本發(fā)明是在由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)資助的授權(quán)號RO1NS060680下由政府支持進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中具有一定權(quán)利。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2014年4月11日提交的美國臨時申請?zhí)?1/978,362的優(yōu)先權(quán)，將其通過引用以其全文特此結(jié)合。

背景

天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP)，又名豆莢蛋白，是切割天冬酰胺殘基C-末端的肽鍵的溶酶體半胱氨酸蛋白酶。AEP涉及到各種細(xì)胞事件中，包括抗原加工、其他溶酶體酶類的切割、破骨細(xì)胞形成、以及適當(dāng)?shù)哪I功能。在哺乳動物中,AEP在腎臟中高度表達(dá)；缺乏AEP的小鼠在其腎臟的近端小管細(xì)胞的內(nèi)體和溶酶體中積累各種蛋白，這導(dǎo)致了由增生、纖維化和腎小球囊腫組成的病理學(xué)。AEP無效的小鼠展現(xiàn)出與噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥的癥狀相似的癥狀，表明該酶涉及此疾病的病理生理學(xué)。在生化上，該酶通過其對天冬酰胺殘基和pH的特異性被高度調(diào)節(jié)。AEP用于識別其底物的具體基序尚未完全了解。失調(diào)的AEP活性已經(jīng)牽涉多種疾病，包括癌癥和神經(jīng)變性。參見巴索托-伊斯拉斯(Basurto-Islas)等人，在阿爾茨海默病中天冬酰胺酰內(nèi)肽酶的激活導(dǎo)致τ蛋白過度磷酸化(Activation of asparaginyl endopeptidase leads to tau hyperphosphorylation in Alzheimer disease)，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)288，2013，17495-17507。陳(Chan)等人，缺乏天冬酰胺酰內(nèi)肽酶的小鼠發(fā)展類似噬血細(xì)胞綜合征的障礙(Mice lacking asparaginyl endopeptidase develop disorders resembling hemophagocytic syndrome)，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)，2009，106，468-473。希思科維茨(Herskowitz)等人，天冬酰胺酰內(nèi)肽酶切割腦中的TDP-43(Asparaginyl endopeptidase cleaves TDP-43 in brain)，蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)，2012，12，2455-2463。

奧瓦特(Ovat)等人報道氮雜-肽基邁克爾受體以及環(huán)氧化物抑制劑作為曼氏裂體吸蟲和蓖子硬蜱豆莢蛋白(天冬酰胺酰內(nèi)肽酶)的抑制劑。參見藥物化學(xué)雜志(J Med Chem)，2009，52，7192-7210。

洛克(Loak)等人報道了天冬酰胺酰內(nèi)肽酶的酰氧基甲基酮抑制劑。參見生物化學(xué)(Biol Chem)，2003，384，1239-1246。

尼斯特羅伊(Niestroj)等人報道了哺乳動物豆莢蛋白被邁克爾受體和氮雜Asn-鹵代甲基酮的抑制。參見生物化學(xué)(Biol Chem)(2002)383，1205-1214。

項(Xiang)等人報道了DNA疫苗靶向腫瘤血管系統(tǒng)和微環(huán)境并且抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。參見免疫學(xué)綜述(Immunol Rev)，2008，222，117-128。

在此引用的參考文獻(xiàn)并非對現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。

概述

本披露涉及天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑及其相關(guān)的組合物和用途。在某些實(shí)施例中，這些天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑對于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病和認(rèn)知障礙例如阿爾茨海默病是有用的。在某些實(shí)施例中，本披露涉及包括天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥用組合物。在某些實(shí)施例中，本披露涉及治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的方法，這些方法包括將有效量的藥用組合物給予至對其有需要的受試者，該藥用組合物包括在此披露的天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑。

附圖簡述

圖1展示了高通量篩選方案。用老鼠腎細(xì)胞裂解物篩選了Asinex庫的54,384種化合物，然后用AEP敲除的細(xì)胞裂解物進(jìn)行反向篩選，得到736個IC₅₀值小于或等于40μM的命中化合物。將命中化合物用純化的人類AEP進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并且將有前景的化合物歸類為8個組。對來自每組的化合物進(jìn)行測試，并且測定細(xì)胞毒性和特異性。

圖2示出IC₅₀值的測定數(shù)據(jù)。將純化的重組酶與不同濃度的抑制劑在存在遞增濃度的抑制劑的適當(dāng)測定緩沖液中孵育。以一式兩份的反應(yīng)監(jiān)測熒光產(chǎn)物的形成，并且將數(shù)據(jù)擬合為適當(dāng)?shù)姆匠桃杂嬎鉏C₅₀值。

圖3A-H示出在完整的Pala細(xì)胞中的IC₅₀值的測定數(shù)據(jù)。將細(xì)胞與抑制劑孵育2小時，然后將細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)行洗滌、收獲并且裂解，并且測定殘余的酶活性。將裂解產(chǎn)物通過布拉德福測定(Bradford assay)標(biāo)準(zhǔn)化，并且將實(shí)驗(yàn)一式三份地進(jìn)行，并且對平均值結(jié)果和SEM進(jìn)行繪圖。

圖4A-D示出化合物的細(xì)胞毒性和基因毒性的數(shù)據(jù)。A.MTT測定，其中將50μM的每種化合物與HepG2細(xì)胞孵育24小時。將含有化合物的培養(yǎng)基去除，并且將細(xì)胞與MTT溶液孵育3小時。隨后，將MTT溶液用DMSO替代，并且觀察OD₅₇₀。B.LDH測定，其中將50μM的每種化合物與原代神經(jīng)元培養(yǎng)物孵育48小時。然后將培養(yǎng)基收集，并且與LDH測定底物在室溫下在黑暗中孵育30分鐘。在反應(yīng)淬滅后，觀察OD₄₉₀。C.COMET測定結(jié)果；將50μM的化合物與HepG2細(xì)胞孵育24小時。然后將細(xì)胞添加至低熔點(diǎn)瓊脂糖并且涂布在顯微鏡載玻片上。將細(xì)胞裂解，并且使DNA變性并進(jìn)行電泳。最后，將DNA用SYBE Green染色，并且在每個實(shí)驗(yàn)中，對于每個樣品，100個細(xì)胞核被計數(shù)；一式三份地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。D.微核測定結(jié)果；將50μM的化合物與HepG2細(xì)胞孵育24小時。將細(xì)胞固定并且將細(xì)胞核用DAPI染色，并且每個樣品中1000個細(xì)胞被計數(shù)；進(jìn)行三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

圖5示出了指示DTT可逆性的數(shù)據(jù)。AEP和指定的抑制劑反應(yīng)，15分鐘后將10mM的DTT或L-半胱氨酸添加到反應(yīng)中，并且讀取熒光信號持續(xù)另外的15分鐘。在孵化的第二個15分鐘結(jié)束時，測定與DMSO對照反應(yīng)相比在每種化合物存在時形成的產(chǎn)物的百分比。

圖6A-H示出AEP的競爭性的、緩慢結(jié)合型的抑制劑的數(shù)據(jù)。通過在固定濃度的A.化合物11，B.化合物BB1下，改變底物Z-AAN-AMC，從擬合為競爭型抑制方程的米氏曲線測定穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)。將每種抑制劑的KI值通過整體擬合到競爭型抑制方程中測定。C.使用時程失活測定產(chǎn)生進(jìn)展曲線，該進(jìn)展曲線描繪了以時間為函數(shù)的產(chǎn)物形成。準(zhǔn)一級速率常數(shù)在化合物11的每個濃度下獲得。D.準(zhǔn)一級速率常數(shù)的再次描繪，k_obs相對化合物11的濃度。E.使用時程失活測定產(chǎn)生進(jìn)展曲線，該進(jìn)展曲線描繪了以時間為函數(shù)的產(chǎn)物形成。準(zhǔn)一級速率常數(shù)在化合物BB1的每個濃度下獲得。F.準(zhǔn)一級速率常數(shù)的再次描繪，k_obs相對化合物BB1的濃度。

圖7A-E示出在OGD處理的神經(jīng)元中，AEP的抑制數(shù)據(jù)。A.用5μM Cbz-Ala-Ala-Asn-AMC在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中測量的AEP活性(x軸代表用0.1μM或1.0μM的特定化合物處理的神經(jīng)元)。B.用5μM Ac-Asp-Glu-Val-Asp-AMC在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中測量的半胱天冬酶活性。C.用5μM D-Val-Leu-Lys-AMC在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中測量的組織蛋白酶活性。D.APP切割的抑制。將與化合物預(yù)孵育30分鐘、經(jīng)歷OGD處理4小時的原代皮質(zhì)神經(jīng)元的裂解物再灌注18小時(常氧神經(jīng)元保持在常氧狀態(tài)下)。E.APP能夠以劑量依賴性形式被切割。將與化合物預(yù)孵育30分鐘、經(jīng)歷OGD處理4小時的原代皮質(zhì)神經(jīng)元的裂解物再灌注18小時(常氧神經(jīng)元保持在常氧狀態(tài)下)。

圖8A-B示出指示化合物11在腦中抑制AEP活性以及AEP介導(dǎo)的APP切割的數(shù)據(jù)。A.AEP活性測定。將5XFAD小鼠用10mg/kg的化合物11或運(yùn)載體處理3個月?；衔?1顯著降低了腦中的AEP活性。*P<0.01。B.APP通過AEP和BACE1的處理?；衔?1減少AEP產(chǎn)生的APP片段和BACE1產(chǎn)生的APP片段(C99)，但是沒有改變?nèi)LAPP和BACE1的水平。

圖9A-G示出指示化合物11在5XFAD小鼠中緩解Aβ沉積和認(rèn)知損害的數(shù)據(jù)。A.在5XFAD小鼠的腦切片的海馬體(HP)、運(yùn)動皮質(zhì)(MC)、和額皮質(zhì)(FC)中的淀粉樣蛋白斑的硫黃素-S染色。比例尺，50μm。B.淀粉樣蛋白斑的定量分析。在5XFAD小鼠腦中斑塊的密度被化合物11降低。*P<0.05，**P<0.01。C-D.在用化合物11或運(yùn)載體處理的5XFAD小鼠中的Aβ1-40和Aβ1-42的ELISA。*P<0.05，**P<0.01，相對運(yùn)載體處理的小鼠。E.莫里斯(Morris)水迷宮分析為用化合物11或運(yùn)載體處理的小鼠的移動距離(mm)以及積分距離(AUC)。*P<0.05。F.在探索實(shí)驗(yàn)中在目標(biāo)象限中所花費(fèi)時間的百分比。用化合物11處理的小鼠比用運(yùn)載體處理的小鼠在目標(biāo)象限中花費(fèi)更多的時間。**P<0.05。G.通過用化合物11處理，5XFAD小鼠的游泳速度沒有改變。

圖10A-F示出指示化合物11在5XFAD小鼠中改善突觸損失并恢復(fù)突觸功能障礙的數(shù)據(jù)。A.突觸結(jié)構(gòu)的代表性電子顯微鏡。箭頭指示突觸。B.在用運(yùn)載體和化合物11處理的5XFAD小鼠中的突觸密度的定量分析。數(shù)據(jù)用平均值±SEM示出(n＝3只小鼠/組)。*p<0.01。C.高爾基體染色揭示了來自CA1區(qū)域的頂樹突層的樹突棘。比例尺，5μm。D.樹突棘密度的定量分析。在5XFAD小鼠中，降低的樹突棘密度被化合物11逆轉(zhuǎn)。*P<0.01，**P<0.05。E.fEPSP的長時程增強(qiáng)(LTP)被3xTBS誘導(dǎo)(100Hz的4次脈沖，以200-ms為間隔重復(fù)3次)。所示的跡線是代表性fEPSP，是在時間點(diǎn)1和2(運(yùn)載體處理的)和時間點(diǎn)3和4(化合物11處理的小鼠)記錄。在5XFAD小鼠中，LTP的大小通過用化合物11處理而增強(qiáng)。數(shù)據(jù)用平均值±SEM來表示。*P<0.05，相對運(yùn)載體處理的小鼠。F.通過在刺激強(qiáng)度和fEPSP斜率之間的輸入/輸出(I/O)關(guān)系評價的突觸傳遞。I/O曲線在海馬體切片中獲得，海馬體切片從運(yùn)載體或化合物11處理的5XFAD小鼠中準(zhǔn)備。

詳細(xì)討論

在更詳細(xì)地描述本披露之前，應(yīng)理解的是本披露不限于所描述的具體實(shí)施例，因此這些當(dāng)然可以改變。還應(yīng)當(dāng)理解，在此使用的術(shù)語僅是為了描述特定實(shí)施例的目的，而并不意圖是限制性的，因?yàn)楸九兜姆秶鷮H由所附權(quán)利要求限定。

除非另外定義，在此所用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本披露所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同意義。雖然與在此所述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料也可以用于實(shí)施或測試本披露中，但現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法和材料。

在本說明書中引用的所有公開物和專利通過引用結(jié)合于此，就好像每個單獨(dú)的公開物或?qū)＠淮_切地并單獨(dú)地指示為通過引用結(jié)合，并且通過引用結(jié)合于此從而結(jié)合引用的公開物披露和描述這些方法和/或材料。任何公開物的引用內(nèi)容是針對在提交日之前的披露，并且不能理解為承認(rèn)因?yàn)橄惹芭抖九恫荒塬@得比這些公開物更早的申請日。此外，所提供的公開日期可能與實(shí)際的公開日期不同，實(shí)際的公開日期可能需要單獨(dú)地確認(rèn)。

如將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的是，在閱讀本披露時，在此描述和展示的單獨(dú)實(shí)施例中的每一個具有離散的組成部分和特征，這些組成部分和特征可以在不偏離本披露的范圍或精神的情況下易于與任何其他一些實(shí)施例的特征分離或組合。可以按照所敘述的事件的順序或按照邏輯上可行的任何其他順序來進(jìn)行任何敘述的方法。

術(shù)語

除非另外說明，本披露的實(shí)施例將采用醫(yī)學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)等的技術(shù)，這些技術(shù)是在本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中得到充分解釋。

必須指出，如在說明書和所附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式“一個/一種(a/an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另外清楚地規(guī)定。

如在此所用，當(dāng)用于描述與一種另外的治療一起給予時，術(shù)語“與...組合”意指該藥劑可以在該另外的治療之前、與其一起、或之后、或其組合被給予。

如本文所用的術(shù)語“衍生物”是指保留所鑒別類似物的足夠功能特征的結(jié)構(gòu)上類似的化合物。該衍生物可能是結(jié)構(gòu)上類似的，因?yàn)槿狈σ粋€或多個原子、被取代、呈鹽形式、呈不同的水合/氧化狀態(tài)，或因?yàn)榉肿觾?nèi)的一個或多個原子被轉(zhuǎn)換，如(但不限于)氧原子被硫原子置換或氨基被羥基置換。所考慮的衍生物包括用雜環(huán)替換碳環(huán)、芳香環(huán)、或苯環(huán)，或用碳環(huán)、芳香環(huán)、或苯環(huán)替換雜環(huán)，通常情況下，環(huán)大小相同。衍生物可通過在合成或有機(jī)化學(xué)教科書中所呈現(xiàn)的任何種類的合成方法或適當(dāng)改動來制備，諸如馬奇的高等有機(jī)化學(xué)：反應(yīng)、機(jī)理以及結(jié)構(gòu)(March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure)，威利出版社(Wiley)，第6版(2007)；邁克爾(Michael B.)史密斯(Smith)或有機(jī)合成中的多米諾反應(yīng)(Domino Reactions in Organic Synthesis)，威利出版社(Wiley)(2006)盧茨F.蒂策(Lutz F.Tietze)中所提供的那些，將所有這些化學(xué)教科書通過引用特此結(jié)合。

術(shù)語“被取代”是指其中至少一個氫原子被取代基置換的一個分子。當(dāng)被取代時，一個或多個基團(tuán)是“取代基”。該分子可被多重取代。在氧代取代基(“＝O”)的情況下，兩個氫原子被置換。在此背景內(nèi)的實(shí)例取代基可以包括鹵素、羥基、烷基、烷氧基、硝基、氰基、氧代、碳環(huán)基、碳環(huán)烷基、雜碳環(huán)基、雜碳環(huán)烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基、雜芳基烷基、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)NRaNRb、-NRaC(＝O)ORb、-NRaSO₂Rb、-C(＝O)Ra、-C(＝O)ORa、-C(＝O)NRaRb、-OC(＝O)NRaRb、-ORa、-SRa、-SORa、-S(＝O)₂Ra、-OS(＝O)₂Ra以及-S(＝O)₂ORa。這種情形中的Ra和Rb可以相同或不同并且獨(dú)立地為氫、鹵素、羥基、烷基、烷氧基、烷基、氨基、烷氨基、二烷氨基、碳環(huán)基、碳環(huán)烷基、雜碳環(huán)基、雜碳環(huán)烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基以及雜芳基烷基。

如本文所用的術(shù)語“烷基”意味著一種非周期支鏈或者支鏈的、不飽和或者飽和烴，例如那些包含1至10個碳原子的烴。代表性飽和直鏈烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基等；然而飽和支鏈烷基包括異丙基、仲丁基、異丁基、叔丁基、異戊基等。不飽和烷基類包含在相鄰碳原子之間的至少一個雙鍵或者三鍵(分別是指如“烯基”或者“炔基”)。代表性直鏈和支鏈烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。而代表性直鏈和支鏈炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。

非芳香族單環(huán)或多環(huán)烷基在此被稱為“碳環(huán)”或“碳環(huán)基”基團(tuán)。代表性的飽和碳環(huán)包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等；而不飽和碳環(huán)化合物包括環(huán)戊烯基和環(huán)己烯基等。

“雜碳環(huán)”或“雜碳環(huán)基”基團(tuán)是可能飽和或不飽和(但不為芳香族)、單環(huán)或多環(huán)的包含從1個到4個獨(dú)立地選自氮、氧和硫的雜原子的碳環(huán)，并且其中這些氮和硫雜原子可任選地被氧化，并且該氮雜原子可任選地被季銨化。雜碳環(huán)包括嗎啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、乙內(nèi)酰脲基、戊內(nèi)酰胺基、環(huán)氧乙烷基、氧雜環(huán)丁烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫苯硫基、四氫硫代吡喃基、四氫嘧啶基、四氫苯硫基、四氫硫代吡喃基等。

“芳基”意指芳香族碳環(huán)單環(huán)或者多環(huán)環(huán)，諸如苯基或萘基。多環(huán)環(huán)系統(tǒng)可以(但不是必需)包含一個或多個非芳香族環(huán)，只要一個環(huán)是芳香族即可。

如本文所用的“雜芳基”或“雜芳香族”是指具有1到4個選自氮、氧以及硫的雜原子并且包含至少1個碳原子的一個芳香族雜碳環(huán)，包括單環(huán)與多環(huán)環(huán)系統(tǒng)。多環(huán)環(huán)系統(tǒng)可以(但不是必需)包含一個或多個非芳香族環(huán)，只要一個環(huán)是芳香族即可。代表性的雜芳基是呋喃基、苯并呋喃基、苯硫基、苯并苯硫基、吡咯基、吲哚基、異吲哚基、氮雜吲哚基、吡啶基、喹啉基、異喹啉基、噁唑基、異噁唑基、苯并噁唑基、吡唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、異噻唑基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基、以及喹唑啉基。所考慮的是，術(shù)語“雜芳基”的使用包括N-烷基化衍生物，諸如1-甲基咪唑-5-基取代基。

如在此所用，“雜環(huán)”或“雜環(huán)基”是指具有1至4個選自氮、氧以及硫的雜原子并且包含至少1個碳原子的單環(huán)和多環(huán)環(huán)系統(tǒng)。這些單環(huán)和多環(huán)環(huán)系統(tǒng)可以是芳香族、非芳香族或芳香族與非芳香族環(huán)的混合物。雜環(huán)包括雜碳環(huán)、雜芳基等。

“烷硫基”是指通過一個硫基橋連接的如上文所定義的一個烷基基團(tuán)。烷硫基的一個實(shí)例是甲硫基(即-S-CH₃)。

“烷氧基”是指通過一個氧基橋連接的如上文所定義的一個烷基基團(tuán)。烷氧基的實(shí)例包括，但并不限于，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基以及仲戊氧基。優(yōu)選的烷氧基是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基以及叔丁氧基。

“烷氨基”是指通過一個氨基橋附接的如上所定義的一個烷基基團(tuán)。烷氨基的一個實(shí)例是甲氨基(即-NH-CH₃)。

“鏈烷?；笔侵竿ㄟ^羰基橋附接的如上所定義的烷基(即-(C＝O)烷基)。

“烷基磺?；笔侵竿ㄟ^磺?；鶚蚋浇拥娜缟纤x的烷基(即-S(＝O)₂烷基)，諸如甲磺?；?，并且“芳基磺酰基”是指通過磺?；鶚蚋浇拥姆蓟?即-S(＝O)₂芳基)。

“烷基氨磺?；笔侵竿ㄟ^氨磺?；鶚蚋浇拥娜缟衔乃x的烷基(即-S(＝O)₂NH烷基)，并且“芳基氨磺?；笔侵竿ㄟ^氨磺?；鶚蚋浇拥姆蓟?即-S(＝O)₂NH芳基)。

“烷基亞磺?；笔侵竿ㄟ^亞磺?；鶚蜻B接的具有指定數(shù)目的碳原子的如上文所定義的烷基(即-S(＝O)烷基)。

術(shù)語“鹵素”和“鹵”是指氟、氯、溴以及碘。

術(shù)語“芳?；笔侵高B接到羰基基團(tuán)的芳基基團(tuán)(芳基基團(tuán)可以如上所述的任選地被取代)(例如-C(O)-芳基)。

術(shù)語“氨磺?；笔侵富撬岬孽０?即-S(＝O)₂NRR')

未指定的“R”基團(tuán)可以是可以任選地被一個或多個相同或不同的取代基取代的氫、低級烷基、芳基、或雜芳基。

貫穿整個說明書中，基團(tuán)和其取代基可以被選擇為提供穩(wěn)定的部分和化合物。

天冬酰胺內(nèi)肽酶的抑制是神經(jīng)保護(hù)的并且在阿爾茨海默病的小鼠模型中改善認(rèn)知記憶

老化是阿爾茨海默病(AD)的最大的風(fēng)險因素。在老化的過程中，腦中的pH逐漸降低。AEP在小鼠腦中被逐步上調(diào)，并且在年老的小鼠中被激活。此外，相比于正常對照，AEP在人類AD腦中也升高和激活。活性AEP切割在AD中兩個主要的病原性參與者APP(淀粉樣前體蛋白)以及τ蛋白兩者。AEP處理APP促進(jìn)了BACE1降解APP，這導(dǎo)致了β-淀粉樣蛋白上調(diào)。從AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型中敲除AEP，逆轉(zhuǎn)了在5XFAD和APP/PS1小鼠中的病理學(xué)事件，并且改善了認(rèn)知損害。另一方面，活性AEP解蛋白性地降解τ蛋白，廢除了它的維管裝配功能，誘導(dǎo)了τ蛋白聚集，并且觸發(fā)了神經(jīng)變性。并且，AEP在τP301s轉(zhuǎn)基因小鼠和人類AD腦中被激活，導(dǎo)致了在NFT中τ蛋白的截短。τP301S轉(zhuǎn)基因小鼠中AEP的缺失實(shí)質(zhì)性地降低了NFT沉積，減輕了突觸損失并且挽救了損害的海馬突觸可塑性以及認(rèn)知損害。AEP主要通過它對SET的切割負(fù)責(zé)τ蛋白的高度磷酸化，SET被切割后是PP2A的抑制劑，這將會導(dǎo)致負(fù)責(zé)70％τ蛋白磷酸酶活性的酶即蛋白磷酸酶-2A(PP2A)的抑制。參見巴索托-伊斯拉斯(Basurto-Islas)等人。AEP在AD的發(fā)作和發(fā)展中起到介導(dǎo)者的作用。AEP的抑制對于治療神經(jīng)退行性疾病(包括AD)可以是治療上有用的。

AEP在年老的正常腦和人類阿爾茨海默病(AD)腦中被上調(diào)和激活，在介導(dǎo)AD的病理生理學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在此披露的是腦可滲透的并且口服有生物活性的AEP抑制劑，該抑制劑降低了在AD小鼠模型中的老年斑的形成并且緩解了認(rèn)知損害。進(jìn)行高通量的篩選?；衔锏膸追N骨架家族被發(fā)現(xiàn)具有強(qiáng)有力的抑制活性。經(jīng)鑒別的無毒的且特異性的AEP抑制劑選擇性的阻滯AEP而不是其他的半胱氨酸相關(guān)的蛋白酶。5XFAD小鼠用口服給予抑制劑的慢性治療改善了突觸損失并且提高了長時程增強(qiáng)(LTP)，導(dǎo)致在AD中的記憶喪失的保護(hù)。因此，這些發(fā)現(xiàn)指示這些AEP抑制劑可以是有效的臨床治療劑。

卒中、癲癇以及頭部創(chuàng)傷都是腦組織缺血的原因，腦組織缺血上調(diào)腦組織中細(xì)胞凋亡和壞死的過程，暗示卒中、癲癇以及頭部創(chuàng)傷是人類中神經(jīng)變性的主要原因。剝奪腦的血液供應(yīng)誘導(dǎo)興奮性毒性效應(yīng)，該效應(yīng)通過非完全了解的機(jī)制引起神經(jīng)元死亡。興奮性毒性的主要特征是酸中毒，是在緩沖的腦間質(zhì)中pH從7.3到6.0的轉(zhuǎn)變，這是由細(xì)胞內(nèi)興奮性氨基酸谷氨酸的濃度增加導(dǎo)致的。響應(yīng)于由興奮性酸中毒引起的顱內(nèi)pH降低，AEP被激活，并且已經(jīng)示出顯示對它的一個底物SET(DNAse抑制劑)的異?；钚?。SET是一種磷蛋白，并且主要定位于細(xì)胞核，在那里，它通過和組蛋白尾相互作用參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在顆粒酶-A介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑中，SET還通過抑制DNA的切口形成起到細(xì)胞凋亡介導(dǎo)者的作用。在缺血和酸中毒誘導(dǎo)之后，AEP被激活，并且解蛋白地切割SET，這導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡；然而，在AEP缺陷型小鼠中，SET保持完好，并且神經(jīng)元細(xì)胞的死亡可以忽略不計。這個發(fā)現(xiàn)表明AEP的抑制提供了一種預(yù)防卒中、癲癇或頭部創(chuàng)傷后的神經(jīng)變性的方式。

AEP主要通過它對SET的切割負(fù)責(zé)τ蛋白的高度磷酸化，這會導(dǎo)致負(fù)責(zé)70％τ蛋白磷酸酶活性的酶即蛋白磷酸酶-2A(PP2A)的抑制。活性AEP以及被切割的SET的N端和C端片段的水平在AD患者的腦中升高。此外，發(fā)現(xiàn)酸中毒觸發(fā)AEP和SET分別從溶酶體和細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)易位。這個發(fā)現(xiàn)指示AEP顯現(xiàn)在阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮一定作用。

AD是最普遍的神經(jīng)退行性疾病。它表征為Aβ和不可溶性τ蛋白的沉積。我們發(fā)現(xiàn)在AD腦中，AEP切割A(yù)PP和τ蛋白。相比于全長APP，AEP產(chǎn)生的APP片段是β-分泌酶的更好的底物，由此增強(qiáng)Aβ的產(chǎn)生。被AEP切割的τ蛋白將產(chǎn)生若干可以促進(jìn)其沉積的片段。此外，被AEP進(jìn)行的SET的切割促進(jìn)由缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，并且促進(jìn)τ蛋白的磷酸化。所有的這些觀察指示AEP抑制劑可以挽救在AD中的漸進(jìn)式神經(jīng)變性。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，將5XFAD小鼠用化合物11處理3個月，并且監(jiān)測該化合物對在該AD模型中的形態(tài)學(xué)的、電生理學(xué)的、生物化學(xué)的、以及行為學(xué)的改變的影響?；衔?1的慢性給藥推定是通過抑制由AEP對APP的切割而降低了Aβ的沉積?；衔?1引起的認(rèn)知功能的恢復(fù)指示AEP抑制劑在體外的的保護(hù)作用可以轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床益處。突觸功能障礙是AD的早期的且不變的特征。在AD中，突觸損失和癡呆相關(guān)聯(lián)。5XFAD小鼠和非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，示出減少的突觸密度以及LTP大小。如增加的突觸密度和LTP大小所示，化合物11逆轉(zhuǎn)了突觸功能障礙，指示該化合物的“突觸保護(hù)”效應(yīng)。

天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑

本披露涉及天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑。在一些實(shí)施例中，天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑是經(jīng)取代的苯并[c][1,2,5]噁二唑衍生物，例如具有以下化學(xué)式的化合物：

其前藥、酯、衍生物、或鹽，其中，

X是O或S；

R¹選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹任選地被一個或多個相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰選自烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹⁰任選地被一個或多個相同或不同的R¹¹取代；

R¹¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；?、甲磺?；?、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺酰基、N-甲基-N-乙基氨磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R²選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²任選地被一個或多個相同或不同的R²⁰取代；

R²⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²⁰任選地被一個或多個相同或不同的R²¹取代；

R²¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；€基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被-甲基氨甲?；-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺?；?、甲磺?；?、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R³選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³任選地被一個或多個相同或不同的R³⁰取代；

R³⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³⁰任選地被一個或多個相同或不同的R³¹取代；

R³¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺酰基、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺?；?、甲磺?；⒁一酋；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁴選自氫、烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁴任選地被一個或多個相同或不同的R⁴⁰取代；

R⁴⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁴⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁴¹取代；并且

R⁴¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；€基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；?、甲磺酰基、乙基磺?；⒓籽趸驶?、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基。

在某些實(shí)施例中，R¹是氨基。在某些實(shí)施例中，R²是氫。在某些實(shí)施例中，R³是氫。在某些實(shí)施例中，R⁴是雜環(huán)基。

在一些實(shí)施例中，天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑是經(jīng)取代的3,7-二氫嘌呤-2,6-二酮衍生物，例如具有以下化學(xué)式的化合物：

其前藥、酯、衍生物、或鹽，其中，

R¹選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹任選地被一個或多個相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹⁰任選地被一個或多個相同或不同的R¹¹取代；

R¹¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺酰基、甲磺?；?、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R²選自氫、烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²任選地被一個或多個相同或不同的R²⁰取代；

R²⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²⁰任選地被一個或多個相同或不同的R²¹取代；

R²¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺酰基、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺?；?、甲磺?；?、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁶選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁶任選地被一個或多個相同或不同的R⁶⁰取代；

R⁶⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁶⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁶¹取代；

R⁶¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；⒓谆?、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲酰基、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；?、甲磺?；?、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁷選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁷任選地被一個或多個相同或不同的R⁷⁰取代；

R⁷⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁷⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁷¹取代；并且

R⁷¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然?、氨甲酰基、巰基、氨磺?；⒓谆?、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；⒓谆酋；?、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺?；,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基。

在某些實(shí)施例中，R¹是烷基。

在某些實(shí)施例中，R²是烷基。

在某些實(shí)施例中，R⁶是巰基。

在某些實(shí)施例中，R⁷是烷基。

在某些實(shí)施例中，天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑是經(jīng)取代的1,3,4-噻二唑衍生物，例如具有以下化學(xué)式的化合物：

其前藥、酯、衍生物、或鹽，其中，

X是O或S；

R¹選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹任選地被一個或多個相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然奔柞；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹⁰任選地被一個或多個相同或不同的R¹¹取代；

R¹¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；?、甲磺?；?、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R²選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；⒎蓟酋；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²任選地被一個或多個相同或不同的R²⁰取代；

R²⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²⁰任選地被一個或多個相同或不同的R²¹取代；并且

R²¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲酰基、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；?、甲磺?；⒁一酋；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺酰基、N-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基。

在某些實(shí)施例中，R¹是巰基。在某些實(shí)施例中，R²是氨基。

在一些實(shí)施例中，天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑是經(jīng)取代的1-苯基-1H-吡咯-2,5-二酮衍生物，例如具有以下化學(xué)式的化合物：

其前藥、酯、衍生物、或鹽，其中，

R¹選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹任選地被一個或多個相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹⁰任選地被一個或多個相同或不同的R¹¹取代；

R¹¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；€基、氨磺酰基、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；-乙基氨甲?；,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；⒓谆酋；⒁一酋；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R²選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²任選地被一個或多個相同或不同的R²⁰取代；

R²⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²⁰任選地被一個或多個相同或不同的R²¹取代；

R²¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然奔柞；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；-乙基氨甲?；,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲酰基、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；?、甲磺?；?、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R³選自氫、烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³任選地被一個或多個相同或不同的R³⁰取代；

R³⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³⁰任選地被一個或多個相同或不同的R³¹取代；

R³¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；?、甲磺酰基、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁴選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁴任選地被一個或多個相同或不同的R⁴⁰取代；

R⁴⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁴⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁴¹取代；

R⁴¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；€基、氨磺?；⒓谆?、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲?；-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；⒓谆酋；?、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺酰基、N-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁵選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁵任選地被一個或多個相同或不同的R⁵⁰取代；

R⁵⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁵⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁵¹取代；

R⁵¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然?、氨甲酰基、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；⒓谆酋；?、乙基磺?；⒓籽趸驶?、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺酰基、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁶選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁶任選地被一個或多個相同或不同的R⁶⁰取代；

R⁶⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁶⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁶¹取代；

R⁶¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然?、氨甲酰基、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；?、甲磺?；?、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁷選自氫、烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁷任選地被一個或多個相同或不同的R⁷⁰取代；

R⁷⁰選自烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁷⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁷¹取代；并且

R⁷¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；?、甲磺?；?、乙基磺?；⒓籽趸驶?、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺酰基、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

在一些實(shí)施例中，天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑是經(jīng)取代的1-甲基哌嗪衍生物，例如具有以下化學(xué)式的化合物：

其前藥、酯、衍生物、或鹽，其中，

R¹選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹任選地被一個或多個相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹⁰任選地被一個或多個相同或不同的R¹¹取代；

R¹¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲酰基、羧基、氨甲酰基、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；⒓谆酋；⒁一酋；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R²選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²任選地被一個或多個相同或不同的R²⁰取代；

R²⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²⁰任選地被一個或多個相同或不同的R²¹取代；

R²¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；⒓谆?、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲酰基、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺酰基、甲磺酰基、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R³選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³任選地被一個或多個相同或不同的R³⁰取代；

R³⁰選自烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³⁰任選地被一個或多個相同或不同的R³¹取代；并且

R³¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；⒓谆?、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺酰基、甲磺?；?、乙基磺?；⒓籽趸驶?、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基。

在一些實(shí)施例中，天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑是經(jīng)取代的喹啉-5-基甲胺衍生物，例如具有以下化學(xué)式的化合物：

其前藥、酯、衍生物、或鹽，其中，

R¹選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹任選地被一個或多個相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹⁰任選地被一個或多個相同或不同的R¹¹取代；

R¹¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲?；,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；⒓谆酋；⒁一酋；⒓籽趸驶?、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R²選自氫、烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²任選地被一個或多個相同或不同的R²⁰取代；

R²⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；?、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²⁰任選地被一個或多個相同或不同的R²¹取代；

R²¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺酰基、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺?；⒓谆酋；?、乙基磺?；⒓籽趸驶?、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R³選自氫、烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³任選地被一個或多個相同或不同的R³⁰取代；

R³⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³⁰任選地被一個或多個相同或不同的R³¹取代；

R³¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；⒓谆酋；?、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁴選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺?；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁴任選地被一個或多個相同或不同的R⁴⁰取代；

R⁴⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁴⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁴¹取代；

R⁴¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲?；-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；⒓谆酋；⒁一酋；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁵選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁵任選地被一個或多個相同或不同的R⁵⁰取代；

R⁵⁰選自烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲酰基、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁵⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁵¹取代；

R⁵¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；?、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺?；?、甲磺?；⒁一酋；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁶選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁶任選地被一個或多個相同或不同的R⁶⁰取代；

R⁶⁰選自烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁶⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁶¹取代；

R⁶¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；⒓谆酋；?、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R⁷選自氫、烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁷任選地被一個或多個相同或不同的R⁷⁰取代；

R⁷⁰選自烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R⁷⁰任選地被一個或多個相同或不同的R⁷¹取代；并且

R⁷¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；€基、氨磺酰基、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；⒁一鶃喕酋；⒓谆酋；?、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；,N-二甲基氨磺酰基、N,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基。

在一些實(shí)施例中，天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑是經(jīng)取代的噻唑衍生物，例如具有以下化學(xué)式的化合物：

其前藥、酯、衍生物、或鹽，其中，

R¹選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹任選地被一個或多個相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺?；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹⁰任選地被一個或多個相同或不同的R¹¹取代；

R¹¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲酰基、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲?；⒓琢蚧?、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；⒓谆酋；?、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；,N-二甲基氨磺?；,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R²選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²任選地被一個或多個相同或不同的R²⁰取代；R²⁰選自烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；?、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²⁰任選地被一個或多個相同或不同的R²¹取代；

R²¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；€基、氨磺酰基、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙酰基氨基、N-甲基氨甲?；-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲酰基、N,N-二乙基氨甲?；?、N-甲基-N-乙基氨甲酰基、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；?、甲磺酰基、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺酰基、N,N-二甲基氨磺?；,N-二乙基氨磺?；-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R³選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；?、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺?；?、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³任選地被一個或多個相同或不同的R³⁰取代；

R³⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R³⁰任選地被一個或多個相同或不同的R³¹取代；并且

R³¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙酰基、乙酰氧基、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲?；,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺酰基、甲磺?；?、乙基磺酰基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；,N-二甲基氨磺?；,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基。

在一些實(shí)施例中，天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑是經(jīng)取代的6-甲基-5,6,7,8-四氫吡啶并[4,3-d]嘧啶-4(3H)-酮衍生物，例如具有以下化學(xué)式的化合物：

其前藥、酯、衍生物、或鹽，其中，

R¹選自氫、烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹任選地被一個或多個相同或不同的R¹⁰取代；

R¹⁰選自烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；Ⅳ然?、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；⒎蓟酋；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R¹⁰任選地被一個或多個相同或不同的R¹¹取代；

R¹¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲?；€基、氨磺酰基、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；?、N-乙基氨甲酰基、N,N-二甲基氨甲?；?、N,N-二乙基氨甲?；-甲基-N-乙基氨甲?；?、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺?；?、乙基亞磺?；?、甲磺酰基、乙基磺?；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺酰基、N-乙基氨磺?；?、N,N-二甲基氨磺?；,N-二乙基氨磺?；?、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基；

R²選自氫、烷基、烯基、鏈烷?；Ⅺu素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲?；?、羧基、氨甲?；⑼檠趸?、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；⑼榛酋；?、芳基磺?；⑻辑h(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²任選地被一個或多個相同或不同的R²⁰取代；

R²⁰選自烷基、烯基、鏈烷酰基、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、巰基、甲酰基、羧基、氨甲?；?、烷氧基、烷硫基、烷氨基、二烷氨基、烷基亞磺?；?、烷基磺酰基、芳基磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基，其中R²⁰任選地被一個或多個相同或不同的R²¹取代；并且

R²¹選自鹵素、硝基、氰基、羥基、三氟甲氧基、三氟甲基、氨基、甲?；?、羧基、氨甲酰基、巰基、氨磺?；?、甲基、乙基、丙基、叔丁基、甲氧基、乙氧基、乙?；⒁阴Ｑ趸?、甲氨基、乙氨基、二甲氨基、二乙氨基、N-甲基-N-乙氨基、乙?；被?、N-甲基氨甲?；-乙基氨甲?；?、N,N-二甲基氨甲?；,N-二乙基氨甲酰基、N-甲基-N-乙基氨甲酰基、甲硫基、乙硫基、甲基亞磺酰基、乙基亞磺?；⒓谆酋；⒁一酋；?、甲氧基羰基、乙氧基羰基、N-甲基氨磺?；?、N-乙基氨磺?；,N-二甲基氨磺?；?、N,N-二乙基氨磺酰基、N-甲基-N-乙基氨磺?；?、碳環(huán)基、芳基、和雜環(huán)基。

藥用組合物

在某些實(shí)施例中，本披露涉及包括在此披露的化合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥用組合物。在某些實(shí)施例中，藥用組合物是處于丸劑、膠囊、片劑、或鹽水水性緩沖液的形式。在某些實(shí)施例中，該藥學(xué)上可接受的賦形劑選自糖類、二糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇、多糖、淀粉、纖維素、微晶纖維素、纖維素醚、羥丙基纖維素(HPC)、木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、明膠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉、二堿式磷酸鈣、碳酸鈣、硬脂酸、硬脂酸鎂、滑石、碳酸鎂、二氧化硅、維生素A、維生素E、維生素C、棕櫚酸視黃酯、硒、半胱氨酸、甲硫氨酸、檸檬酸和檸檬酸鈉、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯及其組合。

在此披露的藥用組合物可以呈藥學(xué)上可接受的鹽類的形式，通常如以下所描述的。適合的藥學(xué)上可接受的有機(jī)和/或無機(jī)酸的某些優(yōu)選但不限定的實(shí)例是鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、乙酸以及檸檬酸，連同其他本身已知的藥學(xué)上可接受的酸(在以下提到的引用文件中進(jìn)行引用)。

當(dāng)本披露的這些化合物包含一個酸基和一個堿基的時候，本披露的這些化合物還可能形成一個內(nèi)鹽，并且這類化合物在本披露的范圍內(nèi)。當(dāng)本披露的這些化合物包含一個給氫的雜原子(如NH)的時候，本披露涵蓋通過將所述氫原子在該分子內(nèi)轉(zhuǎn)移到一個堿基或原子上形成的鹽類和/或異構(gòu)體。

這些化合物的藥學(xué)上可接受的鹽類包括該酸加成以及它的堿性鹽類。適合的酸加成鹽由形成無毒的鹽的酸形成。實(shí)例包括乙酸鹽、己二酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯碳酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、硼酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)己烷氨基磺酸鹽、乙二磺酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、六氟磷酸鹽、羥苯酰苯酸鹽、鹽酸化物/氯化物、氫溴化物/溴化物、氫碘化物/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、萘酚鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、乳清酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、磷酸鹽/磷酸/磷酸二氫鹽、焦谷氨酸鹽、糖質(zhì)酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽以及昔萘酸鹽鹽類。適合的堿鹽從形成無毒鹽的堿形成。實(shí)例包括鋁、精氨酸、芐星青霉素G、鈣、膽堿、二乙胺、二乙醇胺、甘胺酸、細(xì)胞溶素、鎂、甲基葡胺、環(huán)匹羅司乙醇胺、鉀、鈉、氨丁三醇以及鋅鹽。酸類和堿類的半鹽也可能形成，例如半硫酸鹽和半鈣鹽。作為適合的鹽類的一個綜述，參見斯特爾(Stahl)和韋穆特(Wermuth)所著的藥用鹽手冊：特性、選擇以及使用(威利-VCH，2002)，通過引用結(jié)合在此。

在此描述的這些化合物可能以藥物前體的形式給予。前藥可以包括共價結(jié)合的載體，該載體當(dāng)給予哺乳動物受試者時釋放該活性母體藥物。前藥可以通過修飾存在于這些化合物中的功能基團(tuán)制備，其方式是使得這些修飾在常規(guī)操作中或者在體內(nèi)是可切割的，以形成這些母體化合物。例如，藥物前體包括羥基結(jié)合到任意基團(tuán)的化合物，當(dāng)給予到哺乳動物受試者中時，羥基斷裂形成游離的羥基。前藥的實(shí)例包括，但不限于，在這些化合物中的醇功能基團(tuán)的乙酸鹽、甲酸鹽以及苯甲酸鹽衍生物類。將一種化合物構(gòu)建為前藥的方法可以在特斯塔(Testa)和邁耶(Mayer)的書，藥物的水解和前藥新陳代謝(Drug and Prodrug Metabolism)，威利(2006)中找到。典型的前藥通過水解酶轉(zhuǎn)化前藥，酰胺、內(nèi)酰胺、肽、羧酸酯、環(huán)氧化合物的水解，或者無機(jī)酸類酯的切割形成活性代謝產(chǎn)物。制造酯前藥例如游離羥基基團(tuán)的乙酰基酯是本領(lǐng)域中的普通技術(shù)。眾所周知，酯前藥容易在體內(nèi)降解釋放相應(yīng)的醇。參見例如今井(Imai)，藥物代謝藥代動力學(xué)(Drug Metab Pharmacokinet)(2006)21(3):173-85，標(biāo)題為“人類羧酸酯酶同工酶：催化特性和合理藥物設(shè)計”(“Human carboxylesterase isozymes:catalytic properties and rational drug design.”)。

典型地，用于本披露的藥用組合物包括有效量的化合物和適合的藥學(xué)上可接受的載體。這些制劑能以本身已知的方式制備，該方式通常涉及將根據(jù)本披露所述的至少一種化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合，并且，如果是所希望的，與其他藥用活性化合物組合，此時有必要在無菌條件下進(jìn)行。參考美國專利號6,372,778、美國專利號6,369,086、美國專利號6,369,087、美國專利號6,372,733以及以上提及的進(jìn)一步的參考，連同標(biāo)準(zhǔn)手冊，例如最新版本的雷明頓制藥科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences)。

通常來說，對于藥物使用，這些化合物可以被配制為一種藥物制劑，該藥物制劑包括至少一種化合物以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑和/或佐劑，以及任選地一種或多種另外的藥用活性化合物。

被披露的這些藥物制劑優(yōu)選以一種單位劑型的形式，并且可以被適當(dāng)?shù)胤庋b，例如在一個盒子、皰、管形瓶、瓶子、小藥囊、針劑或者任意其他適合的單劑量或者多劑量的夾持器或者容器中(可以被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記)；可任選地用一個或多個包含產(chǎn)品信息和/或使用說明的宣傳單。通常來說，這類單位劑量將在至少本披露的一種化合物包含1mg至1000mg，并且通常在5mg至500mg之間，如每單元劑量10mg、25mg、50mg、100mg、200mg、300mg或者400mg。

這些化合物可以通過多種途徑給予，包括口服、眼睛、直腸、經(jīng)皮、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或者鼻內(nèi)途徑，主要取決于所使用的具體制劑。通常來說，該化合物將以一個“有效量”給予，由此意味著在適當(dāng)?shù)慕o藥下，一種化合物的任意量足夠在它給予的受試者中達(dá)到所希望的治療或者預(yù)防效果。通常，取決于待預(yù)防或者治療的情況以及給藥的途徑，這種有效量將通常為每天每千克病人體重0.01mg至1000mg之間，更經(jīng)常在0.1mg至500mg之間，如1mg至250mg，例如每天每千克病人體重大約5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、150mg、200mg或250mg，該劑量可以作為被劃分成一個或多個日常劑量的單一的日常劑量。給予的量，給藥的途徑以及進(jìn)一步的治療方案可能由治療的臨床醫(yī)師決定，取決與因素，如年齡、性別、以及病人的一般條件以及待治療的疾病/癥狀的性質(zhì)和嚴(yán)重性。參考美國專利號6,372,778、美國專利號6,369,086、美國專利號6,369,087、美國專利號6,372,733以及以上提及的進(jìn)一步的參考，連同標(biāo)準(zhǔn)手冊，例如最新版本的雷明頓制藥科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences)。

對于口服給藥形式，該化合物可以與適合的添加劑混合，如賦形劑、穩(wěn)定劑或者惰性稀釋劑，并且通過常規(guī)方法引入適合的給藥形式，如片劑、包衣片劑、硬膠囊、水、醇或油溶液。適合的惰性載體的實(shí)例是阿拉伯樹膠、氧化鎂、碳酸鎂、磷酸鉀、乳糖、葡萄糖或者淀粉，特別是玉米淀粉。在這種情況下，該制備可以通過干法或者濕法造粒實(shí)行。適合的油性賦形劑或者溶劑是蔬菜或者動物油，如葵花籽油或者魚肝油。水或者醇溶液的適合的溶劑是水、乙醇、糖溶液或者它們的混合物。聚乙二醇以及聚丙二醇也被用作其他給藥形式的另外的助劑。作為立即釋放的片劑，這些組合物可能包含微晶纖維素、磷酸二鈣、淀粉、硬脂酸鎂以及乳糖和/或其他本領(lǐng)域已知的賦形劑、粘合劑、增充劑、分解劑、稀釋劑以及潤滑劑。

當(dāng)通過鼻吸氣霧劑或吸入劑給予時，這些化合物可能根據(jù)藥物配制品的本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)制備，并且制備成鹽溶液，使用苯甲醇以及其他適合的防腐劑，吸收促進(jìn)劑來增強(qiáng)生物利用率，碳氟化合物和/或本領(lǐng)域已知的溶解或分散劑。以氣霧劑或者噴霧的形式給藥的適合的藥物配制品是，例如，在本披露中的這些化合物的溶液、懸浮液或乳液或者它們的生理上可耐受的溶劑，如乙醇或水，或者這類溶劑的一個混合物。如果需要，該配制品可以包含其他藥物助劑，如表面活性劑、乳化劑以及穩(wěn)定劑，連同推進(jìn)劑。

對于皮下或者靜脈給藥，如果是所希望的，因此，這些具有常規(guī)物質(zhì)的化合物如增溶劑、乳化劑或者另外的助劑被引入溶液、懸浮液或者乳液。這些化合物還可以被低壓凍干，并且這些冷凍干燥物可以用于，例如，注射或者浸出制劑的生產(chǎn)。例如，適合的溶劑是水、生理鹽溶液或低級醇類，如乙醇、丙醇、丙三醇，糖溶液，如葡萄糖或者甘露醇溶液，或者提及的多種溶劑的混合物。這些可注射的溶液或者懸浮液可能根據(jù)已知的技術(shù)配置，使用適合的無毒的、不經(jīng)腸可接受的稀釋劑或者溶劑，如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格式溶液或者等滲氯化鈉溶液，或者適合的分散或潤濕以及助懸劑，如包含合成的甘油單酯或甘油二酯無菌的、溫和的非揮發(fā)油，以及包含油酸的脂肪酸類。

當(dāng)以栓劑的形式經(jīng)直腸給予的時候，這些配制品可能通過將化學(xué)式I的這些化合物與一種適合的無刺激性的賦形劑混合，如可可脂、合成甘油酯類或者聚乙二醇類，這些賦形劑在常溫下是固體，但是在直腸腔內(nèi)液化和/或溶解以便釋放藥物。

在某些實(shí)施例中，考慮到這些組合物可以是延長釋放的配制品。典型的延長釋放配制品利用一種腸溶衣。典型地，在口服治療中應(yīng)用一種屏障，以便控制在其被吸收的消化系統(tǒng)的位置。

腸溶衣防止藥物在到達(dá)小腸之前釋放。腸溶衣可能包含多糖類的聚合物，如麥芽糊精、黃胞膠、硬葡聚糖、淀粉、藻酸鹽、短梗霉多糖、透明質(zhì)酸、甲殼質(zhì)、聚葡萄胺糖等；其他天然聚合物，如蛋白質(zhì)類(白蛋白、明膠等)、聚左旋賴氨酸；聚丙烯酸鈉；聚(甲基丙烯酸羥烷酯)(例如聚(甲基丙烯酸羥烷酯))；羧聚乙烯(例如聚羰乙烯TM)；丙烯酸聚合物；聚乙烯吡咯酮；膠類，如古爾膠、阿拉伯膠、卡拉牙膠、闊葉榆綠木膠、刺槐豆膠、羅望子果膠、胞外多糖膠、黃芪膠、瓊脂、果膠、谷蛋白等；聚乙烯醇；乙烯乙烯醇；聚乙二醇(PEG)；以及纖維素醚，如羥甲香豆素(HMC)、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、甲基纖維素(MC)、e乙基纖維素(EC)、羧甲基纖維素(CEC)、乙羥基乙基纖維素(EHEC)、羧甲基纖維素(CMHEC)、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥丙基乙基纖維素(HPEC)以及羧基甲基纖維素鈉(Na CMC)；以及任意以上的聚合物的共聚物和/或(簡單的)混合物。某些上述聚合物可能通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)一步交聯(lián)。

聚合物的選擇將取決于施用于本發(fā)明的組合物的該活性成分/藥物的性質(zhì)連同所希望的釋放率。特別是，它將經(jīng)過普通技術(shù)人員的鑒別，例如在HPMC的情況下，通常一個較高的分子量將提供藥物從該組合物中較低的釋放率。此外，在HPMC的情況下，甲氧基團(tuán)和羥丙基基團(tuán)取代的不同程度將提高藥物從該組合物中的釋放率的變化。在這方面，以及以上所述的，可能令人希望的是提供以涂層形式的本發(fā)明的組合物，其中該聚合物載體通過混合兩種或多種聚合物的方式提供，例如，不同的分子量以便生產(chǎn)一種特殊的所需的或所希望的釋放特征。

聚交酯、聚乙醇酸交酯的微球，以及它們的共聚物聚(丙交酯共聚乙交酯)可能用于形成持續(xù)釋放的蛋白質(zhì)或化合物供應(yīng)系統(tǒng)。蛋白質(zhì)類和/或化合物可以通過多種方法加入該聚(丙交酯共聚乙交酯)微球儲存，這些方法包括與水性蛋白質(zhì)以及有機(jī)溶劑性聚合物形成水油相乳液(乳液法)，與分散在溶劑型聚合物溶液中的固態(tài)蛋白質(zhì)形成固油相懸浮液(懸浮法)，或者通過將該蛋白質(zhì)溶解在溶劑型聚合物溶液中(溶解法)?？梢詫⒕?乙二醇)貼附在蛋白質(zhì)類(聚乙二醇化藥物修飾技術(shù))來增加體內(nèi)循環(huán)治療蛋白質(zhì)的半衰期，并且降低免疫應(yīng)答的機(jī)會。

使用方法

在某些實(shí)施例中，這些天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑對于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病和認(rèn)知障礙例如阿爾茨海默病是有用的。在某些實(shí)施例中，本披露涉及包括天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥用組合物。在某些實(shí)施例中，本披露涉及治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的方法，這些方法包括將有效量的藥用組合物給予至對其有需要的受試者，該藥用組合物包括在此披露的天冬酰胺內(nèi)肽酶抑制劑。

在某些實(shí)施例中，受試者處于展現(xiàn)出AD癥狀的風(fēng)險。

在某些實(shí)施例中，本披露考慮將在此披露的化合物和成像劑(如florbetapir(¹⁸F)和/或涉及治療或改善AD的一種或多種癥狀的治療劑組合給藥。

在某些實(shí)施例中，本披露考慮把此披露的化合物和用于記憶喪失的藥物、用于行為改變的治療、用于睡眠改變的治療組合給藥。

在某些實(shí)施例中，本披露考慮把此披露的化合物和選自膽堿酯酶抑制劑如多奈哌齊、利伐斯的明、加蘭他敏、和他克林和/或用于阻滯NMDA受體的藥劑如美金剛組合給藥，以治療阿爾茨海默病的認(rèn)知癥狀(記憶喪失、困惑以及在思考和推理方面的問題)。

在某些實(shí)施例中，本披露考慮將在此披露的化合物和維生素E組合給藥。

在某些實(shí)施例中，本披露考慮將在此披露的化合物和例如抗興奮、抗焦慮、抗神經(jīng)錯亂、抗失眠以及抗抑郁藥劑的藥物組合給藥。

在某些實(shí)施例中，本披露考慮將在此披露的化合物和淀粉樣蛋白的單克隆抗體疫苗(包括但不限于solanuzemab、gantenerumab、以及bapineuzumab)組合給藥。

在某些實(shí)施例中，本披露考慮將在此披露的化合物和用于卒中或創(chuàng)傷性腦損傷的藥物組合給藥。

在某些實(shí)施例中，本披露考慮將在此披露的化合物和重組組織纖溶酶原激活劑(rtPA)組合給藥。

在某些實(shí)施例中，在此披露的化合物可以用于治療與細(xì)胞凋亡相關(guān)的多種疾病，包括神經(jīng)退行性障礙、缺血性損傷、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、以及骨質(zhì)疏松癥。細(xì)胞凋亡涉及肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、亨廷頓病、阿爾茨海默病、帕金森病、以及脊髓性肌萎縮。在多發(fā)性硬化(MS)中，少突膠質(zhì)細(xì)胞的死亡是神經(jīng)膠質(zhì)通過細(xì)胞凋亡而變性的重要例子。

在某些實(shí)施例中，在此披露的化合物可用于治療亨廷頓病和其他神經(jīng)退行性疾病如齒狀紅核蒼白球呂伊斯體萎縮癥(DRPLA)、3型小腦萎縮癥(SCA-3)、以及脊延髓肌萎縮癥(SBMA)。

神經(jīng)元細(xì)胞凋亡還在急性損傷如卒中、創(chuàng)傷、和缺血后觀察到。細(xì)胞凋亡已經(jīng)在動物卒中模型中的紋狀體的和皮質(zhì)的神經(jīng)元中被觀察到。

實(shí)驗(yàn)

AEP的抑制劑通過高通量篩選來鑒定

為了鑒定AEP的小分子抑制劑，協(xié)同愛默蕾化學(xué)生物發(fā)現(xiàn)中心(Emory Chemical Biology Discovery Center)設(shè)計高通量篩選。該篩選結(jié)合小鼠腎細(xì)胞裂解物以測定54,384種化合物的庫。在用來自AEP-/-小鼠的腎細(xì)胞裂解物進(jìn)行反向篩選時，736個命中化合物被確認(rèn)針對細(xì)胞AEP顯示小于或等于40μM的IC₅₀值。用純化的活性AEP進(jìn)行第三次篩選，發(fā)現(xiàn)46個命中化合物展現(xiàn)出有前景的抑制活性(圖1)。另外的結(jié)構(gòu)分析和分類使這些化合物被歸為8類不同的骨架家族。在來自每組的一些最強(qiáng)的化合物用純化的活性AEP測試后，發(fā)現(xiàn)頂尖的8個候選化合物的IC₅₀值。還使用四種主要的半胱氨酸蛋白酶來確定這些化合物的特異性(圖2)?；衔顱B1顯現(xiàn)在大約130mM具有針對AEP最大的效力，并且它對AEP的選擇性比對組織蛋白酶-L選擇性高約38倍。另一方面，化合物22對于所有測試的半胱氨酸蛋白酶具有大于100μM的IC₅₀。化合物11和38還顯現(xiàn)是AEP的有力抑制劑，因?yàn)樗鼈兎謩e顯示了大約700nM和370nM的IC₅₀值，并且它們對AEP的選擇性比對半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-8的選擇性至少高80倍?；衔?4展現(xiàn)出在2.37μM的最高IC₅₀。它是個低微摩爾抑制劑，并且它對AEP的選擇性比對組織蛋白酶-S、組織蛋白酶-L和半胱天冬酶-8的選擇性高超過40倍，并且比對半胱天冬酶-3的選擇性高約6倍。

化合物的細(xì)胞滲透性

為了評價這些化合物在完整細(xì)胞中的活性，將這些化合物與人類的類B淋巴母細(xì)胞pala細(xì)胞孵育，這些人類B淋巴母細(xì)胞樣pala細(xì)胞富含內(nèi)源性AEP并且已經(jīng)在細(xì)胞測定中被用于抑制AEP。大部分化合物能夠以在亞微摩爾范圍內(nèi)的IC₅₀值抑制酶，然而化合物BB1和10展現(xiàn)出略大的IC₅₀值；許多化合物顯現(xiàn)是細(xì)胞滲透性的(圖3)。IC₅₀值小于1μM的化合物的ADME特征被進(jìn)一步評估。

體外ADMET特征

為了表征這些化合物的毒性，使用人類肝細(xì)胞癌HepG細(xì)胞和原代神經(jīng)元培養(yǎng)物進(jìn)行MTT測定去監(jiān)測細(xì)胞活力。在HepG細(xì)胞中，化合物22(含馬來酰亞胺的衍生物)揭示了和陽性對照依托泊苷相似的毒性，依托泊苷是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑并且已知其誘導(dǎo)雙鏈斷裂(圖4A)。將這些化合物在原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中的細(xì)胞毒性使用LDH測定測量細(xì)胞裂解來測定(圖4B)。化合物的致癌性與它的微核誘導(dǎo)是成正比的。為了評價化合物是否具有任何致癌性，進(jìn)行COMET測定和微核測定。在這些測定中，產(chǎn)生可測量的DNA切口的苯并(α)芘(B(a)p)被包括作為陽性對照。在用50μM化合物處理24小時后，化合物22是唯一一個示出基因毒性的測試化合物，因此將該化合物從進(jìn)一步分析中排除(圖4C和4D)。

為了探索這些化合物的體外ADME特征，進(jìn)行另外的測試。進(jìn)行Caco-2細(xì)胞單層滲透性篩選以評價這些化合物的吸收特征，并且發(fā)現(xiàn)化合物11和31是高度可滲透的，并且因此應(yīng)該是生理上可較好吸收的(表1)。

表1.Caco-2滲透性。

LLOQ＝在接受側(cè)未檢測到化合物

在BBB-PAMPA滲透性測定中，化合物11以高水平被檢測到，并且因此被認(rèn)為能夠穿過血腦屏障(表2)。

表2.BBB-PAMPA滲透性。

LLOQ＝在接受側(cè)未檢測到化合物

ND＝由于生物分析問題未檢測到峰

人類肝微粒體穩(wěn)定性篩選證實(shí)了在孵育30分鐘后，76％的化合物11和88％的化合物38保留在人類肝微粒體中(表3)。

表3.肝微粒體穩(wěn)定性。

ND＝由于生物分析問題(不良的離子化)未檢測到峰

根據(jù)CYP抑制篩選，化合物31能夠以69.2％抑制CYP2C9，并且以55.7％抑制CYP2C19，而化合物64在10μM的濃度下以58.3％抑制CYP2D6，表明這兩種化合物能夠產(chǎn)生潛在的藥物-藥物相互作用(表4)。

表4.CYP抑制。

化合物的DTT可逆轉(zhuǎn)性

雖然并不預(yù)期本披露的實(shí)施例被任何具體機(jī)制所限制，但為了獲得對由抑制劑采用以便去除AEP活性的機(jī)制的進(jìn)一步深入了解，在游離硫醇基的存在下測定這些抑制劑的可逆轉(zhuǎn)性。將強(qiáng)還原劑如DTT，或弱還原劑L-半胱氨酸添加到抑制的反應(yīng)中，可以用于競爭勝過抑制藥劑并且恢復(fù)帶有活性位點(diǎn)硫醇基殘基的酶的催化活性。這里，通過將還原劑DTT或L-半胱氨酸添加到反應(yīng)中來使用類似的途徑，其中為了逆轉(zhuǎn)抑制劑的作用，AEP已經(jīng)與指定的抑制劑孵育。含硫醇基的化合物BB1和38以及含硫氰酸酯部分的化合物10，都顯現(xiàn)在還原劑的存在下已經(jīng)重新獲得實(shí)質(zhì)性的量的活性，指示還原劑能夠還原酶的活性位點(diǎn)半胱氨酸，并且由此增強(qiáng)活性酶的有效濃度。然而，在含硫化合物BB1、10和38的存在下,AEP重新獲得實(shí)質(zhì)性的量的活性。對于化合BB1和38，酶活的這種增加可以是由于在抑制劑和酶之間的二硫鍵的還原，因?yàn)檫@些化合物包含硫醇基?；衔?0包含硫氰酸酯，并且可以經(jīng)歷被酶的活性位點(diǎn)硫醇鹽進(jìn)行親核攻擊，以形成硫代亞氨酸酯酶-抑制劑復(fù)合物。在酸性條件下，該復(fù)合物可由強(qiáng)還原劑如DTT或更弱的還原劑L-半胱氨酸還原。因此，可能的是化合物BB1、10和38可以和AEP的活性位點(diǎn)半胱氨酸形成共價鍵并競爭性地抑制該AEP的活性。

抑制劑表征

為了進(jìn)一步評價由化合物采用的用以抑制AEP的機(jī)制，針對化合物11以及化合物BB1測定抑制動力學(xué)，從而確認(rèn)硫醇部分競爭性地抑制該酶。為了確定化合物BB1和11的抑制模式，將穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)在遞增濃度的每種抑制劑的存在下進(jìn)行測量(圖6A-H)。產(chǎn)生的每種化合物的米氏圖表顯現(xiàn)指示競爭性抑制。競爭抑制劑和底物競爭結(jié)合酶的活性位點(diǎn)，因此在飽和的底物濃度下，抑制可以減弱。抑制劑常數(shù)K_I，是產(chǎn)生半最大抑制的抑制劑濃度，是抑制劑效力的度量；化合物的K_I值在圖6A-B中被列出?；衔顱B1和11的米氏圖以及納摩爾級抑制常數(shù)指示它們是AEP的競爭性抑制劑。因?yàn)锽B1包含硫醇基，它能夠和AEP的活性位點(diǎn)半胱氨酸形成二硫鍵?；衔?1的反應(yīng)性基團(tuán)仍然不清楚，因此為了進(jìn)一步表征它的抑制模式，在遞增濃度的抑制劑下，測量進(jìn)展曲線。所產(chǎn)生的曲線圖指示化合物11以時間和濃度依賴性方式抑制AEP(圖6C)。此外，描繪從進(jìn)展曲線中測定的抑制的準(zhǔn)一級速率常數(shù)k_obs，得到雙曲線，與失活的兩步機(jī)制一致(圖6D)。失活速率，k_inact，被發(fā)現(xiàn)是0.075±0.002mm^-1，因此二級速率常數(shù)k_inact/K_I是1.2x 10⁶min^-1M^-1，表明化合物11不可逆地使AEP失活?；螧B1還顯示了指示緩慢結(jié)合型抑制劑的進(jìn)展曲線(圖6E)。然而，k_obs相對抑制劑濃度曲線得到一條直線，可能是因?yàn)榭焖俚亩蚧镄纬煞磻?yīng)(圖6F)。抑制的二級速率常數(shù)k_inact/K_I能夠從這條曲線的斜率中獲得，并且是3.3x 10⁶min^-1M^-1，并且對于化合物BB1而言，指示此化合物能夠和AEP的活性位點(diǎn)硫醇基形成二硫鍵。

在酸中毒的細(xì)胞模型中的效力

剝奪細(xì)胞的氧和葡萄糖是被用于在所培養(yǎng)的細(xì)胞中觸發(fā)酸中毒的細(xì)胞模型。在氧-葡萄糖剝奪(OGD)的細(xì)胞模型中，測定化合物的效力，從而模擬卒中在原代培養(yǎng)的神經(jīng)元中的影響。作為剝奪了神經(jīng)元的包含氧和葡萄糖的培養(yǎng)基的結(jié)果，AEP活性為雙倍(圖7A，‘DMSO-Norm’相比于‘DMSO-OGD'’)，而半胱天冬酶-3以及組織蛋白酶活性仍然保持相對不變。在化合物11的存在下，AEP活性存在明顯的劑量依賴性下降，這并沒有在半胱天冬酶-3以及組織蛋白酶中觀察到?；衔?2還能夠產(chǎn)生AEP活性的略微下降，并且選擇性的只針對該酶(圖7)。由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺血在卒中后增加阿爾茨海默病的風(fēng)險，淀粉樣前體蛋白(APP)的切割在OGD處理后被評價(圖7D和E)。作為僅對DMSO處理的響應(yīng)，觀察到APP的切割(圖7D，泳道2)，并且顯現(xiàn)在1μM的化合物10、11和12以及僅僅0.1μM的化合物31、38和64處理時，切割被阻滯，推定是由于AEP抑制。圖7E還示出響應(yīng)于化合物10和12存在的劑量依賴性APP切割的降低。

化合物11具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且在AD小鼠中改善認(rèn)知行為

將化合物11的急性和慢性毒性通過口服飼喂C57BL/6J小鼠100mg/kg的藥物經(jīng)30天時間而評估。在整個處理時間中，在體重方面未觀察到顯著的改變。此外，免疫組織化學(xué)染色證實(shí)運(yùn)載體處理的和藥物處理的動物之間沒有大差別。還對用化合物11處理的小鼠進(jìn)行全血球計數(shù)(CBC)分析，并且驗(yàn)證了所有的參數(shù)是在健康小鼠的正常范圍內(nèi)。綜上，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了化合物11在100mg/kg的劑量下，在小鼠中并沒有展現(xiàn)全身毒性?；衔?1具有非常有利的ADMET特征，具有突出的血腦屏障滲透性。

化合物11抑制AEP活性并且在AD的小鼠模型中降低由BACE進(jìn)行的APP切割

活性AEP切割A(yù)PP并且促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生。為了測試化合物11的口服給藥是否可以減弱體內(nèi)Aβ的產(chǎn)生，將5XFAD小鼠在2個月大小開始用化合物11或運(yùn)載體處理3個月。5XFAD小鼠共表達(dá)總計五種與通常的AD相關(guān)聯(lián)的突變，并且在早期發(fā)展腦淀粉樣蛋白斑。AEP活性測定示出口服化合物11顯著地抑制了在小鼠腦內(nèi)AEP的活性(圖8A)。AEP的阻滯減少了接下來在切割A(yù)PP中的BACE活性。C99，是由β位點(diǎn)切割產(chǎn)生的APP的C端片段，在化合物11處理后減少，但是α位點(diǎn)切割產(chǎn)物C83的表達(dá)并沒有被化合物11改變。化合物11處理并沒有改變總的APP或β分泌酶(BACE1)的蛋白水平(圖8B，第二和第三個圖片)。這些結(jié)果指示化合物11在抑制腦中的AEP的活性，并且AEP活性的抑制降低了APP的β位點(diǎn)切割以及Aβ的產(chǎn)生。因此，化合物11抑制AEP并且在AD小鼠模型中降低由BACE進(jìn)行的APP降解。

化合物11的慢性口服給藥挽救在5XFAD小鼠中的記憶損害

為了研究化合物11的慢性口服給藥是否能夠逆轉(zhuǎn)5XFAD小鼠的認(rèn)知損害，將3個月大的小鼠用化合物11通過連續(xù)口服給藥來處理，每日一次持續(xù)3個月。硫黃素S染色發(fā)現(xiàn)運(yùn)載體處理的5XFAD小鼠具有在海馬體(HC)、運(yùn)動皮質(zhì)(MC)、以及額皮質(zhì)(FC)中有顯著的蛋白斑塊沉積，該沉積可以由化合物11減弱(圖9A,B)。該結(jié)果是通過使用抗-Aβ抗體的淀粉樣蛋白斑的免疫組織化學(xué)染色確認(rèn)的。此外，化合物11降低在腦裂解物中的Aβ1-40和Aβ1-42的濃度(圖9C,D)。為了研究化合物11對認(rèn)知活動的治療效力，我們使用莫里斯水迷宮測試評價空間記憶形成。在5個采集日中，當(dāng)與運(yùn)載體處理的小鼠比較時，用化合物11處理的小鼠示出到平臺的降低的距離，指示改進(jìn)了空間學(xué)習(xí)(圖9E)。在探索測試中，化合物11處理的小鼠在之前包含平臺的目標(biāo)象限中花費(fèi)了更多的時間，證實(shí)化合物11對空間記憶回想的挽救(圖9F)。游泳速度并未受到化合物11的影響(圖9G)。這些結(jié)果指示用化合物11的慢性處理改善了在5XFAD模型中的記憶損害。

化合物11在5XFAD小鼠中防止突觸損失并且恢復(fù)突觸可塑性

突觸功能障礙是AD的早期特征，并且被認(rèn)為是認(rèn)知損害的基礎(chǔ)。和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾龋?XFAD小鼠示出降低的突觸密度。為了研究化合物11對突觸功能障礙的影響，在CA1區(qū)域中的突觸密度用電子顯微鏡評價?；衔?1顯著增加了突觸密度(圖10A，B)。將沿著錐體神經(jīng)元的單獨(dú)樹突的樹突棘的密度通過高爾基體染色進(jìn)行評價。再一次，化合物11增加了樹突棘的密度(圖10C，D)。長時程增強(qiáng)(LTP)是構(gòu)成學(xué)習(xí)和記憶基礎(chǔ)的突觸可塑性的度量。5XFAD小鼠在謝弗側(cè)枝-CA1途徑中有降低的LTP大小?；衔?1處理在5XFAD小鼠中顯著逆轉(zhuǎn)了LTP損害，指示由化合物11引起突觸功能的恢復(fù)(圖10E,F)。

方法

小鼠、細(xì)胞和試劑

5XFAD小鼠來自杰克遜(Jackson)實(shí)驗(yàn)室，并且根據(jù)愛默蕾醫(yī)學(xué)院(Emory Medical School)指南在無病原環(huán)境中養(yǎng)殖。小鼠接受10mg/Kg/d劑量的運(yùn)載體或11號化合物的飼喂處理。將抗APP、抗APP C、小鼠單克隆抗APP N585使用肽NH₂-IKTEEISEVC-COOH發(fā)展，并且從蛋白G親和柱中純化。TUNEL原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒來自羅氏(印第安納波利斯，印第安納州(IN))。11號化合物購買自TCI(波特蘭，奧勒岡州(OR))。化學(xué)品還購買自西格瑪奧德里奇。天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP，豆莢蛋白)從義翹神州生物技術(shù)有限公司(Sino Biological)獲得，組織蛋白酶-S從雅典研究與技術(shù)公司(Athens Research and Technology)獲得，半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-8從密理博(Millipore)獲得。Pala細(xì)胞是來自柯林沃茨(Colin Watts)博士的禮物，并且在37℃、5％CO₂下被保存在加濕孵箱中的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10％FBS、2mg/mL谷氨酰胺、100U青霉素/鏈霉素。

高通量篩選

在微高通量篩選形式中，針對潛在的AEP抑制劑對Asinex化合物庫進(jìn)行篩選。在1536孔板中，將625μg/mL野生型小鼠腎細(xì)胞裂解物與16.7μM庫中化合物孵育，并且通過EnVision多標(biāo)記酶標(biāo)儀進(jìn)行讀取(激發(fā)λ＝360nm，發(fā)射λ＝460nm)，以獲得背景讀數(shù)。添加1μM Cbz-Ala-Ala-Asn-AMC以起始反應(yīng)，并且在15分鐘后，再次測量熒光，并且從最終結(jié)果中減去背景值。和對照孔相比，抑制的百分比被測定，并且將前736個化合物與來自AEP敲除小鼠的腎細(xì)胞裂解物和50nM純的活性AEP(義翹神州)進(jìn)行劑量-反應(yīng)確證篩選。

酶學(xué)測定

組織蛋白酶-S-將100nM酶與抑制劑在測定緩沖液(100mM NaH₂PO₄ pH 6.5，100mM NaCl)中在37℃預(yù)孵育10分鐘。該反應(yīng)在添加25μM底物(Boc-Val-Leu-Lys-AMC(巴亨))時起始。

組織蛋白酶-L-將100nM酶與抑制劑在測定緩沖液(100mM乙酸鈉pH5.5，1mM EDTA)中在37℃預(yù)孵育10分鐘。該反應(yīng)在添加25μM底物(D-Val-Leu-Lys-AMC(巴亨))時起始。

半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-8-將酶與抑制劑在測定緩沖液(100mM HEPES pH 7.4，0.1％CHAPS，10％蔗糖)中在37℃預(yù)孵育10分鐘。該反應(yīng)在添加25μM底物(Ac-Asp-Glu-Val-Asp-AMC(巴亨))時起始。

AEP-將50nM酶與抑制劑在測定緩沖液(50mM乙酸鈉pH 5.5，0.1％CHAPS，60mM Na₂HPO₄，1mM EDTA)中在37℃預(yù)孵育10分鐘。該反應(yīng)在添加10μM MAc-Asp-Glu-Val-Asp-AMC(巴亨)時起始。

在完整的Pala細(xì)胞中的IC₅₀測定

將表達(dá)高濃度AEP的人類的類B淋巴母細(xì)胞Pala細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640中，補(bǔ)充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100單位/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素。將不同濃度的每種化合物和Pala細(xì)胞在37℃孵育2小時。將細(xì)胞收集，用PBS洗滌兩次并且在裂解緩沖液(20mM檸檬酸、60mM正磷酸氫二鈉、1mM EDTA、0.1％CHAPS，pH 5.8)中裂解。將蛋白濃度通過布拉德福測定標(biāo)準(zhǔn)化，并且將裂解物用5μM Cbz-Ala-Ala-Asn-AMC測定。將IC₅₀值通過把數(shù)據(jù)擬合到方程中測定：酶活性分?jǐn)?shù)＝1/(1+([I]/IC₅₀))，其中，[I]＝抑制劑濃度，并且IC₅₀＝產(chǎn)生半最大活性的抑制劑濃度。將數(shù)據(jù)用GraFit 5.0.11版本的軟件安裝包進(jìn)行分析。

彗星測定(單細(xì)胞凝膠電泳)

人類肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞被用于測定這些化合物的基因毒性。彗星測定根據(jù)Trevigen試劑盒(4250-050-K)提供的方案進(jìn)行。簡而言之，將細(xì)胞用運(yùn)載體對照或50μM化合物預(yù)處理24小時。將細(xì)胞收獲，嵌入到低熔點(diǎn)瓊脂糖中，并在裂解緩沖液中在4℃浸泡45分鐘。在堿解旋溶液(300mM NaOH，1mM EDTA)中孵育20分鐘后，使細(xì)胞經(jīng)受在堿解旋溶液中在300mA下進(jìn)行30分鐘電泳。將切片用70％乙醇洗滌、進(jìn)行干燥并用SYBR Green在室溫下染色30分鐘。將產(chǎn)生切口的DNA測量為尾DNA的百分比。針對每種樣品對一百個彗星圖案進(jìn)行評分。參見可澤斯(Kozics)等人(2011)黃酮類的結(jié)構(gòu)在HepG2細(xì)胞中影響苯并(a)芘誘導(dǎo)的DNA損傷和微核的抑制程度，贅生物(Neoplasma)58，516-524。

微核測定

將HepG2細(xì)胞用運(yùn)載體或50μM化合物處理24小時。將細(xì)胞用PBS清洗，然后以1:19在低滲溶液(0.075M KCl/0.9％NaCl)中37℃孵育10分鐘。接下來，將細(xì)胞用甲醇:冰醋酸(3:1)在37℃固定15分鐘，然后沖洗并干燥。將細(xì)胞用DAPI(2μg/mL)在室溫下在黑暗中染色30分鐘，用水沖洗、進(jìn)行干燥并且用甘油安放。對于每個實(shí)驗(yàn)，對每個培養(yǎng)皿的一千個細(xì)胞進(jìn)行分析；進(jìn)行三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。

DTT可逆轉(zhuǎn)性測定

大約5倍的每種化合物IC₅₀值被加入到AEP反應(yīng)中，如上描述，并且允許反應(yīng)15分鐘。同時，將10mM(終濃度)二硫蘇糖醇(DTT)或L-半胱氨酸添加到每個反應(yīng)中并且孵育另外的15分鐘。在第二個15分鐘誘導(dǎo)時間結(jié)束時，測量每個樣品的熒光。在DMSO存在下形成的產(chǎn)物的量被用于確定在每種藥物的存在下AEP活性的百分比。

氧-葡萄糖剝奪

將化合物與原代神經(jīng)元培養(yǎng)物DIV13預(yù)孵育30分鐘。將培養(yǎng)基以不含葡萄糖的DMEM替換，并且對神經(jīng)元進(jìn)行脫氣，并且在37℃下，在95％N₂/5％CO₂中用化合物孵育4小時。將培養(yǎng)基用DMEM替換，并且補(bǔ)充化合物，然后將神經(jīng)元在常氧條件下被再灌注18小時。制備神經(jīng)元裂解物用于AEP、半胱天冬酶-3和組織蛋白酶測定。此外，用神經(jīng)元裂解物，使用抗-APP、抗-AEP抗體進(jìn)行免疫印跡分析。

酶抑制測定

為了測定抑制常數(shù)以及化合物BB1、11和38抑制AEP的機(jī)制，在遞增濃度的抑制劑不存在或存在的情況下測定肽底物Z-AAN-AMC水解的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)參數(shù)。在這些測定中，將指定濃度的抑制劑與底物在37℃預(yù)孵育10分鐘，然后添加50 nM AEP以起始反應(yīng)，將該反應(yīng)在10分鐘之后淬滅。將反應(yīng)產(chǎn)物的RFU值用AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化為微摩爾值，并且將最終的反應(yīng)速率針對底物濃度進(jìn)行繪制并且通過5.0.11版本的GraFit，使用非線性最小擬合二乘法，總體上擬合至代表競爭性抑制的方程(方程1)、代表非競爭性抑制的方程(方程2)、代表混合抑制的方程(方程3)、以及代表無競爭性抑制的方程(方程4)。

v＝V_max[S]/([S]+K_m(1+[I]/K_is)) (方程1)，

v＝V_max[S]/([S](1+[I]/K_i)+K_m(1+[I]/K_i)) (方程2)，

v＝V_max[S]/([S](1+[I]/K_ii)+K_m(l-[I]/K_is)) (方程3)，

v＝V_max[S]/([S](1+[I]/K_ii)+K_m) (方程4)。

在方程中，K_ii是截距K_i，K_is是斜率K_i。被化合物誘導(dǎo)的對AEP的抑制模式是通過數(shù)據(jù)到方程1-4的最佳擬合來測定。擬合的目測和標(biāo)準(zhǔn)誤差的比較被用于確認(rèn)這些賦值。

時程失活測定

進(jìn)展曲線是通過在37℃下，在測定緩沖液中孵育5μM Z-AAN-AMC和指定濃度的抑制劑持續(xù)10分鐘來產(chǎn)生。該反應(yīng)通過添加50 nM AEP起始，并且在10分鐘之后被淬滅。從AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線中測定產(chǎn)物的濃度，并且通過非線性回歸來擬合數(shù)據(jù)。因?yàn)榍€是非線性的，因此它們被使用5.0.11版本的GraFit軟件安裝包擬合至方程5，

[產(chǎn)物]＝v_i(1-e^-kobs.app*t)/k_obs.app (方程5)，

其中v_i是初始速率，k_obs.app是失活的表觀偽一級速率常數(shù)，并且t是時間。方程6：

k_obs＝((1+[S])/K_m)k_obs.app (方程6)，

被用于修正從這個分析中獲得的針對底物濃度的表觀偽一級失活速率常數(shù)，并且由此獲得的偽一級失活速率常數(shù)即k_obs被針對測試的抑制劑濃度描繪。由于數(shù)據(jù)符合失活的兩步機(jī)制，將它們擬合至方程7，

k_obs＝(k_inact[I])/(K_I+[I]) (方程7)，

使用5.0.11版本的GraFit軟件，其中K_I是產(chǎn)生半最大失活的失活劑濃度，k_inact是最大失活速率，并且[I]是失活劑濃度。

電子顯微鏡檢查

將突觸密度通過如之前描述的電子顯微鏡檢查來測定(22)。在深麻醉后，將小鼠用在PBS中的2％戊二醛和3％多聚甲醛進(jìn)行經(jīng)心臟灌注。將海馬體切片后固定在冷的1％OsO₄中持續(xù)1小時。將樣品使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行制備并且檢查。將超薄切片(90nm)用鈾酰乙酸酯和乙酸鉛染色，并且在100kV下，在JEOL 200CX電子顯微鏡下觀察。突觸通過突觸小泡和突觸后致密物的存在來鑒定。

小鼠腦組織制備和蛋白提取

在行為測試完成之后，小鼠被戊巴比妥深麻醉并且用鹽水進(jìn)行經(jīng)心臟灌注，并且將腦迅速移除。將一個大腦半球固定在4％磷酸緩沖的多聚甲醛中，同時將另一半速凍以用于生化分析。為了腦蛋白的提取，首先將腦半球在PIPA緩沖液(25mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1％NP 40，0.5％NaDOC，0.1％SDS)中提取，在100,000rpm離心30分鐘，并且將包含不可溶Aβ的球粒進(jìn)一步在2％SDS、25mM Tris-HCl(pH 7.5)中提取。

電生理學(xué)分析

如之前描述的進(jìn)行電生理學(xué)分析(23)。簡而言之，將運(yùn)載體和11號化合物處理的5XFAD小鼠用異氟烷麻醉，頭部被切下，并且將它們的腦滴進(jìn)冰冷的人工腦脊液(a-CSF)中，該人工腦脊液包含124mM NaCl、3mM KCl、1.25mM NaH₂PO₄、6.0mM MgCl₂、26mM NaHCO₃、2.0mM CaCl₂、以及10mM葡萄糖。將海馬體用振動切片機(jī)切成400μm厚的橫切片。在a-CSF中在室溫(23℃-24℃)下孵育60-90分鐘后，將切片放置在直立顯微鏡(奧林巴斯CX-31)的臺子上的記錄槽(RC-22C，華納儀器)中，并且用a-CSF(包含1mMMgCl₂)以3mL每分鐘的速率在23℃-24℃下進(jìn)行灌注。使用0.1MΩ的鎢單極電極以刺激謝弗側(cè)枝。將場興奮性突觸后電位(fEPSP)在CA1輻射層中由填充有具有3-4MΩ電阻的a-CSF的玻璃微電極來記錄。刺激輸出(Master-8；AMPI，耶路撒冷)被EPC9放大器的觸發(fā)功能控制(HEKA Elektronik，蘭布雷希特，德國)。將fEPSP在電流鉗模式下記錄。將數(shù)據(jù)在3kHz下過濾，并且在20kHz的采樣速率下用Pluse軟件(HEKA Elektronik)數(shù)字化。將刺激強(qiáng)度(0.1ms持續(xù)時間,10-30μA)設(shè)定為產(chǎn)生40％最大的f-EPSP并且以0.033Hz的速率施加測試脈沖。將fEPSP的LTP通過3θ-爆發(fā)刺激(TBS)誘導(dǎo)，它是在100Hz下的4次脈沖(以200ms間隔，重復(fù)3次)。配對脈沖易化(PPF)通過利用配對的脈沖來檢查，以20-500ms的間隔分離開。LTP的大小用基線fEPSP初始斜率的平均百分比表示。

Western印跡分析

將小鼠腦組織或人類組織樣品在裂解緩沖液(50mM Tris，pH 7.4，40mM NaCl，1mM EDTA，0.5％Triton X-100，1.5mM Na₃VO₄，50mM NaF，10mM焦磷酸鈉，10mMβ-甘油磷酸鈉，補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物)中裂解，并且在16,000g離心15分鐘。將上清液在SDS裝載緩沖液中煮沸。在SDS-PAGE后，將樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。Western印跡分析用多種抗體進(jìn)行。

免疫組織化學(xué)

將自由漂浮的30μm-厚的連續(xù)切片用0.3％的過氧化氫處理10分鐘，并且然后用抗-AEP切割的APP(1:500)或抗-Aβ(1:500)孵育過夜。使用Histostain-SP試劑盒(#956543，英杰公司(invitrogen))根據(jù)廠商說明書發(fā)展信號。

Aβ蛋白斑染色

將淀粉樣蛋白斑用硫黃素-S染色。將脫蠟和水合的切片在0.25％高錳酸鉀溶液中孵育20分鐘，在蒸餾水中沖洗，并且在包含2％草酸和1％焦亞硫酸鉀的漂白溶液中孵育2分鐘。在蒸餾水中沖洗后，將切片轉(zhuǎn)移到包含1％氫氧化鈉和0.9％過氧化氫的封閉溶液中持續(xù)20分鐘。將切片在0.25％酸性酸中孵育5秒，然后在蒸餾水中沖洗，并用在50％乙醇中的0.0125％的硫黃素-S染色。將切片用50％乙醇清洗并放在蒸餾水中。然后切片用封固溶以及玻璃蓋玻片覆蓋。

Aβ42ELISA

將小鼠腦在8X質(zhì)量的5M胍鹽酸/50mM Tris HCl(pH 8.0)中均化，并且在室溫下孵育3小時。然后將樣品用冷的反應(yīng)緩沖液(具有5％BSA和0.03％吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水，補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物)稀釋，并且在4℃在16000g離心20分鐘。將上清液通過人類Aβ42ELISA試劑盒根據(jù)廠商說明書(KHB3441，英杰公司)進(jìn)行分析。Aβ42的濃度通過和標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來測定。

莫里斯水迷宮實(shí)驗(yàn)

將以標(biāo)準(zhǔn)引用水或11號化合物維持的雌性野生型和5XFAD小鼠在圓的充滿水的桶(直徑52英寸)中在富含額外的迷宮線索的環(huán)境中進(jìn)行訓(xùn)練。將看不見的逃生平臺定位在水下1cm處的一個固定空間位置上，獨(dú)立于在具體試驗(yàn)中受試者的起始位置。以這種方式，受試者需要使用額外的迷宮線索來判定平臺的位置。在每個試驗(yàn)開始時，將小鼠放進(jìn)水迷宮中，用它們的爪子從4個不同的起始位點(diǎn)(N、S、E、W)之一處觸摸墻壁。每個受試者每天被給予4次試驗(yàn)，持續(xù)連續(xù)的5天，試驗(yàn)間的間隔為15分鐘。最大試驗(yàn)時長是60s，并且如果受試者不能在分配的時間中到達(dá)平臺，它們被用手指導(dǎo)到達(dá)。在到達(dá)了不可見的逃生平臺時，受試者留在其上面持續(xù)另外的5秒，以允許在環(huán)境中的空間線索的觀察，以便指導(dǎo)到平臺的未來行程。在每次試驗(yàn)后，將受試者干燥，并放在干的充滿紙巾的塑料保持籠子中，以允許受試者變干。每小時監(jiān)測水的溫度，從而在22℃和25℃之間的水中測試小鼠。在5天任務(wù)采集后，呈現(xiàn)探索試驗(yàn)，在該探索試驗(yàn)期間將平臺移除，并且在之前任務(wù)采集期間包含逃生平臺的象限中所花費(fèi)時間的百分比是經(jīng)60s測量。對所有的試驗(yàn)借助于MazeScan(Clever Sys公司)針對潛伏期、游泳路線長度以及游泳速度進(jìn)行分析。

高爾基體染色

將小鼠腦固定在10％的福爾馬林中持續(xù)24小時，并且然后在黑暗中浸入3％重鉻酸鉀中持續(xù)3天。溶液每天更換。然后將腦轉(zhuǎn)移到2％硝酸銀溶液中并且在黑暗中孵育24小時。振動切片機(jī)將切片以60μm進(jìn)行切割，空氣干燥10分鐘，通過95％和100％乙醇脫水，在二甲苯中進(jìn)行清洗并進(jìn)行封片。為了測量樹突棘密度，僅對垂直于樹突軸出現(xiàn)的樹突棘進(jìn)行計數(shù)。