專利名稱：一種堿性果膠酶pl-str及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種堿性果膠酶PL-STR及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
果膠酶(pectinases)是能協(xié)同分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱。廣泛存在于植物和各種微生物(細(xì)菌、真菌和放線菌)中。由于果膠質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，能夠催化其分解的果膠酶也是種類繁多。根據(jù)分解糖苷鍵的反應(yīng)性質(zhì)或降解底物的性質(zhì)可以分為 果膠水解酶(pectin hydrolases)、果膠裂解酶(pectin lyases, PL)、果膠酯酶(pectin esterases, ΡΕ)和原果膠酶(Alkorta I，et al. Process Biochem 33:21—28,1998)。按其作用最適PH分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。果膠酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料工業(yè)、造紙工業(yè)和紡織工業(yè)中。酸性果膠酶作用最適PH在偏酸性范圍，主要用于水果榨汁和果汁澄清以及飼料工業(yè)，也是目前研究和應(yīng)用較多的果膠酶。堿性果膠酶(Alkaline pectinase)則是指在堿性范圍內(nèi)具有較高活性的果膠酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(Polygalacturonate lyase，簡稱PGL)。其最適pH 在8. 0-10. 0，可以在高pH條件下斷開果膠聚合物主鏈，產(chǎn)寡聚半乳糖醛酸。目前，堿性果膠酶在植物藥提取、茶和咖啡發(fā)酵、油提取，紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)的應(yīng)用越來越受到重視，所以成為人們研究的熱點(diǎn)(Jayani RS, et al. Process Biochemistry 40 :2931_四44，2005)，具有不可估量的潛在應(yīng)用價(jià)值。堿性果膠酶多由細(xì)菌中的桿菌屬和假單胞菌屬產(chǎn)生(Hayashi K，et al.Phytochemistry 45 :1359-1363,1997),放線菌(Beg QK, et al. J Ind Microbiol Biotechnol24 :396-402,2000)和真菌產(chǎn)堿性果膠酶也有報(bào)道(Baracat et al. J Ind Microbiolll =139-142,1993)。不同來源的堿性果膠酶生化性質(zhì)差異較為明顯，報(bào)道的堿性果膠酶的最適作用的PH在8. 5-11.0，最適溫度在30-70°C之間(Singh SA, et al. Process Biochem. 35 :411-417,1999 ；Pietro AD, et al. FEMS Microbiol Lett. 145 :295-298, 1996 ；Zhai C, et al. Enzyme and Microbial Technology. 33 :173-178,2003 ；Membre and Burlot, Appl Environ Microbiol. 60 :2017-2022,1994)。一些堿性果膠酶的基因已經(jīng)被克隆，并且已經(jīng)大腸桿菌、畢赤酵母等表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)(Zhai C，et al. Enzyme and Microbial Technology. 33 :173_178，2003 ；王蕓等，微生物學(xué)通報(bào)，；35 (3) :341-345, 2008)。但堿性果膠酶仍然面臨著在極端堿性條件下失活或酶活很低、表達(dá)量低、生產(chǎn)成本高等問題，至今未得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種堿性果膠酶PL-STR。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述堿性果膠酶的基因pl-str。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述堿性果膠酶基因的重組載體。
本發(fā)明的再一目的是提供包含上述堿性果膠酶基因的重組菌株。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備堿性上述果膠酶的方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述堿性果膠酶的應(yīng)用。本發(fā)明的一種生產(chǎn)上述堿性果膠酶PL-STR的鏈霉菌Mi^ptomyces sp. S27，于 2009年6月四日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 3146，其相關(guān)信息記載于申請?zhí)枮?00910087938的專利中，該專利已公開于2010年9月22日。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的新酶。本發(fā)明人從Mi^ptomyces sp. S27得到一個(gè)新的耐堿、極端堿性條件下有高活性、作用 PH廣的果膠酶。適合于在紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、茶和咖啡發(fā)酵、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)中使用。從上述菌株中獲得了一種堿性果膠酶PL-STR，該酶蛋白含有323個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，沒有預(yù)測的信號肽序列。理論分子量為33. 4kDa。其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示MRRTSARFKL IGAVAATAAA MTLTGVNALS GSAAEAPAPS PLAANSPIGFGAGTTGGAGG60PTVTVTNASQ FVQEVQSSGS KVVQVNGTIN LSSMTKVASN KTIVGVGTSGKITGSGLNVS120NVSNVIIRNL TFTGSNDDAI NVQYSTKVffI DHNDISNAND GALDIKRASDLITVSffNRVH180DHDKTFLLGH SDSNGGEDSG KLRVTYDHNW FDGTNQRHPRVRFGNPVHVL NNYYSNIGSY240GVASTENAGVLVEGNYFENV RDPFHRGEGS SDDGGLAARN NHFVNSGSGETGGSVASIPY300GYTADNASSV KSIVTAGAGV GKI323
本發(fā)明還提供了編碼上述堿性果膠酶的基因。本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一堿性果膠酶基因pl-str，全長972bp，該酶的全基因序列如SEQ ID NO. 2所示atgcgcaggacgagcgcacgcttcaagctgatcggcgccgtggccgccacggccgccgcc60
atgaccctcaccggtgtcaacgcgctcagcggctcggccgcggaggcgccggcgccgagc120
CCgCtggCggccaactcgcccatcggcttcggcgccggcaccaccggcggcgcgggcgga180
cccaccgtcaccgtgacgaacgcgagccagttcgtccaggaagtgcagagcagcggttcg240
aaggtcgtccaggtaaacggcaccatcaacctcagcagcatgaccaaggtggcgtccaac300
aagaccatcgtcggcgtgggcacctccgggaagatcaccggcagcgggctgaacgtcagc360
aacgtcagcaacgtgatcatccgcaacctgaccttcaccggctcgaacgacgacgccatc420
aacgtccagtactccaccaaggtctggatcgaccacaacgacatctcgaacgccaacgac480
ggcgccctcgacatcaagcgcgcctcggacctcatcacggtctcctggaaccgcgtccac540
gaccacgacaagacgttcctgctcggacactccgacagcaacggcggcgaggacagcggc600
aagctgcgggtcacctacgaccacaactggttcgacgggaccaaccagcgccacccgcgg660
gtccgcttcggcaaccccgtccacgttctg￡1￡10￡1￡10 ￡10 acagcaacatcggcagttac720
4
ggcgtggcct ccaccgagaa cgccggcgtg ctggtggagg gcaactactt cgagaacgtc 780agggacccct tccaccgcgg tgagggctcc tcggacgacg gaggcctggc ggccaggaac 840aaccacttcg tcaactccgg ctcgggcgag accggcggct ccgtcgcctc catcccctac 900ggctacaccg ccgacaacgc ctcgtcggtg aagtcgatcg tgaccgcggg cgcgggcgtc 960gggaagatct ga972將堿性果膠酶基因pl-str的DNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行 BLAST比對。發(fā)現(xiàn)與來源于Actinosynnemamirym DSM 43827 (ACU35796)的果膠裂解酶的一致性為72%，與來源于I^seudonocardia sp.的果膠裂解酶的一致性為71 %。說明PL-STR 是一種新的堿性果膠酶，為此基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供優(yōu)良的基因材料。本發(fā)明還提供了包含上述果膠酶基因pl-str的重組載體，優(yōu)選為 pET22b(+)-pl-str0將本發(fā)明的果膠酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間， 使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案， 優(yōu)選為將果膠酶基因插入到質(zhì)粒pET22b(+)上的NcoI和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET22b (+) -pl-str。本發(fā)明還提供了包含上述果膠酶基因pl-str的重組菌株，優(yōu)選為重組大腸桿菌 BL21(DE3)。本發(fā)明還提供了一種制備上述堿性果膠酶PL-STR的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組果膠酶PL-STR的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的果膠酶PL-STR。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3) /pl_str。本發(fā)明還提供了上述堿性果膠酶的應(yīng)用，優(yōu)選其在水解果膠及在紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、茶和咖啡發(fā)酵、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)的應(yīng)用。本發(fā)明的堿性果膠酶的最適pH為10.0，在pH 9. 0_12. 0之間有70%以上的酶活； 具有良好的PH穩(wěn)定性，在pH 7. 0-12. 0之間穩(wěn)定。最適溫度60°C，在50°C及60°C下穩(wěn)定， 易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。做為一種新型的酶制劑，在紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、茶和咖啡發(fā)酵、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)都有應(yīng)用價(jià)值。


圖1堿性果膠酶基因pl-str在大腸桿菌中表達(dá)的果膠酶的SDS-PAGE分析，1，分子量標(biāo)準(zhǔn)；2純化的重組果膠酶。圖2本發(fā)明重組果膠酶PL-STR的最適pH值。圖3本發(fā)明果膠酶PL-STR的pH穩(wěn)定性。圖4本發(fā)明果膠酶PL-STR最適反應(yīng)溫度。圖5本發(fā)明果膠酶PL-STR的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明的一種生產(chǎn)上述堿性果膠酶PL-STR的鏈霉菌Mi^ptomyces sp. S27，于 2009年6月四日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)
5大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 3146，其相關(guān)信息記載于申請?zhí)枮?00910087938的專利中，該專利已公開于2010年9月22日。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體Sti^ptomyces sp. S27由本發(fā)明人分離獲得，宿主大腸桿菌 (Escherichia coli) JM 109 購自 TaKaRa 公司、(Escherichia coli)BL21 (DE3)，載體 pET-22b (+)購自于 Novagen 公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自hvitrogen公司。 果膠、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl，pH7. 0)。 誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基YD(0. 5%蛋白胨、0. 25%酵母提取物、0. 5%果膠、0. 5%多聚半乳糖醛酸、 0. 硫酸鎂、0. 4%磷酸氫二鉀、0. 4%磷酸二氫鉀，pH7. 0)說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。實(shí)施例1 Sti^ptomyces sp. S27產(chǎn)酶特性分析將Sti^ptomyces sp. S27用LB培養(yǎng)基活化后，按照1 %接種量轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基 YD中，置于搖床QOO轉(zhuǎn)/每分鐘)，誘導(dǎo)48小時(shí)后，以pH 9. 0的0. 2% (w/v)多聚半乳糖醛酸為底物，測到明顯堿性果膠酶活性。實(shí)施例2Str印tomyces sp. S27果膠酶編碼基因pl-str的克隆利用基因組提取試劑盒提取Str印tomyces sp. S27基因組DNA。根據(jù)發(fā)表的果膠裂解酶的序列比對結(jié)果找到兩個(gè)保守氨基酸序列保守序列GTHV⑴WI (V) DH和HV (A) Y (V) NNYYE,并設(shè)計(jì)合成了簡并引物PF00M4F和PF00M4R(引物序列見表1)，以Str印tomyces sp. S27的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為95 "C 5min ；94 "C 30sec, 51-46°C 30sec (其中每個(gè)循環(huán)后復(fù)性溫度下降0.5°C )，72°C lmin，10個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入第二個(gè)循環(huán)程序94°C 30sec，46°C 30sec，72°C lmin，25個(gè)循環(huán)后；72°C lOmin，瓊脂糖電泳檢測，得到約^Obp的片段，回收后pGEM-T fesy載體相連并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)檢測為陽性后送測序。根據(jù)測定序列結(jié)果，在NCBI 的 GenBank 中利用 BLASTX(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)進(jìn)行序列比對，初步判斷該基因片段是果膠酶基因片段，并進(jìn)行該片段的相似性研究。該片段長 276bp，與 Thermomonospora curvata DSM 43183 (ACY97999)來源的果膠裂解酶的序列一致性最高為80%。根據(jù)測序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物并將它們分別命名為D1，D2，D3(上游特異性引物)和U1，U2，U3(下游特異性引物)，見表1。通過TAIL-PCR得到已知基因片段序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后測序。將簡并引物得到的核心片段與經(jīng)TAIL-PCR得到的側(cè)翼序列進(jìn)行拼接得到plA 全長基因。結(jié)果表明，該基編碼區(qū)全長972bp (SEQ ID NO. 1)，編碼323個(gè)氨基酸(SEQ IDN0. 2)和一個(gè)終止密碼子。沒有預(yù)測的信號肽序列。酶蛋白與來源于Actinosyrmemamirum DSM 43827 (ACU35796)的果膠裂解酶的氨基酸序列一致性為72 %，與來源于Bacillus sp. TS-47(pdblVBL)的果膠裂解酶的序列一致性為40%。該編碼基因?yàn)橐粋€(gè)新基因。
表1.果膠酶PL-STR TAIL-PCR特異性引物
引物名稱序列(5’—3’)大小(bp)PF00544FGGTACGCACRTNTGGRTNGAYCA23PF00544RCTCGTAGTARTTRTTRTAIRCRTG24DlGACATCTCGAACGCCAACGACGGCGCC27D2GCCAACGACGGCGCCCTCGACATCAAG27D3GTTCGACGGGACCAACCAGCGCCACC26UlTTGCCGAAGCGGACCCGCGGGTG23U2GTGGCGCTGGTTGGTCCCGTCGAACCA27U3CGCGCTTGATGTCGAGGGCGCCGTC25pl-str-petFGAACGCCATGGATATGCGCAGGACGAGCGCAC32pl-str-petRGATACGAATGCGGCCGCGATCTTCCCGACGCCCGC35aY = C/T，K = T/G，R = A/G，N = A/T/G/C ；劃線部分為酶切位點(diǎn)。實(shí)施例3Str印tomyces sp. S27果膠酶基因pl-str的表達(dá)果膠酶基因pl-str與pET22b(+)連接并在大腸桿菌Rosetta(DEIB)中進(jìn)行了表達(dá)。根據(jù)測序及序列分析的結(jié)果設(shè)計(jì)引物pl-str-petF和pl-str-petR(引物序列見表1)，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。質(zhì)粒pET22b(+)和基因片斷進(jìn)行雙酶切(NcoI 和NotI)后連接形成載體pET22b(+)-pl-str，制備BL21(DE!3)感受態(tài)細(xì)胞，將重組質(zhì)粒 pET22b(+)-pl-str電擊轉(zhuǎn)化宿主菌。鑒定陽性重組子，并誘導(dǎo)檢測酶活。取含有重組體質(zhì)粒的BL21(DE3)菌株和含有pET22b(+)空質(zhì)粒的BL21 (DE3)菌株(作對照)，分別接種于 3mL LB (加有100yg/mL的氨芐青霉素)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩培養(yǎng)過夜。分別取100 μ L 過夜培養(yǎng)液加入含ΙΟΟμ g/mL的氨芐青霉素的IOmL LB培養(yǎng)液(1%接種量)中，30°C振蕩培養(yǎng)約2-3h (0D600達(dá)到0. 6-0. 8)后加入終濃度0. 5mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，20°C 180rpm震蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)液12，OOOrpm離心5min，分別收集培養(yǎng)基上清和沉淀，細(xì)胞沉淀用pH9. 0 的緩沖液重懸，超聲破碎后12，OOOrpm離心lOmin，收集上清為細(xì)胞總蛋白(CTP)。按上述酶活測定方法分別檢測培養(yǎng)基上清和CTP酶活。結(jié)果重組酶主要細(xì)胞總蛋白中。
大腸桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的果膠酶PL-STR經(jīng)Ni-NTA柱純化(NEB)，比活為23. OU/mg。純化PL-STR經(jīng)SDS-PAGE得到電泳純的單一條帶，分子量約為35kDa，與預(yù)測分子量相近(圖 1，LANE 2)。實(shí)施例4果膠酶的酶活性分析酶活性測定在pH10.0，60°C條件下，取IOOyL稀釋的果膠酶液，加至2mL含 0. 2%聚半乳糖醛酸和0. 05mmol/L CaCl2的甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液(pH = 10. 0)中，反應(yīng) 15min，用5mL 0. 03mol/L的磷酸終止反應(yīng)，在235nm測定OD值。1個(gè)酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產(chǎn)生1 μ mol不飽和聚半乳糖醛酸的酶量釋放出1 μ mol還原糖的酶量，不飽和聚半乳糖醛酸在235nm處的摩爾消光系數(shù)為4600 ^. cnT1。實(shí)施例5果膠酶PL-STR的酶學(xué)性質(zhì)1、重組果膠酶PL-STR的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定經(jīng)純化的果膠酶PL-STR在不同的pH(pH 8. 0-12. 0)，60°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。所用緩沖液為pH 7. 0-8. 5的0. lmol/L的Tris-HCl緩沖液和pH 9. 0-12. 0的 0. lmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液。純化的果膠酶PL-STR在不同pH的緩沖體系，60°C下測定的PH適性結(jié)果(圖2)表明=PL-STR的最適作用pH為10.0，在pH 12.0時(shí)仍有70%以上的酶活。將酶液在不同pH值(pH 7. 0-12. 0)的緩沖液中于37°C下處理lh，再測定酶活性以研究酶的PH穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖3)，PL-STR在pH范圍為7. 0-10. 0間都很穩(wěn)定，保持 80%以上的酶活。在pH 11.0-12. 0，保持60%以上的酶活。2、重組果膠酶PL-STR的最適溫度及熱穩(wěn)定性的測定最適溫度的測定在pH 10. 0的0. lmol/L的甘氨酸-NaOH緩沖液體系及不同的溫度(0 80°C )下進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖4)表明，PL-STR的最適作用溫度60°C。果膠酶在50°C和60°C下分別保溫不同時(shí)間測定相對酶活力，繪制酶的熱穩(wěn)定性曲線。在50°C下非常穩(wěn)定，60°C下保溫20min，酶活沒有損失，保溫30min后，酶活損失40% (圖 5)。3、不同金屬離子化學(xué)試劑對PL-STR酶活的影響在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性的影響，各種物質(zhì)終濃度為1和5mmol/L。在60°C、pH10. 0條件下測定酶活性。結(jié)果(表 2)表明，ImM和5mM的Cr3+Je3+和EDTA以及5mM的Pb2+幾乎完全抑制PL-STR的活性。5mM 的Li+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Mg2+，和Zn2+強(qiáng)烈抑制PL-STR的活性。Mn2+、SDS和β -巰基乙醇對果膠酶PL-STR有明顯的激活作用，其它離子對酶活沒有影響或有一定的激活作用。4、重組果膠酶PL-STR的Km值測定用不同濃度(l-20mg/mL)的多聚半乳糖醛酸(PGA)為底物，在pH 10. 0的甘氨酸-NaOH反應(yīng)體系中，60°C下測定酶活性，計(jì)算出其在60°C下的Km值。經(jīng)測定，此果膠酶在 60°C下以多聚半乳糖醛酸為底物的表觀Km值為7. 9mg/ml，最大反應(yīng)速度Vmax為17. lymol/ min · mg0表2.不同的金屬離子及化學(xué)試劑對果膠酶PL-STR的活性影響
權(quán)利要求
1.一種堿性果膠酶PL-STR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種堿性果膠酶基因pl-str，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的堿性果膠酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述堿性果膠酶基因pl-str，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO. 2所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述堿性果膠酶基因pl-str的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于所述表達(dá)載體為pET22b(+) -pl-str.,
6.包含權(quán)利要求2或3所述堿性果膠酶基因pl-str的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為大腸桿菌BL21。
8.一種制備堿性果膠酶PL-STR的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組堿性果膠酶PL-STR的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的堿性果膠酶PL-STR。
9.權(quán)利要求1所述堿性果膠酶PL-STR的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種堿性果膠酶PL-STR及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新的堿性果膠酶PL-STR，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述堿性果膠酶PL-STR的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的堿性果膠酶PL-STR最適pH為10.0，在pH 9.0-12.0之間有70％以上的酶活；具有良好的pH穩(wěn)定性，在pH 7.0-12.0之間穩(wěn)定。最適溫度60℃，在50℃及60℃下穩(wěn)定，易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。作為一種新型的酶制劑，在紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、茶和咖啡發(fā)酵、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)都有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12N1/21GK102399764SQ201110345380
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 石鵬君, 羅會穎, 苑鵬, 袁鐵錚, 黃火清 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所