優(yōu)先權(quán)聲明

本申請要求于2014年10月8日提交的美國臨時申請序列號62/061,461的權(quán)益，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

本發(fā)明涉及經(jīng)優(yōu)化的肽，其是具有提高的與鈉通道結(jié)合并抑制鈉通道活化的能力的特化的非天然存在的肽。本發(fā)明還涉及用于通過鈉通道的活性調(diào)節(jié)鈉吸收和流體體積的方法以及用于通過鈉通道的活性治療響應于調(diào)節(jié)鈉吸收的病癥的方法。

背景技術(shù)：

上皮黏膜表面內(nèi)襯有體積和組成受到精確控制的流體。在氣道中，氣道表面液體的薄膜通過用作潤滑劑高效地清除黏液來幫助保護哺乳動物氣道免受感染(hobbs等,j.physiol.591:4377(2013)；knowles等,j.clin.invest.109:571(2002))。該層在清除黏液期間向頭部移動，并且在兩個氣道聚合時累積的過量液體通過以na⁺通過上皮na⁺通道(enac)的na⁺調(diào)節(jié)的氣道表面液體吸收來消除(hobbs等,j.physiol.591:4377(2013)；knowles等,j.clin.invest.109:571(2002))。關(guān)鍵的是，在氣道中調(diào)節(jié)enac活性的機制了解甚少。最近，已累積的證據(jù)表明，氣道表面液體中的分子調(diào)節(jié)劑可以用作體積敏感信號，其稀釋或濃縮可以改變控制離子轉(zhuǎn)運速率的特定細胞表面受體以根據(jù)需要吸收或分泌氣道表面液體(chambers等,respir.physiol.neurobiol.159:256(2007))。作為調(diào)節(jié)靶標之一，enac必須被細胞內(nèi)弗林蛋白酶類型蛋白酶和/或細胞外通道激活蛋白酶(channelactivatingprotease，cap)(例如前列腺蛋白酶(prostasin))切割以具有活性并傳導na⁺(planes等,curr.top.dev.biol.78:23(2007)；rossier,proc.am.thorac.soc.1:4(2004)；vallet等,nature389:607(1997)；chraibi等,j.gen.physiol.111:127(1998))。enac還可被外源性絲氨酸蛋白酶(例如胰蛋白酶)切割和活化，這是被蛋白酶抑制劑抑肽酶減弱的作用(vallet等,nature389:607(1997))。當將人支氣管上皮培養(yǎng)物封固在洗掉天然氣道表面液體的尤斯灌流室中時，enac顯著地具有活性，這表明細胞附著的蛋白酶占優(yōu)勢(myerburg等,j.biol.chem.281:27942(2006)；tarran等,j.gen.physiol.127:591(2006)；gaillard等,2010pfleugersarch,460:1-17)。相比之下，在存在天然氣道表面液體的薄膜條件下，enac活性降低，表明氣道表面液體包含可溶性蛋白酶抑制劑(myerburg等,j.biol.chem.281:27942(2006)；tarran等,j.gen.physiol.127:591(2006)；gaillard等,2010pfleugersarch,460:1-17)。

最近，已表明，短腭、肺和鼻上皮克隆(splunc1)蛋白占氣道表面液體中的總蛋白質(zhì)的多至10％，并且可容易地在鼻腔灌洗液和氣管分泌物二者中檢測到(bingle,c.d.,和craven,c.j.(2002)plunc:anovelfamilyofcandidatehostdefenseproteinsexpressedintheupperairwaysandnasopharynxhummolgenet11,937；campos,m.a.,等(2004)purificationandcharacterizationofpluncfromhumantracheobronchialsecretionsamjrespircellmolbiol30,184；lindahl,m.,stahlbom,b.,和tagesson,c.(2001)；identificationofanewpotentialairwayirritationmarker,palatelungnasalepithelialcloneprotein,inhumannasallavagefluidwithtwo-dimensionalelectrophoresisandmatrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflightelectrophoresis22,1795)。splunc1顯示是一種體積敏感分子，因為其可以分泌到表達enac的表面上皮的黏膜表面中(bartlett等,j.leukoc.biol.83:1201(2008)；bingle等,j.pathol.205:491(2005))。此外，已證明，splunc1包含通過其n端結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作為enac的抑制劑的功能的亞結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明公開了新的特化的非天然存在的肽，其通過結(jié)合并抑制離子轉(zhuǎn)運以調(diào)節(jié)鈉吸收和流體體積來模擬splunc1在調(diào)節(jié)鈉通道中的特性，并且治療響應于調(diào)節(jié)鈉吸收的病癥。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明部分地基于設(shè)計調(diào)節(jié)鈉通道活性的特化的非天然存在的肽。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及抑制鈉通道活化的方法，其包括使鈉通道與特化的非天然存在的肽或其功能性片段接觸。在一個實施方案中，鈉通道是上皮鈉通道(enac)。在一個實施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段與鈉通道結(jié)合。

本發(fā)明的另一方面涉及通過鈉通道抑制鈉吸收的方法，其包括使鈉通道與特化的非天然存在的肽或其功能性片段接觸。在一個實施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段與鈉通道結(jié)合。

本發(fā)明的另一方面涉及增加內(nèi)襯于上皮黏膜表面的流體的體積的方法，其包括使上皮黏膜表面上存在的鈉通道與特化的非天然存在的肽或其功能性片段接觸。在一個實施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段與鈉通道結(jié)合。

本發(fā)明的另一方面涉及降低細胞表面上存在的鈉通道的水平的方法，其包括使鈉通道與特化的非天然存在的肽或其功能性片段接觸。在一個實施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段與鈉通道結(jié)合。

本發(fā)明的另一方面涉及在有需要的對象中治療響應于抑制跨上皮黏膜表面的鈉吸收的病癥的方法，其包括向該對象遞送治療有效量的特化的非天然存在的肽或其功能性片段。在一個實施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段與鈉通道結(jié)合。

本發(fā)明的另一方面涉及在有需要的對象中調(diào)節(jié)鹽平衡、血量和/或血壓的方法，其包括向該對象遞送治療有效量的特化的非天然存在的肽或功能性片段。在一個實施方案中，特化的非天然存在的肽或其功能性片段與鈉通道結(jié)合。

本發(fā)明的另一方面涉及模擬plunc蛋白的鈉通道結(jié)合結(jié)構(gòu)域并與鈉通道結(jié)合的特化的非天然存在的肽或其功能性片段，其中當與該肽結(jié)合時蛋白酶對鈉通道的切割受到抑制。

本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明的肽的試劑盒。

本發(fā)明的另一方面涉及特化的非天然存在的肽或其功能性片段用于制備在有需要的對象中治療響應于抑制鈉吸收的病癥的藥物的用途。

本發(fā)明的這些及其他方面在下文對本發(fā)明的描述中更詳細地闡述。

附圖簡述

圖1示出了s18(seqidno:1)的序列。紅色突出顯示的是enac相互作用所必需的殘基，而藍色突出顯示的是發(fā)現(xiàn)不起作用的殘基。

圖2a至2b顯示，抑制enac和保持asl高度需要s18的第一半(lpvpldqt(seqidno:113)而不是剩余部分dqtlplnvnp(seqidno:114)。

圖3a顯示，盡管seqidno:2以d-丙氨酸為側(cè)翼，s18(seqidno:1)和aalpvpldqtlplnvnpaa(seqidno:2)具有相同的功效和效力。圖3b顯示，盡管(seqidno:3)以d-丙氨酸為側(cè)翼，s18和aalpvpldqtaa(seqidno:3)具有相等的功效和效力。圖3a還示出了肽樣品的相對功效，所述肽樣品包括aalpnlepldqtaa(seqidno:5)，其相對于s18或seqidno:4顯示出增加的功效。

圖4示出了s18和seqidno:5的另外的比較，以及seqidno：5的增加的功效。

圖5a至5u示出了分析當gfp標記的α-enac與β和γenac共表達時不同肽對hek293t細胞中α-enac內(nèi)化的作用和對細胞生存力的作用的實驗結(jié)果。在幾幅圖的底部示出了ec50值。在這些圖中，adg是具有以下序列的陰性對照肽：nh3-adggllllnnppppqtvv-nh2(seqidno:143)。這些實驗中使用的肽是s18(seqidno:1)、seqidno:2、seqidno:141、seqidno:129、seqidno:130、seqidno:128、seqidno:131、seqidno:132、seqidno:133、seqidno:134、seqidno:135、seqidno:136、seqidno:137、seqidno:138、seqidno:131、seqidno:139、seqidno:140、seqidno:144和seqidno:127。這些實驗中還使用了seqidno:12、seqidno:13、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18和seqidno:136的肽，其各自在n和c兩端具有aa帽。還示出了阿米洛利，其通過另一種機制抑制enac，并且不降低細胞表面上功能性受體的量。

圖6示出了分析當gfp標記的α-enac僅與γenac而不與β-enac共表達時不同肽對hek293t細胞中α-enac內(nèi)化的作用的實驗結(jié)果。在該圖中，與s18(seqidno:1)和seqidno:128一起使用了seqidno:143(陰性對照肽)和水(載體)對照。盡管當共表達β-enac時seqidno:1和seqidno:128有效地降低α-enac，但是當不存在β-enac時，在該實驗中沒有觀察到影響。

圖7a示出了分析在用s18肽(seqidno:1)處理之后對enac-tgc57bl:fvb小鼠的百分比存活的作用的實驗結(jié)果。s18(100mm溶液)以1μl/g體重每天施用3次。

圖7b示出了分析在用吸入的seqidno:142或seqidno:128處理之后對enac-tgc57bl:fvb小鼠的百分比存活的作用的實驗結(jié)果。

圖7c和7d示出了分析在用seqidno：129或seqidno：128處理之后對enac-tgc57bl:c3h小鼠的百分比存活的作用的實驗結(jié)果。

圖7e示出了分析在用每天一次劑量的seqidno：128處理之后對enac-tgc57bl:c3h小鼠的百分比存活(左圖)和體重增加(右圖)的作用的實驗結(jié)果。

圖7f示出分析在用seqidno:127、seqidno:134或seqidno:136處理之后對enac-tgc57bl:c3h小鼠的百分比存活的作用的實驗結(jié)果。

發(fā)明詳述

現(xiàn)在將參照附圖更詳細地描述本發(fā)明，在附圖中示出了本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案。然而，本發(fā)明可以以不同的形式體現(xiàn)，并且不應被解釋為限于本文所述的實施方案。當然，提供這些實施方案，使得本公開內(nèi)容是徹底且完整的，并且將向本領(lǐng)域技術(shù)人員充分地傳達本發(fā)明的范圍。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同的含義。本文用于描述本發(fā)明的術(shù)語僅用于描述特定實施方案的目的，并且不旨在限制本發(fā)明。本文引用的所有出版物、專利申請、專利、專利公開及其他參考文獻針對與引用文獻所在句子和/或短語相關(guān)的教導而通過引用并入整體本文。

氨基酸以由iupac-iub生物化學命名委員會推薦的方式，或者(對于氨基酸)通過單字母代碼或三字母代碼表示，二者均根據(jù)37c.f.r.§1.822和已建立的使用方法。

除非上下文另外明確指出，在本發(fā)明說明書和所附權(quán)利要求書的中使用的沒有數(shù)量詞修飾的名詞還旨在包括復數(shù)形式。

此外，本文使用的“和/或”是指且涵蓋相關(guān)所列舉項目中一個或更多個的任何和所有可能組合，以及在替代方案(“或”)中解釋時缺少的組合。

術(shù)語“基本上由...組成”(及其語法變化形式)當應用于本發(fā)明的肽序列時意指由以下兩者組成肽：所記載的序列(例如，seqidno)和在所記載的序列的n-端和/或c-端的總共10個或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)的附加氨基酸，以致所述肽的功能未被實質(zhì)改變?？偣?0個或更少的附加氨基酸殘基包括兩端的附加氨基酸殘基加在一起的總量。術(shù)語“實質(zhì)地改變”當應用于本發(fā)明的肽時是指與由所記載的序列組成的肽的活性相比，結(jié)合活性(例如，與鈉通道或特化的非天然存在的肽)增加或降低至少約50％或更多。

術(shù)語“調(diào)節(jié)”指特定活性水平的增強(例如增加)或抑制(例如降低)。

術(shù)語“增強”或“增加”指特定參數(shù)增加至少約1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍或者甚至15倍。

本文使用的術(shù)語“抑制”或“降低”或者其語法變化形式指特定水平或活性降低或減小至少約15％、25％、35％、40％、50％、60％、75％、80％、90％、95％或更多。在一些具體實施方案中，抑制或降低導致很少或基本上沒有可檢測的活性(至多，不顯著量，例如小于約10％或甚至5％)。

關(guān)于特化的非天然存在的肽和鈉通道，所使用的術(shù)語“接觸”或其語法變化形式指使特化的非天然存在的肽和鈉通道彼此充分接近以使一者對另一者施加生物效應。在一些實施方案中，術(shù)語接觸意指特化的非天然存在的肽與鈉通道結(jié)合。

本文使用的“治療有效”量是為對象提供一些改善或益處的量。換句話說，“治療有效”量是在對象中一定程度地緩解、緩和或減輕至少一種臨床癥狀的量。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，治療效果無需是完全或可治愈的，只要向?qū)ο筇峁┮恍┮嫣幖纯伞?/p>

術(shù)語“治療”旨在降低或者至少部分地改善或改變對象的病癥的嚴重程度，并且旨在實現(xiàn)至少一種臨床癥狀的一定程度的緩解、緩和或減輕。

術(shù)語“片段”當應用于肽時將被理解為意指相對于參照肽或氨基酸序列而言長度縮短的氨基酸序列，并且包含與參照肽或氨基酸序列相同的連續(xù)氨基酸的氨基酸序列、基本上由其組成和/或由其組成。在適當時，根據(jù)本發(fā)明的這樣的肽片段可包含較大多肽中，所述肽片段為較大多肽的組成部分。在一些實施方案中，這樣的片段可以包含長度為根據(jù)本發(fā)明的肽或氨基酸序列的至少約4、5、6、7、8、9、10或更多個連續(xù)氨基酸的肽、基本上由其組成和/或由其組成。在另一些實施方案中，這樣的片段可以包含長度小于根據(jù)本發(fā)明的肽或氨基酸序列的約10、9、8、7、6、5、4或更少個連續(xù)氨基酸的肽，基本上由其組成和/或由其組成。

除非另外說明，否則本文使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”可互換使用并且涵蓋肽和蛋白質(zhì)二者。

“融合蛋白”是當將天然發(fā)現(xiàn)未融合在一起的編碼兩種(或更多種)不同多肽的兩個異源核苷酸序列或其片段一起融合在正確的翻譯閱讀框時產(chǎn)生的多肽。舉例說明性的融合多肽包括本發(fā)明的肽(或其片段)與谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白或報道蛋白(例如，綠色熒光蛋白、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶等)、血凝素、c-myc、flag表位等的全部或一部分的融合體。

本文使用的“功能性”肽或“功能性片段”是基本上保留與該肽通常相關(guān)的至少一種生物活性(例如，結(jié)合或抑制鈉通道)的功能性片段。在一些具體實施方案中，“功能性”肽或“功能性片段”基本上保留未經(jīng)修飾的肽所具有的所有活性?！盎旧媳Ａ簟鄙锘钚砸庵冈撾谋Ａ籼烊欢嚯牡纳锘钚缘闹辽偌s20％、30％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％、97％、99％或更多(并且甚至可以具有比天然肽更高的活性水平)?！胺枪δ苄浴彪氖秋@示出很少或基本上沒有與所述肽相關(guān)的可檢測生物活性(例如，至多，僅不顯著量，例如例如小于約10％或甚至5％)的肽。生物活性(例如蛋白質(zhì)結(jié)合和鈉通道抑制活性)可以使用本領(lǐng)域公知的和如本文所述的測定來測量。

當涉及例如多肽量、劑量、時間、溫度、酶活性或其他生物活性等的可測量值時，本文使用的術(shù)語“約/大約”意指涵蓋特定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±甚至0.1％的變化。

本發(fā)明的第一方面涉及特化的非天然存在的肽與鈉通道結(jié)合并阻止鈉通道活化從而抑制鈉離子流動的能力。因此，本發(fā)明的一個方面涉及抑制鈉通道活化的方法，其包括使鈉通道與特化的非天然存在的肽或其功能性片段接觸(例如，結(jié)合)。在一個實施方案中，鈉通道是上皮鈉通道(enac)，例如人enac或非人哺乳動物enac。在另一個實施方案中，鈉通道是在序列和/或結(jié)構(gòu)上與enac類似的通道，例如酸敏感離子通道(asic)。鈉通道活性的抑制可通過本領(lǐng)域已知或本文公開的任何方法來測量，包括但不限于鈉流量或者跨膜、跨細胞或跨天然或人工內(nèi)襯的電位變化。抑制可為至少約20％，例如至少約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

抑制鈉通道活化的方法可在例如分離的鈉通道、人工膜中的鈉通道或細胞中的鈉通道上進行。在一個實施方案中，鈉通道存在于分離的細胞，例如培養(yǎng)的原代細胞或細胞系中。在另一個實施方案中，分離的細胞是上皮細胞培養(yǎng)物的一部分，例如天然或人工上皮內(nèi)襯，例如其中可跨內(nèi)襯測量例如離子流量和/或電位的特征的裝置(例如尤斯灌流室)中的細胞培養(yǎng)物。在另一個實施方案中，細胞是分離的組織或組織培養(yǎng)物的一部分。在另一個實施方案中，細胞可以存在于動物，例如作為疾病模型或需要治療的對象的動物中。

在一個實施方案中，使鈉通道與特化的非天然存在的肽接觸(例如，結(jié)合)的步驟包括將特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或同系物遞送至包含鈉通道的細胞。

本文使用的術(shù)語“同系物”用于指這樣的多肽，其與公開的特化非天然存在的肽的區(qū)別之處在于對特化的天然存在的多肽進行了修飾但顯著保留所公開的非天然存在的肽的生物活性。次要修飾包括但不限于一個或幾個氨基酸側(cè)鏈的改變、一個或幾個氨基酸的變化(包括缺失、插入和替換)、一個或幾個原子的立體化學變化以及少量衍生化，包括但不限于甲基化、糖基化、磷酸化、乙?；?、肉豆蔻?；?、異戊烯化、棕櫚?；Ⅴ０坊吞腔字＜〈嫉奶砑?。本文使用的術(shù)語“基本上保留”指保留天然存在的肽的活性(例如，結(jié)合鈉通道)的至少約20％，例如約30％、40％、50％或更多的肽片段、同系物或其他變體。取決于肽的其他生物活性可包括酶活性、受體結(jié)合、配體結(jié)合、生長因子的誘導、細胞信號轉(zhuǎn)導事件等。

在一個實施方案中，所述方法包括向包含鈉通道的細胞遞送分離的特化的非天然存在的肽。在一些示例性實施方案中，特化的非天然存在的肽包含公開的特化的非天然存在的肽或其功能性片段、基本上由其組成或由其組成。在另一個實施方案中，分離的特化的非天然存在的肽包含與公知的氨基酸序列或其功能性片段具有至少70％同一性，例如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、基本上由其組成或由其組成。在一些實施方案中，所述肽包含plunc蛋白的天然氨基酸序列的一部分，其具有一個或更多個保守的天然或非天然氨基酸替換和/或一個或更多個非天然氨基酸添加。保守替換物如下所述。在一些實施方案中，如下所述，所述肽包含如下一個或更多個末端修飾。

本發(fā)明肽的非限制性實例在下表1中公開。在一些實施方案中，本發(fā)明的肽可以在氨基和/或羧基末端包含一個或更多個附加殘基。在一些實施方案中，一個或更多個附加殘基是d-丙氨酸。例如，肽可以在氨基和/或羧基末端包含一個或兩個d-丙氨酸。

本發(fā)明的特化的非天然存在的肽還包括功能性部分或片段。片段的長度不關(guān)鍵，只要其基本上保留肽的生物活性(例如，鈉通道結(jié)合活性)即可。舉例說明性的片段包含特化的天然存在的肽的至少約4、5、6、7、8、9、10或更多連續(xù)氨基酸。在另一些實施方案中，所述片段包含特化的非天然存在的肽的不超過約10、9、8、7、6、5或4個連續(xù)氨基酸。

同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，本發(fā)明還涵蓋包含特化的非天然存在的肽或其功能性片段的融合多肽。作為另一個替代方案，融合蛋白可包含報道分子。在另一些實施方案中，融合蛋白可包含提供與所述肽的活性相同或不同的功能或活性的多肽，例如靶向、結(jié)合、或者酶活性或功能。

同樣，應理解，本文具體公開的肽通常容許氨基酸序列中的替換并且基本上保留生物活性。為了鑒定本發(fā)明除本文具體公開的那些之外的肽，氨基酸替換可基于本領(lǐng)域已知的任何特征，包括氨基酸側(cè)鏈取代基的相對類似性或差異，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等。

在鑒定編碼除本文具體公開的那些肽之外的肽的氨基酸序列中，可考慮氨基酸的親水指數(shù)。親水性氨基酸指數(shù)在賦予蛋白質(zhì)相互作用的生物功能中的重要性在本領(lǐng)域中是普遍理解的(參見，kyte和doolittle,j.mol.biol.157:105(1982)；其通過引用整體并入本文)。公認的是，氨基酸的相對親水特征有助于所得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，其進而限定蛋白質(zhì)與其他分子例如酶、底物、受體、dna、抗體、抗原等的相互作用。

每個氨基酸已基于其疏水性和電荷特征分配親水指數(shù)(kyte和doolittle,同上)，這些是：異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

因此，當修飾本文具體公開的肽時，可考慮氨基酸(或氨基酸序列)的親水指數(shù)。

在本領(lǐng)域中還應理解，氨基酸的替換可基于親水性進行。美國專利no.4,554,101(通過引用整體并入本文)指出，蛋白質(zhì)的最大局部親水性(如由其相鄰氨基酸的親水性控制的)與蛋白質(zhì)的生物特性相關(guān)。

如美國專利no.4,554,101中詳述的，已向氨基酸殘基分配以下親水性值：精氨酸(+3.0)、賴氨酸(±3.0)、天冬氨酸(+3.0±1)、谷氨酸(+3.0±1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±i)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。

因此，當鑒定除本文具體公開的那些肽之外的另外的肽時，可考慮氨基酸(或氨基酸序列)的親水性。

本發(fā)明的肽(及其片段)包括與本文公開的肽序列具有至少約70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高氨基酸序列同一性的肽。

如本領(lǐng)域已知的，可使用很多不同的程序來鑒定多肽是否與已知序列具有序列同一性或相似性。序列同一性或相似性可使用本領(lǐng)域已知的標準技術(shù)來確定，包括但不限于smith&waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部序列同一性算法；通過needleman&wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的序列同一性比對算法；通過pearson&lipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444(1988)的相似性檢索方法；通過這些算法(wisconsingeneticssoftwarepackage,geneticscomputergroup,575sciencedrive,madison,wi中的gap、bestfit、fasta和tfasta)的計算機化實施；devereux等,nucl.acidres.12:387(1984)描述的最佳擬合序列程序，優(yōu)選地使用默認設(shè)置，或者通過檢驗。

可用算法的一個實例是pileup。pileup使用漸進式的成對比對由一組相關(guān)序列生成多重序列比對。其還可繪制顯示用于生成比對結(jié)果的聚類關(guān)系的樹。pileup使用feng和doolittle,j.mol.evol.35:351(1987)的漸進式比對方法的簡化；該方法與higgins和sharp,cabios5:151(1989)所述的方法類似。

可用算法的另一個實例是在altschul等,j.mol.biol.215:403(1990)和karlin等.,proc.natl.acad.sci.usa90:5873(1993)中所述的blast算法。特別有用的blast程序是從altschul等,meth.enzymol.,266:460(1996)；blast.wustl/edu/blast/readme.html.獲得的wu-blast-2程序。wu-blast-2使用數(shù)個優(yōu)選設(shè)置為默認值的檢索參數(shù)。這些參數(shù)是動態(tài)值，并且由程序本身根據(jù)具體序列的組成和檢索目的序列所針對的具體數(shù)據(jù)庫的組成確定；然而，可調(diào)整這些值以增加靈敏度。

另一種可用的算法是由altschul等,nucleicacidsres.25:3389(1997)報道的有空位的blast。

百分比氨基酸序列同一性值由匹配相同殘基的數(shù)目除以比對區(qū)中“較長”序列的殘基總數(shù)來確定。“較長”序列是在比對區(qū)中具有最多實際殘基的序列(忽略wu-blast-2為最大化比對評分而引入的空位)。

比對可包括在待比對的序列中引入空位。此外，對于與本文具體公開的肽相比包含更多或更少氨基酸的序列，應理解，在一個實施方案中，序列同一性的百分比將基于相對于總氨基酸數(shù)的相同氨基酸的數(shù)目來確定。因此，例如，在一個實施方案中，使用較短序列中氨基酸的數(shù)目來確定比本文具體公開的序列短的序列的序列同一性。在百分比同一性計算中，序列變化的不同顯示(例如插入、缺失、替換等)不分配相對權(quán)重。

在一個實施方案中，僅將同一性評正分(+1)并且向包括空位的所有序列變化形式評分為“0”，其避免用于序列相似性計算的下述加權(quán)標度或參數(shù)的需要。百分比序列同一性，可例如通過將匹配相同殘基的數(shù)目除以比對區(qū)中“較短”序列的總殘基數(shù)并乘以100來確定?！拜^長”序列是在比對區(qū)中具有最多實際殘基的序列。

可通過在氨基和/或羧基末端添加封端劑促進相關(guān)肽的體內(nèi)存活來修飾本發(fā)明的肽和片段以用于體內(nèi)使用。這可用于其中肽末端在被細胞攝取之前易于被蛋白酶降解的情況。這樣的封端劑可包括但不限于可與待施用肽的氨基和/或羧基末端殘基連接的另外的相關(guān)或不相關(guān)的肽序列。這可在肽合成期間化學進行或者通過任何合適方法通過重組dna技術(shù)進行。例如，可向末端添加一個或更多個非天然存在的氨基酸，例如d-丙氨酸?；蛘?，可使封端劑諸如焦谷氨酸或本領(lǐng)域已知的其他分子連接至氨基和/或羧基末端殘基，或者可用不同部分替換氨基末端的氨基或羧基末端的羧基。另外，可對肽末端進行修飾，例如通過n端的乙?；?或c端的酰胺化進行修飾。同樣地，可在施用之前使肽與可藥用的“載體”蛋白共價或非共價偶聯(lián)。

在一個實施方案中，本發(fā)明的肽或其片段直接施用于對象。一般來說，使本發(fā)明的化合物混懸在可藥用載體(例如。生理鹽水)中并經(jīng)口或通過靜脈內(nèi)輸注施用，或者如下施用：皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、胃內(nèi)、氣管內(nèi)或肺內(nèi)。在另一個實施方案中，氣管內(nèi)或肺內(nèi)遞送可使用標準的噴霧器、噴射噴霧器、絲網(wǎng)噴霧器、干粉吸入器或定量霧化吸入器來完成。其可直接遞送至疾病或病癥的部位，例如肺、腎或腸。所需劑量取決于施用途徑的選擇、制劑的性質(zhì)、患者疾病的性質(zhì)、對象的大小、體重、表面積、年齡和性別，正施用的其他藥物，以及主治醫(yī)師的判斷。合適的劑量為0.01μg/kg至100.0μg/kg。考慮到可利用的肽、片段和同系物的多樣性以及不同施用途徑的不同效率，預期所需劑量廣泛變化。例如，預期與通過靜脈內(nèi)注射來施用相比，經(jīng)口施用需要更高的劑量。如本領(lǐng)域中公知的，這些劑量水平的變化可使用用于優(yōu)化的標準經(jīng)驗途徑進行調(diào)整。施用可以是單次或多次的(例如2、3、4、6、8、10、20、50、100、150或更多次)。肽、片段和同系物在合適遞送載體(例如聚合物微粒或可植入裝置)中的包封可提高遞送的效率，特別是對于經(jīng)口遞送。

根據(jù)某些實施方案，肽或其片段可在體內(nèi)靶向特定細胞或組織。靶向遞送載體(包括脂質(zhì)體)和所靶向的系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的。例如，脂質(zhì)體可通過使用與脂質(zhì)體一起并入以靶向可結(jié)合靶向分子的特定細胞或組織的靶向劑(例如抗體、可溶性受體或配體)來針對特定的靶細胞或組織。靶向脂質(zhì)體在例如ho等.,biochemistry25:5500(1986)；ho等,j.biol.chem.262:13979(1987)；ho等,j.biol.chem.262:13973(1987)；huang等的美國專利no.4,957,735中進行了描述，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

本發(fā)明的另一方面涉及通過鈉通道抑制鈉吸收的方法，其包括使鈉通道與特化的非天然存在的肽或其片段接觸(例如，結(jié)合)。鈉吸收的抑制可通過本領(lǐng)域已知的或本文公開的任何技術(shù)來測量。

本發(fā)明的另一方面涉及一種增加內(nèi)襯于上皮黏膜表面的流體的體積的方法，其包括使上皮黏膜表面上存在的鈉通道與特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或同系物接觸(例如，結(jié)合)。內(nèi)襯于上皮黏膜表面的流體的體積可通過本領(lǐng)域已知的或本文公開的任何技術(shù)來測量。

本發(fā)明的另一方面涉及降低細胞表面上存在的鈉通道的水平的方法，其包括使鈉通道與特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或同源物接觸(例如，結(jié)合)。

本發(fā)明的另一方面涉及在有需要的對象中治療響應于抑制跨上皮黏膜表面的鈉吸收的病癥的方法，其包括向該對象遞送治療有效量的特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或同系物。在一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋在有需要的對象中治療響應于抑制跨上皮黏膜表面的鈉吸收的病癥的方法，其包括向該對象施用包含選自seqidno:2至128的序列的肽。在一些非限制性實例中，本發(fā)明方法中的病癥可以是肺病(例如，囊性纖維化、非囊性纖維化、支氣管擴張、慢性阻塞性肺病、急性或慢性支氣管炎、或哮喘)、胃腸病(例如、炎性腸病)、腎病或心血管病。

本發(fā)明的另一方面涉及在有需要的對象中調(diào)節(jié)鹽平衡、血量和/或血壓的方法，其包括向該對象遞送治療有效量的特化的非天然存在的肽或者其功能性片段或其同系物。

本發(fā)明的第三方面涉及可用于實施本文公開的方法的產(chǎn)品。因此，本發(fā)明的一個方面涉及包含以下序列的肽或其功能性片段：

x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8(seqidno:116)

其中：

x1為亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x2為脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x3為纈氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x4為脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x5為亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x6為天冬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x7為谷氨酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；并且

x8為蘇氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物。

本發(fā)明的另一方面涉及包含以下序列的肽或其功能性片段：

x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8(seqidno:117)

其中：

x1為亮氨酸、正亮氨酸或纈氨酸；

x2為脯氨酸、4-羥脯氨酸、(2r,5s)-5-苯基-吡咯烷-2-羧酸或3,4-脫氫-l-脯氨酸；

x3為纈氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或n-甲基纈氨酸；

x4為脯氨酸、4-羥脯氨酸、(2r,5s)-5-苯基-吡咯烷-2-羧酸或3,4-脫氫-l-脯氨酸；

x5為亮氨酸、正亮氨酸或纈氨酸；

x6為天冬氨酸或谷氨酸；

x7為谷氨酰胺或天冬酰胺；并且

x8為蘇氨酸，絲氨酸或l-α-甲基絲氨酸。

本發(fā)明的另一方面涉及包含以下序列的肽或其功能性片段：

x1-x2-x3-x4-x5-x6-x7-x8-x9-x10-x11-x12-x13-x14-x15(seqidno:118)

其中：

x1為亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x2為脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x3為纈氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x4為脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x5為亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x6為天冬氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x7為谷氨酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x8為蘇氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x9為蘇氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x10為亮氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x11為脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x12為天冬酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x13為纈氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；

x14為天冬酰胺或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物；并且

x15為脯氨酸或者以天然或非天然氨基酸的保守替換物。

在一些實施方案中，所述肽包含選自seqidno:4-142和seqidno:144的序列。在一個實施方案中，所述肽包含seqidno:5或seqidno:122的序列。在一個實施方案中，所述肽包含seqidno:2(aalpvpldqtlplnvnpaa)或seqidno:119的序列。在一個實施方案中，所述肽包含seqidno：127或seqidno:128(aalpipldqtaa)的序列。

在某些實施方案中，本發(fā)明的肽包含至少一個經(jīng)修飾的末端，例如以保護肽免于降解。在一些實施方案中，n端是乙?；暮?或c端是酰胺化的。在一些實施方案中，所述肽包含seqidno:10-127、129、130、133、134或136-140中任一個的序列，所述肽還包含在氨基和/或羧基末端的一個或兩個d-丙氨酸。

在某些實施方案中，本發(fā)明的肽包含至少一個非天然氨基酸(例如，1、2、3個或更多)或至少一個末端修飾(例如1或2個)。在一些實施方案中，所述肽包含至少一個非天然氨基酸和至少一個末端修飾。

在某些實施方案中，所述肽模擬plunc蛋白的鈉通道結(jié)合結(jié)構(gòu)域。鈉通道結(jié)合結(jié)構(gòu)域是具有與全長plunc蛋白基本相同的鈉通道結(jié)合活性所需的plunc蛋白的最小片段。術(shù)語“基本相同的結(jié)合活性”指為全長蛋白質(zhì)的結(jié)合活性的至少約50％，例如結(jié)合活性的的至少約60％、70％、80％或90％的活性。在一些實施方案中，所述肽至少與全長plunc蛋白具有相同的結(jié)合活性。在一個實施方案中，鈉通道是enac，例如人enac。在另一個實施方案中，鈉通道是在序列和/或結(jié)構(gòu)上與enac類似的通道，例如酸敏感離子通道(asic)。

本發(fā)明的肽可任選地與其他治療劑聯(lián)合遞送。另外的治療劑可與本發(fā)明的肽并行遞送。本文使用的詞語“并行”意指在時間上足夠接近以產(chǎn)生組合效果(即，并行可以是同時，或者其可以是在彼此之前或之后的短時間內(nèi)發(fā)生的兩個或更多個事件)。在本發(fā)明的一個實施方案中，將特化的非天然存在的肽與調(diào)節(jié)囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白(cftr)的功能的化合物并行遞送于患者，在此特化的非天然存在的肽和cftr靶向劑的組合活性具有優(yōu)于單獨cftr靶向劑的活性。在本發(fā)明的另一個實施方案中，將特化的非天然存在的肽與黏液溶解化合物并行遞送于患者，在此特化的非天然存在的肽和黏液溶解劑的組合活性具有優(yōu)于單獨黏液溶解劑的活性。在本發(fā)明的又一個實施方案中，將特化的非天然存在的肽與長效b激動劑化合物(laba)并行遞送于患者，在此特化的非天然存在的肽和laba劑的組合活性具有優(yōu)于單獨laba的活性。在本發(fā)明的又一個實施方案中，將特化的非天然存在的肽與糖皮質(zhì)激素激動劑并行遞送于患者，在此特化的非天然存在的肽和糖皮質(zhì)激素劑的組合活性具有優(yōu)于單獨糖皮質(zhì)激素的活性。

本發(fā)明的另一方面涉及包含本發(fā)明的肽并且可用于實施本發(fā)明方法的試劑盒。所述試劑盒還可包含用于進行方法的另外試劑(例如，緩沖劑、容器、另外的治療劑)以及說明書。

作為另一方面，本發(fā)明提供了實現(xiàn)本文所討論的任何治療效果(例如，鈉吸收的調(diào)節(jié))的藥物制劑及其施用方法。所述藥物制劑可以包含在可藥用載體中的上文所討論的任何試劑，例如特化的非天然存在的肽或其功能性片段。

“可藥用”意指不是生物學或其他方面不期望的材料，即所述材料可施用于對象而不引起任何不期望的生物效應，例如毒性。

本發(fā)明的制劑可以任選地包括藥用試劑、藥劑、載體、佐劑、分散劑、稀釋劑等。

本發(fā)明的肽可以根據(jù)已知技術(shù)配制成用于在藥用載體中施用。參見，例如，remington,thescienceandpracticeofpharmacy(第9版1995)。在制備根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑中，通常將肽(包括其生理上可接受的鹽)與尤其可接受的載體混合。所述載體可以是固體或液體，或者二者，并且優(yōu)選地與肽配制成單位劑量制劑，例如片劑，其可包含按重量計0.01％或0.5％至95％或99％的肽。本發(fā)明的制劑中可包含一種或更多種肽，其可通過藥學的任何公知技術(shù)來制備。

本發(fā)明的另一方面是在體內(nèi)治療對象的方法，其包括向?qū)ο笫┯冒诳伤幱幂d體中的本發(fā)明肽的藥物組合物，其中所述藥物組合物以治療有效量施用。向有此需要的人對象或動物施用本發(fā)明的肽可通過本領(lǐng)域已知的用于施用化合物的任何方式來進行。

本發(fā)明的制劑包括適于以下的那些：經(jīng)口、直腸、局部、經(jīng)頰(例如，舌下)、經(jīng)陰道、腸胃外(例如皮下，肌內(nèi)包括骨骼肌、心肌、隔膜肌和平滑肌，皮內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi))、表面(即，皮膚和黏膜表面二者，包括氣道表面)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)和吸入施用；通過門靜脈內(nèi)遞送來適用于肝；以及直接器官注射(例如，注入肝中、注入腦中以遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)、注入胰腺中、或者注入腫瘤或腫瘤周圍的組織中)。任何給定情況下的最合適途徑將取決于所治療病癥的性質(zhì)和嚴重程度以及正在使用的具體肽的性質(zhì)。

對于注射，載體通常是液體，例如無菌無熱原水、無菌生理鹽水、高張鹽水、無熱原磷酸緩沖鹽水溶液、抑菌水或cremophorel[r](basf,parsippany,n.j.)。對于其他施用方法，載體可以是固體或液體。

對于經(jīng)口施用，肽可以以固體劑型(例如膠囊劑、片劑和散劑)或液體劑型(例如酏劑、糖漿劑和混懸劑)施用。肽可以與無活性成分和粉狀載體一起包封在明膠膠囊中，所述載體例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂等?？梢蕴砑右蕴峁┢谕伾?、味道、穩(wěn)定性、緩沖能力、分散或其他已知的所期望特征的另外的無活性成分的實例為氧化鐵紅、硅膠、月桂基硫酸鈉、二氧化鈦、食用白色墨等。可使用類似的稀釋劑來制備壓制片劑。片劑和膠囊劑二者均可制成持續(xù)釋放產(chǎn)品以提供藥物在數(shù)小時時間內(nèi)的持續(xù)釋放。壓制片劑可以是糖包衣或膜包衣的以掩蓋任何令人不愉快的味道并且保護片劑免受大氣破壞，或者是腸溶包衣的以在胃腸道中選擇性崩解。用于經(jīng)口施用的液體劑型可包含著色劑和調(diào)味劑以提高患者的接受度。

適于經(jīng)頰(舌下)施用的制劑包括包含在矯味基質(zhì)(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中的化合物的錠劑和包含在惰性基質(zhì)(例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)中的化合物的錠劑。

適于腸胃外施用的本發(fā)明制劑包含肽的無菌水性和非水性注射液劑，該制劑優(yōu)選地與預期接受者的血液等張。這些制劑可包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使制劑與預期接受者的血液等滲的溶質(zhì)。水性和非水性無菌混懸液劑可包含懸浮劑和增稠劑。制劑可存在于單位/劑量或多劑量容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可儲存在冷凍干燥(凍干)條件下，僅需在使用之前即刻添加無菌液體載體(例如鹽或注射用水)。

即時注射溶液劑和混懸劑可由前述種類的無菌散劑、顆粒劑和片劑制備。例如，在本發(fā)明的一個方面，提供了在密封容器中的單位劑型的包含本發(fā)明肽的可注射的穩(wěn)定無菌組合物。肽或鹽以凍干物的形式提供，其能夠用合適的可藥用載體重構(gòu)以形成適于將其注入對象中的液體組合物。單位劑型通常包含約1mg至約10g的肽或鹽。當肽或鹽基本上不溶于水時，可使用足夠量的可藥用的乳化劑以在水性載體中乳化肽或鹽。一種這樣的可用乳化劑是磷脂酰膽堿。

適于直腸施用的制劑優(yōu)選作為單位劑量栓劑存在。這些可通過將肽與一種或更多種常規(guī)的固體載體(例如可可脂)混合并隨后使所得混合物成形來制備。

適于表面施用于皮膚的制劑優(yōu)選采用軟膏劑、乳膏劑、洗劑，糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑的形式?？墒褂玫妮d體包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、經(jīng)皮增強劑，及其兩種或更多種的組合。

適于經(jīng)皮施用的制劑可作為適于與接受者的表皮長時間緊密接觸的離散貼劑存在。適于經(jīng)皮施用的制劑還可通過離子電滲法遞送(參見，例如，tyle,pharm.res.3:318(1986))，并且通常采用肽的任選緩沖水溶液劑的形式。合適的制劑包含檸檬酸鹽或bis/tris緩沖液(ph6)或乙醇/水，并且包含0.1m至0.2m的化合物。

或者，可將肽配制成用于經(jīng)鼻施用或另外地通過任何合適的方式施用于對象的肺，所述方式例如通過對象吸入的包含肽的可呼吸顆粒的氣霧劑混懸劑來施用?？珊粑w?？梢允且后w或固體。術(shù)語“氣霧劑”包括任何氣載混懸相，其能夠被吸入細支氣管或鼻通道。特別地，氣霧劑包括液滴的氣載混懸劑，如可在定量霧化吸入器或噴霧器中或者在霧狀噴霧器中產(chǎn)生。氣霧劑還包括混懸在空氣或其他載體氣體中的干粉組合物，其可以通過從例如吸入器裝置吹入而被遞送。參見ganderton和jones,drugdeliverytotherespiratorytract,ellishorwood(1987)；gonda(1990)criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems6:273-313；以及raeburn等,j.pharmacol.toxicol.meth.27:143(1992)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包含肽的液體顆粒的氣霧劑可通過任何合適的方式產(chǎn)生，例如用壓力驅(qū)動的氣霧劑噴霧器或超聲噴霧器。參見，例如，美國專利no.4,501,729。包含肽的固體顆粒的氣霧劑同樣地可通過藥學領(lǐng)域已知的技術(shù)用任何固體的顆粒藥物氣霧劑發(fā)生器產(chǎn)生。

或者，可以以局部而非全身的方式，例如在藥性持久或持續(xù)釋放制劑中施用肽。

此外，本發(fā)明提供了本文公開的肽及其鹽的脂質(zhì)體制劑。用于形成脂質(zhì)體混懸劑的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。當肽或其鹽是水溶性鹽時，使用常規(guī)的脂質(zhì)體技術(shù)，可將其并入脂質(zhì)囊泡中。在這樣的情況下，由于肽或鹽的水溶性，肽或鹽將基本上夾帶在脂質(zhì)體的親水性中心或核心內(nèi)。所使用的脂質(zhì)層可具有任何常規(guī)的組成，并且可包含膽固醇或可不含膽固醇。當目的肽或鹽不溶于水時，仍使用常規(guī)的脂質(zhì)體形成技術(shù)時，鹽可基本上夾帶在形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的疏水性脂質(zhì)雙層內(nèi)。在任一情況下，所產(chǎn)生的脂質(zhì)體的尺寸可減小，如通過使用標準的超聲處理和勻漿技術(shù)來減小。

可將包含本文公開的肽或其鹽的脂質(zhì)體制劑凍干以產(chǎn)生凍干物，所述凍干物可用可藥用載體(例如水)重構(gòu)以再生脂質(zhì)體混懸劑。

在水不溶性肽的情況下，可以制備包含水不溶性肽，例如在水性基質(zhì)乳劑中的水不溶性肽的藥物組合物。在這樣的情況下，組合物將包含足夠量的可藥用乳化劑以乳化期望量的肽。特別可用的乳化劑包括磷脂酰膽堿和卵磷脂。

在一些具體實施方案中，將治療有效量(如該術(shù)語在上文定義的)的肽施用于對象。藥學活性肽的劑量可通過本領(lǐng)域已知的方法來確定，參見例如remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingco.,easton,pa)。任何特定肽的治療有效劑量將根據(jù)肽或患者而所有變化，并且將取決于患者的狀況和遞送途徑。作為一般命題，約0.1mg/kg至約50mg/kg的劑量將具有治療效力，其中所有重量均基于肽的重量來計算，包括使用鹽的情況。較高級別的毒性問題可將靜脈內(nèi)劑量限制在較低水平，例如至多約10mg/kg，其中所有的重量均基于肽的重量來計算，包括使用鹽的情況。約10mg/kg至約50mg/kg的劑量可用于經(jīng)口施用。通常來說，約0.5mg/kg至5mg/kg的劑量可用于肌內(nèi)注射。對于靜脈內(nèi)或經(jīng)口施用，具體劑量分別為約1微摩爾/kg至50微摩爾/kg、更具體地約22微摩爾/kg至33微摩爾/kg的肽。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，可在不同時間間隔(例如，每小時、每天、每周、每月等)內(nèi)使用一次以上施用(例如，兩次、三次、四次或更多次施用)以實現(xiàn)治療效果。

本發(fā)明用于獸醫(yī)和醫(yī)療應用。合適的對象包括禽類和哺乳動物，其中優(yōu)選哺乳動物。本文使用的術(shù)語“禽類”包括但不限于雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞和野雞。本文使用的術(shù)語“哺乳動物”包括但不限于人、牛、綿羊、山羊、馬、貓、犬、兔形動物等。人對象包括新生兒、嬰幼兒、青少年和成人。

在以下實施例中更具體地描述本發(fā)明，這些實施例旨在僅是舉例說明性的，因為本文的眾多修改方案和變化方案對本領(lǐng)域技術(shù)人員都將是顯而易見的。

實施例1

實驗部分

組織獲取和細胞培養(yǎng)：如由unc醫(yī)學院irb批準的方案先前所述的，從人支氣管組織通過酶促消化來收獲細胞(tarran等,j.gen.physiol.127:591(2006))。在肺移植時從主干或肺葉(lumbar)支氣管的一部分獲得人過量的供體肺和切除的接受者肺，并通過酶促消化來收獲細胞。使所有制備物維持在改良的支氣管上皮培養(yǎng)基中的空氣-液體界面處，并接種在用人胎盤vi型膠原(sigma)包被的12mmt-clear插入物(corningcostar)上后2至5周使用。使用磷酸緩沖鹽水(pbs)來洗滌人支氣管上皮培養(yǎng)物黏膜表面。

共聚焦顯微鏡：為標記氣道表面液體，向人支氣管上皮培養(yǎng)物黏膜表面添加包含德克薩斯紅-右旋糖酐(2mg/ml；invitrogen)的林格液。經(jīng)黏膜添加全氟化碳以防止氣道表面液體蒸發(fā)，并將培養(yǎng)物放置在具有63×甘油浸漬物鏡的leicasp8共聚焦顯微鏡的臺上包含100μl林格液的室中。每個培養(yǎng)物掃描10個點，并確定平均氣道表面液體高度。對于共聚焦顯微鏡，將人支氣管上皮培養(yǎng)物在包含以下(mm)的改良林格溶液中漿膜浸?。?16nacl、10nahco3、5.1kcl、1.2cacl2、1.2mgcl2、20tes、10葡萄糖,ph7.4)。在所有其他時間，將人支氣管上皮培養(yǎng)物維持在充入5％co2的包含24mmnahco3的改良begm生長培養(yǎng)基中。全氟化碳(fc-77)從3m獲得，并且如先前報道的，其對asl的高度沒有作用。

α-enac的內(nèi)化：根據(jù)生產(chǎn)商的說明并如先前所公開的，在384孔板中使用lipofectamine用在enac的n端融合gfp的gfp-αenac以及未經(jīng)標記的βenac和γenac轉(zhuǎn)染hek293t細胞(參見，例如，hobbs等amjphysiollungcellmolphysiol.2013年12月；305(12):l990-l1001.doi:10.1152/ajplung.00103.2013.電子出版于2013年10月；garland等procnatlacadsciusa.2013年10月1日；110(40):15973-8.doi:10.1073/pnas.1311999110.電子出版于2013年9月16日；tan等jphysiol.2014年12月1日；592(pt23):5251-68)。24小時之后，在t＝0時添加肽或載體對照，3小時后使用tecanm1000讀板器讀取熒光。在488nm和510nm下讀取熒光。

圖6示出了分析在gfp標記的α-enac僅與γenac而不與β-enac共表達時不同肽對hek293t細胞中α-enac內(nèi)化的作用的實驗結(jié)果。在該圖中，與s18(seqidno:1和seqidno:128)一起使用了seqidno:143(陰性對照肽)和水(載體)對照。盡管在共表達β-enac時seqidno:1和seqidno:128有效地降低α-enac，但是當不存在β-enac時，在該實驗中沒有觀察到影響。

βenac小鼠中的效力測試：與cf患者一樣，enac-tg小鼠在出生時未患疾病，但很快發(fā)生阻塞性肺病(zhou,z.,等amjrespircritcaremed178,1245-1256(2008))。c57bl:fvb和c57bl:c3h混合菌株的死亡率分別為90％和50％，并且在這些背景下疾病的再現(xiàn)率足夠高：用n為約8至10只動物/組產(chǎn)生可靠的數(shù)據(jù)。此外，βenac-tg小鼠以與人中cf/copd類似的方式對治療干預作出反應，并且在出生時抑制肺病后可預防肺病的發(fā)展(livraghi,a.,等jimmunol182,4357-4367(2009))。在平行的小鼠組群中，通過鼻內(nèi)滴注(1μl/g體重)每天1至3次地給藥s18衍生肽或載體，持續(xù)14天。每天稱重小鼠，并且如果發(fā)現(xiàn)利尿效應，則通過皮下注射無菌鹽水來替代分泌的體積。在處理結(jié)束時，處死小鼠用于表型分析。

統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均表示為n個實驗的平均值±se。每個研究使用來自三個或更多個單獨供體的氣道培養(yǎng)物，并且在三個獨立的場合重復每個卵母細胞研究。視實驗情況而定，使用配對或非配對t檢驗或其非等效參數(shù)測試平均值之間的差異的統(tǒng)計學顯著性。從這樣的比較，判斷產(chǎn)生p≤0.05的差異是顯著的。將所有的結(jié)合測定擬合成hill方程。

實施例2

特化的非天然存在的肽的鑒定

基于正常人支氣管上皮培養(yǎng)物將氣道表面液體高度調(diào)節(jié)至7μm的能力(其與胰蛋白酶敏感性enac活性的降低相并聯(lián))，我們之前表明splunc1衍生肽(即s18；圖1)在單次劑量之后可以以亞微摩爾范圍內(nèi)的ec50抑制enac多達24小時(hobbs等,2013)。盡管s18對蛋白水解具有抗性且熱穩(wěn)定，我們?nèi)詼y試了我們是否可減小s18的大小、增加其穩(wěn)定性和/或提高其功效。任何這些作用都會增加其作為藥物的效用。

為了確定我們的丙氨酸掃描數(shù)據(jù)，我們制備了子序列a(lpvpldqt(seqidno:113))；圖1)的肽。作為對照，我們制備了含有帶電荷的中間區(qū)(dqt)的重疊第二肽，以及子序列b(dqtlplnvnp(seqidno:114))。如圖2中所示，lpvpldqt(seqidno：113)保留與s18類似的活性，而dqtlplnvnp(seqidno:114)無活性。然而，我們檢測對蛋白酶的易感性的另外實驗證明，盡管lpvpldqt(seqidno:113)可抑制enac引導的流體吸收，但該肽更易遭受蛋白水解降解。因此，我們產(chǎn)生了新的肽，其中我們使c端和n端的側(cè)翼具有一對d-丙氨酸(示為小寫‘a(chǎn)’)。將30μm肽經(jīng)黏膜添加至hbec并在3小時后通過xz-共聚焦顯微鏡測量asl高度。圖2a示出了s18的n端區(qū)域(lpvpldqt)(seqidno:113)相對于重疊的，但是為c端的區(qū)段(dqtlplnvnp)(seqidno:114)的比較。在圖2b中，向子-s18肽lpvpldqt(seqidno:113)和lpvpldqtlpl(seqidno:115)中添加d-丙氨酸以增加lpvpldqt(seqidno：113)的穩(wěn)定性。d-丙氨酸以小寫a表示。所有n＝6至9。數(shù)據(jù)示為平均值±sem。

當與s18相比時，15-聚體和8-聚體顯示出相同的活性(圖2a至2b)。然后，我們產(chǎn)生針對s18對比肽aalpvpldqtaa(seqidno:3)的全劑量應答。s18和aalpvpldqtaa(seqidno:3)產(chǎn)生相同的劑量應答(圖3a)，表明縮短肽并使其側(cè)翼具有非天然氨基酸不影響其功效或效力。接著，我們基于seqidno:2的序列制備了幾種新的肽。在此，由于脯氨酸通常在肽中提供扭結(jié)，因此不對其進行改變和替換，我們系統(tǒng)地對其他氨基酸進行保守替換物。劑量應答示于圖3b中。注意，由于該圖上有幾條線，因此省略了誤差棒和數(shù)據(jù)符號。然而，這些數(shù)據(jù)是使用配對氣道培養(yǎng)物同時獲得的，因此其比較是有效的。顯然，與s18相比，seqidno:5(aalpnlepldqtaa)顯示出效力呈對數(shù)倍增加，而seqidno:9(aalpvpldqsaa)和seqidno:6(aalpvpnledqtaa)分別顯示出降低的功效和效力(圖3b)。圖3b中包括的其他序列是seqidno：4(aanlepvpldqtaa)、seqidno:7(aalpvpldntaa)和seqidno:8(aalpvpleqtaa)。

使用新鮮批次的氣道細胞，我們進行了針對seqidno：5的另外的劑量應答(圖4)?？梢钥闯觯cs18相比，該肽產(chǎn)生功效的顯著增加，并且ic50為30nm。

測試了肽調(diào)節(jié)αenac的內(nèi)化的能力。來自這些實驗的結(jié)果示于圖5a至5u中。adg是具有以下序列的陰性對照肽：nh3-adggllllnnppppqtvv-nh2(seqidno:143)。這些實驗中使用的肽是s18(seqidno:1)、seqidno:2、seqidno:141、seqidno:129、seqidno:130、seqidno:128、seqidno:131、seqidno:132、seqidno:133、seqidno:134、seqidno:135、seqidno:136、seqidno:137、seqidno:138、seqidno:131、seqidno:139、seqidno:140、seqidno:144和seqidno:127。在這些實驗中還使用了seqidno:12、seqidno:13、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18和seqidno:136的肽，其各自在n和c兩端具有aa帽。還示出了阿米洛利，其通過另一種機制抑制enac，并且不降低細胞表面上功能性受體的量。這些結(jié)果表明splunc肽觸發(fā)enac功能的破壞以抑制其活性。

在βenac小鼠中測試肽的效力。來自這些實驗的結(jié)果示于圖7a至7f中。與吸入的seqidno:142相比，用吸入的seqidno:128進行14天處理在增加βenac-tgc57bl:fvb小鼠的百分比存活方面更有效(圖7b)。seqidno:128的14天處理還增加βenac-tgc57bl:c3h小鼠的百分比存活(圖7c和7d)。每日一次給藥seqidno:128增加βenac-tgc57bl:c3h小鼠的存活百分比(圖7e，左圖)。圖7e的右圖顯示，seqidno:128不具有利尿作用。圖7f顯示，用seqidno:127進行處理增加enac-tgc57bl:c3h小鼠的百分比存活。實驗中使用的其他肽的序列是seqidno:129、seqidno:134和seqidno:136。

前述內(nèi)容是對本發(fā)明的舉例說明，并且不應解釋為對本發(fā)明進行限制。本發(fā)明由所附權(quán)利要求書限定，其中本文中包括權(quán)利要求書的等同方案。

序列表

<110>北卡羅米納大學查佩爾希爾分校

斯拜麗絲生物科學公司

r·塔蘭

d·j·克里斯滕森

<120>改良的鈉通道的肽抑制劑

<130>5470-721wo

<150>us62/061,461

<151>2014-10-08

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15

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<211>8

<212>prt

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<220>

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<220>

<221>misc_feature

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leuxaaxaaxaavalgluglnser

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<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

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<400>113

leuprovalproleuaspglnthr

15

<210>114

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

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aspglnthrleuproleuasnvalasnpro

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<210>115

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

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leuprovalproleuaspglnthrleuproleu

1510

<210>116

<211>8

<212>prt

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<220>

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<220>

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<222>(4)..(4)

<223>xaa是p或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

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<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa是d或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>xaa是q或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>xaa是t或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>116

xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa

15

<210>117

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa是l、nle或者v

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa是pro、hyp、2pp或者dhp

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa是v、l、nle或者mv

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>xaa是pro、hyp、2pp或者dhp

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa是l、nle或者v

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa是d或者e

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>xaa是qorn

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>xaa是t、s或者ms

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>117

xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa

15

<210>118

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa是l或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa是p或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa是v或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>xaa是p或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa是l或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa是d或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>xaa是q或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(8)..(8)

<223>xaa是t或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>xaa是t或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>xaa是l或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(11)

<223>xaa是p或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>xaa是n或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>xaa是v或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(14)..(14)

<223>xaa是n或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>xaa是p或者具有天然或非天然氨基酸的保守替換物

<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>酰胺化

<400>118

xaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaaxaa

151015

<210>119

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(15)..(15)

<223>酰胺化

<400>119

leuprovalproleuaspglnthrleuproleuasnvalasnpro

151015

<210>120

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>120

leuprovalproleuaspglnthr

15

<210>121

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa是nle

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>121

xaaprovalproleuaspglnthr

15

<210>122

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa是nle

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>122

leuproxaaproleuaspglnthr

15

<210>123

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa是nle

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>123

leuprovalproxaaaspglnthr

15

<210>124

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>124

leuprovalproleuaspasnthr

15

<210>125

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>125

leuprovalproleugluglnthr

15

<210>126

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>126

leuprovalproleuaspglnser

15

<210>127

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>127

leuproileproleuaspglnthr

15

<210>128

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>酰胺化

<400>128

xaaxaaleuproileproleuaspglnthrxaaxaa

1510

<210>129

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>xaa是ahp

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>129

leuproxaaproleuaspglnthr

15

<210>130

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>130

leupropheproleuaspglnthr

15

<210>131

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>xaa是hyp

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa是nle

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>酰胺化

<400>131

xaaxaaleuxaaxaaproleuaspglnthrxaaxaa

1510

<210>132

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa是nle

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>xaa是hyp

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>酰胺化

<400>132

xaaxaaleuproxaaxaaleuaspglnthrxaaxaa

1510

<210>133

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa是nle

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>酰胺化

<400>133

glyglyleuproxaaproleuaspglnthrleuproleuasnvalasn

151015

proala

<210>134

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(1)..(1)

<223>乙酰化

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>134

leuproileproleuaspglnthr

15

<210>135

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>xaa是nle

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(10)

<223>酰胺化

<400>135

xaaleuproxaaproleuaspglnthrxaa

1510

<210>136

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa是dhp

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>136

leuxaavalproleuaspglnthr

15

<210>137

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>137

valprovalproleuaspglnser

15

<210>138

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>138

glyglyleuproileproleuaspglnthrleuproleuasnvalasn

151015

proala

<210>139

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(2)

<223>xaa是hyp

<220>

<221>mod_res

<222>(8)..(8)

<223>酰胺化

<400>139

leuxaaileproleuaspglnthr

15

<210>140

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>酰胺化

<400>140

glyglyleuproileproleuaspglnthrleuproleuasnvalasn

151015

proala

<210>141

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>酰胺化

<400>141

xaaxaaleuproleuproleuaspglnthrxaaxaa

1510

<210>142

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(2)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>xaa是nle

<220>

<221>misc_feature

<222>(11)..(12)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(12)..(12)

<223>酰胺化

<400>142

xaaxaaleuproxaaproleuaspglnthrxaaxaa

1510

<210>143

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>adg陰性對照肽序列

<220>

<221>mod_res

<222>(18)..(18)

<223>酰胺化

<400>143

alaaspglyglyleuleuleuleuasnasnproproproproglnthr

151015

valval

<210>144

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>抑制鈉通道活性的肽序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>xaa是d-ala

<220>

<221>mod_res

<222>(10)..(10)

<223>酰胺化

<400>144

xaaleuproileproleugluglnserxaa

1510