專利名稱：：絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種化合物，是一種絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物，該化合物為一個(gè)新的化合物，對(duì)乳腺管癌細(xì)胞(MDA-MB-435)具有細(xì)胞毒活性。
背景技術(shù)：
：癌癥一直是不能攻克的世界難題，從天然產(chǎn)物中尋找抗癌活性成分是解決這個(gè)世界難題的有效途徑之一。絞股藍(lán)為多年生落葉草質(zhì)藤本絞股藍(lán)屬植物，因?yàn)槠渌缓母鞣N活性成分，尤其是皂甙類成分而被作為傳統(tǒng)的中藥以及開發(fā)成現(xiàn)代保健品。在創(chuàng)新藥物研究過程中，其關(guān)鍵的切入點(diǎn)是必須發(fā)現(xiàn)生物活性先導(dǎo)物，這是創(chuàng)新藥物的前提。由于天然產(chǎn)物本身在自然界常常儲(chǔ)量有限，化學(xué)合成大多涉及長(zhǎng)路線、低收率的復(fù)雜操作，因此，以天然產(chǎn)物為起點(diǎn)，建立分子多樣性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的"類天然產(chǎn)物"化合物庫(kù)，從中發(fā)現(xiàn)活性先導(dǎo)化合物而創(chuàng)制新藥仍是世界藥學(xué)工作者公認(rèn)的有效途徑之一。水解產(chǎn)物豐富了分子多樣性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性并保持了天然產(chǎn)物的某些特性，因而有望成為產(chǎn)生高質(zhì)量先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的理想方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種絞股藍(lán)總皂甙水解產(chǎn)物中分離的化合物，經(jīng)鑒定以及生物活性試驗(yàn)證明，該化合物是一種新的化合物，具有抗癌活性，可作為制備抗癌藥物被應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物，特征在于，其結(jié)構(gòu)式為:2928該化合物的名稱為(3P，23S)腸3畫hydroxyda腿ar隱20，24國(guó)dien國(guó)21國(guó)oicacid21，23-lactone，分子式為C3。H4603，分子量為454。上述絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物的分離方法，其特征在于，按如下步驟進(jìn)行1)絞股藍(lán)總皂甙的水解取300g絞股藍(lán)總皂甙，溶解在5000ml的乙醇中，然后加入500ml鹽酸，6(TC水浴回流8小時(shí)，減壓濃縮揮干乙醇，通過大孔樹脂柱，樹脂柱先用大量的水洗，再用80%的乙醇洗脫，收集80%的乙醇洗脫液濃縮得到80g水解產(chǎn)物；2)水解產(chǎn)物的分離純化水解產(chǎn)物通過硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離提取其中的化學(xué)成分，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，反相柱層析采用加壓裝置，凝膠柱層析選用SephadexLH-20，多次柱層析，最后得到化合物(3J3，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone。經(jīng)申請(qǐng)人所進(jìn)行的鑒定以及生物活性試驗(yàn)證明，該化合物對(duì)乳腺管癌細(xì)胞(MDA-MB-435)具有細(xì)胞毒活性，能夠用于制備抗癌藥物的應(yīng)用。圖1是絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物化學(xué)成分提取分離流程圖；圖2是豐示題化合物(3(3，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien國(guó)21國(guó)oicacid21，23-lactone的關(guān)鍵HMBC和NOE特征關(guān)系；圖3-圖11是標(biāo)題化合物的結(jié)構(gòu)鑒定圖，其中圖3是標(biāo)題化合物^NMR，圖4是標(biāo)題化合物13CNMR(DEPT)，圖5-6是標(biāo)題化合物的HSQC;圖7-8是標(biāo)題化合物HMBC;圖9-10是標(biāo)題化合物的H-HCOSY;圖11是標(biāo)題化合物的NOESY。以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過對(duì)絞股藍(lán)皂苷的水解，分離純化水解產(chǎn)物，鑒定結(jié)構(gòu)，活性測(cè)定，以求發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的化合物和活性先導(dǎo)物，例如抗癌活性先導(dǎo)物。本發(fā)明為一種絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離得到具有抗癌活性的新化合物。絞股藍(lán)總皂甙(純度98%)購(gòu)自西安天一生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞毒活性試驗(yàn)是在廈門大學(xué)完成。上述材料均為公開的生物材料。主要利用的試劑為鹽酸，乙醇，石油醚(60—90°C)，三氯甲烷，丙酮，甲醇等，均為分析純。其分離過程如下1.絞股藍(lán)總皂甙的水解取300g絞股藍(lán)總皂甙，溶解在5000ml的乙醇中，然后加入500ml鹽酸，60'C水浴回流8小時(shí)，減壓濃縮揮干乙醇，通過大孔樹脂柱，樹脂柱先用大量的水洗，再用80%的乙醇洗脫，收集80%的乙醇洗脫液濃縮得到80g水解產(chǎn)物。水解條件為HCl/EtOHl:10,6(TC加熱反應(yīng)8小時(shí)。2.化合物的分離純化參見圖1，水解產(chǎn)物通過硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離提取其中的化學(xué)成分，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，反相柱層析采用加壓裝置，凝膠柱層析選用SephadexLH-20，多次柱層析最后得到化合物。具體步驟為水解產(chǎn)物浸膏80g干法拌樣(100-200目)，250g硅膠(200-300目)，用氯仿-甲醇=100:0,氯仿_甲醇=50:1，氯仿_甲醇=30:1，氯仿-甲醇=20:1，氯仿-甲醇=10:1，氯仿-甲醇=8:2梯度洗脫，每份洗脫液為300ml，減壓蒸餾濃縮，薄板檢測(cè)，相似合并，得到五個(gè)組分；其中Fr2組分顯示較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，F(xiàn)r2組分繼續(xù)用硅膠柱層析氯仿-甲醇-水二9:1:0.1洗脫，得到四個(gè)組分，在活性追蹤下對(duì)Fr2.2用甲醇-水二70:30，用甲醇-水=80:20，用甲醇-水=90:10進(jìn)行反相柱層析(RP-18)及一次凝膠SephadexLH-20柱層析(氯仿_甲醇=1:1)，得到活性化合物。將得到的活性化合物做薄層層析，經(jīng)紫外，碘和硫酸-乙醇顯色為單一斑點(diǎn)，三種溶劑系統(tǒng)展開均為單一斑點(diǎn)，可初步認(rèn)定為單一化合物。3.化合物的鑒定對(duì)分離到的化合物做質(zhì)譜，碳譜，氫譜，以及二維核磁共振?；衔?3P，23S)國(guó)3國(guó)hydroxydammar畫20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone為白色，可溶解于氯仿，比旋光度為[a產(chǎn)D+87.5(CHCl3;c0.25)。由核磁共振譜數(shù)據(jù)(見表1，圖3-圖12)和高分辨質(zhì)譜得出分子式為C30H46O3，分子量為454，査閱參考文獻(xiàn)，然后綜合分析得到的數(shù)據(jù)，并結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)照分析化合物的可能結(jié)構(gòu)類型，最后根據(jù)物理特性和譜學(xué)特征確定標(biāo)題化合物結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>命名為(3j3，23S)-3-hydroxydammar-20，24國(guó)dien-21-oicadd21,23-lactone，結(jié)構(gòu)經(jīng)過多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)査新，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外尚沒有此化合物的報(bào)道，可確定此化合物為新的化合物。表l:化合物(3p,23S)-3-hydroxydammar-20,24國(guó)dien-21-oicacid21，23誦lactone的NMR數(shù)據(jù)(500MHz，CDC13)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.化合物的細(xì)胞毒活性測(cè)定化合物的細(xì)胞毒活性測(cè)定采用MTT分析法測(cè)定。將乳腺管癌細(xì)胞(MDA-MB-435)用培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液(離心1000R,3-5min，重懸)，稀釋60000-70000個(gè)/ml，以每孔80ul接種到96孔板，6000個(gè)/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)(5%C02，37°C)24小時(shí)，每孔加樣20ul。繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配)10ul。振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。繼續(xù)孵育3小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。8-12小時(shí)后，選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。用下列公式計(jì)算IC5。(抑制率50%的時(shí)候藥物的濃度)抑制率=1_加藥組OD值/對(duì)照組OD值;lgIC5。=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中，Xm:lg為最大劑量；I:lg(最大劑量/相臨劑量)；P:陽(yáng)性反應(yīng)率之和；Pm:最大陽(yáng)性反應(yīng)率；Pn:最小陽(yáng)性反應(yīng)率。結(jié)果得到該化合物對(duì)乳腺管癌細(xì)胞(MDA-MB-435)的IC5。為3.9|ug/ml。綜上所述，從絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物(3P，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone，對(duì)乳腺管癌細(xì)胞(MDA-MB-435)具有細(xì)胞毒活性，IC^為3.9pg/ml。該化合物為一種新的化合物，其分子式為C3GH4603，分子量為454。權(quán)利要求1.絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物，特征在于，該化合物的結(jié)構(gòu)式為該化合物的名稱為(3β，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone，分子式為C30H46O3，分子量為454。2.權(quán)利要求1所述的絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物的分離方法，其特征在于，按如下步驟進(jìn)行1)絞股藍(lán)總皂甙的水解取300g絞股藍(lán)總皂甙，溶解在5000ml的乙醇中，然后加入500ml鹽酸，6(TC水浴回流8小時(shí)，減壓濃縮揮干乙醇，通過大孔樹脂柱，樹脂柱先用大量的水洗，再用80%的乙醇洗脫，收集80%的乙醇洗脫液濃縮得到80g水解產(chǎn)物；2)水解產(chǎn)物的分離純化水解產(chǎn)物通過硅膠柱層析、凝膠柱層析、反相柱層析分離提取其中的化學(xué)成分，常壓柱層析采用濕法裝柱和硅膠拌樣上柱，根據(jù)薄層展開情況選擇洗脫溶劑系統(tǒng)，反相柱層析采用加壓裝置，凝膠柱層析選用SephadexLH-20，多次柱層析，最后得到化合物(3P，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述水解產(chǎn)物的水解條件為:HCl/EtOHl:10，6(TC加熱反應(yīng)8小時(shí)。4.權(quán)利要求1所述的絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物用于制備抗癌藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種絞股藍(lán)總皂甙酸水解產(chǎn)物中分離的化合物，該化合物的結(jié)構(gòu)式為右式，命名為(3β，23S)-3-hydroxydammar-20，24-dien-21-oicacid21，23-lactone，分子式為C₃₀H₄₆O₃，分子量為454。經(jīng)申請(qǐng)人所進(jìn)行的鑒定以及細(xì)胞毒活性試驗(yàn)證明，該化合物對(duì)乳腺管癌細(xì)胞(MDA-MB-435)具有細(xì)胞毒活性，能夠用于制備抗癌藥物的應(yīng)用。文檔編號(hào)C07J19/00GK101463062SQ200910020910公開日2009年6月24日申請(qǐng)日期2009年1月15日優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日發(fā)明者張鞍靈,楊勝祥,白明生,秦建春,高錦明申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)