本發(fā)明屬于功能性糖技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種聯(lián)合使用酸水解和酶水解制備低分子量果膠水解產(chǎn)物的方法。
技術(shù)背景
果膠廣泛存在于陸生植物的細胞壁中，在農(nóng)業(yè)加工廢棄物中大量存在，特別是在柑橘科植物果實、甜菜根、向日葵盤中含量可達到20-30％(w/w，對干基)。目前果膠在食品制造中主要用于增稠、凝膠和穩(wěn)定化。近年來，果膠水解產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)具有抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移擴散的生理功效。這些活性果膠水解產(chǎn)物的分子量范圍約為10-100kDa，酯化度為10-30％，而富含聚半乳糖的鼠李糖半乳糖醛酸區(qū)(RG)水解片段及光滑的聚半乳糖醛酸區(qū)(HG)水解片段都被報道認為具有抗癌活性。
果膠降解的主要方法包括酸水解和酶解，其中酸水解是利用中強無機酸或有機酸水解果膠中的糖苷鍵，從而達到降低分子量的目的，且在該過程中果膠上的甲酯化羧基發(fā)生去甲酯化，酯化度降低，但是酸水解(例如2mol/L H2SO4，80℃，72h)無法高效切斷果膠的主鏈，即半乳糖醛酸單元之間的糖苷鍵。果膠酶針對性地水解半乳糖醛酸單元之間的糖苷鍵，但并不水解其他糖苷鍵，但果膠酶的效果也會因為支鏈的空間位阻效果而降低。因此，僅采用單獨酸降解或單獨酶降解無法迅速將果膠分子量由平均300kDa以上降解至10-100kDa。但聯(lián)合使用酸降解和酶降解則有可能實現(xiàn)高濃度果膠溶液(20-30％)的迅速降解。
果膠水解后可得到三類片段：(1)聚半乳糖醛酸區(qū)(HG)片段由于有大量游離羧基而具有負電荷；(2)HG與鼠李糖半乳糖醛酸區(qū)(RG)的連結(jié)片段由于RG區(qū)的空間位阻效應而帶有較少負電荷；(3)中性水解片段混合物，包括鼠李糖半乳糖醛酸區(qū)(RG)被水解產(chǎn)生的片段及酯化的HG區(qū)水解片段。由于所帶電荷不同，果膠水解片段的理化性質(zhì)和生理活性也有明顯區(qū)別。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種簡便易行的制備低分子量果膠水解產(chǎn)物的方法，進一步地可以對帶不同數(shù)量電荷的水解片段進行分離。
本發(fā)明的原理為：高濃度果膠溶液(1-30％，w/w)在強酸溶液([H+]＝1-10mol/L)中逐漸降解，其中主要是中性糖單元之間的糖苷鍵(主要在RG區(qū)上)被降解，實現(xiàn)果膠分子的初步降解，表現(xiàn)為果膠粉末從不溶性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙鉅顟B(tài)。此時果膠水解產(chǎn)物平均分子量為：HG區(qū)水解產(chǎn)物200-220kDa，RG區(qū)水解產(chǎn)物30-50kDa，此時中和反應后采用截斷分子量為1000-3000Da的超濾膜去除鹽分。之后用果膠酶進一步水解HG區(qū)，而RG區(qū)的水解有利于提高酶解速率，可在短時間內(nèi)迅速降解HG區(qū)，最后得到平均分子量為60-70kDa的果膠水解片段。進一步地，若需要獲得帶不同數(shù)量電荷的果膠水解產(chǎn)物片段，可將酶解液通過陰離子交換色譜，其中不帶電荷的水解片段可直接通過色譜柱，其余帶電荷片段被吸附；之后用不同濃度(離子強度)的NaCl溶液洗脫，即可分離帶不同數(shù)量電荷的果膠水解片段。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)實現(xiàn)：將一定濃度的果膠一次性加入或分次加入，分散在一 定濃度的酸中，在20-100℃下攪拌反應0.5-12h，之后將反應體系pH調(diào)節(jié)為中性，并用水將反應液稀釋，然后用超濾進行脫鹽，所得果膠水解液進一步用果膠酶進行降解0.5-240min，最后干燥獲得固體水解產(chǎn)物。
特別地，果膠初始濃度為1％-30％(w/v)，所用酸可以是任意無機酸或有機酸，濃度為1.0-10.0mol/L。
特別地，超濾所用超濾膜的截斷分子量為1000-3000Da。
特別地，所用果膠酶可以是任意一種商業(yè)果膠酶，酶解反應所用pH值及溫度為該酶活力最適合的pH值及溫度。
進一步地，在果膠酶酶解之后，還可以用陰離子交換色譜進一步吸附果膠水解產(chǎn)物，之后依次用純水、0.05mol/LNaCl和0.10mol/LNaCl洗脫，可依次獲得中性果膠片段、高RG(鼠李糖半乳糖醛酸區(qū))含量果膠片段和高HG(聚半乳糖醛酸區(qū))含量果膠片段。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明技術(shù)具有如下優(yōu)點：(1)可處理濃度范圍1-30％(w/v)的高濃度果膠溶液；(2)可將果膠水解產(chǎn)物平均分子量降低為60-70kDa，酯化度降低為20％左右；(3)可獲得帶不同電荷數(shù)量的三類果膠水解片段。
具體實施方式
實施例一
將初始濃度24％(w/v)的果膠粉(初始平均分子量350-400kDa)在1.5mol/L的HCl溶液中，在85℃下攪拌210min，得到均勻的果膠溶液，此時HG片段平均分子量220kDa，RG片段平均分子量60kDa；之后用NaOH將反應液pH調(diào)節(jié)至中性，稀釋到固形物含量為2％(w/v)，用截斷分子量為3000Da的超濾膜脫除鹽分，所得果膠水解溶液繼續(xù)用果膠酶(Pectinex Ultra SP-L)水解，果膠酶添加量為0.2(v/v)，在pH5.0，50℃下反應10min，最終可得到平均分子量69kDa的果膠水解產(chǎn)物。進一步用陰離子凝膠色譜吸附，之后依次用純水、0.05mol/LNaCl和0.10mol/LNaCl洗脫，得到中性果膠片段，平均分子量為5kDa、高RG(鼠李糖半乳糖醛酸區(qū))含量果膠片段，平均分子量為75kDa和高HG(聚半乳糖醛酸區(qū))含量果膠片段，平均分子量為100kDa。
實施例二
將初始濃度20％(w/v)的果膠粉(初始平均分子量350-400kDa)在1.0mol/L的HCl溶液中，在90℃下攪拌160min，得到均勻的果膠溶液，此時HG片段平均分子量240kDa，RG片段平均分子量70kDa；之后用NaOH將反應液pH調(diào)節(jié)至中性，稀釋到固形物含量為2％(w/v)，用截斷分子量為1000Da的超濾膜脫除鹽分，所得果膠水解溶液繼續(xù)用果膠酶(Pectinex Ultra SP-L)水解，果膠酶添加量為0.2(v/v)，在pH5.0，50℃下反應30min，最終可得到平均分子量65kDa的果膠水解產(chǎn)物。進一步用陰離子凝膠色譜吸附，之后依次用純水、0.05mol/LNaCl和0.10mol/LNaCl洗脫，得到中性果膠片段，平均分子量為10kDa、高RG(鼠李糖半乳糖醛酸區(qū))含量果膠片段，平均分子量為85kDa和高HG(聚半乳糖醛酸區(qū))含量果膠片段，平均分子量為100kDa。