1.腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,包括下述步驟:
步驟一,腫瘤組織單細胞懸液的制備,即從惡性胸水中獲取含有腫瘤特異性T淋巴細胞的單細胞懸液;
步驟二:使用免疫磁珠技術將所述單細胞懸液進行分離,得到腫瘤特異性TIL細胞;
步驟三:腫瘤特異性TIL細胞的快速擴增,即將所述腫瘤特異性TIL細胞在高效擴增培養(yǎng)體系中進行高效擴增培養(yǎng),得到大量的具有特異性殺傷腫瘤細胞活性的腫瘤特異性TIL細胞。
2.如權利要求1所述的腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟一中,所述腫瘤組織單細胞懸液的制備,具體包括如下步驟:
惡性胸水用D-Hanks平衡鹽溶液洗滌,用Ficoll密度梯度法分離單個核細胞,得到腫瘤組織單細胞懸液。
3.如權利要求1所述的腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟二中,所述使用免疫磁珠技術將所述單細胞懸液進行分離,具體包括如下步驟:
(c)往步驟一所得腫瘤組織單細胞懸液中加入PBS緩沖溶液、抗體溶液、Fc受體阻斷劑、磁珠,混勻,重懸得細胞懸液。
(d)將所述細胞懸液加入到細胞分選柱中,利用磁性分離器收集腫瘤特異性TIL細胞。
4.如權利要求1所述的腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟三中,所述腫瘤特異性TIL細胞的快速擴增,具體包括如下步驟:
(e)將步驟二得到的腫瘤特異性TIL細胞與下列試劑和因子混合培養(yǎng):CM和AIM-V混合培養(yǎng)基,異體輻射致死(50Gy)的PBMC,OKT3抗體。
(f)第2天加入IL-2;
(g)根據(jù)細胞數(shù)進行擴瓶(袋)培養(yǎng),培養(yǎng)基為含IL-2的CM和AIM-V混合培養(yǎng)基;
(h)擴增培養(yǎng)到第7-30天,得到最終的大量的腫瘤特異性TIL細胞。
5.如權利要求2所述的腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,所述含膠原酶、透明質酸酶、DNA酶的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基,膠原酶的濃度為0.2-20mg/ml,透明質酸酶的濃度為0.01-10mg/ml,DNA酶的濃度為0.01-10mg/ml。
6.如權利要求3所述的腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,抗體為生物素(Biotin)標記或熒光染料標記或未標記的PD-1抗體、LAG-3抗體和TIM-3抗體中的至少一種;磁珠為與抗體標記相對應的抗生物素磁珠或抗熒光染料磁珠或抗Ig磁珠。
7.如權利要求6所述的腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,按每1.0×108個細胞加入抗體溶液10-500ul、Fc受體阻斷劑10-500ul、磁珠20-1000ul。
8.如權利要求4所述的腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,所述CM和AIM-V混合培養(yǎng)基為CM培養(yǎng)基、AIM-V培養(yǎng)基按照1:1的比例混合而成。
9.如權利要求4所述的腫瘤特異性TIL細胞的分離培養(yǎng)方法,其特征在于,所述異體輻射致死(50Gy)的PBMC與所述腫瘤特異性TIL細胞的比值為10:1-1000:1;所述OKT3抗體,按每1.0ml培養(yǎng)基加入0.01-0.1ug OKT3抗體的比例。
10.如權利要求1~9中任意一項所述的分離培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)的腫瘤特異性TIL細胞用于腫瘤的治療或預防。