專利名稱：綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因、含有該基因的表達(dá)載體的構(gòu)建、該基因在宿主細(xì)胞中的蛋白表達(dá)。
背景技術(shù)：
多聚半乳糖酸酸醇(polygalacturonases, PG)屬于果膠醇(pectolytic enzyme or pectinase)的一種，其在應(yīng)用上，具有與果膠酶相似的特性。果膠酶是指能夠分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱，其大致分為果膠水解酶、 果膠裂解酶、果膠酯酶和原果膠酶等，其中果膠水解酶又可分為多聚半乳糖醛酸酶 (polygalacturonases, PG)、多聚半乳糖酸酸甲酉旨/K解酶(polymethylgalacturonases, PMG)、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶等。隨著對果膠及果膠酶研究的日益深入，其應(yīng)用領(lǐng)域已逐漸拓寬.盡管如此，就果膠酶的高效、多功能特點而言，其應(yīng)用尚有較大的發(fā)展空間。果膠酶的應(yīng)用性研究1.利用果膠酶降解植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，可用于果蔬汁的生產(chǎn)，果酒的澄清等。2.在油料萃取方面，將果膠酶和纖維素酶、半纖維素酶結(jié)合使用，可破壞油料作物的細(xì)胞壁，便于油料的釋放，從而提高萃取率、提高油料的穩(wěn)定性。3.中藥藥材處理方面，可利用果膠酶生產(chǎn)的提取物有銀杏葉提取物、大蒜油濃縮液、蘑菇濃縮液、人參漿、當(dāng)歸浸膏、甘草液等.另外，在金耳多糖、香菇多糖、金針菇多糖、山楂葉總黃酮等的提取中也使用了果膠酶。利用酶類提取，不僅可提高萃取率，還可提高純度。4.造紙工業(yè)中的生物制漿與紡織品的生物脫膠類似，都是通過果膠酶等酶處理降解植物纖維原料中的果膠、半纖維素及木質(zhì)素，使其分散成滿足造紙工業(yè)不同要求的束纖維或單纖維，以生產(chǎn)柔軟、均一、有彈性的高品質(zhì)材料。5.以果膠為底物生產(chǎn)低聚果膠PG可水解細(xì)胞壁中的果膠成分產(chǎn)生聚合度為10左右的寡聚半乳糖醛酸，后者是植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)因子，防御作用包括產(chǎn)生有抗真菌活性的抗毒素，抑制蛋白合成的抑制劑等等。6.制造保健產(chǎn)品方面酶法降解植物細(xì)胞間質(zhì)中的果膠物質(zhì)產(chǎn)生完整的單細(xì)胞懸液的過程稱為浸解作用。在浸解過程中，一方面設(shè)法使內(nèi)源性果膠酯酶滅活，避免細(xì)胞軟化；另一方面，用外源果膠酶適度降解胞外果膠及其它成分，避免胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，降低品質(zhì).該工藝常用于生產(chǎn)帶肉果蔬汁飲料、乳制品的配料、即食的干燥土豆泥、胡蘿卜泥等食品，以及蘆薈、人參、越橘葉、紅花等美容保健品的配料。7. PG可水解幾丁質(zhì)、幾丁聚糖的B2(l，4)2糖苷鍵，得到水溶性寡糖。這類低分子寡糖具有多方面的生理功能，如抗腫瘤、抗菌、增強免疫機能，改善腸道微生物區(qū)系的分布， 刺激有益菌的生長等。多聚半乳糖醛酸酶具有分解果膠的作用，刺吸性昆蟲(如綠盲蝽)損失植物時，主要是唾液腺蛋白中的多聚半乳糖醛酸酶分解植物細(xì)胞壁的果膠，造成植物細(xì)胞壁的損失， 還能引起植物致病菌的侵染。
在植食性刺吸式昆蟲，是指具有刺吸式器，靠吸食植物汁液為生的昆蟲。一般集中在同翅目和半翅目植食性昆蟲，是糧食作物、蔬菜和觀賞植物的主要害蟲之一。
盲蝽是一類刺吸式害蟲，行動活潑，頗善飛翔。多數(shù)類群為植食性，寄主廣泛，包括被子植物、針葉樹和蕨類。除取食植物的葉片外，尤其喜食花、蕾、果實等繁殖器官。世界已知盲蝽近萬種，世界各大動物區(qū)均有分布。盲蝽對棉花及牧草苜蓿的危害較嚴(yán)重，但同時危害蔬菜。
在美國為害嚴(yán)重的盲蝽主要有3種美國牧草盲蝽Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois),豆莢草盲蟲春 Lygus hesperus Knight 及苜猜盲蟲春 Adelphocoris Iineolatus(Goeze)。其中牧草盲蝽和豆莢草盲蝽為同屬，分別廣泛分布于落基山脈的東部和西部。美國牧草盲蝽是北美分布最廣本土盲蝽，為害廣泛，寄主植物達(dá)到3 種，其中130 種是重要的經(jīng)濟作物，包括棉花、苜蓿、樹苗、草莓及番茄等。豆莢草盲蝽是加利福尼亞棉田重要害蟲，主要取食植物上部和端部的果實部分，尤其喜食花芽。苜蓿盲蝽，古北區(qū)種，歐亞大陸的外來入侵種，危害美國東部加拿大的牧草等。盡管這3種盲蝽在牧草上只是偶爾會達(dá)到很高水平，但當(dāng)苜蓿被收割后，牧草盲蝽和豆莢草盲蝽會轉(zhuǎn)移到附近其他蔬菜和水果上危害，給農(nóng)作物帶來巨大損失)。
近年來，隨著轉(zhuǎn)Bt基因棉在我國大面積種植，棉鈴蟲得到了有效的控制，但由于減少了棉田化學(xué)殺蟲劑的使用，盲蝽上升為主要害蟲，其發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重。中國已記錄的盲蝽約200種左右，實際可能達(dá)600種。在我國，盲蝽除為害棉花外，也為害苜蓿及豆科作物等。棉盲蝽主要有綠盲蝽Lygocoris lucorum (Meyre-Dur)、牧草盲蝽 Lygus pratensis (Linnaeus)、中 Il 盲 Adelphocoris suturalis (Jakovlev)、！If 盲蟲春 Adelphocoris Iineolatus(Goeze)等幾種。盲蝽若蟲和成蟲均可危害棉株，以刺吸式口器吸食花，果實，種子汁液，在棉花上形成“破頭瘋”和“破葉瘋”，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。
綜上，隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，對于綠盲蝽PG基因的研究，更多地擴展到分子水平，PG不僅可以應(yīng)用于傳統(tǒng)的果膠酶應(yīng)用領(lǐng)域，還可以利用該酶的抑制劑作為對刺吸式害蟲的防治策略，從而達(dá)到對目標(biāo)害蟲的防治。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)的核苷酸序列， 以及該序列所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，在獲得目的基因片段的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了 PG基因的重組表達(dá)載體，并將其分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌、畢赤酵母宿主細(xì)胞中表達(dá)PG蛋白，將表達(dá)出的PG蛋白純化后應(yīng)用于食品領(lǐng)域、造紙工業(yè)等領(lǐng)域。
本發(fā)明的一方面在于一種綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :10 或 SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO 12 所示。
本發(fā)明的另一方面在于上述的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因所編碼的蛋白質(zhì)， 其氨基酸序列依次為SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 15所示。
本發(fā)明的另一方面在于攜帶上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的重組表達(dá)載體。
具體的，上述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體或者真核表達(dá)載體。具體的，上述的原核表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體pET48a(+)。具體的，上述的真核表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9。本發(fā)明的另一方面在于由上述表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化得到的重組菌株。本發(fā)明的另一方面在于一種利用權(quán)利要求7所述重組菌株制備綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括如下步驟設(shè)計引物擴增上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因；構(gòu)建含有上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的表達(dá)質(zhì)粒；培養(yǎng)用該質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，經(jīng)過篩選得到菌株；培養(yǎng)菌株，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；分離并純化所表達(dá)的蛋白。本發(fā)明的另一方面在于上述方法制備的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶蛋白在食品領(lǐng)域、造紙工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明的下述具體實施例部分，公開了本發(fā)明技術(shù)方案的完整的實施過程首先提取綠盲蝽總RNA，根據(jù)該酶的保守序列設(shè)計引物，利用RT-PCR方法擴增獲得3個PG的同源基因序列，再利用RACE實驗，獲得5'和3'的未知序列。最后利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分別進(jìn)行了該酶的重組表達(dá)、純化及性質(zhì)分析。有益效果本發(fā)明首先解決了綠盲蝽的多聚半乳糖醛酸酶的基因序列獲取問題，還首例解決了昆蟲來源多聚半乳糖醛酸酶的重組表達(dá)問題。所獲得的重組菌株能大量表達(dá)多聚半乳糖醛酸酶，其在食品(果汁榨取)、油料萃取、中藥藥材處理、造紙工業(yè)及低聚果膠保健產(chǎn)品等方面有良好應(yīng)用前景。另外，針對該酶的抑制劑還可作為對刺吸式害蟲的防治策略，從而達(dá)到對目標(biāo)害蟲的防治。


圖 1 綠盲蝽total RNA 的瓊脂糖凝膠電泳，其中，M :DL2, 000DNA Marker, 1 :total RNA0圖2 =Total RNA的掃描結(jié)果。圖3 瓊脂糖凝膠電泳，其中:M :DL2, OOODNAMarker, 1 利用引物Fl和Rl擴增的 PCR產(chǎn)物，2 利用引物F2和R2擴增的PCR產(chǎn)物。圖4 瓊脂糖凝膠電泳，其中:Lane M :DL2，000DNA Marker ；Lane 1 5'未知序列的 PCR 產(chǎn)物；Lane 2 =M-MLV (-)對照。圖5 瓊脂糖凝膠電泳，其中LaneM :DL2，OOODNAMarker ；Lane 1 3'未知序列的 PCR 產(chǎn)物；Lane 2 =M-MLV (-)對照。圖6 瓊脂糖凝膠電泳，其中:Lane M :DL2，000DNA Marker ；Lane 1 利用引物 PGl-F和PGl-R擴增的PG-I的PCR產(chǎn)物；Lane 2 利用引物PG2-1-F和PG2-1-R擴增的 PG2-1的PCR產(chǎn)物；Lane 3 利用引物PG2-2-F和PG2-2-R擴增的PG2-2的PCR產(chǎn)物。SEQ ID NO :1是根據(jù)多聚半乳糖醛酸酶的同源序列設(shè)計引物Fl和R1，以綠盲蝽全 RNA為模板，通過RT-PCR反應(yīng)得到綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PGl的保守核苷酸序列。序列長為739bp。SEQ ID NO :2是根據(jù)多聚半乳糖醛酸酶的同源序列設(shè)計引物F2和R2，以綠盲蝽全RNA為模板，通過RT-PCR反應(yīng)得到綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2中的一個亞型(命名為PG2-1)的保守核苷酸序列。序列長為578bp。
SEQ ID NO :3是根據(jù)多聚半乳糖醛酸酶的同源序列設(shè)計引物F2和R2，以綠盲蝽全 RNA為模板，通過RT-PCR反應(yīng)得到綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2中的另一個亞型(命名為 PG2-2)的保守核苷酸序列。序列長為486bp。
SEQ ID NO :4 是通過 5 ‘ -Full RACE 實驗，禾丨J 用弓丨物 5，RACE-PG1-R1 和 5，RACE-PGl-R2擴增的PGl的5'未知核苷酸序列。序列長為222bp，第40，41，42的ATG 為起始密碼子。
SEQ ID NO :5 是通過 3 ‘ -Full RACE 實驗，利用弓丨物 3，RACE-PGI-Fl 和 3，RACE-PG1-F2擴增的PGl的3'未知核苷酸序列。序列長為180bp，第129，130，131的 TGA為終止密碼子。
SEQ ID NO :6 是通過 5 ‘ -Full RACE 實驗，利用引物 5，RACE-PG2-1-R1 和 5，RACE-PG2-1-R2擴增的PG2-1的5'未知核苷酸序列。序列長為354bp，第43，44，45的 ATG為起始密碼子。
SEQ ID NO :7 是通過 3 ‘ -Full RACE 實驗，利用引物 3，RACE-PG2-1-F1 和 3，RACE-PG2-1-F2擴增的PG2-1的3'未知核苷酸序列。序列長為497bp，第440，441，442 的TAA為終止密碼子。
SEQ ID NO :8 是通過 5 ‘ -Full RACE 實驗，利用引物 5，RACE-PG2-2-R1 和 5，RACE-PG2-2-R2擴增的PG2-2的5'未知核苷酸序列。序列長為207bp，第38,39,40的 ATG為起始密碼子。
SEQ ID NO :9 是通過 3 ‘ -Full RACE 實驗，利用引物 3，RACE-PG2-2-F1 和 3，RACE-PG2-2-2擴增的PG2-2的3'未知核苷酸序列。序列長為481bp，第440，441，442 的TAA為終止密碼子。
SEQ ID NO 10是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PGl的核苷酸序列。序列長為105;3bp， 第01，02，03的ATG為起始密碼子，第1051，1052，1053的TGA為終止密碼子。
SEQ ID NO :11是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2-1的核苷酸序列。序列長為 1098bp，第01，02，03的ATG為起始密碼子，第1096，1097，1098的TAA為終止密碼子。
SEQ ID NO :12是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2-2的核苷酸序列。序列長為 llOlbp，第01，02，03的ATG為起始密碼子，第1099，1100，1101的TAA為終止密碼子。
SEQ ID NO 13是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PGl的氨基酸序列。共350個氨基酸殘基。
SEQ ID NO 14是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2-1的氨基酸序列。共365個氨基酸殘基。
SEQ ID NO 15是綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶PG2-2的氨基酸序列。共366個氨基酸殘基。
具體實施方式
下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
綠盲蝽Lygocoris Iucorum(Meyre-Dur)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所贈與。下述實施例中涉及到使用試劑盒的實驗操作，均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。實施例1綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的獲得一、綠盲蝽的total RNA提取使用RNAiso plus (大連寶生物公司，Code No. D9108A)對綠盲蝽進(jìn)行總RNA提取， 獲得綠盲蝽的總RNA。取Iul上述綠盲蝽總RNA進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1 Lane M :DL2, OOODNAMarker，其由 DNA 片段，共 6 條帶2，OOObpU, OOObp、750bp、 500bp、250bp 以及 IOObp 組成。Lane 1 綠盲蝽 total RNA,其 ^S rRNA 分子量接近于 DL2, 000DNA Marker 的第 2 條帶(IOOObp)，且亮度較高，18S rRNA分子量接近于DL2，OOODNAMarker第5條帶(250bp)， 且^S的亮度接近于18S的1. 5倍。結(jié)論電泳條帶正常。綠盲蝽總RNA的OD測定及掃描取2ul綠盲蝽總RNA，使用NanoDrop-1000進(jìn)行OD測定及掃描，OD測定結(jié)果如表
1 表1. OD測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQID N0:10或 SEQ ID NO 11 或 SEQ ID NO 12 所示。
2.權(quán)利要求1所述的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列依次為 SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO 14 或 SEQ ID NO 15 所示。
3.含有權(quán)利要求1所述的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的重組表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于其為原核表達(dá)載體或者真核表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于原核表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體 pET-28a(+)ο
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于真核表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)載體 pPIC9。
7.由權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化得到的重組菌株。
8.一種利用權(quán)利要求7所述重組菌株制備綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶的方法，包括如下步驟設(shè)計引物擴增上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因；構(gòu)建含有上述綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶基因的表達(dá)質(zhì)粒；培養(yǎng)用該質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，經(jīng)過篩選得到菌株；培養(yǎng)菌株， 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；分離并純化所表達(dá)的蛋白。
9.權(quán)利要求2所述的綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶蛋白在食品領(lǐng)域、造紙工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種綠盲蝽多聚半乳糖醛酸酶(PG)的基因序列和一種制備該酶的方法。首先提取綠盲蝽總RNA，根據(jù)該酶的保守序列設(shè)計引物，利用RT-PCR方法擴增獲得3個PG的同源基因序列，再利用RACE實驗，獲得5′和3′的未知序列。最后利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分別進(jìn)行了該酶的重組表達(dá)、純化及性質(zhì)分析。本發(fā)明首先解決了綠盲蝽的多聚半乳糖醛酸酶的基因序列獲取問題，還首例解決了昆蟲來源多聚半乳糖醛酸酶的重組表達(dá)問題。在食品(果汁榨取)、油料萃取、中藥藥材處理、造紙工業(yè)及低聚果膠保健產(chǎn)品等方面有應(yīng)用前景。另外，針對該酶的抑制劑還可作為對刺吸式害蟲的防治策略，從而達(dá)到對目標(biāo)害蟲的防治。
文檔編號C12R1/19GK102492706SQ20111040705
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者劉田, 姜秀萍, 楊君, 楊青, 賈秋磊 申請人:大連理工大學(xué)