本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及惡性胸水來源的TIL細(xì)胞(腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞)的分離培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)是存在于腫瘤組織、腫瘤引流淋巴結(jié)、癌性胸胸水中的淋巴細(xì)胞，相比于外周血淋巴細(xì)胞，TIL細(xì)胞中含有較高比例的活化的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，這一類淋巴細(xì)胞經(jīng)過體外分離、擴(kuò)增、活化后，對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性提高，可用于腫瘤的過繼細(xì)胞免疫治療。

使用這種技術(shù)已經(jīng)取得了良好的臨床效果。Rosenberg等采用全身放療+化療+TIL細(xì)胞治療惡性黑色素瘤，總有效率達(dá)到了72％(Rosenberg SA1,Dudley ME.Adoptive Cell Therapy for the Treatment of Patients with Metastatic Melanoma.Curr Opin Immunol.2009Apr；21(2):233–240.)；Li J等采用化放療+TIL細(xì)胞治療鼻咽癌，20人中有19人有客觀的抗腫瘤反應(yīng)(Li J1,Chen QY2,He J1,Li ZL1,Tang XF1,Chen SP1,Xie CM3,Li YQ1,Huang LX1,Ye SB1,Ke M1,Tang LQ2,Liu H2,Zhang L2,Guo SS2,Xia JC1,Zhang XS1,Zheng LM1,Guo X2,Qian CN2,Mai HQ2,Zeng YX4.Phase I trial of adoptively transferred tumor-infiltrating lymphocyte immunotherapy following concurrent chemoradiotherapy in patients with locoregionally advanced nasopharyngeal carcinoma.Oncoimmunology.2015 Mar 6；4(2):e976507.eCollection 2015.)；Khammari A等用TIL細(xì)胞結(jié)合瘤內(nèi)注射表達(dá)IFN-r的腺病毒治療惡心黑色素瘤，取得了46％的疾病控制率(Khammari A1,Nguyen JM,Saint-Jean M,Knol AC,Pandolfino MC,Quereux G,Brocard A,Peuvrel L,Saiagh S,Bataille V,Limacher JM,Dreno B.Adoptive T cell therapy combined with intralesional administrations of TG1042(adenovirus expressing interferon-γ)in metastatic melanoma patients.Cancer Immunol Immunother.2015 Apr 7.)。

目前臨床應(yīng)用的TIL細(xì)胞的來源主要有兩個方面：1.手術(shù)切除的腫瘤組織或淋巴結(jié)；2.癌性胸胸水。從手術(shù)樣品中分離TIL細(xì)胞一般需要經(jīng)過機(jī)械剪切，多種蛋白酶的酶解等多個步驟；癌性胸胸水來源的TIL細(xì)胞分離的方法相對簡單，也容易在體外培養(yǎng)。

由于TIL細(xì)胞是一種異質(zhì)性的細(xì)胞群，包含T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等，其中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要是活化的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，因此TIL細(xì)胞治療的關(guān)鍵技術(shù)是如何從TIL中篩選出活化的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

傳統(tǒng)的TIL細(xì)胞分離和培養(yǎng)步驟復(fù)雜，整個操作時間將近2個月，其中分離和鑒定腫瘤特異性TIL細(xì)胞的過程最復(fù)雜、耗時最長。首先需要將腫瘤組織制作成小塊組織或單細(xì)胞懸液，分成很多小份然后用大劑量IL-2培養(yǎng)，培養(yǎng)4-6個星期后，每份取少量細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，通過測試共培養(yǎng)后的上清中IFN-r的含量確定哪一份里面有腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞。然后取這些孔內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行快速擴(kuò)增培養(yǎng)。這種操作方法步驟復(fù)雜，時間長，而且分離過程易受操作者主觀因素的影響，不同的操作者操作的結(jié)果差別很大。長時間的操作過程容易導(dǎo)致污染，且細(xì)胞活力降低。因此很大程度地影響了TIL細(xì)胞臨床應(yīng)用的效果。

因此TIL治療的兩大關(guān)鍵的技術(shù)，一是要從惡性胸水中找到腫瘤抗原特異性的T淋巴細(xì)胞，并把它分離出來；二是要把這些珍貴的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增。要把具有腫瘤特異性殺傷活性的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞從腫瘤組織中分離出來，需要用到一個可以區(qū)分腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的表面標(biāo)記。腫瘤組織中的腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞是一種已經(jīng)活化了的T淋巴細(xì)胞，PD-1、LAG-3和TIM-3都是T細(xì)胞活化后誘導(dǎo)表達(dá)的抑制性受體，與其配體結(jié)合后抑制T細(xì)胞的活化和功能。TIL細(xì)胞中具有腫瘤特異性殺傷活性的T淋巴細(xì)胞就存在于這一群已經(jīng)活化了的T淋巴細(xì)胞中(Alena Gros etc.PD-1identifies the patient-specific CD8⁺tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.The Journal of Clinical Investigation.Volume 124Number 5May 2014)。因此PD-1、LAG-3和TIM-3都可以作為分離TIL細(xì)胞中腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的標(biāo)記。

免疫磁珠(Immunomagnetic bead,IMB)技術(shù)是一種免疫學(xué)技術(shù)，IMB為包被有抗體的球型磁性微粒，可特異性地與靶物質(zhì)結(jié)合使之具有磁響應(yīng)性。IMB技術(shù)的優(yōu)勢在于可以保證被分離靶細(xì)胞的形態(tài)和功能完整，同時還具有靈敏度高、特異性高、檢測速度快、重復(fù)性好、操作簡單和不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。用IMB技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分離由兩種方式，一種是直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞的方法稱為陽性分離；用IMB去除無關(guān)細(xì)胞使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為陰性分離。因此利用免疫磁珠將具有腫瘤特異性殺傷活性的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞從TIL細(xì)胞群中直接分離出來。

目前未有文獻(xiàn)報(bào)道利用PD-1、LAG-3和TIM-3中的至少一種作為分離TIL細(xì)胞中腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的標(biāo)記，并結(jié)合免疫磁珠技術(shù)將腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞從TIL細(xì)胞群中分離出來，再經(jīng)過體外高效擴(kuò)增獲得腫瘤特異性TIL細(xì)胞的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)分離培養(yǎng)TIL細(xì)胞操作復(fù)雜、耗時、長時間的操作過程容易導(dǎo)致污染、細(xì)胞活力降低的不足，提供了一種TIL細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，該方法將具有腫瘤特異性殺傷活性的腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞從TIL細(xì)胞群中分離出來并進(jìn)行大量擴(kuò)增培養(yǎng)，操作流程更簡單，花費(fèi)時間明顯縮短，便于推廣使用，分離得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞殺傷活性更強(qiáng)。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：步驟一，單細(xì)胞懸液的制備，即從惡性胸水中獲取含有腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸液；步驟二：使用免疫磁珠技術(shù)將所述單細(xì)胞懸液進(jìn)行分離，即將腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞從腫瘤細(xì)胞、腫瘤非特異性T淋巴細(xì)胞、抑制性T淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等混合體中分離出來，得到腫瘤特異性TIL細(xì)胞；步驟三：腫瘤特異性TIL細(xì)胞的快速擴(kuò)增，即將所述腫瘤特異性TIL細(xì)胞在高效擴(kuò)增培養(yǎng)體系中進(jìn)行高效擴(kuò)增培養(yǎng)，得到大量的具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞活性的腫瘤特異性TIL細(xì)胞。

優(yōu)選的，步驟一中，所述單細(xì)胞懸液的制備，具體包括如下步驟：

惡性胸水用D-Hanks平衡鹽溶液洗滌，用Ficoll密度梯度法分離單個核細(xì)胞，得到腫瘤組織單細(xì)胞懸液。

優(yōu)選的，步驟二中，所述使用免疫磁珠技術(shù)將所述單細(xì)胞懸液進(jìn)行分離，具體包括如下步驟：

2.1往步驟一所得腫瘤組織單細(xì)胞懸液中按每1×10⁸個細(xì)胞加入0.4ml PBS緩沖溶液、10-500ul生物素標(biāo)記或熒光染料標(biāo)記(包括Cy5/Anti-Alexa Fluor 647、Cy7、FITC、PE、APC等標(biāo)記)或未標(biāo)記的PD-1、LAG-3、TIM-3的抗體溶液中的至少一種、10-500ul Fc受體阻斷劑、與抗體標(biāo)記相對應(yīng)的20-1000ul抗生物素磁珠或抗熒光染料磁珠(包括Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 MicroBeads、Anti-Cy7MicroBeads、Anti-FITC MicroBeads、Anti-PE MicroBeads、Anti-APC MicroBeads)或抗Ig磁珠，混勻，重懸得細(xì)胞懸液。

2.2將所述細(xì)胞懸液加入到細(xì)胞分選柱中，利用磁性分離器收集腫瘤特異性TIL細(xì)胞。

優(yōu)選的，步驟三中，所述腫瘤特異性TIL細(xì)胞的快速擴(kuò)增，具體包括如下步驟：

1.將步驟二得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞與下列試劑和因子混合培養(yǎng)：CM和AIM-V混合培養(yǎng)基，異體輻射致死(50Gy)的PBMC，OKT3抗體。

2.第2天加入IL-2 100-10000IU/ml。

3.根據(jù)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行擴(kuò)瓶(袋)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含IL-2的CM和AIM-V混合培養(yǎng)基。

4.擴(kuò)增培養(yǎng)到第7-30天，得到最終的大量的腫瘤特異性TIL細(xì)胞。

優(yōu)選的，步驟三中，所述CM和AIM-V混合培養(yǎng)基為CM培養(yǎng)基、AIM-V培養(yǎng)基按照1:1的比例混合而成。

優(yōu)選的，步驟三中，所述異體輻射致死(50Gy)的PBMC與所述腫瘤特異性TIL細(xì)胞的比值為10:1-1000:1。

優(yōu)選的，步驟三中，所述OKT3抗體，按每1.0ml培養(yǎng)基加入0.01-0.1ug OKT3抗體的比例。

使用本發(fā)明涉及的分離培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)的腫瘤特異性TIL細(xì)胞用于腫瘤的治療或預(yù)防。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1.本發(fā)明TIL細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法更簡單，細(xì)胞培養(yǎng)周期明顯縮短，大大降低培養(yǎng)成本；

2.本發(fā)明利用免疫磁珠技術(shù)分離腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，相比現(xiàn)有技術(shù)使分離時間由4-5個星期縮短到1天，而且操作流程更簡單，便于推廣使用。

3.本發(fā)明利用活化的T細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體將腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞從復(fù)雜的細(xì)胞群中分離出來，增加了分離的針對性，使最終培養(yǎng)得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞的腫瘤殺傷活性更強(qiáng)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1與對比例1得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；

圖2為實(shí)施例2與對比例2得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；

圖3為實(shí)施例3與對比例3得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；

圖4為實(shí)施例4與對比例4得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；

圖5為實(shí)施例5、6得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明并不限于這些具體實(shí)施方式。

實(shí)施例1

現(xiàn)取一肝癌患者(女，48歲)惡性胸水為制備腫瘤特異性TIL細(xì)胞的材料，腫瘤特異性TIL細(xì)胞分離培養(yǎng)過程如下:

步驟1：單細(xì)胞懸液的制備。

1.2胸水用D-Hanks溶液洗2次，沉淀細(xì)胞加入適量PBS緩沖溶液(含0.5％BSA，2mmol EDTA，PH 7.2)用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用PBS緩沖溶液重懸，得到最終的腫瘤組織單細(xì)胞懸液。

步驟2：用免疫磁珠技術(shù)分離得到腫瘤特異性TIL細(xì)胞。

2.1調(diào)整步驟1最終所得的細(xì)胞濃度為每1.0ml緩沖溶液2.5×10⁸個細(xì)胞。

2.2加入100ul Fc受體阻斷劑(Miltenyi Biotec，貨號130-059-901)，混勻，2-8攝氏度冰箱放置10分鐘。

2.3加入10-20ml PBS緩沖溶液300xg離心10分鐘，去除上清。

2.4加入0.4ml PBS緩沖溶液、100ul CD279(PD1)-Biotin溶液(Miltenyi Biotec，貨號130-096-162),混勻，2-8攝氏度冰箱放置10分鐘。

2.5加入10-20ml PBS緩沖溶液300xg離心10分鐘，去除上清。

2.6加入0.8ml PBS緩沖溶液、200ul抗生物素磁珠(Miltenyi Biotec，貨號130-090-485)，混勻，2-8攝氏度冰箱放置15分鐘。

2.7加入10-20ml PBS緩沖溶液300xg離心10分鐘，去除上清，加入1ml緩沖溶液重懸得到細(xì)胞懸液。

2.8將LD柱放在MACS磁性分離器中，用2ml PBS緩沖溶液潤洗一次。

2.9加入步驟2.5所得細(xì)胞懸液到LD柱中，收集通過LD柱未標(biāo)記的細(xì)胞到A管中，再用PBS緩沖溶液洗2次(每次使用1ml PBS緩沖溶液)，洗液也收集到A管中，得到未標(biāo)記的細(xì)胞。

2.10將LD柱從磁性分離器中取出，加入2ml緩沖液用推桿將標(biāo)記的細(xì)胞洗出來，用B管收集，得到腫瘤特異性TIL細(xì)胞。

步驟3：腫瘤特異性TIL細(xì)胞的快速擴(kuò)增。

3.1將步驟2得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞按每1×10⁶細(xì)胞與下列試劑和因子混合培養(yǎng)：CM培養(yǎng)基(在RPMI1640培養(yǎng)基中加入25mmol/L HEPES PH 7.2，100IU/mL盤尼西林(penicillin)，100ug/mL鏈霉素(streptomycin)，2mmol/L谷氨酰胺(L-glutamine)，5.5×10^-5mol/Lβ-巰基乙醇(β-mercaptoethanol),10％人AB血清)75ml，2×10⁸個異體輻射致死(50Gy)的PBMC，4.5ug OKT3抗體，75ml AIM-V培養(yǎng)基。

3.2第2天加入IL-2至6000IU/ml。

3.3第5天，去除120ml上清，再加入120ml含6000IU/ml IL-2的50％CM和50％AIM-V的混合培養(yǎng)基。

3.4第6天根據(jù)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行擴(kuò)瓶(袋)培養(yǎng)，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁶/ml，培養(yǎng)基為6000IU/ml IL-2的50％CM和50％AIM-V的混合培養(yǎng)基。

3.5擴(kuò)增培養(yǎng)到第14天，得到最終的大量的腫瘤特異性TIL細(xì)胞。

實(shí)施例2

現(xiàn)取一結(jié)直腸癌患者(男，53歲)惡性胸水為制備腫瘤特異性TIL細(xì)胞的材料，腫瘤特異性TIL細(xì)胞分離培養(yǎng)過程如下:

步驟1和步驟3同實(shí)施例1的；

步驟2的操作過程同實(shí)施例1的，步驟2.4中加入的抗體不一樣，為Anti-TIM-3-APC(Miltenyi Biotec，貨號130-098-936)；步驟2.6中加入的磁珠不一樣，為抗APC磁珠(Miltenyi Biotec，貨號130-090-855)。

實(shí)施例3

取一結(jié)直腸癌患者(女，58歲)惡性胸水為制備腫瘤特異性TIL細(xì)胞的材料，腫瘤特異性TIL細(xì)胞分離培養(yǎng)過程如下:

步驟1和步驟3同實(shí)施例1的；

步驟2的操作過程同實(shí)施例1的，不同之處有：步驟2.4中加入的抗體不一樣，為鼠抗人LAG-3抗體(R&D SYSTEMS，貨號：MAB23193，IgG1)；步驟2.6中加入的磁珠不一樣，為抗鼠IgG1磁珠(Miltenyi Biotec，貨號130-047-101)

實(shí)施例4

取一肝癌患者(男，58歲)的癌性胸水為制備腫瘤特異性TIL細(xì)胞的材料，腫瘤特異性TIL細(xì)胞分離培養(yǎng)過程如下:

步驟1：腫瘤組織單細(xì)胞懸液的制備

癌性胸水1000ml，1500轉(zhuǎn)離心10分鐘得到細(xì)胞沉淀，沉淀細(xì)胞加入適量PBS緩沖溶液(含0.5％BSA，2mmol EDTA，PH 7.2)用Ficoll分離單個核細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用PBS緩沖溶液重懸，得到最終的腫瘤組織單細(xì)胞懸液。

步驟2和3同實(shí)施例1的。

實(shí)施例5、6

取一肝癌患者(女，68歲)惡性胸水為實(shí)施例5、6制備腫瘤特異性TIL細(xì)胞的材料，腫瘤特異性TIL細(xì)胞分離培養(yǎng)過程如下:

步驟1～3的操作過程同實(shí)施例1的，不同之處在于：

(1)步驟1.1中加入膠原酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶的數(shù)量不同:

實(shí)施例5：0.2mg/ml膠原酶、0.01mg/ml透明質(zhì)酸酶、0.01mg/ml DNA酶；

實(shí)施例6：20mg/ml膠原酶、10mg/ml透明質(zhì)酸酶、10mg/ml DNA酶。

(2)步驟2中加入抗體溶液、Fc受體阻斷劑、抗生物素磁珠的數(shù)量不同:

實(shí)施例5：10ul抗體溶液、10ul Fc受體阻斷劑、20ul抗生物素磁珠；

實(shí)施例6：500ul抗體溶液、500ul Fc受體阻斷劑、1000ul抗生物素磁珠。

(3)步驟3中加入IL-2、異體輻射致死(50Gy)的PBMC、OKT3抗體的數(shù)量不同:

實(shí)施例5：IL-2 100IU/ml、異體輻射致死(50Gy)的PBMC 1.0×10⁷個、OKT3抗體1.5ug；

實(shí)施例6：IL-2 10000IU/ml、異體輻射致死(50Gy)的PBMC 1.0×10⁹個、OKT3抗體15ug。

(4)步驟3中細(xì)胞培養(yǎng)的天數(shù)不同：

實(shí)施例5：擴(kuò)增培養(yǎng)到第7天，得到最終的大量的腫瘤特異性TIL細(xì)胞；

實(shí)施例6：擴(kuò)增培養(yǎng)到第30天，得到最終的大量的腫瘤特異性TIL細(xì)胞。

對比例1～4

對比例1取實(shí)施例1步驟1制備的腫瘤組織單細(xì)胞懸液為制備TIL細(xì)胞的初始材料；

對比例2取實(shí)施例2步驟1制備的腫瘤組織單細(xì)胞懸液為制備TIL細(xì)胞的初始材料；

對比例3取實(shí)施例3步驟1制備的腫瘤組織單細(xì)胞懸液為制備TIL細(xì)胞的初始材料；

對比例4取實(shí)施例4步驟1制備的腫瘤組織單細(xì)胞懸液為制備TIL細(xì)胞的初始材料。

對比例1～4的TIL細(xì)胞分離培養(yǎng)過程完全相同，如下:

步驟1：制備自體腫瘤細(xì)胞株

將細(xì)胞懸液用CM培養(yǎng)基重懸，加入到2級密度梯度分離液上(下層是100％Ficoll，中間層是75％Ficoll和25％CM培養(yǎng)液的混合液)，2000轉(zhuǎn)離心20分鐘，收集上層和中間層之間的細(xì)胞得到富集了的腫瘤細(xì)胞。用含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁵個/ml，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

步驟2：TIL細(xì)胞的初始擴(kuò)增

單細(xì)胞懸液用CM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁵個/ml，加入6000IU/ml IL-2，接種在24孔板中，每孔接種2ml，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

無論孔內(nèi)淋巴細(xì)胞生長如何，不超過一周要進(jìn)行一次半量換液。當(dāng)任何一個孔內(nèi)的淋巴細(xì)胞長滿時，將所有孔內(nèi)的細(xì)胞混勻，均分為2份，補(bǔ)加含6000IU/ml IL-2的CM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后，每周進(jìn)行2次半量換液?；蛘邔⒓?xì)胞濃度調(diào)整為0.8～1.6×10⁶個/ml。此過程需要4-5個星期。

步驟3：IFN-r釋放實(shí)驗(yàn)

3.1取步驟3得到的TIL細(xì)胞和步驟2得到的自體腫瘤細(xì)胞以1:1的比例一起加入到一個96孔板孔中，加入200ul含10％FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，共培養(yǎng)12小時。

3.2每孔取上清100ul用于ELISA方法檢測IFN-r濃度(BD，貨號：550612)，腫瘤殺傷性TIL細(xì)胞定義為上述IFN-r濃度>200pg/ml，從而篩選出腫瘤殺傷性TIL細(xì)胞。

步驟4：TIL細(xì)胞的擴(kuò)增。

4.1將步驟4篩選出的腫瘤殺傷性TIL細(xì)胞按每1×10⁶細(xì)胞與下列試劑和因子混合培養(yǎng)：CM培養(yǎng)基75ml，2×10⁸異體輻射致死(50Gy)的PBMC，4.5ug OKT3抗體，75ml AIM-V培養(yǎng)基。

4.2第2天加入IL-2至6000IU/ml。

4.3第5天，去除120ml上清，再加入120ml含6000IU/ml IL-2的50％CM和50％AIM-V的混合培養(yǎng)基。

4.4第6天根據(jù)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行擴(kuò)瓶(袋)培養(yǎng)，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10⁶/ml，培養(yǎng)基為6000IU/ml IL-2的50％CM和50％AIM-V的混合培養(yǎng)基。

4.5擴(kuò)增培養(yǎng)至第14天，得到最終的TIL細(xì)胞。

殺瘤實(shí)驗(yàn)

步驟一：制備自體腫瘤細(xì)胞株

將實(shí)施例5、6步驟一所得細(xì)胞懸液用CM培養(yǎng)基重懸，加入到2級密度梯度分離液上(下層是100％Ficoll，中間層是75％Ficoll和25％CM培養(yǎng)液的混合液)，2000轉(zhuǎn)離心20分鐘，收集上層和中間層之間的細(xì)胞得到富集了的腫瘤細(xì)胞。用含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁵個/ml，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

步驟二：

分別將上述實(shí)施例1～6中最終得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞和對比例1～4中最終的到的TIL細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別以對比例1～4步驟2得到的自體腫瘤細(xì)胞和以上步驟一制備的自體腫瘤細(xì)胞株為靶細(xì)胞。

1.取效應(yīng)細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基洗2次，用含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基配成1×10⁶/ml細(xì)胞懸液。

2.取靶細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基洗一次，配成1×10⁵/ml細(xì)胞懸液。

3.按效靶比10:1接種到96孔板內(nèi)，同時設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞孔和靶細(xì)胞孔，按每種培養(yǎng)基3個復(fù)孔，37度5％CO2培養(yǎng)4小時。

4.用MTT法測吸光度值，計(jì)算殺瘤率。

殺瘤率％＝1-(試驗(yàn)孔-效應(yīng)細(xì)胞孔)/靶細(xì)胞孔。

結(jié)果：

實(shí)施例1與對比例1得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖1；

實(shí)施例2與對比例2得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖2；

實(shí)施例3與對比例3得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖3；

實(shí)施例4與對比例4得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖4；

實(shí)施例5、6得到的TIL細(xì)胞殺瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見圖5；

結(jié)論：

從實(shí)施例1～4和對比例1～4可以看出，相比于對比例1～4用到的方法，采用本發(fā)明的方法分離腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞時間由4-5周縮短到1天，降低成本，而且操作流程更簡單，便于推廣使用。

從圖1可以看出，實(shí)施例1得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞的腫瘤殺傷活性高于對比例1得到的TIL細(xì)胞；

從圖2可以看出，實(shí)施例2得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞的腫瘤殺傷活性高于對比例2得到的TIL細(xì)胞；

從圖3可以看出，實(shí)施例3得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞的腫瘤殺傷活性高于對比例3得到的TIL細(xì)胞；

從圖4可以看出，實(shí)施例4得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞的腫瘤殺傷活性高于對比例4得到的TIL細(xì)胞；

因此，本發(fā)明利用活化的T細(xì)胞表達(dá)的抑制性受體將腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞從復(fù)雜的細(xì)胞群中分離出來，增加了分離的針對性，使最終培養(yǎng)得到的腫瘤特異性TIL細(xì)胞的腫瘤殺傷活性更強(qiáng)。

應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個實(shí)施方式僅包含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實(shí)施方式中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。

上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實(shí)施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。