相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考

本發(fā)明要求2014年6月3日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)杣s62/007,321的優(yōu)先權(quán)，將該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容并入本文參考。

發(fā)明背景

蛋白激酶(pks)是催化細(xì)胞蛋白質(zhì)中特定絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸磷酸化的酶。這些底物蛋白質(zhì)的翻譯后修飾作為分子開關(guān)起作用，所述分子開關(guān)在各種生物過程中起關(guān)鍵作用，例如控制細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、腫瘤微環(huán)境(例如vegfr)、分化和凋亡。已經(jīng)在幾種疾病狀態(tài)中觀察到異常、過度或更一般地是不適合的pk活性，包括惡性增殖性疾患，例如髓質(zhì)甲狀腺癌(mtc)和其它人體惡性腫瘤的功能突變、急性髓性白血病(aml)的flt3中的itd(內(nèi)銜接重復(fù))-突變、胃腸道間質(zhì)腫瘤(gist)的c-kit突變和慢性髓性白血病(cml)的bcr-abl重排的ret獲得。此外，酪氨酸激酶(例如trk-a、trk-b、trk-c和ret)的活化和/或超表達(dá)與癌癥患者、尤其是胰腺癌患者中的嚴(yán)重性疼痛相關(guān)。許多酪氨酸激酶彼此同源；抑制一種酪氨酸激酶還能夠產(chǎn)生對(duì)其它酪氨酸激酶的一定抑制活性。例如，伊馬替尼已經(jīng)用作治療劑，其不僅用于cml患者(基于抑制bcr-abl激酶)，而且用于gist癌癥患者(基于抑制c-kit激酶)。近期有關(guān)酪氨酸激酶的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)展已經(jīng)證實(shí)，許多酪氨酸激酶可以被藥物靶向。例如，在最近十年以來已經(jīng)批準(zhǔn)了超過十二種新藥，其靶向vegfr2、bcr-abl、flt3、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體(pdgfr)和c-kit。簡(jiǎn)要地描述了用于癌癥療法的幾種靶標(biāo)及其牽涉的問題。

ret

在1985年，ret(轉(zhuǎn)染過程中的重排)基因被鑒定為通過dna重排被活化的新的癌基因(takahashi,m.cell,1985,42,581-588)。

mtc(甲狀腺髓樣癌)是甲狀腺中c細(xì)胞的惡性腫瘤。mtc作為多發(fā)性內(nèi)分泌瘤病2型綜合征men2a和men2b可以是散發(fā)的或家族性的。家族性的(約95％)和散發(fā)的(約50％)mtc展示出ret原癌基因中功能獲得點(diǎn)突變，導(dǎo)致促存活信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)增加。ret信號(hào)傳導(dǎo)維持腫瘤發(fā)生。作為結(jié)果，阻斷這種ret信號(hào)傳導(dǎo)提供用于mtc患者的“阿基利斯(achilles)’足跟”治療途徑。多內(nèi)分泌性腺瘤形成2b是主要因ret受體激酶結(jié)構(gòu)域中的m918t突變導(dǎo)致的遺傳性綜合征，而多發(fā)性內(nèi)分泌惡性腫瘤2a主要因c634突變導(dǎo)致(santoro,m.等人science,1995,267,381)。無一突變位于atp結(jié)合位點(diǎn)。分離型家族性mtc因ret胞外或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中的不同突變導(dǎo)致，包括突變v804m和v804l，其靶向激酶atp結(jié)合位點(diǎn)中的看門殘基。對(duì)于mtc的系統(tǒng)性治療通常難以有效，其中56％的患者經(jīng)歷術(shù)后復(fù)發(fā)，這歸因于早期轉(zhuǎn)移(wells,jr.s.a.等人,clin.cancerres.2009,15,7119-7123)。

ptc(乳頭狀甲狀腺癌)來源于濾泡甲狀腺細(xì)胞。在ptc中，ret被染色體重排靶向，導(dǎo)致異源基因的其5′-端的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的組成部分發(fā)生框內(nèi)融合。據(jù)估計(jì)在2012年美國(guó)大約有60,000個(gè)新病例。觀察到5％以下的分化型甲狀腺癌癥患者中出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，且復(fù)發(fā)性疾病的發(fā)生率為10-15％。治療復(fù)發(fā)性疾病主要包括手術(shù)和放射碘。然而。治療放射性頑固性ptc疾病仍然是未得到滿足的醫(yī)療需求(schlumberger,m.thyroid,2009,19,1393-1400)。

肺癌是與癌癥相關(guān)的死亡率的主要原因。治療占全部肺癌主要部分的非小細(xì)胞肺癌(nsclc)的范例已經(jīng)從組織學(xué)診斷轉(zhuǎn)移至使用分子亞型診斷。一些“分子驅(qū)動(dòng)突變”可以產(chǎn)生組成型活性突變體信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)，例如egfr和alk。近來，一些研究鑒定了約1％具有腺癌型nsclc的患者中的ret激酶融合體(kif5b-ret和更罕見的ret/ptc變體)。在肺癌中鑒定alk融合體后快至4年，fda批準(zhǔn)了一種用于nsclc的alk抑制劑。因此，ret-陽(yáng)性nsclc患者可以類似地得益于特異性靶向療法(hutchinson,k.e.nat.med.2012,18,349-351)。

cmml是呈現(xiàn)單核白細(xì)胞增多癥的骨髓增生病。骨髓組織增殖性腫瘤通常與因嵌合型融合基因或點(diǎn)突變導(dǎo)致的異常組成型酪氨酸激酶相關(guān)。已經(jīng)報(bào)道了cmml、bcr-ret和fgfr1op-ret中的兩種新的融合基因。阻斷cmml中的ret活性對(duì)于重建信號(hào)傳導(dǎo)動(dòng)態(tài)平衡、再生適合的定向造血干細(xì)胞分化和控制異常致癌信號(hào)傳導(dǎo)具有重要性(ballerini,p.等人,leukemia2012,1-6)。

近期還鑒定了er-陽(yáng)性乳腺癌小組中的ret超表達(dá)。245個(gè)乳腺浸潤(rùn)性癌的組的原位雜交(用于測(cè)定組織中遺傳序列存在或不存在的技術(shù))分別在29.7％和59.4％的腫瘤中檢測(cè)到ret和gfrα1mrna。這些腫瘤的大部分是er-陽(yáng)性。在乳腺癌細(xì)胞系的觀察中報(bào)道了類似的發(fā)現(xiàn)。此外，對(duì)于一小組乳腺腫瘤初級(jí)細(xì)胞的qpcr分析檢測(cè)到er-陽(yáng)性樣品中retmrna的優(yōu)先表達(dá)。最后，這些研究通過微陣列研究被強(qiáng)化，即在一組36個(gè)乳腺癌樣品中，ret表達(dá)與er表達(dá)正相關(guān)。ret在他莫昔芬抗性乳腺癌中的作用在dr.isacke及其同仁的基于細(xì)胞的測(cè)定方式中被進(jìn)一步驗(yàn)證。在erα-陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中，受體酪氨酸激酶ret被其配體gdnf活化導(dǎo)致ser118和ser167上的erα磷酸化增加，以及erα轉(zhuǎn)錄活性的雌激素非依賴性活化。體外ret減量調(diào)節(jié)導(dǎo)致mcf7細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的抗增殖作用的敏感性增加6.2-倍，而gdnf刺激對(duì)該藥物具有保護(hù)效應(yīng)。在他莫昔芬抗性mcf7細(xì)胞中，靶向ret恢復(fù)了他莫昔芬的敏感性。最終，主要人乳腺癌的兩個(gè)獨(dú)立的組織微陣列的檢查揭示出，ret蛋白質(zhì)表達(dá)明顯與erα-陽(yáng)性腫瘤相關(guān)，并且在輔助劑他莫昔芬治療后隨即發(fā)生侵害性復(fù)發(fā)的患者中ret-陽(yáng)性腫瘤的數(shù)量增加2-倍(morandi,a.trendsinmol.med.2011,17,149-157)。

vegfr

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)是牽涉血管生成(vasculogenesis)和血管發(fā)生(angiogenesis)的重要信號(hào)傳導(dǎo)蛋白。作為其名稱的暗示，vegf活性主要限于血管內(nèi)皮細(xì)胞，盡管它對(duì)于有限數(shù)量的其它細(xì)胞類型具有作用。在體外，已經(jīng)證實(shí)vegf刺激內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂發(fā)生和細(xì)胞遷移。vegf還促進(jìn)微血管通透性，且有時(shí)稱作血管滲透因子。vegfr激酶已經(jīng)用作實(shí)體瘤的靶標(biāo)，例如高度血管化的惡性腫瘤，如腎癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝癌(bhargava,p.curroncolrep,2011,103-111)。

flt3

盡管急性髓性白血病(aml)的治愈率在過去四十年已經(jīng)改善，但是存活率仍然欠佳。60歲患者的5年存活率僅為40％。對(duì)于最新診斷的具有aml的患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)由誘導(dǎo)化療與輸注阿糖胞苷和蒽環(huán)類抗生素組成。

fms-樣酪氨酸激酶3(flt3)基因中的突變以30％的aml病例為特征。flt3內(nèi)銜接重復(fù)(itd)突變(占約23％的aml病例)與特別差的預(yù)后相關(guān)。在診斷時(shí)在包含約7％的病例中發(fā)現(xiàn)的flt3/d835點(diǎn)突變的預(yù)后牽涉問題尚未得到確立。抑制flt3及其突變可能是有利的。

c-kit

c-kit是通常控制原始造血細(xì)胞、黑素細(xì)胞和生殖細(xì)胞功能的受體酪氨酸激酶。顯而易見的是c-kit的不受控制的活性促使形成大量人腫瘤。c-kit的不受調(diào)節(jié)的活性可能歸因于超表達(dá)、自分泌環(huán)或突變活化。這使得c-kit成為這些腫瘤中癌癥療法的極佳靶標(biāo)，尤其是gist和aml(vonmehren,m.clin.colorectalcancer,2006,s30-40)。

trk

原肌球蛋白-相關(guān)激酶(trks)是通常在神經(jīng)元組織中表達(dá)的受體酪氨酸激酶，其中它們?cè)诎l(fā)育和功能方面起重要作用。trk受體家族由被稱作神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白的特異性配體活化的3個(gè)成員(a、b和c)組成。每種trk受體包含胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其在結(jié)合它們相應(yīng)的配體(trka的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)、腦衍生的生長(zhǎng)因子(bdnf)和trkb的nt-4/5和trkc的nt3)時(shí)觸發(fā)所述受體寡聚化、所述激酶結(jié)構(gòu)域中的特異性酪氨酸殘基磷酸化和下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括正常和腫瘤神經(jīng)元細(xì)胞中的存活、增殖和分化。已經(jīng)在大量類型的癌癥中描述了trka和trkb及其關(guān)連配體失調(diào)，包括前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、黑素瘤、甲狀腺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤，且主要通過野生型受體超表達(dá)、活化、擴(kuò)增和/或突變發(fā)生。重要地，腫瘤組織中增加的trks活化與攻擊性表型和臨床效果差相關(guān)。另外，trks和ret在周圍神經(jīng)侵害和相關(guān)癌癥疼痛中起作用。

pdgfr

血小板衍生生長(zhǎng)因子作為各種細(xì)胞的有效的促分裂原和趨化因子起作用，所述細(xì)胞例如成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和腦膠質(zhì)細(xì)胞。已經(jīng)提出異常pdgf-誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖導(dǎo)致增殖性疾患。對(duì)于pdgfr抑制劑存在需求，其提供對(duì)增殖性疾患例如胃腸道間質(zhì)腫瘤(gist)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑素瘤的治療有益性。

附圖簡(jiǎn)述

本專利或申請(qǐng)文件包含用彩色完成的至少一個(gè)附圖。具有彩色附圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)出版物的復(fù)印件將在需要和必需支付費(fèi)用時(shí)由專利局提供。

圖1：顯示用pz-1或媒介物(nt：未處理)抑制完整細(xì)胞中ret/c634y和ret/m918t磷酸化的印跡照片。用所示濃度的pz-1將表達(dá)ret/c634y或ret/m918t突變體的血清饑餓的nih3t3細(xì)胞處理2hr。將50μg總細(xì)胞裂解物用抗-磷酸-y1062(αp1062)或抗-磷酸-y905(αp905)ret抗體進(jìn)行免疫印跡。使用抗-ret(αret)抗體使印跡標(biāo)準(zhǔn)化。

圖2：顯示用pz-1或媒介物(nt：未處理)抑制看門ret點(diǎn)突變和重排的ret癌基因蛋白質(zhì)磷酸化的印跡照片。用表達(dá)ret/c634r-v804m突變體(v804是看門ret殘基)或ret/ptc1(ccdc6-ret，在乳頭狀甲狀腺癌和肺腺癌中發(fā)現(xiàn))、ret/ptc3(ncoa4-ret，在乳頭狀甲狀腺癌和肺腺癌中發(fā)現(xiàn))或kif5b-ret(在肺腺癌中發(fā)現(xiàn))的載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞hek293。轉(zhuǎn)染后36hr，使細(xì)胞血清饑餓12hr且然后用所示濃度的pz-1處理2hr。50μg總細(xì)胞裂解物進(jìn)行使用抗-磷酸-y1062(αp1062)和抗-磷酸-y905(αp905)ret抗體的免疫印跡。使用抗-ret(αret)抗體使印跡標(biāo)準(zhǔn)化。

圖3：顯示用所示濃度的pz-1或媒介物(nt：未處理)抑制在tt細(xì)胞(表達(dá)ret/c634w的人mtc細(xì)胞系)中內(nèi)源性表達(dá)的ret蛋白和甲狀腺未轉(zhuǎn)化的nthy-ori-3-1細(xì)胞中減少的作用的印跡照片。用所示濃度的pz-1將血清饑餓的人tt和甲狀腺未轉(zhuǎn)化的nthy-ori-3-1細(xì)胞系處理2hr。將50μg總細(xì)胞裂解物用抗-磷酸-y1062(αp1062)和抗-磷酸-905(αpy905)ret抗體、抗-磷酸-mapk(αpmapk,t302/y304)和抗-磷酸-shc(αpshc,y317)抗體進(jìn)行免疫印跡。使用抗-ret(αret)和抗-shc(αshc)使印跡標(biāo)準(zhǔn)化。

圖4：顯示用所示劑量的pz-1或媒介物(nt：未處理)抑制在hek293細(xì)胞中表達(dá)的vegfr2異常磷酸化的印跡照片。用表達(dá)vegfr2的載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后36hr，使細(xì)胞血清饑餓12hr，用所示濃度的pz-1處理2hr，且最終用vegf-a(100ng/ml)處理15min。50μg總細(xì)胞裂解物進(jìn)行使用抗-磷酸-y1175(αpvegfr2)vegfr2抗體的免疫印跡。使用抗-vegfr2(αvegfr2)使印跡標(biāo)準(zhǔn)化。

圖5：所示濃度的pz-1或媒介物(nt：未處理)對(duì)tt(表達(dá)ret/c634w的人mtc細(xì)胞系)、lc-2/ad(表達(dá)ccdc6-ret的人nsclc)和nthy-ori-3-1(甲狀腺未轉(zhuǎn)化的)細(xì)胞系增殖發(fā)揮的作用。數(shù)據(jù)為一式三份進(jìn)行的一次實(shí)驗(yàn)的平均值±sd(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。底部，右側(cè))pz-1對(duì)不同細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制ic50：95％ci(置信區(qū)間)如括號(hào)中所示。將細(xì)胞一式三份接種在60-mm平皿中并且保持在5％(nthy-ori-3-1)或10％(tt和lc-2/ad)胎牛血清中。鋪板后的當(dāng)天，向培養(yǎng)基中加入不同濃度的pz-1或媒介物并且每隔2-3天換一次。每隔2-3天計(jì)數(shù)一次細(xì)胞并且將細(xì)胞數(shù)量報(bào)道為±sd(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。通過對(duì)來自生長(zhǎng)曲線的最后1天的曲線擬合分析、使用prizm軟件程序(graphpadsoftwareinc)計(jì)算ic50劑量(與置信區(qū)間)。

圖6：pz-1對(duì)鼠ba/f3細(xì)胞的ncoa4-ret癌基因驅(qū)動(dòng)的il-3-非依賴性增殖的活性。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示pz-1對(duì)ba/f3-ncoa4-ret、而不對(duì)親代ba/f3的抑制作用。將ba/f3和ba/f3ncoa4-ret細(xì)胞與媒介物(nt)或所示濃度的pz-1在完全培養(yǎng)基中一起溫育并且在不同時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)。數(shù)據(jù)為一式三份進(jìn)行的一次實(shí)驗(yàn)的平均值±sd。鼠白細(xì)胞介素-3(il-3)依賴性原-bba/f3細(xì)胞來自atcc。通過用電穿孔傳染ncoa4-ret的長(zhǎng)同種型(ret-51)生成穩(wěn)定表達(dá)ncoa4-ret(ret/ptc3)的蛋白質(zhì)的ba/f3細(xì)胞。將親代和ba/f3-ncoa4-ret細(xì)胞在具有10％fbs的rpmi1640中培養(yǎng)；親代細(xì)胞還需要10ng/mlil-3。顯示了ic50劑量(與置信區(qū)間)。

圖7：pz-1對(duì)異種移植入scid小鼠的tt細(xì)胞的抗-腫瘤發(fā)生活性。附圖顯示pz-1對(duì)植入tt細(xì)胞并且通過口腔管飼法每日用媒介物(n.10只小鼠，18個(gè)腫瘤)或用0.3、1.0或3.0mg/kgpz-1(n.29只小鼠，52個(gè)腫瘤)處理的scid小鼠的皮下腫瘤的作用。報(bào)道腫瘤體積的平均值±sd(標(biāo)準(zhǔn)偏差)。將tt細(xì)胞(7.5x10⁶/小鼠)皮下接種入39只雌性scid小鼠(jacksonlaboratories,barharbor,maine)的背側(cè)部分(雙側(cè))。5周后，每只小鼠中存在至少一個(gè)腫瘤，且總計(jì)可見70個(gè)腫瘤：56個(gè)腫瘤為40-150mm³，且14個(gè)腫瘤為<40mm³。腫瘤在31只小鼠的2個(gè)注射部位明顯；在其余8只小鼠中僅1個(gè)部位展示出腫瘤形成。將攜帶腫瘤的動(dòng)物隨機(jī)分組以便通過口腔管飼法接受pz-1(0.3、1.0或3.0mg/kg，每日)(29只小鼠，52個(gè)腫瘤)或媒介物(10只小鼠，18個(gè)腫瘤)。將治療施用連續(xù)28天。每周使用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤直徑。通過旋橢圓體公式計(jì)算腫瘤體積(v)：v＝axb²/2(a＝軸直徑；b＝旋轉(zhuǎn)直徑)并且報(bào)道為平均體積±標(biāo)準(zhǔn)偏差。為了比較腫瘤生長(zhǎng)，使用克-瓦二氏檢驗(yàn)(非參數(shù)anova)和dunn氏多重比較檢驗(yàn)(instatprogram,graphpad軟件)。p值在p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖8：pz-1對(duì)植入ret/c634y或hras(g12v)轉(zhuǎn)化的nih3t3成纖維細(xì)胞的裸鼠的抗-腫瘤發(fā)生活性。附圖顯示pz-1對(duì)使用pz-1(1.0、3.0或10mg/kg，每日)或媒介物通過口腔管飼法處理所示時(shí)間期限的小鼠的皮下腫瘤的作用。報(bào)道平均腫瘤體積(±sd：標(biāo)準(zhǔn)偏差)。將nih3t3ret/c634y(200,000細(xì)胞)或nih3t3hras/g12v(50,000細(xì)胞)皮下接種入6周齡雌性balb/cnu/nu小鼠(n.31只小鼠/細(xì)胞系)(jacksonlaboratories,barharbor,maine)的背側(cè)部分(雙側(cè))。4天后，在腫瘤出現(xiàn)前，將動(dòng)物隨機(jī)分組以便通過口腔管飼法接受pz-1(1.0、3.0或10mg/kg，每日)(23只小鼠/細(xì)胞系：8只小鼠/組，1.0和3.0mg/kg每日劑量；和7只小鼠，10dosemg/kg每日)或媒介物對(duì)照(8只小鼠)。每隔1-2天使用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤直徑。通過旋橢圓體公式計(jì)算腫瘤體積(v)并且報(bào)道為平均體積±標(biāo)準(zhǔn)偏差。為了比較腫瘤生長(zhǎng)，使用克-瓦二氏檢驗(yàn)(非參數(shù)anova)和dunn氏多重比較檢驗(yàn)(instatprogram,graphpad軟件)。p值在p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

圖9：顯示pz-1對(duì)通過注射被ret/c634y或hras/g12v轉(zhuǎn)化的nih3t3成纖維細(xì)胞在裸鼠中誘導(dǎo)的腫瘤中的細(xì)胞磷酸化事件(來自圖8)的作用的印跡的照片。顯示pz-1處理對(duì)ret/c634y-和hras/g12v-誘導(dǎo)的腫瘤中的pvegfr2的抑制作用和對(duì)僅在ret/c634y-誘導(dǎo)的腫瘤中ret磷酸化和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)(shc、mapk、p70s6k和s6rp)的抑制作用的印跡。用不同劑量的pz-1(tr)將在圖8中所述腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)媒介物處理的腫瘤中的一部分處理48hr或保持不做處理(nt)。在處理結(jié)束時(shí)，將50μg腫瘤蛋白質(zhì)裂解物用抗-磷酸-y1062(αp1062)和抗-磷酸-905(αpy905)ret抗體、抗-磷酸-mapk(αpmapk,t302/y304)、抗-磷酸-shc(αpshc,y317)、抗-磷酸-p70s6k(αpp70s6k,t389)、抗-磷酸-s6rp(αps6rp,s235/s236)和抗-磷酸-vegfr2(αpvegfr2py1175)抗體進(jìn)行免疫印跡。使用抗-ret(αret)、抗-shc(αshc)、抗-mapk(αmapk)、抗-p70s6k(αp70s6k)、抗-s6rp(αs6rp)或抗-vegfr2(αvegfr2)抗體使印跡標(biāo)準(zhǔn)化。

圖10：pz-1(n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺)與紅色的ret激酶和綠色的vegfr2激酶的對(duì)接模型。ret與vegfr2之間有4個(gè)氨基酸不同，這可以用于設(shè)計(jì)選擇性ret抑制劑。得到vegfr-2dfg外晶體結(jié)構(gòu)(pdb#2oh4)和ret的氨基酸序列(pdb#2ivu)。使用swiss-modelautomaticmodelingmode(swissmodel.expasy.org)，ret序列用于使用vegfr2dfg外結(jié)構(gòu)作為模板構(gòu)建retdfg外同源性模型。使用autodocktools：1)將全部氫作為‘唯一極性’加入；2)生成atp結(jié)合位點(diǎn)的柵盒(中心x＝-25.881，中心y＝9.55，中心z＝-10.927/大小x＝16，大小y＝44，大小z＝18)。使用autodocktools指定計(jì)算機(jī)模型化的化合物的適合的可旋轉(zhuǎn)的鍵。然后，autodockvina用于使所述化合物模型化。模型化結(jié)果可見且采用discoverystudio3.5進(jìn)行分析。

發(fā)明概述

在第一個(gè)方面，本文提供式viii的化合物：

其中r¹是未取代或(被r⁶)取代的芳基或雜芳基；r²選自h、(c1-c3)烷基、鹵素、-cn、-o-(c1-c3)烷基、-o-(ch2)nx、-n(r⁷)(r⁸)、-conh(ch2)nx、-so2nh(ch2)nx和-so2(c1-c3)烷基；r³和r⁴各自獨(dú)立地是h、(c1-c6)烷基或cn；r⁵是-(c1-c3)烷基或被1－3個(gè)氟取代的-(c1-c3)烷基；r⁶是h、oh、nh2、(c1-c3)烷基、鹵素、-cn、-o(c1-c3)烷基、-o(ch2)nx、-n(r⁷)(r⁸)、-conh2、-conh(ch2)nx、-so2nh(ch2)nx或-so2(c1-c3)烷基；x是or⁹、n(r⁷)(r⁸)；r⁷和r⁸各自獨(dú)立地是氫或(c1-c4)烷基或(c1-c4)烷氧基，并且可以彼此之間形成環(huán)；n是2或3；且r⁹是h或(c1-c3)烷基。還提供式viii的鹽、異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、對(duì)映體、外消旋體、溶劑合物、水合物、多晶型物和前藥。

在一些實(shí)施方案中，式viii的化合物選自：n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺(pz-1)；2-(4-(5-(1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)-n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2,3-二甲基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2,4-二甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(噻吩-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2,4-二氟苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2,4-二氯苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(4-(甲硫基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(6-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2-甲氧基吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(6-嗎啉代吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(吡啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(4-(甲基磺酰基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(嘧啶-5-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；和n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-苯基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，式viii的化合物是n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺(pz-1)。

在第二個(gè)寬泛的方面，本文提供制備酪氨酸激酶抑制劑的方法。第一種方法包括使取代的苯胺與活化的氟化物化合物在親核加成反應(yīng)中反應(yīng)，產(chǎn)生加成產(chǎn)物；選擇性地還原所述加成產(chǎn)物，產(chǎn)生第一種還原產(chǎn)物；環(huán)化還原的產(chǎn)物，產(chǎn)生環(huán)化的中間體；使環(huán)化的中間體與硼酸(boronicacid)或錫衍生物偶合，產(chǎn)生酯；和還原所述酯，產(chǎn)生第二種還原產(chǎn)物；和使第二種還原產(chǎn)物氨化，產(chǎn)生酪氨酸激酶抑制劑。

在一些實(shí)施方案中，取代的苯胺包含在對(duì)位上的溴。在一些實(shí)施方案中，選擇性還原包含將no2基團(tuán)還原成nh2，而不還原溴。在一些實(shí)施方案中，所述環(huán)化包含用酸活化還原的產(chǎn)物。在具體的實(shí)施方案中，所述酸包含ptsa。在一些實(shí)施方案中，所述環(huán)化的中間體包含2-(4-(5-溴-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯。

在一些實(shí)施方案中，所述偶合是鈀催化的。在一些實(shí)施方案中，溴是偶合步驟中的離去基。在一些實(shí)施方案中，偶合步驟包含suzuki偶合。在一些實(shí)施方案中，所述酯選自：2-(4-(5-(1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2,3-二甲基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2,4-二甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(噻吩-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2,4-二氟苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2,4-二氯苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(4-(甲硫基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(6-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2-甲氧基吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(6-嗎啉代吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(吡啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(4-(甲基磺?；?苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(嘧啶-5-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；和2-(4-(5-苯基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯。在一些實(shí)施方案中，所述酯主要由2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯組成。

在一些實(shí)施方案中，所述第二種還原產(chǎn)物包含選自如下的化合物：2-(4-(5-(1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2,3-二甲基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2,4-二甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(噻吩-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2,4-二氟苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2,4-二氯苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(4-(甲硫基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(6-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2-甲氧基吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(6-嗎啉代吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(吡啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(4-(甲基磺?；?苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(嘧啶-5-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；和2-(4-(5-苯基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰。在一些實(shí)施方案中，所述第二種還原產(chǎn)物主要由2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰組成。

第二種方法包括使溴硼酸酯(boronicdester)與鹵代-芳基或雜芳基化合物在催化劑和堿的存在下反應(yīng)，產(chǎn)生中間體；使所述中間體與硼酸或錫衍生物偶合，產(chǎn)生酪氨酸激酶抑制劑前體；以及還原所述酪氨酸激酶抑制劑前體并且使其氨化，產(chǎn)生酪氨酸激酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述堿包含乙酸鉀。

在一些實(shí)施方案中，所述鹵代-芳基或雜芳基包含吡咯基、吡唑基、吡喃基、噻喃基、呋喃基、咪唑基、吡啶基、噻唑基、三嗪基、鄰苯二甲酰亞胺基、吲哚基、嘌呤基、苯并噻唑基或其組合。在一些實(shí)施方案中，所述鹵代-芳基或雜芳基包含選自如下的雜環(huán)殘基：環(huán)氧乙烷基、氮雜環(huán)丙烯基(azirinyl)、氮丙啶基(aziridinyl)、1,2-氧雜硫雜環(huán)戊基、噻吩基、呋喃基、四氫呋喃基、吡喃基、噻喃基、噻蒽基、異苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2h-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、異噻唑基、二噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、噠嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、(s-氧代或s,s-二氧代)-硫代嗎啉基、吲嗪基、異吲哚基、3h-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、香豆基、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4h-喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌間二氮苯基、菲咯啉基、呋咱基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、色烯基、異色滿基和色滿基.

在一些實(shí)施方案中，所述中間體包含2-(4-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯。

在一些實(shí)施方案中，所述酪氨酸激酶抑制劑前體選自：2-(4-(5-(1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2,3-二甲基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2,4-二甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(噻吩-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2,4-二氟苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2,4-二氯苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(4-(甲硫基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(6-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(2-甲氧基吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(6-嗎啉代吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(吡啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(4-(甲基磺酰基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(嘧啶-5-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；2-(4-(5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯；和2-(4-(5-苯基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯。在一些實(shí)施方案中，所述酪氨酸激酶抑制劑前體主要由2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯組成。

在一些實(shí)施方案中，所述酪氨酸激酶抑制劑前體被還原成還原產(chǎn)物，其包含選自如下的化合物：2-(4-(5-(1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2,3-二甲基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2,4-二甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(噻吩-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2,4-二氟苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2,4-二氯苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(4-(甲硫基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(6-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(2-甲氧基吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(6-嗎啉代吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(吡啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(4-(甲基磺酰基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(嘧啶-5-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；2-(4-(5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰；和2-(4-(5-苯基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰。在一些實(shí)施方案中，所述酪氨酸激酶抑制劑前體被還原成還原產(chǎn)物，其主要由2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鹽組成。

在另一個(gè)寬泛的方面，本文提供藥物組合物。該藥物組合物包含式viii的化合物和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

還提供治療具有癌癥的受試者、抑制磷酸化和抑制包括甲狀腺癌細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞增殖的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包含對(duì)受試者或細(xì)胞施用有效量的式viii的化合物。在一些實(shí)施方案中，所述化合物包含n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺(pz-1)。在一些實(shí)施方案中，甲狀腺癌細(xì)胞包含mtc。

還提供抑制酪氨酸激酶的方法，包含用有效量的式viii的化合物處理細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述酪氨酸激酶選自ret、flt3、c-kit、vegfr、trk-a、trk-b、trk-c和pdgfr。在一些實(shí)施方案中，所述化合物顯示出具有小于1μm的ic50值的激酶結(jié)構(gòu)域。

還提供治療與癌癥相關(guān)的疼痛的方法。該方法包括對(duì)有此需要的受試者施用有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含式viii的化合物和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

還提供藥盒。在第一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備酪氨酸激酶抑制劑的藥盒包含容納取代苯胺的第一個(gè)容器和容納活化的氟化物化合物的第二個(gè)容器。在一些實(shí)施方案中，所述藥盒還包含一種或多種還原劑硼酸或錫衍生物。在第二個(gè)實(shí)施方案中，用于制備酪氨酸激酶抑制劑的藥盒包括容納硼酸酯的第一個(gè)容器、容納鹵代-芳基或雜芳基化合物和催化劑的第二個(gè)容器。在一些實(shí)施方案中，所述藥盒還包含一種或多種還原劑。在第三個(gè)實(shí)施方案中，用于制備藥物組合物的藥盒包含容納式viii的化合物的第一個(gè)容器和容納藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的第二個(gè)容器。

詳細(xì)描述

本文公開的化合物、制備化合物的方法和使用化合物的方法中描述了不同的實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到，下列實(shí)施方案的詳細(xì)描述僅是示例性的，且不預(yù)期以任何方式起限定作用。另外的實(shí)施方案自身易于啟示本領(lǐng)域技術(shù)人員具有本文公開的益處。本文公開中所涉及的“實(shí)施方案”、“方面”或“實(shí)例”表示如此描述的本發(fā)明的實(shí)施方案可以包括具體的特性、結(jié)構(gòu)或特征，但并非每個(gè)實(shí)施方案必須包括所述具體的特性、結(jié)構(gòu)或特征。此外，術(shù)語(yǔ)“在一個(gè)實(shí)施方案中”的反復(fù)應(yīng)用不一定是指同一實(shí)施方案，盡管可能如此。

定義

本文所用的通用化學(xué)術(shù)語(yǔ)具有其在本領(lǐng)域中通常的含義。例如，本文所用的術(shù)語(yǔ)“c1-c4烷基”單獨(dú)地或以組合方式表示由碳和氫原子組成的直鏈或支鏈c1-c4烷基基團(tuán)，其實(shí)例為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基等。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“鹵代”或“鹵素”表示氟、氯、溴或碘。本文所用的術(shù)語(yǔ)“c1-c6烷基”是指1-6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈一價(jià)飽和脂族鏈，并且包括、但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基和己基。術(shù)語(yǔ)“c1-c6烷基”在其定義范圍內(nèi)包括術(shù)語(yǔ)“c1-c4烷基”和“c1-c3烷基”。術(shù)語(yǔ)“羧基(carboxy)”或“羧基(carboxyl)”是指羧酸。術(shù)語(yǔ)“羧酰胺”是指被nh2部分取代的羰基。術(shù)語(yǔ)“氧代”是指羰基基團(tuán)。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指包含1-5個(gè)選自o、s和n的雜原子的芳基部分。雜芳基基團(tuán)的實(shí)例包括吡咯基、吡唑基、吡喃基、噻喃基、呋喃基、咪唑基、吡啶基、噻唑基、三嗪基、鄰苯二甲酰亞胺基、吲哚基、嘌呤基和苯并噻唑基。雜芳基特別地是雜環(huán)基殘基，其選自環(huán)氧乙烷基、氮雜環(huán)丙烯基、氮丙啶基、1,2-氧雜硫雜環(huán)戊基、噻吩基、呋喃基、四氫呋喃基、吡喃基、噻喃基、噻蒽基、異苯并呋喃基、苯并呋喃基、色烯基、2h-吡咯基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑烷基、苯并咪唑基、吡唑基、吡嗪基、吡唑烷基、噻唑基、異噻唑基、二噻唑基、噁唑基、異噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哌啶基、哌嗪基、噠嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、(s-氧代或s,s-二氧代)-硫代嗎啉基、吲嗪基、異吲哚基、3h-吲哚基、吲哚基、苯并咪唑基、香豆基(cumaryl)、吲唑基、三唑基、四唑基、嘌呤基、4h-喹嗪基、異喹啉基、喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并噻吩基、二苯并噻吩基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌間二氮苯基、菲咯啉基、呋咱基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、色烯基、異色滿基和色滿基。

本文使用各種縮寫。術(shù)語(yǔ)dcm是指二氯甲烷。術(shù)語(yǔ)dipea是指n,n-二異丙基乙胺。術(shù)語(yǔ)pd2(dba)3是指三(二亞芐基丙酮)二鈀。術(shù)語(yǔ)dppf是指1,1′-雙(二苯基膦基)二茂鐵。術(shù)語(yǔ)dma是指n,n-二甲基乙酰胺。術(shù)語(yǔ)dmf是指n,n-二甲基甲酰胺。術(shù)語(yǔ)dmso是指二甲亞砜。術(shù)語(yǔ)edc是指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺。術(shù)語(yǔ)etoac是指乙酸乙酯。術(shù)語(yǔ)etoh是指乙醇。術(shù)語(yǔ)es是指電噴霧。術(shù)語(yǔ)h是指小時(shí)。術(shù)語(yǔ)hoac是指乙酸。術(shù)語(yǔ)hoat是指1-羥基-7-氮雜苯并三唑。術(shù)語(yǔ)ipa是指異丙醇。術(shù)語(yǔ)koac是指乙酸鉀。術(shù)語(yǔ)lc是指液相色譜法。術(shù)語(yǔ)lioh是指氫氧化鋰。術(shù)語(yǔ)mgso4是指硫酸鎂。術(shù)語(yǔ)min是指分鐘。術(shù)語(yǔ)ml是指毫升。術(shù)語(yǔ)mmol是指毫摩爾。術(shù)語(yǔ)ms是指質(zhì)譜。術(shù)語(yǔ)nahco3是指碳酸氫鈉。術(shù)語(yǔ)ptsa是指對(duì)-甲苯磺酸。術(shù)語(yǔ)p(cy)3是指三環(huán)己膦。術(shù)語(yǔ)rt是指室溫。術(shù)語(yǔ)thf是指四氫呋喃。術(shù)語(yǔ)tlc是指薄層色譜法。術(shù)語(yǔ)tmof是指原甲酸三甲酯。

如果復(fù)數(shù)形式用于化合物、鹽、藥物制劑、疾病、疾患等，則預(yù)期其還指單一化合物、鹽、藥物制劑、疾病等。如果使用“一種(a)”或“一種(an)”，則其是指不確定的制品或優(yōu)選“一種”。

一般描述

本文提供式viii的化合物及其鹽、異構(gòu)體、立體異構(gòu)體、對(duì)映體、外消旋體、溶劑合物、水合物、多晶型物和前藥：

其中r¹是未取代或(被r⁶)取代的芳基或雜芳基；r²選自h、(c1-c3)烷基、鹵素、-cn、-o-(c1-c3)烷基、-o-(ch2)nx、-n(r⁷)(r⁸)、-conh(ch2)nx、-so2nh(ch2)nx和-so2(c1-c3)烷基；r³和r⁴各自獨(dú)立地是h、(c1-c6)烷基或cn；r⁵是-(c1-c3)烷基或被1－3個(gè)氟取代的-(c1-c3)烷基；r⁶是h、oh、nh2、(c1-c3)烷基、鹵素、-cn、-o(c1-c3)烷基、-o(ch2)nx、-n(r⁷)(r⁸)、-conh2、-conh(ch2)nx、-so2nh(ch2)nx或-so2(c1-c3)烷基；x是or⁹,n(r⁷)(r⁸)；r⁷和r⁸各自獨(dú)立地是氫或(c1-c4)烷基或(c1-c4)烷氧基，并且可以彼此之間形成環(huán)；

n是2或3；且r⁹是h或(c1-c3)烷基。本文還提供式viii的化合物的代謝前體，例如酯類或酰胺類。

作為非限制性實(shí)例，式viii的化合物具體地包括、但不限于如下列出的化合物：

1)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

2)2-(4-(5-(1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)-n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)乙酰胺；

3)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2,3-二甲基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

4)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

5)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2,4-二甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

6)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(噻吩-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

7)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2,4-二氟苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

8)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2,4-二氯苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

9)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(4-(甲硫基)苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

10)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

11)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(6-氟吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

12)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(2-甲氧基吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

13)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

14)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(6-嗎啉代吡啶-3-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

15)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(吡啶-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

16)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(4-(甲基磺?；?苯基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

17)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(嘧啶-5-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

18)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

19)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(6-甲基吡啶-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

20)n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-苯基-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺；

及其藥學(xué)上可接受的鹽。應(yīng)當(dāng)理解，上述清單中化合物名稱前的的序號(hào)在本文中可以用于鑒定它所相當(dāng)于的具體化合物。還應(yīng)當(dāng)理解，上述清單中示例性的化合物僅為本發(fā)明的代表，且不以任何方式起限定作用。本公開的任意化合物用作酪氨酸激酶抑制劑。

在本說明書的上下文中，式viii的化合物的實(shí)例可以稱作化合物1(即n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺)、pz-1、pz-01或這些術(shù)語(yǔ)的任意組合。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，本文所述的任意化合物能夠成鹽。作為非限制性實(shí)例，所述化合物與任意數(shù)量的有機(jī)酸或無機(jī)酸反應(yīng)，形成藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。

制備方法

在一些實(shí)施方案中，本文公開的化合物可以根據(jù)如下方案和實(shí)施例制備。應(yīng)當(dāng)理解，制備所述化合物的許多另外的方法是可能的。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，引入一些取代基可以在式viii的化合物中生成不對(duì)稱性。本發(fā)明涵蓋所有的對(duì)映體和對(duì)映體混合物，包括外消旋體。優(yōu)選包含手性中心的本發(fā)明的化合物為單一對(duì)映體，但并不要求。

可以通過各種方法制備本公開的化合物，所述方法的一些示例在如下所示的方案中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將要認(rèn)識(shí)到，下列方案中的各個(gè)步驟可以改變，以便得到式viii的化合物。生產(chǎn)式viii的化合物所需的特定步驟次序依賴于所合成的具體化合物、起始化合物和取代基團(tuán)的相對(duì)不穩(wěn)定性。

在一些實(shí)施方案中，式viii的化合物通過方案i合成，如下所示。

方案i

方案i的步驟a描述適當(dāng)取代的苯胺(2)的親核加成反應(yīng)至活化的氟化物化合物(1)。對(duì)位-溴取代對(duì)于該反應(yīng)而言是重要的；它不僅加速氟nh2取代，而且溴原子還能夠通過得到的中間體(5)中的suzuki反應(yīng)使碳-碳鍵形成?？梢苑蛛x產(chǎn)物并且通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)純化，例如沉淀、過濾、萃取、蒸發(fā)、色譜和重結(jié)晶。

在方案i的步驟b中，一些條件適用于中間體3，得到中間體4。典型地，該反應(yīng)在適合的溶劑例如meoh、etoh或酸中進(jìn)行，以便選擇性地將no2基團(tuán)還原成nh2，而不還原溴，但另外的方法是可能的。該反應(yīng)在低于室溫(例如冰浴中)至環(huán)境溫度下進(jìn)行4-8h?？梢苑蛛x產(chǎn)物并且通過上述技術(shù)純化。

方案1的步驟c描述中間體4的環(huán)化，得到任選取代的中間體5。典型地，用適合的酸(優(yōu)選ptsa)在適合的溶劑或凈tmof中、在100℃和以上的溫度下活化適合的中間體4?？梢苑蛛x產(chǎn)物并且通過上述技術(shù)純化。

方案i的步驟d描述鈀催化的中間體5與硼酸或錫衍生物的偶合，得到中間體6。典型地，中間體5的鹵化物(尤其是溴)在適合的催化劑(優(yōu)選pd2(dba)3)和適合的堿(例如乙酸鉀)的存在下用作硼酸或錫類似物組合中的離去基，以便進(jìn)一步合成式viii的化合物(suzuki反應(yīng)：參見，例如miyaura,n.等人synth.commun.,1981,513-518)。

在一些實(shí)施方案中，式viii的化合物可以通過如下所示的方案ii合成。

方案ii

方案ii的步驟e描述通過本領(lǐng)域公知的方法合成中間體9的硼酸酯(li等人,j.org.chem.,2002,5394-5397)。按照步驟d相同的方式，鹵代-芳基或雜芳基化合物可以與中間體9在適合的催化劑(例如pd2(dba)3)和適合的堿(例如乙酸鉀)的存在下反應(yīng)，以便進(jìn)一步合成式viii的化合物(suzuki反應(yīng)：參見，例如miyaura,n.等人synth.commun.,1981,513-518)。化合物17-20(其iupac名稱在上述清單中指定)可以通過方案ii、使用與方案i相同的2個(gè)其余步驟-步驟e和f合成。

藥物組合物

本文公開的化合物可以并入藥物組合物，用于治療各種疾病。在一些實(shí)施方案中，式viii的鹽尤其用于藥物組合物。

可以用任意式viii的化合物(為酪氨酸激酶抑制劑)+任意常用的賦形劑、稀釋劑或載體配制藥物組合物。可以將組合物壓制成片劑或配制成酏劑或溶液，以便便利地用于口服施用或通過肌內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑施用?？梢越?jīng)皮施用所述化合物且可以將其配制成緩釋劑型等。

本文的化合物、組合物和制劑用于治療動(dòng)物(例如人類)的各種疾病。本文公開的治療人體患者的方法包括施用有效量的酪氨酸激酶抑制劑或包含酪氨酸激酶抑制劑的藥物組合物。可以將所述酪氨酸激酶抑制劑配制成可以通過口服和直腸途徑施用的組合物，通過局部、胃腸外(例如通過注射和通過連續(xù)或不連續(xù)動(dòng)脈內(nèi)輸注)施用，施用形式為，例如片劑、錠劑、舌下片、小藥囊、扁囊劑、酏劑、凝膠、混懸液、氣霧劑、軟膏劑(例如它們?cè)谶m合的基質(zhì)中包含1-10％重量的活性化合物)、軟和硬膠囊、栓劑、在生理學(xué)可接受的介質(zhì)中的可注射溶液和混懸液，以及吸附在支持材料上的用于制備可注射溶液的無菌包裝的粉末。為了該目的，有利地，可以將組合物制成單位劑型形式，優(yōu)選每個(gè)劑量單位包含約5-約500mg(在胃腸外或吸入施用的情況中約5-約50mg；和在口服或直腸施用的情況中約25-約500mg)所述化合物?？梢允┯妹咳占s0.5-約300mg/kg、優(yōu)選0.5-20mg/kg劑量的活性成分，不過，當(dāng)然易于理解的是，實(shí)際施用的化合物的量由臨床醫(yī)師根據(jù)所有的相關(guān)情況決定，包括待治療的病癥、所施用的化合物的選擇和施用途徑的選擇。因此，并不預(yù)期本文討論的劑量范圍以任何方式限定本發(fā)明的范圍。

用于單獨(dú)施用酪氨酸激酶抑制劑的制劑通常包含混合了載體或被載體稀釋或包封或被膠囊、小藥囊、扁囊劑、紙張或其它容器形式的可攝入載體或被一次性容器(例如安瓿)包囊的至少一種選自式viii的化合物的化合物(在本文中可以稱作活性成分或活性物質(zhì))。載體或稀釋劑可以是固體、半固體或液體材料，其用作用于活性治療物質(zhì)的媒介物、賦形劑或介質(zhì)?？梢杂糜诒景l(fā)明藥物組合物中的稀釋劑或載體的一些實(shí)例是乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、丙二醇、液體石蠟、白軟石蠟、高嶺土、煙霧二氧化硅、微晶纖維素、硅酸鈣、二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮、十八醇十六醇混合物、淀粉、改性淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、可可脂、乙氧基化酯類、可可屬的油、花生油、藻酸鹽、黃蓍膠。明膠、糖漿、甲基纖維素、聚氧乙烯月桂山梨坦、乳酸乙酯、羥基苯甲酸甲酯和羥基苯甲酸丙酯、三油酸山梨坦、倍半油酸山梨坦和油醇和拋射劑，例如三氯一氟甲烷、二氯二氟甲烷以及二氯四氟乙烷。在片劑的情況中，可以將潤(rùn)滑劑摻入以防止粉狀成分粘結(jié)和粘合模頭和壓片機(jī)的沖頭。為了這類目的，例如，可以使用硬脂酸鋁、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石粉或礦物油。

在一些實(shí)施方案中，本公開的藥物組合物包含有效量的式viii的化合物和/或另外的溶于或分散于藥學(xué)上可接受的載體的試劑。術(shù)語(yǔ)“藥物”或“藥學(xué)上可接受的”是指在施用于動(dòng)物(例如人)時(shí)不產(chǎn)生不良、過敏性或另外不需要的反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。包含至少一種化合物或另外的活性成分的藥物組合物的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開的內(nèi)容已知的，以remington’spharmaceuticalsciences,2003為示例，將其并入本文參考。此外，對(duì)于動(dòng)物(例如人)施用，應(yīng)當(dāng)理解，制劑應(yīng)當(dāng)滿足作為fdaofficeofbiologicalstandards所要求的無菌性、熱原質(zhì)性和一般的安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。

本文公開的組合物可以包含不同類型的載體，根據(jù)以固體、液體還是氣霧劑形式施用以及對(duì)于作為注射施用這類途徑是否是無菌的的情況而定。本文公開的組合物可以通過靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、透皮、向鞘內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、骨內(nèi)、假體周圍、局部、肌內(nèi)、皮下通過粘膜、子宮內(nèi)、口服、局部、局部地、通過吸入(例如氣霧劑吸入)、通過注射、通過輸注、通過連續(xù)輸注、通過直接浸浴靶細(xì)胞的局限性灌注、通過導(dǎo)管、通過灌洗、用乳劑、用液體組合物(例如脂質(zhì)體)或通過其它方法或上述任意的組合來施用，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的(參見，例如remington'spharmaceuticalsciences,2003,并入本文參考)。

施用于動(dòng)物或人體患者的本文公開的組合物的實(shí)際劑量可以根據(jù)身體和生理學(xué)因素確定，例如體重、病情的嚴(yán)重性、待治療的疾病類型、預(yù)先或同時(shí)的治療干預(yù)、患者的特發(fā)癥和施用途徑。根據(jù)施用劑量和途徑的不同，優(yōu)選的劑量和/或有效量的施用次數(shù)根據(jù)受試者的響應(yīng)的不同而改變。本公開的化合物通常在寬劑量范圍內(nèi)是有效的。在任何情況下，負(fù)責(zé)施用的醫(yī)務(wù)人員可以決定組合物中活性成分的濃度和用于個(gè)體受試者的適合的劑量。

在一些實(shí)施方案中，藥物組合物可以包含，例如至少約0.1％的活性化合物。在另外的實(shí)施方案中，例如，活性化合物可以占單位重量的約2％－約75％或約25％－約60％和其中衍生的任意范圍。自然地，每種治療有用組合物中的活性化合物的量可以按照這樣的方式制備，使得適合的劑量在任意化合物的指定單位劑量中得到。例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途徑、產(chǎn)品壽命以及其它藥理學(xué)考量這樣的因素應(yīng)當(dāng)是制備這類藥物制劑的普通技術(shù)人員所關(guān)注的，且照此各種劑量和治療方案是可期望的。

在另外的非限制性實(shí)例中，劑量還可以包含每次施用約1微克/kg/體重、約5微克/kg/體重、約10微克/kg/體重、約50微克/kg/體重、約100微克/kg/體重、約200微克/kg/體重、約350微克/kg/體重、約500微克/kg/體重、約1毫克/kg/體重、約5毫克/kg/體重、約10毫克/kg/體重、約50毫克/kg/體重、約100毫克/kg/體重、約200毫克/kg/體重、約350毫克/kg/體重、約500毫克/kg/體重－約1000mg/kg/體重或以上和其中衍生的任意范圍。在來自本文舉出的可衍生范圍的非限制性實(shí)例中，基于上述數(shù)值，可以施用約5mg/kg/體重－約100mg/kg/體重、約5微克/kg/體重－約500毫克/kg/體重等。

在一些實(shí)施方案中，可以配制通過消化途徑施用的組合物和/或另外的試劑。消化途徑包括所有可能的施用途徑，其中組合物直接接觸消化道。特別地，本文公開的藥物組合物可以通過口服、口含、直腸或舌下施用。照此，可以用惰性稀釋劑或可熔化的可攝入的載體配制這些組合物，或可以將它們包封在硬膠囊或軟膠囊或可以將它們壓制成片劑或可以將它們直接摻入膳食食物。

在另外的實(shí)施方案中，本文所述的組合物可以通過胃腸外途徑施用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“胃腸外”包括繞過消化道的途徑。特別地，可以施用本文公開的藥物組合物，例如、但不限于通過靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、向鞘內(nèi)、皮下或腹膜內(nèi)(美國(guó)專利us6,753,514、us6,613,308、us5,466,468、us5,543,158、us5,641,515和us5,399,363各自特別地以其完整的形式并入本文參考)。

可以用適當(dāng)混合表面活性劑(例如羥丙基纖維素)的水制備本文公開的作為游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽的組合物的溶液?？梢杂酶视汀⒁后w聚乙二醇及其混合物和用油制備分散液。在常規(guī)的儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以便防止微生物生長(zhǎng)。適合于注射應(yīng)用的藥物劑型包括無菌水溶液或分散液或有意臨時(shí)制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末(美國(guó)專利us5,466,468特別地以其完整的形式并入本文參考)。在所有情況下，劑型應(yīng)當(dāng)是無菌的且應(yīng)當(dāng)是流動(dòng)的以達(dá)到方便注射性能的程度。它在制備和儲(chǔ)存條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的且應(yīng)當(dāng)防止微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含，例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其適合的混合物和/或植物油。例如，可以通過使用包衣衣料例如卵磷脂、通過維持分散液情況中所需的粒徑和通過使用表面活性劑維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。可以用各種抗菌劑和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等防止微生物的作用。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如、但不限于糖類或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)延長(zhǎng)可注射組合物的吸收。

對(duì)于用水溶液胃腸外施用，例如，如果必要，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)緩沖該溶液，且液體稀釋劑首先與足量的鹽水或葡萄糖等滲。這些特定的水溶液尤其適合于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。例如，將1個(gè)劑量溶于1ml等滲nacl溶液并且加入到1000ml皮下輸注流體中或在建議的輸注部位注射(參見，例如“remington'spharmaceuticalsciences”第15版,第1035-1038和1570-1580頁(yè))。劑量中的一些改變必要地根據(jù)待治療的受試者病情的不同而發(fā)生。負(fù)責(zé)施用的人員在任何情況下都可以決定用于個(gè)體受試者的適合的劑量。

通過將所述組合物以所需量與各種另外上述舉出的成分(如果需要)一起摻入適合的溶劑、然后無菌過濾制備無菌注射溶液。通常，通過將各種無菌的組合物摻入無菌媒介物制備分散液，所述無菌媒介物包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和所需的來自上述舉出的那些的另外的成分。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況中，一些制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其從預(yù)先無菌過濾的溶液中得到活性成分+任意另外的期望的成分的粉末。將粉狀組合物與液體載體合并，例如水或鹽水溶液，其中使用或不使用穩(wěn)定劑。

在另外的實(shí)施方案中，為通過不同的多種途經(jīng)施用配制所述組合物，例如局部(即透皮)施用、粘膜施用(鼻內(nèi)、陰道等)和/或吸入。

用于局部施用的藥物組合物可以包括為醫(yī)療應(yīng)用配制的組合物，例如軟膏劑、糊劑、霜?jiǎng)┗蚍勰＼浉鄤┌ㄋ杏托晕招匀閯┖突谒苄缘挠糜诰植渴┯玫慕M合物，而霜?jiǎng)┖拖磩┦莾H包括乳劑基質(zhì)的那些組合物。局部施用的藥物可以包含滲透促進(jìn)劑以有利于活性成分通過皮膚吸收。適合的滲透促進(jìn)劑包括甘油、醇類、烷基甲基亞砜類、吡咯烷酮類和月桂氮卓酮(luarocapram)。用于局部施用的組合物的可能的基質(zhì)包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和凡士林油以及其它適合的吸收乳劑或水溶性軟膏劑基質(zhì)。局部制劑還可以包括乳化劑、膠凝劑和抗微生物防腐劑(如果必要)以對(duì)組合物防腐并且提供均勻的混合物。所述組合物的透皮施用還可以包含使用“貼劑”。例如，貼劑可以以預(yù)定速率和連續(xù)方式在固定時(shí)間期限內(nèi)提供一種或多種組合物。

在一些實(shí)施方案中，可以提供滴眼液、噴鼻劑、吸入劑和/或其它氣霧劑遞送媒介物遞送所述組合物。用于將組合物通過鼻部噴霧劑直接遞送至肺的方法描述在美國(guó)專利us5,756,353和us5,804,212中(各自特別地以其完整的形勢(shì)并入本文參考)。同樣，使用鼻內(nèi)微粒樹脂(takenaga等人,1998)和溶血磷脂?；视突衔?美國(guó)專利us5,725,871，特別地以其完整的形式并入本文參考)遞送藥物也是制藥領(lǐng)域眾所周知的且可以用于遞送本文所述的組合物。同樣，聚四氟乙烯支持物基質(zhì)形式的跨粘膜遞藥描述在美國(guó)專利us5,780,045中(特別地以其完整的形式并入本文參考)并且可以用于遞送本文所述的組合物。

還關(guān)注本文公開的組合物可以通過氣霧劑遞送。術(shù)語(yǔ)氣霧劑是指固體細(xì)粉或液體顆粒分散于液化或加壓氣體拋射劑中的膠體系統(tǒng)。用于吸入的典型氣霧劑由活性成分在液體拋射劑或液體拋射劑和適合的溶劑的混合物中的混懸液組成。適合的拋射劑包括烴類和烴醚類。適合的容器根據(jù)拋射劑的壓力要求的不同而改變。施用氣霧劑可以根據(jù)受試者的年齡、體重和癥狀的嚴(yán)重性和響應(yīng)的不同而改變。

本發(fā)明的優(yōu)選的藥物劑型是膠囊、片劑、栓劑、注射溶液、霜?jiǎng)┖蛙浉鄤?、特別優(yōu)選的是吸入用制劑，例如氣霧劑；用于注射的和用于口服攝入的制劑。

藥盒

還預(yù)期可以將本文公開的化合物或組合物包裝在包含多個(gè)容器的藥盒的形式中。這類藥盒的許多實(shí)施方案是可能的。在一些實(shí)施方案中，藥盒包含用于制備酪氨酸激酶抑制劑化合物的方法的多種成分。在具體的實(shí)施方案中，藥盒包含取代的苯胺、活化的氟化物化合物、一種或多種還原劑和硼酸或錫衍生物。在另外的實(shí)施方胺中，藥盒包含硼酸酯、鹵代-芳基或雜芳基化合物、催化劑和任選的一種或多種還原劑。在另外的實(shí)施方案中，用于制備藥物組合物的藥盒包含酪氨酸激酶抑制劑(例如式viii的化合物)和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。涵蓋藥盒的許多另外的變化形式和實(shí)施方案。

所述藥盒典型地還包括用于使用該藥盒的成分的說明書，以便實(shí)施主題方法，但不一定需要包括這類說明書。用于實(shí)施主題方法的說明書通常被記錄在適合的記錄介質(zhì)上。例如。說明書可以作為包裝插頁(yè)存在于藥盒中或在藥盒或其組成部分的容器的標(biāo)簽上。在另外的實(shí)施方案中，說明書作為電子儲(chǔ)存數(shù)據(jù)文件存在，其可以在適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)可讀儲(chǔ)存介質(zhì)上呈現(xiàn)，例如cd-rom、軟磁盤或閃存驅(qū)動(dòng)器。在另外的實(shí)施方案中，確切的說明書并不存在于藥盒中，而是提供用于從遠(yuǎn)端來源(例如通過因特網(wǎng))得到該說明書的方式。該實(shí)施方案的實(shí)例是包括網(wǎng)址的藥盒，其中說明書可以是可視的和/或從其中下載該說明書。與說明書一樣，這種用于得到說明書的方式被記錄在適合的底物上。

實(shí)施例

實(shí)施例1.制備1-式iii的制備

將4-氨基苯基乙酸乙酯(3.67g,20.45mmol)與4-溴-1-氟-2-硝基苯(3.00g,13.64mmol)和dma(10ml)一起加入到20ml微波小瓶中。密封該反應(yīng)混合物，在160℃下置于微波照射中30分鐘。向粗反應(yīng)混合物中加入水，用etoac萃取產(chǎn)物。用鹽水1x、酸化水(ph～4)2x和鹽水2x洗滌有機(jī)萃取物。采集有機(jī)層，然后用mgso4干燥。使用快速色譜法與己烷/etoac純化濃縮的粗產(chǎn)物，得到2-(4-((4-溴-2-硝基苯基)氨基)苯基)乙酸乙酯3，為血紅色油狀物(4.2g,81％)。esmsm/z379(m+h)⁺.2-(4-((4-溴-2-硝基苯基)氨基)苯基)乙酸乙酯(式iii)的結(jié)構(gòu)如下所示：

實(shí)施例2.制備2-式iv的制備.

將2-(4-((4-溴-2-硝基苯基)氨基)苯基)乙酸乙酯(2.026g,5.34mmol)放入100ml圓底燒瓶。向燒瓶中加入etoh(20ml)和鋅(3.49g,53.4mmol)，然后用冰浴冷卻該反應(yīng)混合物。用etoh(10ml)稀釋乙酸(2.246g,37.4mmol)，然后滴加入反應(yīng)混合物，歷時(shí)1h。將該反應(yīng)混合物在0℃攪拌5h，然后過濾，蒸發(fā)etoh。用nahco3水溶液堿化該反應(yīng)混合物，用乙醚萃取產(chǎn)物。用nahco3水溶液將該反應(yīng)混合物洗滌3次，采集有機(jī)層。用mgso4干燥有機(jī)層，蒸發(fā)溶劑，得到2-(4-((2-氨基-4-溴苯基)氨基)苯基)乙酸乙酯4，為淡紫色固體(1.834g,98％)。esmsm/z349(m+h)⁺.2-(4-((2-氨基-4-溴苯基)氨基)苯基)乙酸乙酯的結(jié)構(gòu)(式iv)如下所示：

實(shí)施例3.制備3-式v的制備.

將如上所述制備的2-(4-((2-氨基-4-溴苯基)氨基)苯基)乙酸乙酯(2g,5.73mmol)放入50ml圓底燒瓶。將tmof(15ml)加入燒瓶，然后加入ptsa(0.109g,0.573mmol)。將該反應(yīng)混合物在rt攪拌3h。蒸發(fā)過量的溶劑，用nahco3水溶液洗滌該反應(yīng)混合物。用乙醚萃取產(chǎn)物，用nahco3水溶液2x和1x鹽水洗滌有機(jī)層。采集有機(jī)層，干燥，濃縮，得到2-(4-(5-溴-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯5，為棕色固體(2.04g,99％)。esmsm/z359(m+h)⁺.2-(4-(5-溴-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯(式v)的結(jié)構(gòu)如下所示：

實(shí)施例4.制備4-式ix的制備.

將2-(4-(5-溴-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯(4g,11.14mmol)、雙(頻哪醇酸)二硼(8.48g,33.4mmol)和koac(3.28g,33.4mmol)溶于二噁烷(100ml)。用n2給該反應(yīng)混合物脫氣10min，加入pd2(dba)3(0.102g,0.111mmol)和p(cy)3(0.094g,334mmol)。密封試管，在正n2壓力下加熱至85℃12h或直到基于tlc和lc-ms測(cè)定全部原料耗盡。蒸發(fā)溶劑，使產(chǎn)物吸附的硅膠上。用快速色譜法純化該化合物，得到化合物2-(4-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯9(4.09g,86％)。esmsm/z407(m+h)⁺¹。2-(4-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯的結(jié)構(gòu)(式ix)如下所示：

實(shí)施例5.制備5-式vi的制備.

將2-(4-((2-氨基-4-溴苯基)氨基)苯基)乙酸乙酯(800mg,2.227mmol)與4：1dmf/水(20ml)一起放入30mlcem微波小瓶。向小瓶中加入1-甲基吡唑-4-硼酸頻哪醇酯(556mg,2.67mmol)與na2co3(1,168mg,11.14mmol)。用n2給反應(yīng)容器脫氣10min，然后添加pd(dppf)cl2(91mg,0.111mmol)。用微波反應(yīng)器在130℃將該反應(yīng)混合物加熱20min，蒸發(fā)溶劑。使反應(yīng)殘余物吸附在硅膠上，通過快速色譜法純化產(chǎn)物，得到2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯6(365mg,45.5％)。esmsm/z361(m+h)⁺¹。2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯的結(jié)構(gòu)(式vi)如下所示：

使用如上述制備5中所述的suzuki偶合方法，得到下表1中所述的中間體：

表1.

實(shí)施例6.制備6-式vii的制備.

將lioh(72.5mg,3.03mmol)與h2o(4ml)一起加入到30mlcem微波小瓶中，將2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸乙酯(365.3mg,1.014mmol)溶于thf(4ml)，轉(zhuǎn)入微波小瓶。在100℃下在微波中將該反應(yīng)混合物加熱10min，通過tlc和lc-ms驗(yàn)證水解完成，蒸發(fā)全部溶劑。用h2o再溶解該反應(yīng)混合物，用dcm洗滌1次。然后濃縮水層，得到化合物2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰7(302mg,90％)。esmsm/z331(m-li)^-1。2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰的結(jié)構(gòu)(式vii)如下所示：

使用與如上述制備6中所述的水解方法，得到下表2中列出的中間體：

表2

實(shí)施例7-式viii的制備.

向100ml圓底燒瓶中加入2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酸鋰(600mg,1.805mmol),edc(700mg,4.51mmol)、hoat(246mg,1.805mmol)、dipea(0.377ml,2.166mmol)和5-(叔丁基)異噁唑-3-胺(380mg,2.71mmol)。然后向該反應(yīng)混合物中加入dmf(15ml)，在正氮?dú)鈮毫ο旅芊鉄?。在rt(～20-25℃)攪拌12h。在12h時(shí)間點(diǎn)時(shí)，通過tlc和lc-ms驗(yàn)證已經(jīng)耗盡全部原料，使用快速色譜法純化該反應(yīng)混合物。采集產(chǎn)物峰，縮合，得到n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺8(589.2mg,71.8％)。esmsm/z455(m+h)⁺¹。n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺的結(jié)構(gòu)(化合物1：式viii的化合物)如下所示：

使用如上述實(shí)施例1中所述的縮合方法，得到下表3中列出的中間體：

表3

實(shí)施例8-雙向ret和vegfr2激酶抑制劑的發(fā)現(xiàn).

ret和vegfr2計(jì)算機(jī)結(jié)合模型的建立

用吡唑并嘧啶pp1和4-苯胺喹唑啉zd6474(凡他尼布)使ret原癌基因酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)晶。這些化合物是蛋白激酶的i型抑制劑，并且已經(jīng)證實(shí)其結(jié)合dfg內(nèi)構(gòu)象中的ret激酶。通過基于溫育的研究經(jīng)過動(dòng)力學(xué)方式測(cè)定該骨架結(jié)合dfg外構(gòu)象中的ret激酶(ii型)。通過從zd6474/ret的晶體結(jié)構(gòu)的變構(gòu)袋的背面上除去殘基ser774－gln781生成用于dfg外的ret激酶的模型。這種精修的dfg外ret激酶模型用于分子對(duì)接。discoverystudio3.5visualizer、autodockvina和autodocktools用于潛在小分子抑制劑的分子模型化。經(jīng)證實(shí)dfg外模型精確地預(yù)測(cè)ii型抑制劑的結(jié)合模式。

藥物發(fā)現(xiàn)和研發(fā)

建立用于ret和vegfr2小分子激酶抑制劑(來自激酶定向的片段(kdf)文庫(kù))的適合的篩選試驗(yàn)。ret激酶試驗(yàn)使用ezreaderelectrophoresismobilitychipinstrument(caliperlifescience)。在本試驗(yàn)中，將2nm重組ret酶(invitrogen)于小分子抑制劑或?qū)φ站彌_液一起溫育30min，以使ii型激酶抑制劑俘獲dfg外該抑制劑結(jié)合的構(gòu)象。這類抑制劑間接地與atp競(jìng)爭(zhēng)，且緩慢結(jié)合動(dòng)力學(xué)(低kd)能夠使得所述抑制劑實(shí)質(zhì)上顯示出非競(jìng)爭(zhēng)性和實(shí)質(zhì)上假擬的不可逆性。因?yàn)檫@些抑制劑的非競(jìng)爭(zhēng)性，所以在本試驗(yàn)中并入更具有生物相關(guān)性濃度的atp底物(200μm)。30min預(yù)溫育后，加入包含200μmatp、20mmmgcl2和1.5μm熒光標(biāo)記的ret底物肽(caliperls,肽22；perkinelmer,usa)的底物混合物。然后使用ezreader儀器測(cè)定ret底物肽的轉(zhuǎn)化水平。類似地，還使用相同的肽底物建立vegfr2和ret/v804m激酶試驗(yàn)。

由于ret和vegfr2的atp活性位點(diǎn)高度同源，所以篩選和優(yōu)化主要集中于ret。僅用有效ret抑制劑測(cè)定vegfr2活性，以便測(cè)定選擇性、通過片段(和/或特別處理的結(jié)構(gòu)，分子量：小于300)篩選鑒定咪唑類似物，所述片段篩選使用200μm的atp濃度以避免非特異性結(jié)合和假陽(yáng)性。具有已知測(cè)定ret激酶dfg袋的vegfr-2晶體結(jié)構(gòu)的ret激酶的同源性模型化易于進(jìn)行親脂性基團(tuán)(例如間-三氟甲基苯基基團(tuán))的添加。結(jié)構(gòu)-活性相關(guān)性(sar)信息與dfg袋和苯并咪唑5位上取代的進(jìn)一步優(yōu)化的組合得到了臨床候選物pz-1(n-(5-(叔丁基)異噁唑-3-基)-2-(4-(5-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-1h-苯并[d]咪唑-1-基)苯基)乙酰胺，其在生化試驗(yàn)中具有活性且ret野生型、gatekeeper突變體retv804m和vegfr2的ic50小于1nm。pz-1的實(shí)際效能超過生化試驗(yàn)的可測(cè)定限。

在基于細(xì)胞的試驗(yàn)中測(cè)定pret和pvegfr2的活性，并且pz-1等效地抑制兩種磷酸生物標(biāo)記。分別如圖3和圖4中所示的自-ret磷酸化(tt細(xì)胞系中)和自-vegfr2磷酸化(hek293細(xì)胞系中)的抑制活性顯示與ret和vegfr2生化試驗(yàn)的強(qiáng)烈相關(guān)性。臨床候選物pz-1在測(cè)試的全部細(xì)胞系和突變中在納摩爾濃度下抑制90％ret和vegfr2自磷酸化(圖1-4)。

作用機(jī)制和總體激酶選擇性

pz-1在低于1nm下對(duì)ret和全部測(cè)試的ret突變它特別有效，包括gatekeeper突變體ret/v804m(圖1-3)。本文所述的ret生化試驗(yàn)不適合于測(cè)定基于低于1nm的ic50的抑制劑的活性，因?yàn)閞et酶在本試驗(yàn)中的濃度為2nm。因此，中間體化合物用于動(dòng)力學(xué)研究。將溫育時(shí)間從5min延長(zhǎng)至20min或60min導(dǎo)致ic50增加3-倍(100nm到30nm)，這表明dfg內(nèi)到dfg外的構(gòu)象改變，即ii型激酶抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)特征。用pz-1在50nm濃度下對(duì)kinomescan中的91種激酶進(jìn)行篩選，這代表了每個(gè)kinome簇的多樣性。kinomescan中的激酶試驗(yàn)比上述生化試驗(yàn)更為敏感。盡管對(duì)5種激酶(trkb、trkc、gka、fyn和src)具有～90％的抑制率，但是基于有效的細(xì)胞數(shù)據(jù)，pz-1仍然對(duì)這些激酶具有顯著的選擇性(在1nm下對(duì)pret強(qiáng)烈抑制)，表明良好的總體kinome選擇性。

基于細(xì)胞的試驗(yàn)中pz-1對(duì)pret和pvegfr2活性的抑制

在幾種不同的細(xì)胞系中測(cè)定pz-1對(duì)ret自-磷酸化的抑制，包括表達(dá)ret/c634y或ret/m918t的nih3t3成纖維細(xì)胞、表達(dá)ret/c634w(mtc)的tt、nthy-ory-3-1(甲狀腺，用ret不轉(zhuǎn)化；陰性對(duì)照)、hek293/ret/ptc1(可以在ptc&肺癌中發(fā)現(xiàn)的ccdc6-ret)、hek293/ret-kif5b(可以在肺癌中發(fā)現(xiàn)的)、hek293/ret/ptc3(ncoa4-ret，可以在ptc&肺癌中發(fā)現(xiàn)的)和用ret/c634r-v804m轉(zhuǎn)染的hek293(圖1-3)，用包含期望突變體的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后36hrs，使細(xì)胞血清饑餓12hrs，且然后用所示濃度的pz-1處理2hrs，使總細(xì)胞裂解物進(jìn)行試驗(yàn)抗-磷酸-y1062(αp1062)和抗-磷酸-y905(αp905)ret抗體的免疫印跡。使用抗-ret(αret)抗體使印跡標(biāo)準(zhǔn)化。在1nm下，pz-1在全部細(xì)胞系中強(qiáng)烈地抑制劑pret(圖1-3)，包括表達(dá)ret/c634r-v804m的細(xì)胞。pz-1在1nm下還強(qiáng)烈地抑制用vegfr2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和用vegf刺激的hek293細(xì)胞中的vegfr2自磷酸化(圖4)。pmapk是許多激酶途經(jīng)通過ras/mek/erk途經(jīng)的信號(hào)的下游標(biāo)記。在包含ret突變體的tt細(xì)胞中(圖3)，pmapk和pret類似地在1nm下被強(qiáng)烈地抑制。相反，在甲狀腺細(xì)胞系中(nthy-ory-3-1，用致癌基因ret不轉(zhuǎn)化)中，pmapk僅在100nm下被抑制(圖3)，證實(shí)pz-1的總體kinome選擇性。

ret-驅(qū)動(dòng)的癌細(xì)胞系中pz-1的抗增殖作用

將nthy-ory-3-1和tt細(xì)胞接種在60-mm平皿中。將細(xì)胞保持在2％(nthy-ori-3-1)或10％(tt)胎牛血清中。在鋪板后1天，將不同濃度的pz-1或媒介物加入到培養(yǎng)基中并且每隔2-3天改變一次。每隔2-3天計(jì)數(shù)一次細(xì)胞。ba/f3細(xì)胞增殖依賴于il3，并且在表達(dá)組成型活性激酶例如ret時(shí)失去這種依賴性。將表達(dá)親代和ret/ptc的ba/f3保持在6-多孔板中的10％胎牛血清中，并且連續(xù)4天隔天計(jì)數(shù)一次，每隔2天改變一次培養(yǎng)基。為了比較細(xì)胞生長(zhǎng)，使用instat軟件程序(graphpadsoftwareinc)進(jìn)行未配對(duì)斯氏t檢驗(yàn)。全部p值是雙面的。通過曲線擬合分析、prism軟件程序(graphpadsoftwareinc)計(jì)算ic50劑量。pz-1抑制ret驅(qū)動(dòng)的癌細(xì)胞增殖，其中對(duì)tt細(xì)胞的ic50為1.86nm(圖5)、對(duì)lc-2/ad細(xì)胞的為907pm(圖5)且對(duì)ret/ptc3轉(zhuǎn)染的ba/f3細(xì)胞為340pm(圖6)。當(dāng)使用3天時(shí)，直到1000nmpz-1也未顯著地減少親代nih3t3成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)，這證實(shí)了其選擇性。

pret和pvegfr2的體內(nèi)靶標(biāo)抑制(ivti)測(cè)定和效能模型

將tt細(xì)胞(7.5x10⁶/小鼠)皮下接種入39只scid小鼠(jacksonlaboratories,barharbor,maine)的背側(cè)部分(雙側(cè))。5周后，每只小鼠中存在至少一個(gè)腫瘤；將帶有腫瘤的小鼠隨機(jī)分組以便通過口腔管飼法接受pz-1(0.3、1.0或3.0mg/kg，每日)(29只小鼠，52個(gè)腫瘤)或媒介物(10只小鼠，18個(gè)腫瘤)。施用處理連續(xù)28天。每周使用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤直徑。通過旋轉(zhuǎn)橢圓體公式計(jì)算腫瘤體積(v)：v＝axb²/2(a＝軸直徑；b＝旋轉(zhuǎn)直徑)并且報(bào)道為平均體積±標(biāo)準(zhǔn)偏差。pz-1在全部測(cè)試劑量下均強(qiáng)烈地抑制腫瘤生長(zhǎng)(圖7)。還在植入ret/c634y或hras(g12v)轉(zhuǎn)化的nih3t3成纖維細(xì)胞的裸鼠中評(píng)價(jià)了pz-1的抗腫瘤發(fā)生活性。在這種情況中，將nih3t3ret/c634y或nih3t3hras/g12v細(xì)胞皮下接種入balb/cnu/nu小鼠(n.31只小鼠/細(xì)胞系)(jacksonlaboratories,barharbor,maine)的背側(cè)部分(雙側(cè))。4天后，在腫瘤出現(xiàn)前，將動(dòng)物隨機(jī)分組以便通過口腔管飼法接受pz-1(1.0、3.0或10mg/kg，每日)(23只小鼠/細(xì)胞系：8只小鼠/組，1.0和3.0mg/kg，每日劑量，和7只小鼠10劑量mg/kg，每日)或媒介物對(duì)照組(8只小鼠)。每隔1-2天使用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤直徑。通過旋轉(zhuǎn)橢圓體公式計(jì)算腫瘤體積(v)：v＝axb²/2(a＝軸直徑；b＝旋轉(zhuǎn)直徑)并且報(bào)道為平均體積±標(biāo)準(zhǔn)偏差。盡管所述處理總體上預(yù)防了ret細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤形成，其僅是減少、而不是根除hras癌基因驅(qū)動(dòng)的腫瘤形成(圖8)。

在圖8中報(bào)道的腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，用不同劑量的pz-1(1.0或3.0mg/kg每日)將媒介物處理的腫瘤中的一些測(cè)試48hr或保持不處理。在處理結(jié)束時(shí)，將蛋白質(zhì)裂解物使用抗-磷酸-y1062(αp1062)和抗-磷酸-905(αp905)ret抗體、抗-磷酸-mapk(αpmapk,t302/y304)、抗-磷酸-shc(αpshc,y317)、抗-磷酸-p70s6k(αpp70s6k,t389)、抗-磷酸-s6rp(αps6rp,s235/s236)和抗-磷酸-vegfr2(αpvegfr2,py1175)抗體進(jìn)行免疫印跡。pz-1處理在ret/c634y-和hras/g12v-誘導(dǎo)的腫瘤中抑制pvegfr2，并且僅在ret/c634y-誘導(dǎo)的腫瘤中抑制ret磷酸化和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)(shc、mapk、p70s6k和s6rp)(圖9)。

pz-1的臨床前期配制、pk、pd和毒理學(xué)

為了進(jìn)行pz-1在動(dòng)物中的pk研究，生成用于口服施用的在500μl聚山梨醇酯80、500μletoh和1.0mlph2緩沖液中的溶液制劑。為了進(jìn)行毒性研究，生成在吐溫20(20％)和黃原膠(0.125％)中的混懸液制劑。

pz-1具有6.5μg/hr/ml的auc(溶液制劑)和在小鼠中在2mg/kg下3.8h的消除半衰期。在大鼠中的口服pk研究中，pz-1在10mg/kg(口服)時(shí)顯示出97％的高生物利用度與19μg/hr/ml的auc和在1mg/kg(iv)時(shí)1.9μg/hr/ml的auc。口服研究中的消除半衰期為4.2h，清除率為9ml/min/kg，且容量分布為2.02l/kg。大鼠中的t1/2(3-4hrs)與小鼠中的t1/2一致(4.2hrs)。

在體外，pz-1在包含ret^c634w的mtctt細(xì)胞系中是抗增殖的，ic50為1.86nm，并且對(duì)用癌基因ret(ret/ptc3)轉(zhuǎn)染的ba/f3細(xì)胞具有抗增殖作用，ic50為0.34nm。pz-1在膜片鉗herg試驗(yàn)中具有最小的活性，其中herg試驗(yàn)的ic50為10μm(genscript)。對(duì)ret的選擇性超過對(duì)herg10,000-倍，這表明清楚的心血管毒性特性。pz-1對(duì)cyp2d6(ic50為13.8μm)和cyp3a4(ic50為7.4μm)都具有最小的活性，表明使用兩種主要的cyp同種型不存在藥物-藥物相互作用問題。

在使用10mg/kg－100mg/kg混懸液制劑的每日劑量遞增的小鼠中的1周-長(zhǎng)毒理學(xué)研究中，不存在顯著的毒性。心臟、腎和肝臟中的器官病理學(xué)分析在100mg/kg劑量下未顯示不良反應(yīng)。類似地，在任何劑量下都未影響毒性標(biāo)記，包括磷、肌酸酐、總膽紅素、ggt、alp、葡萄糖、總蛋白、白蛋白、球蛋白、鈣、膽固醇和bun。肝毒性標(biāo)記alt在10mg/kg下在血清(bloodsyrum)中成比例地從22u/l增加至在30mg/kg下的51u/l和在100mg/kg下的96u/l。在最高劑量下，alt的濃度稍高于正常的80u/lalt水平，但低于200u/l的毒性閾值。alt水平易于監(jiān)測(cè)且可以用作臨床環(huán)境中的可逆毒性標(biāo)記。

實(shí)施例9-方法.

ret生物化學(xué)測(cè)定

ret激酶試驗(yàn)使用基于微流體的用于直接激酶活性讀出的儀器(caliperlifescience)。在本試驗(yàn)中，將1-2nm重組ret酶(invitrogen)與小分子抑制劑或?qū)φ战M緩沖液一起預(yù)溫育30min，以使所述抑制劑俘獲dfg外構(gòu)象。這類抑制劑間接地與atp競(jìng)爭(zhēng)，且緩慢的結(jié)合動(dòng)力學(xué)(極為緩慢的koff)能夠使得所述抑制劑實(shí)質(zhì)上顯示出非競(jìng)爭(zhēng)性和實(shí)質(zhì)上假擬的不可逆性。因?yàn)檫@些抑制劑的非競(jìng)爭(zhēng)性，所以在本試驗(yàn)中并入更具有生物相關(guān)性濃度的atp底物。30min預(yù)溫育后，加入包含180-200μmatp和1.0-1.5μm熒光標(biāo)記的ret底物肽(caliperls,肽22；perkinelmer,usa)的底物混合物。然后使用ezreader儀器測(cè)定ret底物肽的轉(zhuǎn)化水平。緩沖成分的最終試驗(yàn)濃度如下：50mmhepes，0.075％(v/v)brij-35,0.10％(v/v)聚山梨醇酯20，0.02％(w/v)nan3，10mmmgcl2和2mmddt。全部示例性的化合物顯示出具有ic50值<1μm的ret激酶結(jié)構(gòu)域。

vegfr2生物化學(xué)測(cè)定

vegfr-2試驗(yàn)與ret試驗(yàn)相同，但是用1-2nm重組vegfr-2替代ret。全部示例性的化合物顯示出具有ic50值<1μm值的vegfr2激酶結(jié)構(gòu)域。

flt3生物化學(xué)測(cè)定

flt3試驗(yàn)與ret試驗(yàn)相同，但是用1-2nm重組flt3替代ret。此外，用1.0-1.5μm熒光標(biāo)記的flt3底物肽(caliperls,肽2；perkinelmer,usa)替代肽22。全部示例性的化合物顯示出具有ic50值<1μm值的flt3激酶結(jié)構(gòu)域。

細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)

在具有5％小牛血清(nih3t3)或10％胎牛血清(rat1)、2mml-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素-鏈霉素的dmem培養(yǎng)基(gibco,paisley,pa)中培養(yǎng)ret癌基因轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞。使hek293細(xì)胞生長(zhǎng)在補(bǔ)充了10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素-鏈霉素(gibco,paisley,pa)的dmem中。使用lipofectamine試劑，根據(jù)制造商的說明(gibco)用pcdna-ret/c634r-v804m、pbabe-ret/ptc1(ccdc6-ret)、-ret/ptc3(ncoa4-ret)或-kif5b/ret載體進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。用于轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞和hek293的ret構(gòu)建體編碼ret蛋白質(zhì)的短同種型(ret-9)。在補(bǔ)充了10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素-鏈霉素的rpmi(gibco,paisley,pa)中培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)ret/ptc3的親代ba/f3和ba/f3細(xì)胞。通過用電穿孔轉(zhuǎn)染長(zhǎng)同種型ret/ptc3(ret-51)生成穩(wěn)定表達(dá)ret/ptc3蛋白質(zhì)的ba/f3細(xì)胞。使親代細(xì)胞在10ng/mlil3的存在下生長(zhǎng)。使來源于正常甲狀腺濾泡組織并且用sv40larget無限增殖的nthy-ori-3-1(nthy-ori)細(xì)胞系生長(zhǎng)在補(bǔ)充了10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素-鏈霉素的rpmi中。在具有20％小牛血清、2mml-谷氨酰胺和100單位/ml青霉素-鏈霉素的rpmi(gibco,paisley,pa)中培養(yǎng)來源于包含ret/c634w突變的人mtc(carlomagno,1995)的tt細(xì)胞系。

免疫印跡和生長(zhǎng)曲線試驗(yàn)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備蛋白質(zhì)裂解物。簡(jiǎn)言之，用包含50mmn-2-羥基乙基哌嗪-n'-2-乙磺酸(hepes；ph7.5)、1％(vol/vol)tritonx-100、150mmnacl、5mmegta、50mmnaf、20mm焦磷酸鈉、1mm正釩酸鈉、2mm苯基甲基磺酰氟(pmsf)和1μg/ml抑肽酶的緩沖液裂解細(xì)胞。通過以10,000xg離心15min凈化裂解物。通過改進(jìn)的bradford試驗(yàn)(bio-rad,munich,germany)評(píng)價(jià)的包含相差無幾量的蛋白質(zhì)的裂解物進(jìn)行直接蛋白質(zhì)印跡。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒(amershampharmaciabiotech,littlechalfort,uk)檢測(cè)免疫復(fù)合物。當(dāng)在y317上磷酸化時(shí)識(shí)別shc蛋白質(zhì)的抗-磷酸-shc(#y317)來自u(píng)pstatebiotechnologyinc.(lakeplacid,ny)?？?shc(h-108)來自santacruzbiotechnology(santacruz,ca)。對(duì)在thr202/tyr204上磷酸化的p44/42mapk(erk1/2)具有特異性的抗-mapk(#9101)和抗-磷酸-mapk(#9102)來自cellsignalingtechnologies(danvers,ma,usa)。對(duì)在tyr1175上磷酸化的vegfr2/kdr具有特異性的抗-磷酸-vegfr-2/kdr(#2479)和抗-vegfr-2/kdr(#2478)來自cellsignalingtechnologies(danvers,ma,usa)。對(duì)在ser235-236上磷酸化的s6核糖體蛋白具有特異性的抗-磷酸-s6核糖體蛋白(#2211)、抗-s6核糖體蛋白(#2217)、抗-p70s6激酶(p70s6k)(#2708)和抗-磷酸p70s6激酶(t389)(#9234)來自cellsignalingtechnologies(danvers,ma,usa)?？?ret是針對(duì)人ret的酪氨酸激酶蛋白質(zhì)片段(santoro,1995)的多克隆抗體?？?磷酸905是識(shí)別在y905上磷酸化的ret蛋白質(zhì)的磷酸-特異性多克隆抗體?？?磷酸1062是識(shí)別在y1062上磷酸化的ret蛋白質(zhì)的磷酸-特異性多克隆抗體。與辣根過氧化物酶偶合的二次抗體來自santacruzbiotechnology。

ic50值

對(duì)于這些實(shí)施例，使用曲線擬合prism軟件(graphpadsoftware)將劑量響應(yīng)曲線和ic50劑量制圖。未配對(duì)學(xué)生-t檢驗(yàn)(instatprogram,graphpad軟件)用于比較腫瘤生長(zhǎng)。p值在p<.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

上述實(shí)施例中定義了本文公開的化合物和方法的一些實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例在顯示本發(fā)明具體實(shí)施方案的同時(shí)僅作為示例給出。從上述討論和這些實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本公開的主要特征，并且在不脫離其精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種改變和變型，以使本文所述的組合物和方法適應(yīng)不同的用途和條件。可以進(jìn)行各種改變，且在不脫離本公開主要范圍的情況下用等效方案替代其要素。此外，可以進(jìn)行許多變型以使特定情形或材料適應(yīng)于本公開的教導(dǎo)，而不脫離其主要范圍。