部分通過用可編程的數(shù)字計(jì)算機(jī)執(zhí) 行算法，測定存在于第 一或第二樣品中的一個(gè)或多個(gè)生物分子的相 對量。所述算法確定第一質(zhì)i普和第二質(zhì)譜中的至少一個(gè)峰值。然后 所述算法比較質(zhì)譜的第 一質(zhì)譜峰值的信號(hào)強(qiáng)度與第二質(zhì)譜峰值的信 號(hào)強(qiáng)度。相對信號(hào)強(qiáng)度為存在于第一和第二樣品中生物分子的量的 指示。當(dāng)?shù)诙悠诽峁┦勾嬖谟诘?一樣品中的生物分子的量更好的 量化時(shí)，可分析含已知量的生物分子的標(biāo)準(zhǔn)品。在某些實(shí)施方案中， 也可確定第 一和第二樣品中的生物分子的特性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過MALDI-TOF質(zhì)譜檢測 至少一種上皮癌生物標(biāo)記物水平。 絲
用于本發(fā)明的抗體可從商業(yè)來源得到?；蛘撸贵w可由 抗上皮癌生物標(biāo)記物多肽或一部分上皮癌生物標(biāo)記物多肽而產(chǎn)生。
可采用產(chǎn)生抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法，生產(chǎn)用于本發(fā)明的抗體。 例如，通過單克隆抗體生產(chǎn)(Campbell, A.M., Monoclonal Antibodies Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science出W反商，Amsterdam, the Netherlands (1984);St. Groth等，J. Immunology, (1990) 35: 1-21;和Kozbor等，Immunology Today (1983) 4:72)?？贵w也可易于通過使用蛋白質(zhì)的抗原部分，用本 領(lǐng)域熟悉的方法篩查抗體庫，諸如噬菌體展示庫(display library)得 到。例如，美國專利5,702,892 (U.S.A. Health & Human Services)和WO 01/18058 (Novopharm Biotech Inc.)公開用于生產(chǎn)抗體結(jié)合域片段的噬 菌體展示文庫和選擇方法。
本發(fā)明還涉及用于膀胱癌的檢測和預(yù)后性評價(jià)以及用于 4!襲性膀胱癌的診斷的市售試劑盒。所述試劑盒可以本領(lǐng)域普通專 業(yè)技術(shù)人員熟悉的任何結(jié)構(gòu)存在并且可用于實(shí)施本文描述的檢測至 少一種上皮癌生物標(biāo)記物的一種或多種方法。試劑盒在提供許多但 非所有進(jìn)行檢測生物樣品中至少 一種上皮癌生物標(biāo)記物的分析的重 要試劑方面有其便利性。再有，所述分析優(yōu)選與包含在試劑盒中的 標(biāo)準(zhǔn)品或多重標(biāo)準(zhǔn)品諸如預(yù)定量的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物蛋白或核酸同時(shí)進(jìn)行，這樣試驗(yàn)的結(jié)果可定量或驗(yàn)證。
所述試劑盒包括探測選擇性結(jié)合至少一種上皮癌生物標(biāo) 記物蛋白的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物水平諸如抗體或抗體片段的 方法。診斷分析試劑盒優(yōu)選以才示準(zhǔn)的兩個(gè)-抗體結(jié)合格式板配制，其 中一個(gè)的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物-特異性抗體捕獲患者樣品中的生物標(biāo)記物，而另 一個(gè)ADAM-特異性抗體用于探測捕獲至少一種上 皮癌生物標(biāo)記物。例如，將捕獲抗體固定在固相上，如分析板、分 析孔、硝化纖維素膜、磁珠(bead)、纖維素測試條(dipstick)或洗提柱 的組分上。第二抗體，即，檢測抗體，典型地用可測定的標(biāo)記物諸 如量熱劑或放射性同位素標(biāo)記。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括測定尿樣品中的 至少一種上皮癌生物標(biāo)記物水平的方法。在特定實(shí)施方案中，試劑 盒包括"纖維素測試條'，及固定在其上的特異性結(jié)合上皮癌生物標(biāo) 記物蛋白的至少一種抗-上皮癌生物標(biāo)記物抗體或片段。然后可使用， 例如可用量熱劑或放射性同位素可測定地標(biāo)記的第二抗體，測定特 異性結(jié)合的上皮癌生物標(biāo)記物蛋白。
在其它實(shí)施方案中，分析試劑盒可采用(但不限于)以下技 術(shù)竟?fàn)幮院头蔷範(fàn)幮苑治?、；故射免疫分?RIA)、生物發(fā)光和化學(xué) 發(fā)光分析、熒光分析、夾心分4斤、免疫輻射計(jì)分析、斑點(diǎn)印跡、包 括ELISA的酶聯(lián)分析、微滴定板和免疫細(xì)胞化學(xué)。對于每一試劑盒， 其分析的范圍、靈敏度、精密度、可靠性、特異性和重現(xiàn)性通過本 領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員熟悉的方法確定。
以上描述的分析試劑盒還將提供使用說明書和裝尿樣品 的容器。
本發(fā)明還通過下列的實(shí)施例加以詳細(xì)說明。
提供這些實(shí)施例是幫助對本發(fā)明的理解而不視為對本發(fā) 明的限制。實(shí)施例1凈排尿、膀胱癌組織和用于移行細(xì)胞癌癥中生物標(biāo)記 物發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組學(xué)分析導(dǎo)言
需要新的生物標(biāo)記物以幫助診斷和處理上皮源性癌癥。 尿可用作上皮癌生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)和分析的很好的介質(zhì)。通過二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D PAGE)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析是一種分析人樣本的 蛋白質(zhì)組的有效工具。本發(fā)明人應(yīng)用2DPAGE分析了凈排尿、人膀 胱腫瘤和正常組織，以及作為用于生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)的方法的人源性 膀胱癌細(xì)胞系。 方法
根據(jù)IRB批準(zhǔn)的方案，本發(fā)明人從采用活檢的診斷性膀 胱鏡檢查之前的63個(gè)患者和22個(gè)無膀胱癌臨床跡象和無惡性疾病 史的、年齡匹配的對照患者中收集凈排尿樣品。分離和定量尿總蛋 白質(zhì)。將等量的個(gè)體患者的蛋白質(zhì)匯成三組l.階段Ta,高級；2.階 段Ta,低級；3.正常對照組。每組包含8個(gè)患者。分析來自每組的總 數(shù)為40ng(每個(gè)患者5ng)的蛋白質(zhì)并用2D PAGe進(jìn)行比較。逾教
根據(jù)IRB批準(zhǔn)的方案，自階段T3 Nl M0移行細(xì)胞癌癥患者膀胱切除術(shù)的樣本中收集膀胱腫瘤組織和正常膀胱上皮 (urothelium)。立即將組織樣本于液氮中冷凍，然后分離和定量總蛋 白質(zhì)。分析來自每個(gè)胂瘤組和正常組的40ng的蛋白質(zhì)并用2D PAGE進(jìn)行比較。 勿應(yīng)^
從兩個(gè)前述細(xì)胞系中分離分級的蛋白質(zhì)(Fractionated protein): 1.MGH-U1,培養(yǎng)自高級的膀胱移行細(xì)胞癌癥和高致瘤性棵 小鼠；2.MGH-U4,培養(yǎng)自患嚴(yán)重非典型尿道上皮癌癥患者和棵小鼠 非致瘤性(細(xì)胞)。對來自每一細(xì)^^手、的細(xì)胞質(zhì)、核和膜蛋白質(zhì)組分各 40 ng進(jìn)行分析并用2D PAGE進(jìn)行比較。
對于以上所有樣本，分離獨(dú)特的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)和用液相色 譜質(zhì)譜儀-質(zhì)譜儀(LCMS-MS)分析。潛果
通過2D PAGE的分析確定代表普通或正常尿蛋白組學(xué)的 3組尿樣品在普通分子量(MW)和等電點(diǎn)(pI)的一些蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。同樣 地，本發(fā)明人證明組織樣本和細(xì)月包系的普通蛋白質(zhì)組學(xué)光傳。來自Ta 高級患者的尿、胂瘤組織和MGH-U1細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組學(xué)光譜，在 MW10-15kD和pI8-10的范圍中，顯示幾個(gè)相似的肽斑點(diǎn)，它們不 存在或已經(jīng)鑒定這些蛋白質(zhì)中的三種為半胱氨酸蛋白酶抑制劑B(內(nèi) 源性半胱氨酸蛋白酶抑制劑)、伴侶蛋白IO(熱休克蛋白)和肌動(dòng)蛋白 抑制蛋白(細(xì)胞骨架蛋白)。潛論
本發(fā)明人證實(shí)發(fā)現(xiàn)了三種新的對上皮源性癌癥的生物標(biāo)記物。實(shí)施例II對于膀胱癌組織中半胱氨酸蛋白酶抑制劑B免疫染色 才法
將正常膀胱和膀胱癌組織使用小鼠單克隆抗-半胱氨酸蛋 白酶抑制劑B抗體進(jìn)行免疫染色并且用蘇木精復(fù)染(counterstained)。 使用膀胱癌組織微陣列BL801 (US Biomax Inc, Rockville, MD)進(jìn)行免 疫染色。將組織脫蠟，于3%過氧化氫的曱醇溶液中內(nèi)源性過氧化物 封閉，并且使用抗原解掩蔽溶液(Unmaskmg Solution)施行微波抗原修 復(fù)(retrieval)。使用5%常規(guī)馬血清封閉和用抗生物素蛋白/生物素試劑 盒封閉內(nèi)源性生物素。用小鼠單克隆抗-半胱氨酸蛋白酶抑制劑 B/Stefm B抗體、克隆A6/2 (GeneTex, Inc, San Antomo， TX),隨后用 抗-小鼠生物素化的次級抗體孵育組織，使用ABC試劑盒擴(kuò)增和用 DAB顯色。用Gill's Hematoxylin #3 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)使 組織復(fù)染色和用Tacha's Bluing Solution (Biocare, Concord, CA)變藍(lán)。 除非另外指明，所有試劑購自Vector Laboratories, Burlingame, CA。 所有影像在攝影時(shí)的曝光時(shí)間相同。錄^
來自膀胱癌患者的樣本中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B水 平顯著高于正常膀胱組織樣本中所觀測到的水平。
權(quán)利要求
1.一種易于診斷上皮源性癌癥患者的方法，該方法包括a.從患者獲得生物樣品；和b.檢測生物樣品中至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的存在或缺乏，其中至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的存在提示有上皮源性癌癥，且其中上皮癌生物標(biāo)記物選自半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白10和肌動(dòng)蛋白抑制蛋白。
2. —種用于在患者中診斷上皮源性癌癥的方法，該方法包括a. 檢測來自患者的生物樣品，即測試樣品中存在的至少一種上 皮癌生物標(biāo)記物的水平；b. 將測試樣品中的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的水平與存在于 對照樣品中的上皮癌生物標(biāo)記物的水平進(jìn)行比較；其中與對照樣品中的上皮癌生物標(biāo)記物的水平比較，測試樣品 中的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的較高水平提示有上皮源性癌癥， 且其中上皮癌生物標(biāo)記物選自半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白10 和肌動(dòng)蛋白抑制蛋白。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述上皮源性癌癥選自乳腺癌、 基底細(xì)胞癌、腺癌、胃腸癌、唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌、胃 癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、皮 膚癌、前列腺癌和腎細(xì)胞癌。
4. 一種易于診斷患者的膀胱癌的方法，該方法包括a. 從患者獲得生物樣品；和b. 檢測生物樣品中半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的存在或缺乏， 其中半胱氨酸蛋白酶抑制劑B上皮癌生物標(biāo)記物的存在表示有膀胱癌。
5. —種診斷患者的膀胱癌的方法，該方法包括a. 檢測來自患者的生物樣品，即測試樣品中存在的半胱氨酸蛋 白酶抑制劑B的水平；b. 將測試樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的水平與存在于對 照樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B上皮癌生物標(biāo)記物的水平進(jìn)行 比較；其中與對照樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的水平比較，測 試樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的較高水平提示有膀胱癌。
6. —種診斷患者的侵襲性膀胱癌的方法，該方法包括a. 檢測來自患者的生物樣品，即測試樣品中存在的半胱氨酸蛋 白酶抑制劑B的水平；b. 將測試樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的水平與存在于非 侵襲性對照樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的水平進(jìn)行比較；其中與非侵襲性對照樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的水平 比較，測試樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的較高水平提示有侵 襲性膀胱癌。
7. 任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述生物樣品是尿。
8. 權(quán)利要求1或4的方法，其中至少一種上皮癌生物標(biāo)記物或 半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的存在或缺乏是采用基于抗體的結(jié)合部分 檢測的，所述基于抗體的結(jié)合部分特異性地結(jié)合于至少一種上皮癌 生物標(biāo)記物或半胱氨酸蛋白酶抑制劑B。
9. 權(quán)利要求2、 5或6中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種上皮癌 生物標(biāo)記物或半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的水平通過檢測至少一種上 皮癌生物標(biāo)記物蛋白或半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的蛋白質(zhì)水平來檢 測。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述上皮癌生物標(biāo)記物的蛋白質(zhì) 水平或半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的水平由包括以下步驟的方法檢測:a. 使測試樣品或其制備物與特異性地結(jié)合上皮癌生物標(biāo)記物或 半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的基于抗體的結(jié)合部分接觸，形成抗體-上 皮癌生物標(biāo)記物復(fù)合物；和b. 檢測復(fù)合物的存在，從而測定存在的上皮癌生物標(biāo)記物的水平。
11. 依據(jù)權(quán)利要求8或10的方法，其中所述基于抗體的結(jié)合部 分用可測定的標(biāo)記物標(biāo)記。
12. 依據(jù)權(quán)利要求ll的方法，其中所述標(biāo)記物選自放射性標(biāo)記 物、半抗原標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物和酶標(biāo)記物。
13. 依據(jù)權(quán)利要求8或10的方法，其中所述基于抗體的結(jié)合部 分是抗體。
14. 依據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
15. —種用于檢測尿樣品中的至少一種上皮癌生物標(biāo)記物的試 劑盒，所述試劑盒包括容納尿樣品的容器和至少一種特異性結(jié)合上 皮癌生物標(biāo)記物的抗體。
16. 權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述試劑盒包括特異性結(jié)合于 至少 一種上皮癌生物標(biāo)記物的兩種抗體， 一種抗體固定在固相上和 一種抗體纟皮可4企測性地標(biāo)記。
17. —種用于測定尿樣品中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的試劑 盒，所述試劑盒包括容納尿樣品的容器和至少 一種特異性結(jié)合半胱 氨酸蛋白酶抑制劑B的抗體。
18. 權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述試劑盒包括特異性結(jié)合于 半胱氨酸蛋白酶抑制劑B的兩種抗體， 一種抗體固定在固相上和一 種抗體4皮可4企測性i也標(biāo)^己。
19. 權(quán)利要求15或17的試劑盒，它還包括使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、伴侶蛋白10和肌動(dòng)蛋白抑制蛋白此三種蛋白質(zhì)，存在于一種上皮源性癌癥的膀胱癌病人的尿中。因此，本發(fā)明涉及用于上皮源性癌癥的預(yù)后的評價(jià)方法和涉及通過監(jiān)測生物樣品中這些標(biāo)記物的存在而使上皮源性癌癥易于診斷的方法。本發(fā)明還涉及用于治療功效的標(biāo)記物。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101268368SQ200680009872
公開日2008年9月17日 申請日期2006年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者A·S·費(fèi)爾德曼, B·R·策特, S·W·麥杜加爾 申請人:兒童醫(yī)療中心有限公司;綜合醫(yī)院公司