專利名稱：：基因表達(dá)盒及轉(zhuǎn)化體、及使用該轉(zhuǎn)化體的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法及2-脫氧-青蟹肌...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因表達(dá)盒及轉(zhuǎn)化體、及使用該轉(zhuǎn)化體的2-脫氧-青蟹肌糖(scylloinosose)的制備方法及2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法。
背景技術(shù)：
：目前在石油化學(xué)領(lǐng)域中，開始以石油作為原料生產(chǎn)六元碳環(huán)化合物。另一方面，在丁酰苷菌素(butyrosin)生產(chǎn)菌環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)中發(fā)現(xiàn)了2-脫氧-青蟹肌糖合成酶(DOI合成酶)，該酶可催化以葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)為基質(zhì)，合成六元碳環(huán)化合物2-脫氧-青蟹肌糖(以下也稱為DOI)的反應(yīng)(圖l,專利文獻(xiàn)l)。D0I合成酶是參與含有2-脫氧鏈霉胺作為苷元的氨基糖苷抗生素的生物合成的酶，其生成物DOI是作為醫(yī)藥原料或化學(xué)工業(yè)資源有用的物質(zhì)?；瘜W(xué)合成DOI的方法使用多步反應(yīng)和有害或昂貴的金屬，與其相對(duì)，如果使用DOI合成酶，則能夠用較短的工序高效率地生產(chǎn)DOI。目前已經(jīng)確立了使用通過在大腸桿菌中表達(dá)DOI合成酶而荻得的重組DOI合成酶，用較短工序由葡萄糖-6-磷酸生產(chǎn)DOI的方法(專利文獻(xiàn)l)。并且，已知DOI可以通過下述反應(yīng)合成，即，使己糖激酶和DOI合成酶與葡萄糖作用的二步酶反應(yīng)、或使DOI合成酶與葡萄糖-6-磷酸作用的一步酶反應(yīng)(專利文獻(xiàn)l、非專利文獻(xiàn)l)。另外，也有才艮道指出，濃縮酶反應(yīng)液后制成乙酸溶液，與^典化氫作用，由此可以在不精制DOI的情況下變?yōu)閮翰璺?專利文獻(xiàn)l)。但是，使用嵌入DOI合成酶的大腸桿菌、以來自生物質(zhì)(biomass)的D-葡萄糖為原料、通過發(fā)酵進(jìn)行DOI合成的方法，尚未作為課題被提出。目前為止，已有報(bào)道指出可通過酶反應(yīng)合成DOI,變?yōu)榉磻?yīng)組合物狀態(tài)的DOI,但精制.分離DOI本身的方法未見報(bào)道。并且，完全沒有公開關(guān)于從含有比酶反應(yīng)液中多種多量的培養(yǎng)基成分、作為碳源的葡萄糖、除此之外還含有來自蛋白胨等的氨基酸類、或各種金屬離子類的微生物培養(yǎng)液中精制DOI的信息。即。目前的現(xiàn)狀為，沒有在來自酶反應(yīng)液及微生物培養(yǎng)液等的雜質(zhì)的存在下精制DOI的相關(guān)報(bào)道，或尚未確立可工業(yè)應(yīng)用的精制方法。為了在來自微生物培養(yǎng)液等的雜質(zhì)的存在下精制DOI,已知有實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的通過HPLC分離或采用活性炭柱色語的方法。但是，不言而喻通過HPLC分離不適于工業(yè)生產(chǎn)。另外，采用活性炭柱色語的方法中，使培養(yǎng)基中的有機(jī)化合物都吸附到活性炭上后，邊改變醇等有機(jī)溶劑的濃度，邊利用吸附力的差別使其順次洗脫。所以，生產(chǎn)大量的DOI時(shí)，必須有足以吸附培養(yǎng)基中大部分有機(jī)化合物的量的活性炭，此方法也不適于大量4青制。由此可知，目前為止尚未確立用于纟青制DOI的適當(dāng)?shù)墓I(yè)方法。專利文獻(xiàn)l:特開2000-236881號(hào)公報(bào)(專利第3122762號(hào))非專利文獻(xiàn)l:K.Kakinuma、E.Nango、F.Kudo、Y.Matsushima、及T.Eguchi著、TetrahedronLetters、2000年、41巻、p.1935—1938非專利文獻(xiàn)2:Ota,Y.等著,J.Antibiot.、2000年、53巻、1p.158-1167非專利文獻(xiàn)3:Kudo,F.等著、J.Antibiot.、1999年、52巻、p.559-571
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是鑒于上述問題而完成的，其目的在于提供能夠?qū)崿F(xiàn)可以工業(yè)規(guī)模制備DOI的體系的基因表達(dá)盒、具有此基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化體及2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法及2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法。本發(fā)明的基因表達(dá)盒的特征在于，由參與2-脫氧-青蟹肌糖的合成的基因構(gòu)成。本發(fā)明的基因表達(dá)盒的特征在于，所述參與2_脫氧-青蟹肌糖的合成的基因是2-脫氧-青蟹肌糖合成酶。由此，可以獲得能夠工業(yè)制備DOI的轉(zhuǎn)化體。另外，本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的特征在于，該轉(zhuǎn)化體是向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入上述基因表達(dá)盒而獲得的。本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的特征在于，所述宿主細(xì)胞是選自大腸菌種、及GILSP基因重組微生物表記載的宿主細(xì)胞(平成18年3月公告表中記載的細(xì)胞)中的宿主細(xì)胞。由此，可以實(shí)施能工業(yè)制備DOI的方法。本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的特征在于，所述宿主細(xì)胞是基因被破壞的宿主細(xì)胞，所述基因選自編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶的pgi基因、編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氪酶的zwf基因、編碼磷酸葡糖變位酶的pgm基因、及編碼處于穩(wěn)定期的負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成修飾的核糖體修飾因子蛋白質(zhì)的rmf基因中的至少一種。由此，除上述之外，還能夠?qū)嵤┠芤暂^高效率工業(yè)制備DOI的方法。另一方面，本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法的特征在于，具有使上述轉(zhuǎn)化體和碳源接觸的工序。由此，能夠工業(yè)制備DOI。本發(fā)明的2_脫氧-青蟹肌糖的制備方法的特征在于，所述碳源為選自D-葡萄糖、寡糖、多糖、淀粉、纖維素、米糠及廢糖蜜、及可以得到D-葡萄糖的生物質(zhì)中的至少一種碳源。由此，除上述之外，還能通用地制備DOI。本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的特征在于，是通過上述2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法獲得的。由此，能夠得到充分發(fā)揮了利用轉(zhuǎn)化體的制備方法的特質(zhì)的2-脫氧-青蟹肌糖。本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于，包含以下工序，即，使上述轉(zhuǎn)化體和碳源接觸，得到具有2-脫氧-青蟹肌糖的組合物的工序，和，用具有氫離子型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂和有機(jī)酸離子型石成性陰離子交換樹脂的混合柱(mixed-bedcolumn)或雙柱(double-bedcolumn)處理所述組合物的工序。由此，能以工業(yè)方式獲得高純度的DOI。本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于，所述有枳i酸離子型堿性陰離子交換樹脂是乙酸離子型陰離子交換樹脂。由此，能夠通過濃縮操作除去乙酸，因此實(shí)用中可以優(yōu)選使用。本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的特征在于，是通過上述2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法獲得的。由此，可以得到純度高、充分發(fā)揮了利用轉(zhuǎn)化體的特質(zhì)的2-脫氧-青蟹肌糖。本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于，包含以下工序，即，使上述2-脫氧-青蟹肌糖和三烷氧基曱烷反應(yīng)，得到2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序，和在酸存在下水解所述2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序。由此，除上述之外，還能高效地分離雜質(zhì)。本發(fā)明的2_脫氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于，所述三烷氧基曱烷是三甲氧基曱烷。由此，能夠通過濃縮操作容易地除去在接下來的水解工序中生成的曱醇，因此，實(shí)用中可以優(yōu)選使用。本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的特征在于，是通過上述2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法獲得的。由此，能夠得到在純度等方面實(shí)用性也優(yōu)異的2-脫氧-青蟹肌糖。作為醫(yī)藥原料或化學(xué)工業(yè)原料十分重要的六元碳環(huán)化合物，目前為止通過以石油為原料的石油化學(xué)進(jìn)行制備。但是，通過使用本發(fā)明的技術(shù)，可以以來自可再生的植物資源(生物質(zhì))的D-葡萄糖作為原料，由細(xì)菌合成六元碳環(huán)化合物2-脫氧-青蟹肌糖(DOI)。另夕卜，可以通過處理培養(yǎng)液，回收精制的DOI。[圖1]表示由D-葡萄糖生成DOI的反應(yīng)路線及DOI合成酶催化的反應(yīng)。[圖2A]表示pLEX-btrC的結(jié)構(gòu)。[圖2B]表示pGAP-btrC的結(jié)構(gòu)。[圖2C]表示pGAD-btrC的結(jié)構(gòu)。[圖2D〗表示pGAP-btrC/pGAD—btrC的結(jié)構(gòu)。[圖3A]表示將含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724Apgi抹在2xYT培養(yǎng)基、或米糠培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同的時(shí)間時(shí)，菌體萃取物的SDS-PAGE圖案。[圖3B]表示將含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的大腸桿菌GI724△pgiAzwfApgm林在2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同的時(shí)間時(shí)，菌體萃取物的SDS-PAGE圖案。[圖4A]為含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724Apgi抹的培養(yǎng)(2xYT3L、30°C、pH7.5、5%D-葡萄糖、培養(yǎng)24小時(shí))上清液的肟化反應(yīng)物的HPLC圖。[圖4B]為含有pLEX-btrC的大腸桿菌GYI724△rmf林的培養(yǎng)(2xYT、10mL、30°C、pH7，3%D-葡萄糖、培養(yǎng)48小時(shí))上清液的肟化反應(yīng)物的HPLC圖(左圖培養(yǎng)0小時(shí))。[圖5]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724Apgi林的培養(yǎng)(2xYT+2%葡萄糖()，或，2xYT+5%D—葡萄糖(■)、3L、30°C、pH7.5),(A)培養(yǎng)基的濁度、(B)D-葡萄糖濃度、及(C)DOI生產(chǎn)量的時(shí)間曲線(橫軸為添加葡萄糖后的經(jīng)過時(shí)間)。[圖6]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724ApgiAzwf林的培養(yǎng)(2xYT+3。/。甘露醇+50/。D—葡萄糖、3L、30°C、pH7.5),(A)培養(yǎng)基的濁度、(B)D-葡萄糖濃度、及(C)DOI生產(chǎn)量的時(shí)間曲線(橫軸為添加葡萄糖后的經(jīng)過時(shí)間)。[圖7]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724ApgiAzwfApgm林的培養(yǎng)(2xYT+5%D-葡萄糖+0.5%甘露醇、3L、25°C、pH7),(左)菌體濁度、(中)培養(yǎng)基中的D-葡萄糖濃度、(右)DOI生產(chǎn)量的時(shí)間曲線(橫軸為添加D-葡萄糖后的經(jīng)過時(shí)間)。[圖8]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724ApgiAzwfApgm抹()和含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的大腸桿菌GI724ApgiAzwfApgm抹(■)的培養(yǎng)(2xYT+5%D-葡萄糖+0.5%甘露醇、3L、25°C、pH6-7),(左)菌體濁度、(中)培養(yǎng)基中的D-葡萄糖濃度、(右)DOI生產(chǎn)量的時(shí)間曲線(橫軸為添加D-葡萄糖后的經(jīng)過時(shí)間)。[圖9]表示伴隨含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI7M野生型抹()和含有pLEX-btrC的大腸桿菌GI724Armf林(■)的培養(yǎng)(2xYT+3%D-葡萄糖、10mL、30°C、pH7),(左)菌體濁度、(中)培養(yǎng)基中的D-葡萄糖濃度、(右)DOI生產(chǎn)量的時(shí)間曲線(橫軸為添加D-葡萄糖后的經(jīng)過時(shí)間)。[圖10]為對(duì)按照實(shí)施例8的方法將培養(yǎng)液流入離子交換樹脂所得的餾分的pH、傳導(dǎo)度、DOI濃度進(jìn)行繪制所得的圖。[圖11]按照實(shí)施例8的方法精制所得的DOI的13C-NMR光語。[圖12]為對(duì)按照實(shí)施例9的方法將培養(yǎng)液流入離子交換樹脂所得的餾分的pH、傳導(dǎo)度、DOI濃度進(jìn)行繪制所得的圖。[圖13]按照實(shí)施例9的方法精制所得的DOI的13C-NMR光譜。[圖14]表示本發(fā)明2-脫氧-青蟹肌糖精制方法的第二方案的原理的簡(jiǎn)圖。[圖15]按照實(shí)施例10的方法精制所得的DOI的H-NMR光譜。[圖16]按照實(shí)施例11的方法精制所得的DOI的&-NMR光語。[圖17]按照實(shí)施例12的方法精制所得的DOI的^-NMR光i脊。具體實(shí)施方式考慮DOI合成酶的特性，將該酶導(dǎo)入其他微生物中，由此能夠以來自大量存在的生物質(zhì)的D-葡萄糖為原料，高效率地用較短工序生產(chǎn)有用資源DOI。因此，本發(fā)明人等為了開發(fā)出以大腸桿菌為宿主細(xì)胞通過發(fā)酵法用簡(jiǎn)便便宜的方法生產(chǎn)DOI的方法作為DOI的新型合成方法，進(jìn)行了潛心研究。從而完成本發(fā)明。另外，為采用工業(yè)方法精制DOI的系統(tǒng)時(shí)，作為優(yōu)選方法，例如可以舉出原理為從柱上部流入培養(yǎng)液，從下部流出精制的DOI的方法、及使DOI或其衍生物結(jié)晶化進(jìn)行分離的方法、及將上述方法組合的方法。基于上述觀點(diǎn)，通過研究吸附DOI之外的物質(zhì)且DOI不祐:吸附最先流出之類的柱基材，并且研究在結(jié)晶化.分離后能夠高效地獲取DOI的DOI衍生物，從而完成本發(fā)明。以下，說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案?！幢景l(fā)明的基因表達(dá)盒〉本發(fā)明的基因表達(dá)盒的特征在于，由參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因構(gòu)成。即，本發(fā)明的基因表達(dá)盒只要由參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因、和能使此基因表達(dá)的例如載體等的基因構(gòu)成即可，沒有特殊的限制。(參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因)在本發(fā)明的基因表達(dá)盒中，作為參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因可以為編碼能夠合成2-脫氧-青蟹肌糖的公知的蛋白質(zhì)的基因。作為其例子，可以舉出btrC基因，該btrC基因編碼由D-葡萄糖合成DOI的、來自環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)的DOI合成酶的42kDa亞基(參見專利文獻(xiàn)l、非專利文獻(xiàn)l及GenbankAB066276等)。當(dāng)然，只要為編碼具有DOI合成酶活性的酶的基因即可，也可以利用來自環(huán)狀芽孢桿菌之外的生物的基因。另外，上述基因的堿基序列只要是合成具有本發(fā)明DOI合成酶活性的酶的基因即可，在其基因的堿基序列中可以產(chǎn)生缺失、取代、插入等變異。(本發(fā)明的基因表達(dá)盒的構(gòu)建)為了構(gòu)建本發(fā)明的基因表達(dá)盒，可以使用在下述宿主細(xì)胞內(nèi)能夠使上述參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因表達(dá)的基因。作為基因表達(dá)盒的基因構(gòu)建，可以舉出啟動(dòng)子、參與轉(zhuǎn)錄活化的序列、RBS(核糖體結(jié)合部位)、終止子等。例如，在以大腸桿菌為宿主細(xì)胞的大量表達(dá)蛋白質(zhì)的體系中，該基因的5'上游可以連接啟動(dòng)子、參與轉(zhuǎn)錄活化的序列、RBS(核糖體結(jié)合部位)等DNA序列，該基因的3'下游可以連接終止子等DNA序列。上述DNA序列只要是在大腸桿菌中發(fā)揮作用的序列即可，可以為任意序列。啟動(dòng)子有進(jìn)行結(jié)構(gòu)表達(dá)的啟動(dòng)子或進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子，可以使用任一種啟動(dòng)子，優(yōu)選可以控制表達(dá)的啟動(dòng)子。另夕卜，在以大腸桿菌為宿主的基因表達(dá)中，通常使用以IPTG(異丙基一石克4戈一p比口南半享'L斗唐苦,isopropyl—thio—galactopyranoside)為首的成本較高的誘導(dǎo)物。本發(fā)明中，優(yōu)選使用不利用IPTG之類昂貴誘導(dǎo)物即可實(shí)現(xiàn)目的基因高度表達(dá)的表達(dá)體系。作為用于實(shí)現(xiàn)此目的的宿主載體體系，例如可以利用P^表達(dá)體系(Invitogen)、使用GAP啟動(dòng)子或GAD啟動(dòng)子的表達(dá)體系等。在PL表達(dá)體系中，嵌入載體(pLEX，氨節(jié)青霉素耐性標(biāo)記物)上的基因的表達(dá)，受到來自入噬菌體的引起構(gòu)成上強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子Pt啟動(dòng)子的控制。另外，PL表達(dá)體系利用培養(yǎng)基中色氨酸濃度進(jìn)行表達(dá)控制，在色氨酸濃度高的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)。另一方面，在單獨(dú)或同時(shí)使用gapA(編碼甘油醛一3—磷酸脫氫酶A的基因)啟動(dòng)子或gadA(編碼谷氨酸脫羧酶A的基因)啟動(dòng)子的表達(dá)體系中，嵌入載體(來自pUC,氨千青霉素耐性標(biāo)記物)上的基因的表達(dá)，可以在營(yíng)養(yǎng)增殖期或穩(wěn)定期引起結(jié)構(gòu)上的強(qiáng)表達(dá)。使用上述gapA啟動(dòng)子或gadA啟動(dòng)子等的表達(dá)體系不需要特殊的試劑或操作，在通常的培養(yǎng)時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。另一方面，PL表達(dá)體系中，通常用于大腸桿菌培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基中為了誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性存在充分量的色氨酸，不需要為了誘導(dǎo)表達(dá)再另外加入色氨酸。另外，使用gapA啟動(dòng)子或gadA啟動(dòng)子的表達(dá)體系也同樣不需要為了誘導(dǎo)表達(dá)而加入誘導(dǎo)物。即，不需要使用昂貴的誘導(dǎo)物，就可以高度表達(dá)目的基因?！幢景l(fā)明的轉(zhuǎn)化體〉本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的特征為，向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入上述基因表達(dá)盒而形成。以下，說明本發(fā)明的宿主細(xì)胞。(宿主細(xì)胞)作為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中可以使用的宿主細(xì)胞，沒有特殊的限制，可以使用保藏在菌抹保藏單位(例如IFO、ATCC等)中的菌抹。作為上述例子，例如可以舉出大腸桿菌。另外，作為大腸桿菌之外的宿主細(xì)月包，可以使用GILSP(GoodIndustrialLarge—ScalePractice(優(yōu)良工業(yè)規(guī)范))基因重組微生物表中記載的宿主細(xì)胞(平成18年3月公告表中記載的細(xì)胞，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、4豆芽孑包片干菌(Bacillusbrevis)HPD31、^i芽孑包一干菌HPD31—M3、；也衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)DN2461、地衣芽孢桿菌DN2717、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)K2A1、來自枯草芽孢桿菌M168的菌才朱、谷氛酉臾才奉才干菌(Corynebacteriumglutamicum)、來自大腸斥干菌(Escherichiacoli)K12的菌抹、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus))。(本發(fā)明的基因破壞林)在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，考慮到2-脫氧-青蟹肌糖的合成，上述宿主細(xì)胞可以使用各種破壞染色體/質(zhì)?；虻木?。本發(fā)明的優(yōu)選方案為，將編碼宿主細(xì)胞載有的、參與葡萄糖一6—磷酸代謝的酶即磷酸葡糖異構(gòu)酶、葡萄糖一6—磷酸1一脫氫酶及磷酸葡糖變位酶的基因(分別為pgi基因、zwf基因及pgm基因)分別單獨(dú)地破壞、或同時(shí)破壞兩個(gè)(pgi基因和zwf基因及pgi基因和pgm基因)，或同時(shí)破壞3個(gè)。并且，可以單獨(dú)地破壞編碼參與控制穩(wěn)定期中蛋白質(zhì)合成的RMF蛋白質(zhì)的基因(rmf基因)，或者將編碼參與上述葡萄糖一6—磷酸代謝的酶的基因被破壞的各種基因破壞株的rmf基因破壞。由此抑制菌引起的作為用于DOI生產(chǎn)的直接基質(zhì)的葡萄糖一6—磷酸的分解代謝，通過穩(wěn)定期中的蛋白質(zhì)合成，使得DOI生產(chǎn)能力顯著提高。[參與葡萄糖一6—磷酸分解的基因的破壞林]為了以盡可能高的收率合成DOI，一般認(rèn)為有必要盡可能地抑制由菌體導(dǎo)致的D—葡萄糖的異化代謝。在大腸桿菌中，作為編碼與D一葡萄糖異化代謝相關(guān)的酶的基因，有以下三種基因，即，編碼與在糖酵解體系中從葡萄糖一6—磷酸變?yōu)楣且?—磷酸相關(guān)的磷酸葡糖異構(gòu)酵(phosphoglucoseisomerase)的(pgi)基因，和編碼參與磷酸戊糖途徑中從葡萄糖-6-磷酸向磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化的酶即葡萄糖-6-磷酸卜脫氫酶(Gluxose_6-phosphatedehydrogenase)的zwf基因，編碼參與從葡萄糖-6-磷酸向葡萄糖-1-磷酸的轉(zhuǎn)化的酵即石岸酉吏葡#唐變<立酵(phosphoglucomutase)的pgm基因。通過石皮i不上述基因，能夠抑制作為DOI合成酶基質(zhì)的葡萄糖-6-磷酸伴隨菌體增殖的異化分解。[參與穩(wěn)定期中的蛋白質(zhì)合成的基因的破壞株]為了解除對(duì)穩(wěn)定期中的BtrC蛋白質(zhì)合成的抑制，必須抑制參與該過程的RMF蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。因此，認(rèn)為通過破壞編碼RMF蛋白質(zhì)的rmf基因，在穩(wěn)定期之后也可以合成BtrC蛋白質(zhì)，進(jìn)而繼續(xù)DOI合成。(本發(fā)明的基因破壞抹的制作)在本發(fā)明中，作為制作破壞宿主細(xì)胞特定基因的基因破壞林的方法，可以使用本沖支術(shù)領(lǐng)域7>知的方法。例如，可以舉出誘發(fā)突變的方法(通過自然育種的方法、添加變異劑、紫外線照射、放射線照射等)、采用隨機(jī)突變的方法(采用插入序列(IS)、易位子(Tn)等的方法)、部位特異性基因破壞法(采用單、雙交換方法的方法)等。其中，從篩選所期望的基因破壞抹的方面來看，優(yōu)選可在破壞對(duì)象的基因中插入含有顯示耐藥性的基因的片段的部位特異基因破壞法。需要說明的是，如下所述，本發(fā)明轉(zhuǎn)化體中使用的實(shí)施了基因破壞的宿主細(xì)胞，可以4吏用GeneBridges社的QuickandEasyBACModificationKit制作，但并不限定于此。(本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的制作方法)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以將上述基因表達(dá)盒導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞中進(jìn)行制作。作為此導(dǎo)入方法，可以舉出感受態(tài)法(competencemethod)或利用受體介導(dǎo)的胞吞作用的方法等?！幢景l(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法〉本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法的特征在于，使上述轉(zhuǎn)化體和碳源在適于轉(zhuǎn)化體成長(zhǎng)等的介質(zhì)中接觸。作為碳源，可以使用D-葡萄糖或D-葡糖胺、D-半乳糖胺等含氮單糖類，上述單糖類構(gòu)成的二糖以上的糖類或寡糖、或來自碳水化合物(淀粉、米糠、廢糖蜜等)多糖類的單糖類。作為進(jìn)行本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法的介質(zhì)，只要是能夠使宿主細(xì)胞增殖/成長(zhǎng)等的公知的培養(yǎng)基即可，可以為固態(tài)、液體等，介質(zhì)形態(tài)沒有限定。作為上述例子，可以舉出瓊脂培養(yǎng)基、RMG培養(yǎng)基、2xYT培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基或SOB培養(yǎng)基等。上述介質(zhì)中有碳源、氮源、無機(jī)鹽類、其他有機(jī)營(yíng)養(yǎng)源。此碳源，除上述之外，還可以為甘露醇等表l所示的物質(zhì)等。作為該氮源，例如可以舉出氯化銨、酪蛋白氨基酸、蛋白胨、酵母提取物。作為無機(jī)鹽類，例如可以舉出磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化4美、氯化鈉等。如上所述，作為宿主載體體系使用GAP-GAD表達(dá)體系或PL表達(dá)體系(Invitrogen)時(shí)，可以不用昂貴的誘導(dǎo)物。另一方面，為了適應(yīng)宿主的生長(zhǎng)等，介質(zhì)還可以含有適當(dāng)?shù)奶砑觿榱耸箤?dǎo)入上述基因表達(dá)盒中的參與2-脫氧-青蟹肌糖的合成的基因表達(dá)，介質(zhì)中還可以含有例如IPTG或色氨酸等使啟動(dòng)子活性提高的化合物。特別是，通過啟動(dòng)子進(jìn)行的基因表達(dá)為誘導(dǎo)型時(shí)，可以適時(shí)添加i秀導(dǎo)物。在本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法中，使上述轉(zhuǎn)化體和碳源接觸的溫度、時(shí)間、氛圍等，只要是適于轉(zhuǎn)化體成長(zhǎng)的環(huán)境即可，沒有特殊的限制。例如，其溫度較優(yōu)選為20。C至37。C。另外，時(shí)間也沒有特殊限制，可以大致為1天至7天。例如，本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法，首先，使作為碳源的大腸桿菌能夠同化的物質(zhì)(例如，D-葡萄糖等)在培養(yǎng)基中與上述轉(zhuǎn)化體接觸。之后，從所得培養(yǎng)上清液中回收DOI。如上所述，通過使用轉(zhuǎn)化體的本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法，可以工業(yè)上獲得DOI。本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法由于具有上述構(gòu)成，所以能夠通過己糖激酶(hexokinase)和DOI合成酶以高收率由D-葡萄糖合成DOI。另外，通過制作、培養(yǎng)上述含有質(zhì)粒pGAP-btrC、pGAD-btrC、pGAP—btrC/pGAD—btrC或pLEX—btrC的GI724Armf轉(zhuǎn)化抹、GI724ApgiArmf轉(zhuǎn)化林、GI724Apgi轉(zhuǎn)化林、GI724ApgiAzwf轉(zhuǎn)化林或GI724ApgiAzwfApgm轉(zhuǎn)化抹等的方法，如圖l所示，從D-葡萄糖經(jīng)過葡萄糖-6-磷酸，再經(jīng)過DOI合成酶催化的5步反應(yīng)，可生成DOI。在本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法中，如上所述，使轉(zhuǎn)化體和碳源接觸，可以得到具有2-脫氧-青蟹肌糖的組合物(例如，含有2-脫氧-青蟹肌糖的培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞等)。例如，以含有2-脫氧-青蟹肌糖的培養(yǎng)基為2-脫氧-青蟹肌糖的原料時(shí)，只需從培養(yǎng)上清液中回收DOI即可。在本發(fā)明中，作為從培養(yǎng)液中回收DOI的方法，考慮到2-脫氧-青蟹肌糖的物理/化學(xué)性質(zhì)或培養(yǎng)基的組成等，只需采用公知的萃取方法回收2-脫氧-青蟹肌糖即可。例如，可以使用下述方法。即，首先，在培養(yǎng)結(jié)束后，用離心機(jī)或過濾裝置等從培養(yǎng)液中除去菌體，得到培養(yǎng)上清液。之后，再過濾處理此培養(yǎng)上清液，除去菌體等固態(tài)物，將此濾液添加到離子交換樹脂中，用蒸餾水洗脫。邊測(cè)定折射率、pH、傳導(dǎo)率，邊分離不含雜質(zhì)的餾分，去除此水溶液的溶劑，可以回收DOI。例如可以采用高效液相色i普法或核f茲共振法等對(duì)所得DOI進(jìn)行分析?！幢景l(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法的第一方案〉本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于包括如下工序，即，使上述轉(zhuǎn)化體和碳源接觸，得到具有2-脫氧-青蟹肌糖的組合物的工序，和用具有氫離子型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂和有機(jī)酸離子型堿性陰離子交換樹脂的混合柱或雙柱處理所述組合物的工序。在本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法中，使轉(zhuǎn)化體和碳源接觸的步驟，以上述本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法為基準(zhǔn)進(jìn)行。通過此步驟，可以得到含有2-脫氧-青蟹肌糖的組合物。此組合物由上述介質(zhì)構(gòu)成，以下說明使用培養(yǎng)基作為介質(zhì)的情況。在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，在該培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液中，除了作為殘留碳源的葡萄糖之外，還含有培養(yǎng)基的各種成分。作為上述各種成分可以舉出各種氨基酸或肽類、及各種金屬離子類等。為了獲得DOI,必須除去上述各成分，在本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法中提供了解決上述問題的方法。作為培養(yǎng)基中含有的應(yīng)該除去的雜質(zhì)，如上所述，有作為殘留碳源的D-葡萄糖、各種氨基酸或肽類、及各種金屬離子類。其中通過研究培養(yǎng)條件，可知能夠繼續(xù)培養(yǎng)至D-葡萄糖完全消耗。如上所述得到的培養(yǎng)基中，作為殘留的雜質(zhì)，有各種氨基酸或肽類、及各種金屬離子類。在氨基酸類中，有賴氨酸或組氨酸、色氨酸之類具有多個(gè)氨基的堿性氨基酸，也有谷氨酸或天冬氨酸之類具有多個(gè)羧基的酸性氨基酸。另外，金屬離子當(dāng)然為陽離子，同時(shí)培養(yǎng)基中也存在作為其相反離子的氯離子或硫酸根離子等。所以，只需研究出一種吸附所有上述雜質(zhì)，并且不吸附DOI的基材即可。本發(fā)明人等基于上述構(gòu)思，對(duì)基材進(jìn)行研究且探討了洗脫條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用常用的離子交換樹脂，例如鈉離子型或氫離子型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂及氯離子型或氫氧根離子型堿性陰離子交換樹脂的方法，不能高效率地精制DOI。即，即使使用分別連接的雙柱、或?qū)烧呋旌系幕旌现?，仍然不能?shí)現(xiàn)上述目的。氨基酸可以與2種離子交換樹脂的任一種鍵合。另外，金屬離子與陽離子交換樹脂鍵合，而DOI由于無離子性官能團(tuán)，所以，具有不與任何離子交換樹脂鍵合的特性。所以，推測(cè)氨基酸類及金屬鹽類與離子交換樹脂鍵合，只有DOI不吸附而溶離出來，-f旦結(jié)果并非如此。DOI的回收率為50%以下，并且因離子交換樹脂的使用條件不同而變化較大。為了適合大量處理的工業(yè)方法，必須進(jìn)一步提高回收率且使效果穩(wěn)定。本發(fā)明人等更廣泛地深入研究基材和精制條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過采用使用有機(jī)酸離子作為陰離子交換樹脂的相反離子的方法，即，使用有機(jī)酸離子型陰離子交換樹脂和氫離子型陽離子交換樹脂的混合柱或雙柱，可以更有效率地精制DOI。作為有機(jī)酸，可以舉出乙酸、丙酸、草酸等，其中優(yōu)選使用乙酸?？紤]到在pH為8以上的堿性區(qū)域內(nèi)DOI極易分解，只有在pH為35的弱酸性條件下穩(wěn)定，優(yōu)選使用乙酸作為有機(jī)酸。即，如果DOI在酸性和堿性兩區(qū)域內(nèi)完全穩(wěn)定，則可以采用將培養(yǎng)液流入常用的將陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂填充到各柱內(nèi)的雙柱中的方法，除去上述雜質(zhì)。另外，如果在兩區(qū)域中具有與果糖同等的穩(wěn)定性，則可以用混合柱精制。本發(fā)明人等率先發(fā)現(xiàn)，即使使用混合柱，DOI在堿性區(qū)域中仍發(fā)生分解而不穩(wěn)定，更不必i兌7又片主。為了解決此問題，本發(fā)明人等對(duì)如何選擇與所用離子交換樹脂鍵合的相反離子進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了使用有機(jī)酸離子作為陰離子交換樹脂的相反離子的方法。由此，有機(jī)酸殘留在溶離液中，也可混入到DOI的溶離成分中，但其能夠有效地將溶離液的pH保持在4左右。在有機(jī)酸中，乙酸具有可以通過濃縮除去的優(yōu)點(diǎn)。由此可知，可以通過使培養(yǎng)液通過將氫離子型陽離子交換樹脂和有機(jī)酸離子型陰離子交換樹脂混合而制成的離子交換柱，精制DOI,從而完成本發(fā)明。該方法是能適用于工業(yè)大量生產(chǎn)的方法。使用混合填充式或雙填充式離子交換樹脂柱的精制方法能夠吸附除去殘留在葡萄糖完全消耗的培養(yǎng)液中的來自原料的帶電性雜質(zhì)、各種氨基酸或肽類、及各種金屬離子類。所以，可以通過洗脫未吸附的中性物質(zhì)DOI進(jìn)行精制。但是，根據(jù)培養(yǎng)條件不同，此DOI中可能混入微量中性物質(zhì)，進(jìn)一步研究將從離子交換樹脂柱中洗脫的DOI更高度灃青制的方法。才艮據(jù)NMR等的測(cè)定，可以推斷DOI以酮型和水合物型混合的結(jié)構(gòu)存在，DOI難于結(jié)晶化。目前為止，DOI和其衍生物的結(jié)晶化均未見報(bào)道。以下，說明進(jìn)一步高度精制DOI的方法?！幢景l(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法的第二方案〉本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法的特征在于包含以下工序，即，使上述2-脫氧-青蟹肌糖和三烷氧基曱烷反應(yīng)，得到2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序，和在酸存在下水解所述2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序。作為該方案中可以使用的2-脫氧-青蟹肌糖，除含有2-脫氧-青蟹肌糖的上述組合物之外，還可以舉出第一方案得到的2-脫氧-青蟹肌糖等。以下，說明該第二方案。本發(fā)明人等基于將洗脫的DOI衍生轉(zhuǎn)化為結(jié)晶性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶化，分離.精制后，高效地恢復(fù)為DOI的原理，探討適用此原理的物質(zhì)及精制方法。圖14給出該原理的概述。圖14為表示本發(fā)明2-脫氧-青蟹肌糖精制方法的第二方案的原理的簡(jiǎn)圖。為了滿足上述要件，轉(zhuǎn)化DOI的反應(yīng)條件及恢復(fù)的反應(yīng)條件的必須要件是能夠在DOI不發(fā)生分解的酸性條件下實(shí)施、及衍生改變的物質(zhì)易于結(jié)晶化且能恢復(fù)成DOI、并且上述操作能夠以工業(yè)規(guī)模實(shí)施。研究了符合上述要件的各種方法。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定的酸性條件下使DOI與三烷氧基甲烷反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮(DOI-dak)進(jìn)行結(jié)晶化.精制的方法。在此三烷氧基曱烷((RO)3CH)中，R只要為碳原子數(shù)為14的鏈狀烷烴類即可，沒有特殊的限制，例如可以舉出甲烷、乙烷、丙烷、丁烷等。本發(fā)明中，作為該烷氧基曱烷，從容易除去下述水解工序中生成的醇的方面來看，最優(yōu)選三曱基曱烷。需要說明的是，使用三甲基曱烷時(shí)，可以得到脫氧-青蟹肌糖二曱基縮酮(DOI-dmk)。2-脫氧-青蟹肌糖烷基縮酮的結(jié)晶化可以在將2-脫氧-青蟹肌糖烷基縮酮溶解于適當(dāng)?shù)娜軇?例如曱醇、乙醇、水等)后，利用使液相的親水性降低的介質(zhì)(例如氯仿、己烷、醚等)進(jìn)行結(jié)晶化。如上所述，可以得到2-脫氧-青蟹肌糖烷基縮酮的結(jié)晶。如上所述得到的2-脫氧-青蟹肌糖烷基縮酮在酸存在下水解，變?yōu)?-脫氧-青蟹肌糖。此水解反應(yīng)可以在甲苯石黃酸、鹽酸、石克酸等適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)存在下進(jìn)行。水解后可以得到2-脫氧-青蟹肌糖。由此可知，本發(fā)明的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法是能夠充分地進(jìn)行工業(yè)大量生產(chǎn)的方法。實(shí)施例以下，通過實(shí)施例具體地說明本發(fā)明。但本發(fā)明的范圍并不限定于這些實(shí)施例。(實(shí)施例l)<〈DOI合成酶基因〉>作為糖環(huán)化酶基因，可以使用來自環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)的、編碼2-脫氧-青蟹肌糖(DOI)合成酶的42kDa亞基的btrC基因(參見專利文獻(xiàn)l、GenbankAB066276、非專利文獻(xiàn)2等)。(實(shí)施例2)<<重組質(zhì)粒及重組4朱的構(gòu)建〉〉<btrC基因及pLEX—btrC>以含有btrC基因全長(zhǎng)的質(zhì)粒pDS4(非專利文獻(xiàn)3)作為模板，使用序列號(hào)1所示引物1和序列號(hào)2所示引物2，btrC基因的PCR擴(kuò)增使用KOD聚合酶(TOYOBO)，PCR的反應(yīng)條件為以94。O30秒、52°030秒、68。Cxl分為l次循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)。將如上所述地進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的DNA片斷用NdeI和XbaI進(jìn)行消化，通過將其插入載體pLEX(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)NdeI—Xbal部位,構(gòu)建pLEX-btrC(圖2A)。<pGAP-btrC/p-GAD-btrC〉gapA啟動(dòng)子基因以大腸桿菌的染色體DNA為模板，使用序列號(hào)17所示引物和序列號(hào)18所示引物，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行合成。該gapA啟動(dòng)子基因的PCR擴(kuò)增中，使用KOD聚合酶，在以下反應(yīng)條件下進(jìn)行，得到gapA啟動(dòng)子片斷。將94。O30秒50。030秒68。Cxl分鐘作為l次循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)gadA啟動(dòng)子基因，以大腸桿菌的染色體DNA為模板，使用序列號(hào)19所示引物和序列號(hào)20所示引物，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行合成。該gadA啟動(dòng)子基因的PCR擴(kuò)增使用KOD聚合酶，在以下反應(yīng)條件下進(jìn)行，得到gadA啟動(dòng)子片斷。將94。Cx30秒52。Cx30秒68。Cxl分鐘作為l次循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)aspA終止子基因，以含有aspA終止子基因的質(zhì)粒pLEX(Invitrogen)作為模板，使用序列號(hào)21所示引物和序列號(hào)22所示引物，通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行合成。該aspA終止子基因的PCR擴(kuò)增使用KOD聚合酶(TOYOBO),在以下反應(yīng)條件下進(jìn)行，得到aspA終止子片斷。將94"Cx30秒55°030秒68。Cxl分鐘作為l次循環(huán)，進(jìn)^于30次循環(huán)在16°C下，使用2xLigationmix(TAKARA)使PCR擴(kuò)增得到的gadA啟動(dòng)子片斷和上述btrC片斷反應(yīng)30分鐘。將由此所得的連接(Ligation)產(chǎn)物作為模板，使用序列號(hào)2所示引物和序列號(hào)5所示引物，使用KOD聚合酶，在以下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到2個(gè)片斷合為1個(gè)形成的片斷gadA-btrC片斷。將94。O30秒52。Cx30秒68。Cxl分鐘作為l次循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)將此片斷用Xbal消化所得的片斷插入載體pLEX(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)的XbaI部位。然后，在16。C下，使用2xLigationmix使上述擴(kuò)增得到的gapA啟動(dòng)子片斷和btrC片斷和aspA終止子片斷反應(yīng)30分鐘。將由此所得的連接(Ligation)產(chǎn)物作為模板，使用序列號(hào)3所示的引物和序列號(hào)8所示的引物，使用KOD聚合酶，在以下條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到3個(gè)片斷合為l個(gè)形成的片斷gapA啟動(dòng)子-btrC-aspA終止子片斷。將94"Cx30秒5(TCx30秒68。Cxl分鐘作為l次循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)將此片斷用BamHI消化所得的片斷插入載體pLEX(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)的BamHI部位，所述載體中插入了gadA-btrC,由此構(gòu)建pGAP-btrC/pGAD-btrC(圖5)。(實(shí)施例3)<<宿主細(xì)胞的制備〉〉<吏用GeneBridges牙土的QuickandEasyBACModificationKit,才艮才居其中所附說明書記載的方法進(jìn)行基因破壞。用于制作單獨(dú)破壞pgi基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號(hào)3和序列號(hào)4所示。在用于單獨(dú)破壞zwf基因所用的盒的擴(kuò)增中使用的PCR引物組的序列如序列號(hào)5和序列號(hào)6所示。用于制作單獨(dú)破壞pgm基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號(hào)7、序列號(hào)8、序列號(hào)9及序列號(hào)10所示。為了得到pgi基因和zwf基因的雙重破壞抹，用于擴(kuò)增破壞zwf基因單獨(dú)破壞抹中的pgi基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號(hào)11和序列號(hào)12所示。為了得到pgi基因和pgm基因的雙重破壞抹，用于擴(kuò)增破壞pgi基因單獨(dú)破壞林中的pgm基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號(hào)7、序列號(hào)8、序列號(hào)9及序列號(hào)10所示。進(jìn)而，為了得到pgi基因和zwf基因和pgm基因的三重破壞抹，用于擴(kuò)增破壞pgi基因和pgm基因的雙重破壞抹中的zwf基因所用的盒的PCR引物組的序列如序列號(hào)5和序列號(hào)6所示。另外，破壞rmf基因的盒所用的引物如序列號(hào)13、序列號(hào)14、序列號(hào)15及序列號(hào)16所示。將載體、pSC101-BAD-gbaA-tetra導(dǎo)入宿主細(xì)胞大腸桿菌抹(GI724)中，所述載體添加在試劑盒中，編碼在大腸桿菌內(nèi)促進(jìn)相同重組的酶群。在添加3pg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中將該抹進(jìn)行一夜前培養(yǎng)。將前培養(yǎng)菌體以1%濃度植菌在添加了3(ig/mL的LB培養(yǎng)基中，在30。C下培養(yǎng)至O.D.=0.2。在該時(shí)間點(diǎn)下添加阿拉伯糖使終濃度為0.2%，進(jìn)而在37。C下培養(yǎng)1小時(shí)，由此誘導(dǎo)表達(dá)參與促進(jìn)相同重組的酶群。進(jìn)而分別轉(zhuǎn)化基因破壞用盒，誘導(dǎo)靶基因的基因破壞。通過在含有氯霉素、新霉素(卡那霉素)或鏈霉素或其中2個(gè)或3個(gè)的、37°C的LB培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化體，得到目的基因破壞林(pgi基因破壞抹(Apgi抹)、zwf基因破壞林(Azw琳)、pgm基因破壞抹(Apgm抹)、pgi/zwf雙重基因破壞抹(ApgiAzwf抹)、pgi/pgm雙重基因破壞林(ApgiApgm4朱)及pgi/zwf/pgm三重基因破壞抹(Apgi△zwfApgm抹))。對(duì)于rmf基因破壞抹(Armf株)，使用與上述相同的方法，得到上述各種破壞抹的rmf破壞抹。由此所得的野生型抹及各基因破壞林在各種單一碳源中的生長(zhǎng)水平如表1所示。Apgi抹、Azwf抹及Apgm株可以使用D-葡萄糖作為碳源，與野生型抹相比，使用D-葡萄糖的生長(zhǎng)速度也顯著減緩，認(rèn)為能夠抑制菌體對(duì)D-葡萄糖的消耗。另外，由于ApgiAzwf抹、ApgiApgm林及ApgiAzwfApgm林以D-葡萄糖作為單一碳源生長(zhǎng)非常困難，所以認(rèn)為葡萄糖-6-磷酸的分解幾乎完全被抑制。由此可知，能夠期待通過使用上述的破壞抹，DOI生產(chǎn)量及DOI轉(zhuǎn)化效率與野生型株相比得到提高。另外，各雙重基因破壞抹及三重基因破壞抹通過輔助地加入甘露醇或葡糖酸鹽等非發(fā)酵性碳源，能夠使生長(zhǎng)得到改善(表l)。另外，rmf基因破壞抹中的碳源，具有與破壞了葡萄糖-6-磷酸代謝酶基因的各種破壞抹相同的生長(zhǎng)水平。[表l]<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>(表中，"++"表示生長(zhǎng)非常好"+"表示生長(zhǎng)良好"+/-"表示少量生長(zhǎng)"-"表示幾乎不生長(zhǎng))(實(shí)施例4)<<轉(zhuǎn)化體>〉根據(jù)GeneBridges社試劑盒附帶說明書中記載的方案，用上述所得的pLEX-btrC轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌抹(GI724)，通過在含有氨節(jié)青霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇，得到GI724/pLEX-btrC抹。另外，與上述相同地，將pGAP-btrC/pGAD-btrC轉(zhuǎn)化到宿主大腸桿菌才朱(GI724)，通過在含有氨千青霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇，得到GI724/pGAP-btrC/pGAD-btrC才朱。進(jìn)而，也可以對(duì)GI724Armf、GI724Apgi、GI724Azwf、GI724Apgm、GI724ApgiArmf、GI724ApgiAzwf、GI724ApgiApgm及GI724ApgiAzwfApgm的各基因破壞抹，相同地轉(zhuǎn)化pGAP-btrC/pGAD-btrC,分別得到GI724Armf/pGAP-btrC/pGAD-btrC抹、GI724Apgi/pGAP-btrC/pGAD-btr沐、GI724Azwf/pGAP-btrC/pGAD-btrC抹、GI724Apgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC抹、GI724ApgiArmf/pGAP-btrC/pGAD_btrC株、GI724ApgiAzwf/pGAP-btrC/pGAD-btrC林、GI724ApgiApgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC林、GI724ApgiAzwfApgm/pGAP-btrC/pGAD_btrC才朱。(實(shí)施例5)<〈DOI合成酶表達(dá)的確認(rèn)〉〉<GI724Apgi/pLEX-btrC抹〉在30。C下于誘導(dǎo)培養(yǎng)基(6%磷酸氳二鈉、3%磷酸二氬鉀、0.5%氯化鈉、1%氯化銨、0.2%酪蛋白氨基酸、0.5%D-葡萄糖、lmM氯化鎂)中培養(yǎng)GI724Apgi/pLEX-btrC抹至O.D600nm-0.7后，移至2xYT培養(yǎng)基(大腸桿菌用完全培養(yǎng)基、1.6%色氨酸、1%酵母提取物、0.5%氯化鈉)中，在37。C下再培養(yǎng)6小時(shí)后，回收菌體，通過12%SDS聚丙晞酰胺凝膠電泳確認(rèn)BtrC蛋白質(zhì)的表達(dá)。其結(jié)果如圖3A所示?？梢源_認(rèn)通過在2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)，BtrC大量表達(dá)。需要說明的是，圖3A的各條帶如下所示。條帶M:分子量標(biāo)記物(商品名:PrecisionPlusProteinStandard(BIO-RAD社制、目錄序號(hào)161-0374)、以下相同)條帶l:將含有pLEX_btrC的GI724抹在基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨)中培養(yǎng)6小時(shí)所得的菌體的萃取物(用lxSDSLodingBuffer:50mMTris-HC1(pH6,8);2%SDS;0.1%溴酚藍(lán)；10%甘油；lOOmM二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)溶液萃取、以下相同)條帶2:將含有pLEX-btrC的GI724抹在添加色氨酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)所得的菌體的萃取物條帶3:將含有pLEX-btrC的GI724抹在未添加色氨酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)所得到菌體的萃取物條帶4:在米糠培養(yǎng)基(組成20%米糠酶處理液)中培養(yǎng)2小時(shí)所得的菌體的萃取物條帶5:在添加色氨酸的2xYT培養(yǎng)基中在米糠培養(yǎng)基(組成20%米糠酶處理液)中培養(yǎng)6小時(shí)所得的菌體的萃取物使用2xYT培養(yǎng)基時(shí)，即使不添加色氨酸，BtrC也可高度表達(dá)。另外，使用米糠培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體中，BtrC也可高度表達(dá)。上述結(jié)果表明，使用上述表達(dá)體系，不使用昂貴的誘導(dǎo)物，也可以高度表達(dá)DOI合成酶基因。<GI724ApgiAzwfApgm/pGAP-btrC/pGAD-btr沐〉在前培養(yǎng)培養(yǎng)基(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中，在30。C下將GI724ApgiAzwfApgm/pGAP-btrC/pGAD-btrC抹培養(yǎng)一晚。以該前培養(yǎng)液作為主培養(yǎng)培養(yǎng)基，在2xYT培養(yǎng)基(大腸桿菌用完全培養(yǎng)基；1.6%胰胨(triptone)、1%酵母^是取物、0.5%氯化鈉)中按1%進(jìn)行植菌，再于30°〇下培養(yǎng)直至0.0.60011111=0.7后，回收菌體，用12。/。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳確認(rèn)BtrC蛋白質(zhì)的表達(dá)。其結(jié)果如圖3B所示。需要說明的是，圖3B的各條帶如下所示。帶l:分子量標(biāo)記物帶2:主培養(yǎng)O小時(shí)后收集的菌體萃取物帶3:主培養(yǎng)12小時(shí)后收集的菌體萃取物帶4:主培養(yǎng)36小時(shí)后收集的菌體萃取物帶5:主培養(yǎng)72小時(shí)后收集的菌體萃取物根據(jù)圖3B可以確認(rèn)，通過在2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時(shí)，BtrC大量表達(dá)。由此結(jié)果可知，通過使用此表達(dá)體系，不添加昂貴的誘導(dǎo)物，DOI合成酶基因也能高度表達(dá)。(實(shí)施例6)<〈DOI的合成〉〉<使用含有pLEX-btrC的GI724Apgi抹的DOI合成〉將GI724Apgi/pLEX-btrC抹接種至裝入300mL三角燒瓶中的35mL前培養(yǎng)液(RMG培養(yǎng)基、0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中，培養(yǎng)15小時(shí)。然后，在裝入3升2xYT培養(yǎng)基的10升培養(yǎng)槽中以1%的濃度植入菌體。將其在培養(yǎng)溫度30。C、攪拌速度300rpm、空氣10L/分鐘、pH7.7的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，600nm的O.D.為0.7時(shí)以20/0或5%濃度添加D-葡萄糖，再培養(yǎng)48小時(shí)。通過離心從培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間的培養(yǎng)液中除去菌體，回收培養(yǎng)上清液l。<使用含有pLEX-btrC的GI724ApgiAzwf抹的DOI合成>在35mL含有l(wèi)。/。甘露醇的RMG培養(yǎng)基(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氬鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中植入GI724ApgiAzwf/pLEX-btrC抹，進(jìn)行l(wèi)晚的前培養(yǎng)。然后，在3升含有3。/。甘露醇的2xYT培養(yǎng)基(IO升培養(yǎng)槽內(nèi))中以1%的濃度植入菌體，在30。C、攪拌速度300rpm、空氣10L/分鐘、pH7.7的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，600nm的O.D.為0.7時(shí)，以3%的濃度添加葡萄糖，再繼續(xù)培養(yǎng)。通過離心從培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間的培養(yǎng)液中除去菌體，回收培養(yǎng)上清液2。條條條條條<使用含有pLEX-btrC的GI724ApgiAzwfApgm林的DOI合成>向300mL三角燒瓶中的50mL前培養(yǎng)液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中接種含有pLEX-btrC的GI724ApgiAzwfApgm抹，培養(yǎng)15小時(shí)。將該前培養(yǎng)液以l。/。植菌到加入了3L2xYT培養(yǎng)基的IOL培養(yǎng)槽(B.E.MARUBISHI抹式會(huì)社MDL-6C型)中。將其在培養(yǎng)溫度25。C、攪拌速度300rpm、流入空氣10L/分鐘、pH7.0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，OD600nm=0.7時(shí)添加D-葡萄糖使其濃度為5%，再培養(yǎng)72小時(shí)。通過離心從培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間的培養(yǎng)液中除去菌體，回收培養(yǎng)上清液3。<使用含有pGAP—btrC/pGAD—btrC的GI724ApgiAzwfApgm抹的DOI合成〉向300mL三角燒瓶中的50mL的前培養(yǎng)液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化《美)中接種含有pGAP-btrC/pGAD-btrC的GI724ApgiAzwfApgm抹，培養(yǎng)15小時(shí)。將該前培養(yǎng)液以1%的濃度植菌到加入3L的2xYT培養(yǎng)基的10L培養(yǎng)槽中。將其在培養(yǎng)溫度25。C、攪拌速度300rpm、流入空氣10L/分鐘、pH6.0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，OD600nm=0.7時(shí)添加D-葡萄糖使?jié)舛葹?%，再培養(yǎng)72小時(shí)。通過離心從培養(yǎng)，見定時(shí)間的培養(yǎng)液中除去菌體，回收培養(yǎng)上清液4。<使用含有pLEX-btrC的GI724Armf株的DOI合成〉在試驗(yàn)管中向3mL前培養(yǎng)液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中接種含有pLEX-btrC的GI724Armf抹，培養(yǎng)15小時(shí)。將此前培養(yǎng)液以1%的濃度植菌到加入1OmL的2xYT培養(yǎng)基的L型試驗(yàn)管中。將其在培養(yǎng)溫度30。C、振蕩速度160rpm、pH7.0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，OD600nm=0.7時(shí)，添加D-葡萄糖使其濃度為3%，再培養(yǎng)72小時(shí)。通過離心從培養(yǎng)身見定時(shí)間的培養(yǎng)液中除去菌體，回收培養(yǎng)上清液5。(實(shí)施例7)<〈DOI生產(chǎn)量的測(cè)定〉〉〈DOI的將化〉按照以下順序定量培養(yǎng)上清液中蓄積的DOI。對(duì)于培養(yǎng)上清液1及2,在各時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)液，加入與上清液等量的水、上清液的2倍量的曱醇、及終濃度為1.5mg/mL的0-(4-硝基千基)羥基胺(NBHA)，將其混合，在60。C下培育1小時(shí)，由此誘導(dǎo)DOI的肟化。另外，將培養(yǎng)上清液3、4及5混合9倍量的滅菌蒸餾水，再加入與該溶液等量的曱醇后，力口入30mg/mL的o-(4-硝基節(jié)基)羥基胺鹽酸鹽(NBHA),將其混合，在60。C下培育1小時(shí)，由此誘導(dǎo)DOI的月虧體。<001的斗全測(cè)〉如上所述得到的DOI將體在SpeepVacSystem(Thermo社ISSl10)中蒸發(fā)掉溶劑后，將肟化DOI溶解于適量的曱醇，采用HPLC(高效液相色譜)分析法對(duì)其中的一部分進(jìn)行分析，進(jìn)行DOI的檢測(cè)及定量。高效液相色i普為SHIMADZU社LC-10AT、柱使用Phrnomenex社Luna5uC18(柱長(zhǎng)150mm、柱內(nèi)徑4.6mm),溶離液4吏用20%曱醇。測(cè)定262nm下的紫外線吸收。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量DOI的O-(4-硝基節(jié)基)肟衍生物的量。需要說明的是，使用Glucoseassayprocedurekit(Megazyme社制)進(jìn)行葡萄糖定量。如圖4A及4B所示，在HPLC分析中確認(rèn)相當(dāng)于DOI的將體的峰。另外，圖5至7中給出DOI生產(chǎn)量、培養(yǎng)基的濁度、及D-葡萄糖濃度的時(shí)間曲線。(參考例l)<使用含有pLEX-btrC的GI724Apgi抹的DOI合成〉向裝入300mL三角燒瓶的35mL前培養(yǎng)液(RMG培養(yǎng)基0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中接種GI724Apgi/pLEX-btrC加入3升的2xYT培養(yǎng)基的10升培養(yǎng)槽中以1%的濃度植入菌體。將其在培養(yǎng)溫度30。C、攪拌速度300rpm、空氣10L/分鐘、pH7.7的條件下培養(yǎng)，600nm的O.D.為0.7時(shí)添加D-葡萄糖至濃度為2%或5%，再培養(yǎng)24小時(shí)。通過離心從培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間的培養(yǎng)液中除去菌體，回收培養(yǎng)上清液ll。(參考例2)<使用含有pLEX-btrC的GI724ApgiAzwfApgm株的DOI合成>向300mL三角燒瓶中的50mL前培養(yǎng)液(0.6%磷酸氫二鈉、0.3%磷酸二氬鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)中接種含有pLEX-btrC的GI724ApgiAzwfApgm抹，培養(yǎng)15小時(shí)。在加入3L2xYT培養(yǎng)基的10L培養(yǎng)槽(B.E.MARUBISHI抹式會(huì)社MDL-6C型)中以1%濃度植菌此前培養(yǎng)液。將其在培養(yǎng)溫度25。C、攪拌速度300rpm、流入空氣10L/分鐘、pH7.0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，OD600nm-0.7時(shí)，添加D-葡萄糖使其濃度為5%，再培養(yǎng)72小時(shí)。分別回收D-葡萄糖添加前及D-葡萄糖添加后的培養(yǎng)液，將此培養(yǎng)液離心，除去菌體，分別回收培養(yǎng)上清液12及13。(參考例3)<使用含有pLEX-btrC的GI724野生型抹的DOI合成〉在具有3mL前培養(yǎng)液(0.6%磷酸氬二鈉、0.3%磷酸二氫鉀、0.05%氯化鈉、0.1%氯化銨、2%酪蛋白氨基酸、1%甘油、lmM氯化鎂)的試驗(yàn)管中接種含有pLEX-btrC的GI724野生型株，培養(yǎng)15小時(shí)。將此前培養(yǎng)液以1%的濃度植菌到加入1OmL的2xYT培養(yǎng)基的L型試驗(yàn)管中。將其在培養(yǎng)溫度30。C、振蕩速度160rpm、pH7.0的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，OD600nm=0.7時(shí)添加D-葡萄糖使其濃度為3%，再培養(yǎng)72小時(shí)。通過離心從培養(yǎng)規(guī)定時(shí)間的培養(yǎng)液中除去菌體，回收培養(yǎng)上清液14。(參考例4)〈DOI生產(chǎn)量的測(cè)定〉可以按照下述順序?qū)θ缟纤龅玫降呐囵B(yǎng)上清液11至14中蓄積的DOI進(jìn)行定量。對(duì)于培養(yǎng)上清液ll,加入與此上清液等量的水、上清液的2倍量的甲醇、及終濃度1.5mg/mL的O-(4-硝基節(jié)基)羥基胺(NBHA)，將其混合，在60。C下培育1小時(shí)，由此誘導(dǎo)DOI的肝化。針對(duì)培養(yǎng)上清液12、13及14,混合相對(duì)于上清液為9倍量的滅菌蒸餾水，再加入與此溶液等量的甲醇后，加入30mg/mL的o-(4-硝基千基)羥基胺鹽酸鹽(NBHA)混合，在60。C下培育1小時(shí)，由此誘導(dǎo)DOI的將體。用SpeepVacSystem(Thermo社ISSl10)使來自上述衍生化的培養(yǎng)上清液11至14的液體蒸發(fā)掉溶劑后，將肟化DOI溶解于適量的曱醇，用HPLC(高效液相色譜)分析法對(duì)其中的一部分進(jìn)行分析，進(jìn)行DOI的檢測(cè)及定量。高效液相色語為SHIMADZU社LC-9A、柱使用Phrnomenex一土Luna5uC18(片主長(zhǎng)150mm、4主內(nèi)^圣4.6mm),;容離'液4吏用20%曱醇。測(cè)定262nm下的紫外線吸收。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量DOI的O—(4-硝基節(jié)基)將衍生物的量。(實(shí)施例8)<使用AmberliteIR120和AmberliteIRA410混合柱的方法〉將氫離子型的AmbediteIR120和乙酸離子型的AmberliteIRA410各200mL混合后，充填到柱(cp5cmx25cm)中，將柱調(diào)至pH2.96,添力口100mL參考例l的培養(yǎng)液(含有1.4g的D01)后，通過以2mL/分鐘的流速流入蒸餾水進(jìn)行溶離。以每餾分6mL進(jìn)行收集，每隔l瓶對(duì)所得餾分測(cè)定pH及傳導(dǎo)度。另外，每隔3瓶進(jìn)行DOI的定量。DOI的定量在衍生成0-(4-硝基千基)肟后，用HPLC測(cè)定面積，之后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。此時(shí)的結(jié)果如圖10所示。另外，將餾分分4段收集，凍結(jié)干燥后，測(cè)定各段中DOI的純度及量。結(jié)果如表2所示。所得的精制DOI的13〔-NMR色譜如圖ll所示。13C-NMR色譜使用Bruker社的DPX-250NMR裝置("C核在67.5MHz共振)，測(cè)定溶解于重水的試沖羊。(實(shí)施例9)<使用AmberliteIR200和AmberliteIRA410的混合柱的方法〉將氫離子型的AmberliteIR200和乙酸離子型的AmberliteIRA410各200mL混合后，充填到柱(cp5cmx25cm)中。向其中加入pH調(diào)至2.97的50mL參考例l的培養(yǎng)液(含有562mg的D01)后，通過以2mL/分鐘的流速流入蒸餾水進(jìn)行溶離。以每餾分6mL進(jìn)行收集，每隔l瓶對(duì)所得餾分測(cè)定pH及傳導(dǎo)度。另外，每隔3瓶進(jìn)行DOI的定量。此時(shí)的結(jié)果如圖12所示。另外，將餾分分為4段進(jìn)行收集，凍結(jié)干燥后，測(cè)定各段中DOI的純度及量。結(jié)果如表3所示。所得的精制D0I的130NMR色語如圖13所示。DOI的定量方法及"C-NMR色譜的測(cè)定方法與實(shí)施例8相同。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>(實(shí)施例1O)<使用Amberlite200CT和AmberlitelRA96SB的雙柱的方法〉在陽離子交換樹脂柱(Amberlite200CT、氫離子型、400mL)中負(fù)荷含有DOI的培養(yǎng)液(DOI含量22.1g/850mL),用水使其洗脫。將通過洗脫液的TLC分析確認(rèn)含有DOI的餾分通入陰離子交換樹脂柱(AmberlitelRA96SB、乙酸離子型、600mL)，接下來用水使其洗脫。將通過洗脫液的TLC分析確認(rèn)含有DOI的餾分減壓濃縮，得到20.8g圖15的1H-NMR所示純度的DOI。其純度與通過混合柱進(jìn)行精制法時(shí)程度幾乎相同。力-NMR使用Bruker社的DPX-250NMR裝置，測(cè)定溶解于重水的試樣。(實(shí)施例ll)〈轉(zhuǎn)化為二甲基縮酮衍生物，進(jìn)行了結(jié)晶化.精制后，變回為2-脫氧-青蟹肌糖的方法〉將實(shí)施例IO的精制DOI(17.8g)溶解于甲醇(835mL)中，加入三曱氧基曱烷(310mL)、曱苯磺酸一水合物(2.12g)攪拌3小時(shí)后，用碳酸氫鈉(30.6g)中和反應(yīng)液，過濾后進(jìn)行減壓濃縮。將殘?jiān)芙庥诩状贾?，加入?倍量的硅膠(C-200、60g),通過減壓濃縮，使DOI吸附在硅膠表面上。將吸附此DOI的硅膠填充到用乙酸乙酯曱醇=5:l平衡的硅膠柱中。之后，使用乙酸乙酯曱醇=5:l的混合溶劑使DOI洗脫。收集含有DOI的洗脫液，減壓濃縮，得到二曱基縮酮衍生物(20.7g)。接下來，在加入25mL曱醇溶解得到的溶液中，邊加熱邊加入100mL氯仿和7.5mL己烷，冷卻，分離析出的白色結(jié)晶，得到9.1g2-脫氧-青蟹肌糖二甲基縮酮結(jié)晶。在圖16所示的^-NMR中，未檢測(cè)到雜質(zhì)的信號(hào)。將二甲基縮酮體的結(jié)晶(995mg)溶解于丙酮(22mL)中，加入曱苯磺酸一水合物(280mg)和蒸餾水(6mL),攪拌5小時(shí)。通過TLC確認(rèn)原料消失后，減壓濃縮。將溶解于水的殘?jiān)ㄟ^陰離子交換樹脂柱(IRA96SB、乙酸離子型、10mL),濃縮所含餾分，由此可以定量地得到高度精制的DOI(770mg)。圖17所示的111-NMR中，未檢測(cè)到雜質(zhì)的信號(hào)。本發(fā)明中使用的保藏微生物的說明如下所示。EscherichiacoliGI724ApgiAzwfApgm/pGAP-btrC/pGAD—btrCFERMAP-208091.保藏機(jī)構(gòu)名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心2.保藏日平成18年2月24日(2006年2月24日)3.保藏編號(hào)FERMAP-20809EscherichiacoliGI724ArmfApgi/pLEX-btrCFERMAP_208081.保藏機(jī)構(gòu)名稱獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心2.保藏日平成18年2月24日(2006年2月24日)3.保藏編號(hào)FERMAP-20808產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，使用來自可再生資源的如淀粉等生物質(zhì)的原料，代替現(xiàn)有的來自石油的化學(xué)物質(zhì)，通過發(fā)酵，可以制造高純度DOI，該DOI為用于制造各種六元碳環(huán)化合物的起始原料。以上通過本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案說明了本發(fā)明。雖然此處給出特定的具體例說明本發(fā)明，但只要不超出權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的廣泛的宗旨及范圍，上述具體例中可以加入各種修改及變更。即，不能理解為本發(fā)明限定于具體例的詳細(xì)說明及附圖。權(quán)利要求1、一種基因表達(dá)盒，其特征在于，由參與2-脫氧-青蟹肌糖的合成的基因構(gòu)成。2、如權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)盒，其特征在于，所述參與2-脫氧-青蟹肌糖的合成的基因?yàn)?-脫氧-青蟹肌糖合成酶。3、一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于，該轉(zhuǎn)化體通過將權(quán)利要求1或2所述的基因表達(dá)盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞而形成。4、如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是選自大腸桿菌種、及GILSP基因重組微生物表中記載的宿主細(xì)胞(平成18年3月7>告的表中記載的細(xì)胞)中的宿主細(xì)胞。5、如權(quán)利要求3或4所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是基因被破壞的宿主細(xì)胞，所述基因?yàn)檫x自編碼磷酸葡糖異構(gòu)酶的pgi基因、編碼葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的zwf基因、編碼磷酸葡糖變位酶的pgm基因、及編碼負(fù)責(zé)處于穩(wěn)定期的蛋白質(zhì)合成的修飾的核糖體修飾因子蛋白質(zhì)的rmf基因中的至少一種。6、一種2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法，其特征在于，該方法具有使權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體和碳源接觸的工序。7、如權(quán)利要求6所述的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法，其特征在于，所述碳源為選自D-葡萄糖、寡糖、多糖、淀粉、纖維素、米糠及廢糖蜜以及可以得到D-葡萄糖的生物質(zhì)中的至少一種碳源。8、一種2-脫氧-青蟹肌糖，其特征在于，是通過權(quán)利要求6或7中所述的2-脫氧-青蟹肌糖的制備方法而獲得的。9、一種2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法，其特征在于，所述精制方法包含以下工序，使權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體和碳源接觸，得到含有2-脫氧-青蟹力幾糖的組合物的工序；和用具有氫離子型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂和有機(jī)酸離子型堿性陰離子交換樹脂的混合柱或雙柱處理所述組合物的工序。10、如權(quán)利要求9所述的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法，其特征在于，所述有機(jī)酸離子型堿性陰離子交換樹脂是乙酸離子型陰離子交換樹脂。11、一種2-脫氧-青蟹肌糖，其特征在于，是通過權(quán)利要求9或IO所述的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法而獲得的。12、一種2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法，其特征在于，所述精制方法包含以下工序，使權(quán)利要求11所述的2-脫氧-青蟹肌糖和三烷氧基曱烷反應(yīng)，得到2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序；和在酸存在下水解所述2-脫氧-青蟹肌糖二烷基縮酮的工序。13、如權(quán)利要求12所述的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法，其特征在于，所述三烷氧基曱烷是三曱氧基曱烷。14、一種2-脫氧-青蟹肌糖，其特征在于，是通過權(quán)利要求12或13所述的2-脫氧-青蟹肌糖的精制方法而獲得的。全文摘要在作為宿主細(xì)胞的大腸桿菌中導(dǎo)入至少一種由參與2-脫氧-青蟹肌糖合成的基因構(gòu)成的基因表達(dá)盒，配制轉(zhuǎn)化體，使用此轉(zhuǎn)化體，由D-葡萄糖、寡糖、多糖、淀粉或米糠合成2-脫氧-青蟹肌糖。將含有此2-脫氧-青蟹肌糖的培養(yǎng)液，用由氫離子型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂和有機(jī)酸離子型堿性陰離子交換樹脂構(gòu)成的混合柱或雙柱進(jìn)行處理。使該被精制的2-脫氧-青蟹肌糖與三甲氧基甲烷反應(yīng)，變?yōu)?-脫氧-青蟹肌糖二甲基縮酮，結(jié)晶化·精制后，在酸存在下水解，高度精制。文檔編號(hào)C12N15/00GK101151368SQ20068001077公開日2008年3月26日申請(qǐng)日期2006年3月23日優(yōu)先權(quán)日2005年3月30日發(fā)明者宮崎達(dá)雄,小暮高久,平山匡男,肋坂直樹,高久洋曉,高木正道,鲹坂勝美申請(qǐng)人:新潟生物研究園株式會(huì)社