本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及抗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的多肽、其衍生物、立體異構(gòu)體、或無生理毒性的鹽。本發(fā)明還涉及含有上述多肽、其衍生物、立體異構(gòu)體、或無生理毒性的鹽的藥物組合物，以及所述多肽、其衍生物、立體異構(gòu)體、或無生理毒性的鹽在制備治療和/或預(yù)防和/或輔助治療HIV感染所致相關(guān)疾病尤其是獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS，即艾滋病)的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

艾滋病主要是由人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染所導(dǎo)致的致死性高的傳染性疾病，其流行廣，傳播快。目前該病尚不能根治且缺乏有效疫苗，藥物治療仍是目前唯一有效的方法。臨床上應(yīng)用抗HIV-1藥物，輔以高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法，可以在一定程度上延長HIV感染者的生存時間和改善其生活質(zhì)量。但是，由于HIV疫苗研究進(jìn)展緩慢以及耐藥性問題日益明顯，研發(fā)新型抗HIV藥物即具有新的作用機(jī)制和新的作用靶點(diǎn)的藥物仍是當(dāng)務(wù)之急。

HIV融合抑制劑(HIV fusion inhibitors)是干擾病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的新型抗HIV藥物，其在感染的初始環(huán)節(jié)切斷病毒的傳播，這對于預(yù)防及控制HIV-1感染具有特殊意義，因而成為新機(jī)制抗HIV藥物研究的熱點(diǎn)。

Gp41是介導(dǎo)HIV-1病毒與靶細(xì)胞膜融合的特異性蛋白，是融合抑制劑的主要作用靶標(biāo)。Gp41的胞外區(qū)存在著兩個與膜融合密切相關(guān)的螺旋結(jié)構(gòu)功能區(qū)，即N末端重復(fù)序列(簡稱為HR1、NHR或N肽)和C末端重復(fù)序列(簡稱為HR2、CHR或C肽)。在膜融合過程中，三個gp41分子中的HR2與HR1相互作用，形成一個六螺旋體核心結(jié)構(gòu) (6-HB)。該gp41分子內(nèi)形成的6-HB是整個融合的核心結(jié)構(gòu)，其晶體結(jié)構(gòu)是設(shè)計融合抑制劑的基礎(chǔ)和基本模型。通過設(shè)計肽融合抑制劑與gp41分子相應(yīng)的螺旋區(qū)序列作用，阻礙該內(nèi)源性6HB的形成，從而阻斷病毒和細(xì)胞的融合。

基于天然C肽序列的融合抑制劑活性較高，IC₅₀可達(dá)納摩爾水平，因此已進(jìn)入臨床開發(fā)的融合抑制劑均為C肽及其衍生物，典型的C肽融合抑制劑有T20和C34，二者都來自gp41的CHR天然序列的多肽，這些C肽類藥物的作用靶標(biāo)均為NHR三聚體。研究人員通過優(yōu)化gp41天然序列，設(shè)計出新一代融合抑制劑，這些抑制劑大都以C34為模板。與T20相比，新抑制劑的活性和穩(wěn)定性都有很大改善，其中取得良好臨床結(jié)果的有T1144和西夫韋肽。雖然新開發(fā)的融合抑制劑能高效抑制已有流行T20抗性毒株，但對T20的交叉抗性還是經(jīng)常出現(xiàn)。由于靶標(biāo)相同，這些交叉抗性預(yù)期在這些新藥進(jìn)入臨床使用后會更加明顯。因此開發(fā)針對不同靶標(biāo)序列，具有新穎結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的融合抑制劑應(yīng)是將來這類藥物研發(fā)的重點(diǎn)。

基于病毒gp41的NHR設(shè)計的N肽融合抑制劑是另一個發(fā)展方向。從上述三個gp41分子內(nèi)折疊形成6HB的結(jié)構(gòu)和機(jī)制中可知，CHR和NHR互為配基，二者具備特異性相互作用的特質(zhì)，形成6HB并放出能量，驅(qū)動完成病毒與細(xì)胞的融合。迄今，雖然N肽融合抑制劑尚無品種進(jìn)入臨床研究，但首個報道的融合抑制劑DP107就是N肽。這從另一側(cè)面表明其研究問題更多，難度更大。N肽的活性一般在微摩爾水平，比對應(yīng)的C肽低約1000倍。根據(jù)6HB晶體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制推斷，N-肽融合抑制劑通過兩種方式抑制gp41分子內(nèi)6HB形成，進(jìn)而阻斷HIV與細(xì)胞的融合過程：1)外源性N肽三聚體與gp41中CHR作用，形成異源6HB，使得gp41不能分子內(nèi)折疊，中斷融合；2)單鏈N肽嵌合在NHR中，形成雜合三聚體，抑制gp41分子內(nèi)6HB形成。相比而言，以第1種方式為作用機(jī)制的N肽抑制劑的活性更高，兩種方式的活性相差1到3個數(shù)量級。所以，研究人員利用各種方法使得N肽融合抑制劑主要通過第一種方式抑制gp41分子內(nèi)6HB形成，但問題是N肽片段本身難以 形成活性構(gòu)象的穩(wěn)定三聚體(N3螺旋)，同時其表面含有較多的疏水殘基，在生理條件下容易聚集而失活。因此，N肽融合抑制劑的研究主要是如何穩(wěn)定其三聚體和改善理化性能。從研發(fā)藥物角度來看，CHR和NHR可互為靶標(biāo)，N肽融合抑制劑以gp41中CHR為靶標(biāo)，與T20(恩夫韋肽)、Maraviroc兩種上市的融合抑制劑藥物的作用機(jī)理完全不同，是避免或減緩與現(xiàn)有藥物產(chǎn)生交叉抗藥性的有效途徑之一。

目前，也有提高N肽抑制活性的相關(guān)研究，一般的方法是將天然的N肽片段與能形成穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)的輔助多肽綴合，或使用二硫鍵連接上述設(shè)計的綴合N肽，形成不可逆三聚體N肽，這樣可以提高N肽抑制劑活性2－3個數(shù)量級。但上述方法也有自身的缺陷：單鏈的N肽活性較低，易于聚集而沉淀；綴合輔助多肽，使得綴合后N肽序列冗長；二硫鍵交聯(lián)雖然可以提高N肽活性，但是交聯(lián)反應(yīng)位點(diǎn)和反應(yīng)專一性不可控，等等。以上缺陷都限制了N肽抑制劑的發(fā)展，使之距離成藥還有很長的距離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從頭設(shè)計了一段可穩(wěn)定形成三螺旋結(jié)構(gòu)的人工輔助序列，并且設(shè)計出新的共價鍵形成方法，在適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾，利用內(nèi)酰胺鍵，得到了定點(diǎn)共價交聯(lián)的三聚體輔助序列，之后將其與部分天然N肽綴合，使得綴合后的N肽能夠和病毒的CHR作用，得到共價交聯(lián)的新綴合的N肽抑制劑，由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明基于新的設(shè)計思路和新的共價鍵形成方法，設(shè)計出了新穎的N肽抑制劑，提高了N肽的抑制活性。

本發(fā)明第一方面涉及式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，

Z-X₁X₂IX₃X₄IEQX₅IX₆X₇IEQRIQQIEQX₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁LLQLTVWGIKQLQARIL-B(I)

(Z-X₁X₂IX₃X₄IEQX₅IX₆X₇IEQRIQQIEQX₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉X₂₀X₂₁LLQLTVWGIKQLQARIL-B)₃(II)

其中：

式II所示的化合物為三個式I所示的化合物通過兩兩共價交聯(lián)形成的三聚體，

X₁缺失或者選自L型天然氨基酸，

X₂、X₃、X₄、X₆、X₇各自獨(dú)立地選自天然L型天然氨基酸，

X₅選自L型天然氨基酸、L型非天然氨基酸，

X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄、X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁各自獨(dú)立地選自L型天然氨基酸，

X₈、X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃、X₁₄同時存在或同時缺失，

X₁₅、X₁₆、X₁₇、X₁₈、X₁₉、X₂₀、X₂₁同時存在或同時缺失，

Z代表N末端基團(tuán)，可以為-NH₂、-NR₁C(O)R₂、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或-L-R₃，

其中，R₁和R₂獨(dú)立地選自H和烷基，

L為連接片段，選自二元羧酸(例如乙二酸、丙二酸、丁二酸等)，將N末端衍生出羧基并與帶有羥基基團(tuán)的R₃成酯，

R₃為R’OH、PEG、膽固醇等可以和羧基反應(yīng)且不影響交聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)，其中R’為烷基，

B代表C末端基團(tuán)，可以為-COOH或-C(O)NR₄R₅，其中，R₄和R₅獨(dú)立地選自H和烷基，優(yōu)選R₄和R₅同時為H。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，其中所述的共價交聯(lián)是在一個式I化合物中的X₅與另一個式I化合物中X₅后面第5位的谷氨酸之間形成共價鍵，或者所述的共價交聯(lián)是在一個式I化合物中的X₂與另一個式I化合物中X₂后面第5位的谷氨酸之間形成共價鍵，所述共價鍵優(yōu)選為酰胺鍵(-NC(O)-)。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，其中所述的天然L型天然氨基酸選自甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、 天冬酰胺(Asn)、纈氨酸(Val)、賴氨酸(Lys)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)，

所述的L型非天然氨基酸為鳥氨酸(Orn，O)。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面所述權(quán)利要求1的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，其中：

X₁為色氨酸(Trp)，

X²選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和鳥氨酸(Orn)，

X₃選自谷氨酰胺(Gln)和組氨酸(His)，

X₄選自谷氨酰胺(Gln)和組氨酸(His)，

X₅選自精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和鳥氨酸(Orn)，

且X₂和X₅不同時為精氨酸(Arg)，

X₆選自谷氨酰胺(Gln)和組氨酸(His)，

X₇選自谷氨酰胺(Gln)和組氨酸(His)，

X₈為精氨酸(Arg)，

X₉為異亮氨酸(Ile)，

X₁₀為谷氨酰胺(Gln)，

X₁₁為谷氨酰胺(Gln)，

X₁₂為異亮氨酸(Ile)，

X₁₃為谷氨酸(Glu)，

X₁₄為谷氨酰胺(Gln)，

X₁₅為精氨酸(Arg)，

X₁₆為異亮氨酸(Ile)，

X₁₇為谷氨酸(Glu)，

X₁₈為丙氨酸(Ala)，

X₁₉為谷氨酰胺(Gln)，

X₂₀為谷氨酰胺(Gln)，

X₂₁為組氨酸(His)。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，其中所述的共價交聯(lián)是在一個式I化合物中的X₅代表的賴氨酸或鳥氨酸與另一個式I化合物中X₅后面第5位的谷氨酸之間形成酰胺鍵(-NC(O)-)，或者所述的共價交聯(lián)是在一個式I化合物中的X₂代表的賴氨酸或鳥氨酸與另一個式I化合物中X₂后面第5位的谷氨酸之間形成酰胺鍵(-NC(O)-)。

在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，其選自如下的化合物：

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(Ac‐WRIQQIEQKIHHIEQRIQQIEQLLQLTVWGIKQLQARIL‐NH₂)₃(SEQ ID NO：1)₃

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(Ac‐LLQLTVWGIKQLQARILARIQQIEQKIHHIEQRIQQIEQ‐NH₂)₃(SEQ ID NO：11)₃

本發(fā)明的第二方面涉及一種核酸分子，其編碼前述本發(fā)明第一方面任一項所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽。

本發(fā)明的第三方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。在本發(fā)明中，所述載體可以為原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體。

本發(fā)明的第四方面涉及一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第二方面所述的核酸分子和/或本發(fā)明第三方面所述的重組載體。在本發(fā)明中，所述細(xì)胞例如為原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)或真核細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞)。

本發(fā)明的第五方面涉及一種藥物組合物，其含有至少一種前述本發(fā)明第一方面任一項所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，或者其含有至少一種本發(fā)明第二方面所述的核酸分子，任選地，其還含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明的第六方面涉及前述本發(fā)明第一方面任一項所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者第二方面所述的核酸分子或者本發(fā)明第五方面所述的藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防和/或輔助治療HIV感染相關(guān)疾病(特別是艾滋病)的藥物中的用途。

本發(fā)明的第七方面涉及前述本發(fā)明第一方面任一項所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者第二方面所述的核酸分子或者本發(fā)明第五方面所述的藥物組合物在制備用于抑制HIV(例如HIV-1)與細(xì)胞融合的藥物中的用途。

本發(fā)明的第八方面涉及一種在體內(nèi)或體外抑制HIV(例如HIV-1)與細(xì)胞融合的方法，所述方法包括使用有效量的至少一種前述本發(fā)明 第一方面任一項所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者第二方面所述的核酸分子或者本發(fā)明第五方面所述的藥物組合物的步驟。

本發(fā)明的第九方面涉及一種治療和/或預(yù)防和/或輔助治療HIV感染相關(guān)疾病(特別是艾滋病)的方法，所述方法包括給予需要這種治療的患者治療和/或預(yù)防有效量的至少一種前述本發(fā)明第一方面任一項所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽或者第二方面所述的核酸分子或者本發(fā)明第五方面所述的藥物組合物的步驟。

本發(fā)明還涉及前述本發(fā)明第一方面任一項所述的式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽，所述式I或式II所示的化合物、其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽用于抑制HIV(例如HIV-1)與細(xì)胞融合，或者用于治療和/或預(yù)防和/或輔助治療HIV感染相關(guān)疾病(特別是艾滋病)。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的HIV是指人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，包括HIV-1型病毒和HIV-2型病毒，優(yōu)選為HIV-1型病毒。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的艾滋病即為獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)。

HIV-1病毒的Gp41的胞外區(qū)存在著兩個與膜融合密切相關(guān)的螺旋結(jié)構(gòu)功能區(qū)，即N末端重復(fù)序列(HR1)和C末端重復(fù)序列(HR2)。在膜融合過程中，三個gp41分子中的HR2與HR1相互作用，形成一個六螺旋體核心結(jié)構(gòu)(6-HB)。在6-HB核心結(jié)構(gòu)中，3個N肽(即N末端重復(fù)序列的36肽，N36)形成位于中心的三聚體復(fù)合螺旋核，也稱為N螺旋三聚體，或簡稱三聚體。

本發(fā)明的式I化合物為N肽衍生物，因此在本發(fā)明中也可以將式I化合物稱為N肽。本發(fā)明的式II化合物在三條式I化合物所示的多肽之間形成了共價交聯(lián)，從而形成了更加穩(wěn)定和具有更高活性的三聚體化合物。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，其中所述的共價交聯(lián)是在一個式I化合物中的X₅代表的賴氨酸或鳥氨酸與另一個式I化合物中X₅后面第5位(即X₅+5位)的谷氨酸之間形成酰胺鍵(-NC(O)-)，或者所述的共價交聯(lián)是在一個式I化合物中的X₂代表的賴氨酸或鳥氨酸與另一個式I化合物中X₂后面第5位(即X₂+5位)的谷氨酸之間形成酰胺鍵(-NC(O)-)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，兩條式I所示化合物之間可以形成一個酰胺鍵，因此在形成的三聚體中，三條式I所示化合物之間兩兩共價相聯(lián)，可以形成三個酰胺鍵，由此達(dá)到穩(wěn)定三聚體的目的。

本發(fā)明式I化合物可以采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相方法合成，選用Rink Amide樹脂，肽鏈由C端向N端延長。縮合劑可采用HBTU/HoBt/DIEA。脫保護(hù)劑可采用哌啶/DMF溶液?？梢岳肅S Bio多肽合成儀合成肽序列，最后多肽的N端用乙酸酐試劑乙酸化封端。裂解劑可采用三氟乙酸/乙二硫醇/間甲酚(TFA/EDT/m-cresol)，粗肽用水溶解后凍干保存。可用中壓液相色譜法或高壓液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分離純化，純肽含量>95％，用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)確定肽序列分子量。

本發(fā)明式II化合物可采用如下方法合成：

將式I化合物中X₂后面第5位(即X₂+5位)的谷氨酸進(jìn)行硫脂修飾，然后溶解在反應(yīng)溶液中，則其能形成三聚體結(jié)構(gòu)，此時設(shè)計的賴氨酸和硫脂修飾的谷氨酸發(fā)生反應(yīng)，形成N肽之間的酰胺鍵，即，在硫脂修飾的式I化合物形成的三聚體結(jié)構(gòu)中，一個式I化合物中X₅代表的賴氨酸或鳥氨酸與另一個式I化合物中X₅后面第5位(即X₅+5位)的谷氨酸之間形成酰胺鍵(-NC(O)-)，或者，一個式I化合物中的X₂代表的賴氨酸或鳥氨酸與另一個式I化合物中X₂后面第5位(即X₂+5位)的谷氨酸之間形成酰胺鍵(-NC(O)-)。如圖1所示，在式II化合物中，三個單鏈?zhǔn)絀分子自聚成三螺旋結(jié)構(gòu)，其中，一個式I分子上的X₅(或X₂)代表的賴氨酸與另一個式Ⅰ分子中的第X₅+5(或X₂+5)位的谷氨酸分別位于多肽的g和e’(e’表示與g位在不同的肽 分子上)位，在空間方向和空間距離上都較為合適，有利于形成共價鍵，而其余位置的氨基酸由于空間距離和空間方向的不合適，因此不會參與到共價鍵的形成，就是說，其余位置的氨基酸由于空間距離和空間方向的不合適而不會影響共價鍵的形成。

在本文所用術(shù)語“天然氨基酸”是選自以下的氨基酸(括號內(nèi)為常用的三字母符號和單字母符號)：甘氨酸(Gly，G)、脯氨酸(Pro，P)、丙氨酸(Ala，A)、纈氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、異亮氨酸(Ile，I)、甲硫氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、苯丙氨酸(Phe，F(xiàn))、酪氨酸(Tyr，Y)、色氨酸(Trp，W)、組氨酸(His，H)、賴氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、谷氨酰胺(Gln，Q)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu，E)、天冬氨酸(Asp，D)、絲氨酸(Ser，S)和蘇氨酸(Thr，T)。如果由于打字錯誤，與通常使用的符號有所偏差，以通常使用的符號為準(zhǔn)。

本文中使用的術(shù)語“烷基”是指飽和的直鏈或支鏈一價烴基，其可以是被取代的(單或多)或未被取代的。優(yōu)選地，所述烷基是C_1-20烷基，更優(yōu)選C_1-15、更優(yōu)選C_1-10烷基、更優(yōu)選C_1-8烷基、更優(yōu)選C_1-6烷基、更優(yōu)選C_1-4烷基。特別優(yōu)選的烷基包括例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、叔戊基、新戊基、正己基、正庚基和正辛基等。合適的取代基包括例如羥基、烷基、鹵素、烷氧基、鹵代烷基、鹵代烷氧基、氨基、氨基烷基或環(huán)烷基。

本發(fā)明化合物既可以其本身也可以其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽的形式使用。式I或式II化合物的無生理毒性的鹽包括與藥學(xué)上可接受的無機(jī)酸或有機(jī)酸、或者與可藥用的無機(jī)堿或有機(jī)堿形成的鹽。合適的酸加成鹽的例子包括與鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富馬酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羥基乙酸、甲酸、乳酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、撲酸、丙二酸、羥基馬來酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水楊酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羥基萘甲酸、氫碘酸、蘋果酸、鞣酸等形成的鹽。合適的堿 加成鹽的例子包括與鈉、鋰、鉀、鎂、鋁、鈣、鋅、N,N'-二芐基乙二胺、氯代普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普魯卡因等形成的鹽。本文中涉及到本發(fā)明化合物時，包括通式I或式II化合物及其衍生物、立體異構(gòu)體或無生理毒性的鹽。

根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物包含本發(fā)明式I或式II化合物與常規(guī)藥用載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備成各種劑型，包括但不限于片劑、膠囊、溶液、懸浮液、顆粒劑或注射劑等。該藥物組合物可通過下面的任意方式施用：口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，陰道用藥，局部用藥，非腸道用藥如皮下、靜脈、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)用藥和局部用藥方式。

本文中術(shù)語“治療和/或預(yù)防有效量”的本發(fā)明化合物指以適用于任何醫(yī)學(xué)治療和/或預(yù)防的合理效果的足夠量的化合物。但應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明化合物和組合物的總?cè)沼昧宽氂芍髟\醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)作出決定。對于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的疾病和該疾病的嚴(yán)重程度；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體化合物的給藥時間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時間；與所采用的具體化合物組合使用或同時使用的藥物；及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。一般說來，本發(fā)明式I化合物用于哺乳動物特別是人的劑量可以介于0.001～1000mg/kg體重/天，例如介于0.01～100mg/kg體重/天，例如介于0.01～10mg/kg體重/天。

本發(fā)明設(shè)計出新的共價鍵形成方法(在適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)，進(jìn)行化學(xué)修飾，利用內(nèi)酰胺鍵)，得到了定點(diǎn)共價交聯(lián)的三聚體輔助序列，之后將其與部分天然N肽綴合，使得綴合后的N肽能夠和病毒的CHR作用，得到共 價交聯(lián)的新綴合的N肽抑制劑，通過共價交聯(lián)顯著提高了N肽的抑制活性。本發(fā)明的N肽抑制劑具有與目前使用藥物不同的作用機(jī)制、作用方式和作用靶標(biāo)，對找尋新型HIV-1融合抑制劑藥物具有重要意義。

附圖說明

圖1三條式I化合物形成的三聚體螺旋結(jié)構(gòu)(式Ⅱ化合物)的橫截面示意圖，其中g(shù)代表賴氨酸，e代表谷氨酸，各單肽之間形成酰胺鍵。

圖2實(shí)施例8樣品配制圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

在本發(fā)明中使用的縮寫具有下面的含義：

AIDS(Acquired Immune Deficiency Syndrome)艾滋病，獲得性免疫缺陷綜合征

DCM(Dichloromethane)二氯甲烷

DMF(N,N-Dimethyl malonate)二甲基甲酰胺

Env(Envelope glycoprotein)包膜糖蛋白

Fmoc(Fluorenylmethoxycarbonyl)芴甲氧羰基

HBTU 2-(1H-1-羥基苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸

HOBt(1-Hydroxylbenzotriazole anhydrous)1-羥基苯并三氮唑

6-HB(six-helix bundle)六螺旋體

HR1(N-terminal heptad repeat，NHR)N末端重復(fù)序列

HR2(C-terminal heptad repeat，CHR)C末端重復(fù)序列

HIV(Human Immunodeficiency Virus))人免疫缺陷病毒

HIV-1人免疫缺陷病毒Ⅰ型

HPLC(High performance liquid chromatography)高效液相色譜

OAll烯丙基

TFA(trifluoroacetic acid)三氟乙酸

DIEAN,N-二異丙基乙胺

EDC鹽酸鹽1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽

PBS(Phosphate Buffered Saline)磷酸鹽緩沖液(pH＝7.2)

MALDI-TOF-MS基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜

本發(fā)明實(shí)施例所用固相合成載體Rink酰胺樹脂為天津南開合成責(zé)任有限公司產(chǎn)品；HBTU、HOBt、DIEA、EDC鹽酸鹽以及Fmoc保護(hù)的天然氨基酸為上海吉爾生化公司以及成都誠諾新技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。三氟乙酸(TFA)為北京博邁杰科技有限公司產(chǎn)品；DMF、DCM為北京博邁杰科技有限公司產(chǎn)品；色譜純乙腈為Fisher公司產(chǎn)品。其它試劑如無說明均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

本發(fā)明實(shí)施例中所用單位“M”是指mol/L。

實(shí)施例1：SEQIDNO:5所示單體多肽的制備

多肽合成采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相方法。選用Rink Amide樹脂，肽鏈由C端向N端延長。縮合劑為HBTU/HOBt/DIEA。脫保護(hù)劑為哌啶/DMF溶液。利用CS Bio多肽合成儀合成肽序列,最后多肽的N端用乙酸酐試劑乙酸化封端。裂解劑為三氟乙酸/乙二硫醇/間甲酚(TFA/EDT/m-cresol)，粗肽用水溶解后凍干保存。用中壓液相色譜法或高壓液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分離純化，純肽含量>95％，并且用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)確定肽序列分子量。

合成條件如下：

保護(hù)氨基酸：0.25M氨基酸的DMF溶液，

活化劑：0.2M HBTU/0.2M HOBt的DMF溶液，

活化堿：0.4M DIEA的DMF溶液，

脫保護(hù)劑：20v/v％哌啶的DMF溶液，

封閉試劑：20v/v％乙酸酐的DMF溶液。

稱取Rink Amide樹脂0.53g(0.23mmol)置入CS Bio自動多肽合成 儀反應(yīng)器中，然后將保護(hù)氨基酸，活化劑，活化堿，脫保護(hù)試劑，封閉試劑按上述濃度配置好后，用CS Bio自動多肽合成儀進(jìn)行合成。完成后肽樹脂用DMF洗滌3遍后用無水甲醇收縮，室溫真空干燥，得肽樹脂約2.02g。

裂解液(體積百分比)：三氟乙酸︰乙二硫醇︰間甲酚︰水＝87.5︰5︰5︰2.5。

肽樹脂的裂解：稱取CS Bio自動多肽合成儀合成好的肽樹脂2.02g，放入500ml茄形瓶中，冰浴，電磁攪拌。按1克肽樹脂加入10ml的量配制裂解液。TFA需預(yù)先冰浴降溫30min或者預(yù)先存放于冰箱中使用；將配制好的裂解液加入到冰浴條件下的肽樹脂中，電磁攪拌，樹脂變橙紅色，在冰浴條件下反應(yīng)30min，然后，撤去冰浴，室溫再繼續(xù)攪拌反應(yīng)200min，反應(yīng)完成。劇烈攪拌下向反應(yīng)器中加入冷乙醚500ml，析出白色沉淀，繼續(xù)攪拌60min；用G3的砂芯抽慮漏斗濾出析出物，用冷乙醚反復(fù)洗滌3遍，晾干。加入10％(v/v)乙酸水溶液150ml，乙腈5ml使固體充分溶解，抽慮，濾液凍干粗肽927mg。

所得的粗肽用中壓或高壓色譜進(jìn)行純化。色譜柱為C8柱，洗脫劑為乙腈、水及少量乙酸。具體操作步驟：稱取粗肽867mg，加水20ml，乙腈5ml使固體完全溶解，經(jīng)0.25μm孔徑的濾膜過濾后上樣。色譜柱預(yù)先用含有0.1v/v％乙酸的乙腈溶液與水的混合溶液(其中乙腈溶液與水的體積百分比分別為15％和85％)200ml平衡。上樣后繼續(xù)用含有0.1v/v％乙酸的乙腈溶液與水的混合溶液(其中乙腈溶液與水的體積百分比分別為15％和85％)200ml沖洗，高效液相色譜檢測洗脫液成分。根據(jù)液相檢測結(jié)果逐漸升高乙腈含量，直至所純化的多肽主峰被洗脫出來。合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大部分溶劑，凍干得純的N肽，HPLC檢測含量大于80％。

反相制備液相二次純化N肽，具體方法如下：將中壓純化后的N肽，用2ml乙腈和8ml純水溶解，經(jīng)0.25μm孔徑的濾膜過濾后上樣，然后進(jìn)行梯度洗脫。洗脫液的A相為0.1v/v％三氟乙酸水溶液；B相為0.1v/v％三氟乙酸的乙腈溶液與水的混合溶液(其中乙腈溶液與水 的體積百分比分別為70％和30％)。反相制備液相先用20v/v％B相和80v/v％A相的混合溶液平衡5min，上樣后，根據(jù)需要調(diào)整洗脫梯度，逐漸升高B相的含量，直至所純化的多肽主峰被洗脫出來。將HPLC檢測含量大于95％的洗脫液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大部分溶劑，凍干得純的N肽。

實(shí)施例2：其他單體多肽的制備

其他未交聯(lián)的單體N肽(SEQIDNO:1～SEQIDNO:4，以及SEQIDNO:6～SEQIDNO:11所示的單體多肽)的制備方法同實(shí)施例1中SEQIDNO:5所示單體多肽的制備方法相同。

實(shí)施例3：(SEQIDNO:1)₃所示共價交聯(lián)多肽的制備

單體多肽序列的合成同實(shí)施例1中SEQIDNO:5所示單體多肽，但是在樹脂接氨基酸時，將要需位點(diǎn)修飾的E換成E(OAll)。序列在樹脂上合成完畢后，不裂解，做以下進(jìn)一步化學(xué)修飾。

在樹脂上，脫出多肽序列中E(OAll)的側(cè)鏈保護(hù)基OAll(O-烯丙基)。

在合成完畢的多肽樹脂，轉(zhuǎn)移入50ml茄形瓶，并稱量0.26g四(三苯基膦)鈀(Pd(PPh₃)₄),0.31g5,5-二甲基環(huán)己二酮溶于8ml無水四氫呋喃和二氯甲烷混合溶劑(v/v＝1/1)中，加入到茄形瓶內(nèi)，避光反應(yīng)6小時。在多肽反應(yīng)器內(nèi)，采用DCM洗滌3次，再用DMF洗滌3次，之后用50ml 0.5v/v％DIEA的DMF溶液洗滌5次，50ml 0.5％(質(zhì)量/體積)銅試劑的DMF溶液洗滌5次，最后用分別用DMF、DCM、MeOH洗滌，每種溶液洗滌2次，抽干。

在樹脂上，脫出側(cè)鏈保護(hù)基后的多肽側(cè)鏈硫酯化。

在多肽反應(yīng)器內(nèi)，加入脫出側(cè)鏈保護(hù)基后的多肽樹脂，并將275μl芐硫醇、315mgHOBt、450mgEDC鹽酸鹽溶于5mlDMF和5mlDCM的混合溶劑中，然后加入到反應(yīng)器內(nèi)，反應(yīng)6小時后，將反應(yīng)溶劑抽干，再次將275μl芐硫醇、315mgHOBt、450mgEDC鹽酸鹽溶于5mlDMF和5mlDCM的混合溶劑中，加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)12小時后，最后分別用DMF、DCM、MeOH洗滌，每種溶液洗滌2次，抽 干。

之后按照實(shí)施例1中SEQIDNO:5所示單體多肽的裂解方法、純化方法，得到純肽，HPLC檢測純度大于90％。

純化后的硫酯修飾的N肽溶解在反應(yīng)溶劑中(30％PBS/70％H₂O),濃度約在1mg/ml,在37度溫度下反應(yīng)40小時，HPLC檢測反應(yīng)至完全，之后再反向制備高效液相的純化條件下，純化得到目標(biāo)N肽，純度大于95％。

實(shí)施實(shí)例4：其他共價交聯(lián)N肽的制備

其他共價交聯(lián)N肽(如(SEQIDNO:2)₃～(SEQIDNO:11)₃所示的共價交聯(lián)多肽)的制備方法與實(shí)施例3中(SEQIDNO:1)₃所示交聯(lián)多肽相同。

上述各單體多肽和共價交聯(lián)多肽的分子量見表1。

表1多肽的分子量

實(shí)施實(shí)例5：N肽的α螺旋度的表征

1.N肽溶液的配置

稱取約1mg純肽，溶解在700μlddH₂O中，震蕩，離心，取上清液后在nanodrop2000儀器上標(biāo)定N肽溶液的濃度。以緩沖液PBS(pH＝7.4)為稀釋劑，配置N肽溶液10μM，500μl。

2.測定N肽溶液的螺旋度

將配制好的N肽溶液加入到比色皿內(nèi)，在圓二色光譜儀器中測定其螺旋吸收值(已扣除空白對照吸收值)，并按照以下公式，換算成螺旋度：

其中濃度(c)指N肽溶液的濃度值，路徑(L)指參比池長度，殘基數(shù)(N)指測量N肽的酰胺鍵數(shù)。

各N肽的螺旋度值見表2。

實(shí)施例8：化合物抑制HIV-1介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合活性評價(IC₅₀)

細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗：

1.TZM-bl細(xì)胞和HL2/3細(xì)胞的復(fù)蘇/凍存

將細(xì)胞凍存管從液氮中取出，37℃水浴迅速升溫，取出細(xì)胞凍存液(1ml)，加至15ml離心管，并加入1ml培養(yǎng)基(購自上海立菲生物技術(shù)公司)，離心(800rpm，10min)，除去培養(yǎng)基，重新加入1ml新鮮培養(yǎng)基，并輕吹使細(xì)胞均勻懸浮，將細(xì)胞懸浮液全部轉(zhuǎn)移至含有15ml培養(yǎng)基的75cm²培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO₂下培養(yǎng)。

消化細(xì)胞并計數(shù)后，離心，棄上清，加凍存液輕吹使細(xì)胞均勻懸浮(100萬/ml)，分裝至凍存管(1ml/管)，分別置于4℃(30min)、-20℃(2小時)、-80℃(12小時)、-196℃保存。

2.傳代培養(yǎng)

取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，倒去培養(yǎng)基，加入2ml消化液(購自gibico公司)，輕晃使其在細(xì)胞表面平鋪均勻，倒去消化液，重新加入2ml消化液，鋪勻，37℃消化2min，加入4ml培養(yǎng)基終止消化，取出所有液體，離心，棄上清，加4ml培養(yǎng)基并輕吹使細(xì)胞均勻懸浮，取10μl計數(shù)，取40-50萬細(xì)胞置于75cm²培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。

3.融合實(shí)驗

A.取TZM-bl細(xì)胞(由美國NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供)懸浮液稀釋至50萬/ml，鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，50μl/孔，培養(yǎng)24小時。

B.配樣品：取待測化合物，先估計化合物的IC₅₀值，以這個估計的值為基礎(chǔ)，乘以兩個4，再乘以6得到待測化合物的配制濃度，例如：估計樣品的IC₅₀為10nM，則樣品的配制濃度為10*4*4*6＝960nM，以此濃度為基礎(chǔ)，在96孔板上第(1-10)列依次將待測化合物稀釋四倍，11列和12列為空白溶劑(空白溶劑即只含培養(yǎng)基，不含待測樣品，其中11列為陽性對照，為無樣品抑制劑條件下以1:3濃度混合的TZM-bl細(xì)胞和HL2/3細(xì)胞；12列為陰性對照，為單一TZM-bl細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光信號)；DMSO含量≤6％。

樣品配制說明(見附圖2)：每個96孔樣品板(每行12孔，共8行；Costar 3799，Corning Incorporation，USA)配制4個樣品，每個樣品 重復(fù)1次，如圖2所示，以第一行為例將選定濃度的樣品放置第S1孔，序列稀釋4倍(即后一個孔的樣品濃度是前一個孔的1/4)，按此稀釋10個濃度梯度。最后兩個孔作為對照只含有培養(yǎng)基，其中第11孔含有靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞為100％融合對照(陽性對照)，第12孔只含靶細(xì)胞為無融合背景對照(陰性對照)。

C.取HL2/3細(xì)胞(由美國NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供)懸浮液稀釋至100萬/ml，加入細(xì)胞板的(1-11)×(A-H)，50μl/孔，第12×(A-H)補(bǔ)加50μl/孔培養(yǎng)基。

D.立即取步驟B中的20μl/孔樣品加入細(xì)胞板，培養(yǎng)6小時。

E.去除細(xì)胞板中每孔中的培養(yǎng)基(120μl/孔)，以PBS洗2次，150μl/次。

加入稀釋后的裂解液(1×)，50μl/孔，裂解5min；其中稀釋后的裂解液(1×)即將Luciferase試劑盒(Promega，USA)中(5×)的裂解液用水稀釋，根據(jù)用量新鮮配制。

F.取20μl/孔細(xì)胞裂解液鋪在96孔磷光板上。

G.將融化后的LA緩沖液(Luciferase Assay Buffer，Promega Cooperation,USA)加入LA底物(Luciferase Assay Substrate，Promega Cooperation,USA)中混勻，加40μl/孔于96孔磷光板中。

H.立即在酶標(biāo)儀上檢測發(fā)光。實(shí)驗的陰性對照為單一TZM-bl細(xì)胞的化學(xué)發(fā)光信號，用Min表示；陽性對照為無樣品抑制劑條件下以1:3濃度混合的TZM-bl細(xì)胞和HL2/3細(xì)胞，用Max表示；測定值為某一樣品在某一濃度下的信號值，用X示；細(xì)胞融合率＝(X-Min)/(Max-Min)*100％。

按照上述方法，活性測定結(jié)果見下面的表2。表2中的數(shù)據(jù)表明，共價交聯(lián)后的N肽活性得到了明顯的提高，最好的活性達(dá)到了低納摩爾水平。

表2

注：1.a)Uni：deg*m²dmol^-1，在222nm的吸收值并歸一化處理，100％α螺旋度的數(shù)值為-33000；b)表中的數(shù)據(jù)表明，交聯(lián)后的N肽活性得到了明顯的提高，最好的活性達(dá)到了低納摩爾水平。

2.T20,C34是C肽融合抑制劑，作為細(xì)胞融合活性實(shí)驗對照。其中，T20是已上市藥物，C34是實(shí)驗室中活性較好且穩(wěn)定的融合抑制劑。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。