相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)是于2016年3月4日提交的申請(qǐng)序列號(hào)pct/us16/21042的部分繼續(xù)申請(qǐng)，pct/us16/21042又是2015年7月17日提交的pct/us15/41034的部分繼續(xù)申請(qǐng)，pct/us15/41034又要求了以下優(yōu)先權(quán)和權(quán)益：2014年11月7日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/076,789以及2014年7月17日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)62/025,681，將以上每個(gè)的內(nèi)容以其全文并入本申請(qǐng)參考。本申請(qǐng)包含以ascii格式電子提交的序列表，并通過引用整體并入本文。所述ascii復(fù)制，在2006年6月14日創(chuàng)建，被命名為319_003_pct_cip2_sl，txt，大小為2,666字節(jié)。
背景技術(shù)：
：在25-30％的乳腺癌中，生長因子受體基因her2(人表皮生長因子受體-2，也稱為neu/erbb2)的擴(kuò)增和過表達(dá)與增強(qiáng)的腫瘤浸潤性以及復(fù)發(fā)和死亡的高風(fēng)險(xiǎn)性相關(guān)(slamon,d.等,1987,science235:177；yarden,y.,2001,oncology1:1)。該致癌基因編碼185千道爾頓(kda)的跨膜受體酪氨酸激酶(rtk)。作為人類表皮生長因子受體(egfr)家族的四個(gè)成員之一，her2本身以如下幾種方式與其他進(jìn)行區(qū)別。首先，her2是孤兒受體。沒有鑒定到高親和力配體。第二，對(duì)其他egfr家族成員(her1/egfr、her3和her4)，her2是用于形成異二聚體的優(yōu)選配偶體，異二聚體顯示高配體親和力和優(yōu)異的信號(hào)傳導(dǎo)活性。第三，全長her2進(jìn)行蛋白水解切割，釋放出可溶性細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)。脫落的ecd在體外和體內(nèi)均已經(jīng)顯示出可作為全長her2活化機(jī)制的替代物，因?yàn)槠淞粝铝司哂屑っ富钚缘哪ゅ^定片段。不管其表達(dá)水平如何，her2在egfr家族信號(hào)傳導(dǎo)中的中心作用與其參與的幾種癌癥類型的腫瘤發(fā)生相關(guān)，如乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和胃癌(slamon,d.等，1989,science244:707；hynes,n.等，1994,biochem.biophys.acta.1198:165)。her2還可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)某些化學(xué)治療劑具有抗性(pegram,m.等，1997,oncogene15:537)。鑒于其在腫瘤發(fā)生中的重要作用，her2是癌癥治療的重要靶標(biāo)。受體酪氨酸激酶的人類egf受體(her)家族調(diào)節(jié)多種生物過程，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和存活。該家族由四個(gè)成員組成：egfr(her1)、her2(neu或erbb2)、her3(erbb3)和her4(erbb4)。迄今為止，已經(jīng)報(bào)道了11種配體，包括表皮生長因子(egf)、肝素結(jié)合性egf樣生長因子(hb-egf)、轉(zhuǎn)化生長因子α(tgfα)、雙調(diào)蛋白(ar)、上皮調(diào)節(jié)蛋白、β細(xì)胞素和調(diào)蛋白。這些配體直接結(jié)合其同源受體，這導(dǎo)致受體同二聚體或異二聚體的形成，其觸發(fā)多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活化。通過激活突變、受體過表達(dá)或異常配體釋放，her-家族成員的失調(diào)導(dǎo)致各種人類腫瘤的發(fā)展。her3在乳腺癌、卵巢癌和肺癌中過表達(dá)，并且這種遺傳特征與不良預(yù)后相關(guān)。一旦被調(diào)蛋白激活，her3與her2、egfr二聚化以形成有效的致癌受體異二聚體。在這個(gè)復(fù)合體內(nèi)，her3優(yōu)先募集pi3激酶到其細(xì)胞質(zhì)對(duì)接位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活。到目前為止，人們假定her3是激酶-失活(kinase-inactive)的，因?yàn)槠浼っ附Y(jié)構(gòu)域中有明顯異常的序列特征，并且人們假定her3需要與her家族的激酶-完整成員進(jìn)行異二聚化以便啟動(dòng)信號(hào)事件。與此相一致，據(jù)顯示her2需要her3以驅(qū)動(dòng)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖。然而，最近的研究結(jié)果表明，her3能夠磷酸化pyk2，其導(dǎo)致人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中mapk通路的激活。此外，her3特異性的單克隆抗體可以抑制癌細(xì)胞系的增殖和遷移。有趣的是，最近顯示癌細(xì)胞通過上調(diào)her3信號(hào)傳導(dǎo)而逃避her家族抑制劑治療，并且her3的抑制消除了乳腺癌細(xì)胞中her2驅(qū)動(dòng)的他莫昔芬耐藥性。此外，據(jù)顯示，對(duì)吉非替尼(iressa)(一種egfr小分子抑制劑)治療的抗性與her3信號(hào)激活有關(guān)。her3是在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞生長中起重要作用的受體蛋白。her3缺乏內(nèi)在激酶活性，并且依賴于her2的存在進(jìn)行跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。最初轉(zhuǎn)錄時(shí)，her3的前體mrna含有28個(gè)外顯子和27個(gè)內(nèi)含子。完全剪接好的her3mrna由28個(gè)外顯子組成，該her3mrna中內(nèi)含子已經(jīng)被剪接出來了。在過去的十年中，靶向治療已經(jīng)成為癌癥治療的基石。因?yàn)檫@些受體酪氨酸激酶在許多癌癥中會(huì)失調(diào)，所以，egf受體家族成員-即egfr(或her1)和erbb2(或her2/neu)已經(jīng)演變?yōu)榉浅Ｓ形Φ陌袠?biāo)。因?yàn)樵诮閷?dǎo)對(duì)her2和pi3k通路-導(dǎo)向的治療的抗性中起主要作用，egf受體家族的另一成員erbb3或her3的致癌功能在最近被仔細(xì)考察，。已經(jīng)在許多不同的腫瘤類型，包括乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和黑色素瘤中鑒定了her3的激活突變和/或過表達(dá)，這些在這些腫瘤中預(yù)示一個(gè)較差的總體預(yù)后。盡管在該領(lǐng)域有所進(jìn)展，仍然不確定使用基于細(xì)胞或基于蛋白質(zhì)的以her-3為靶向的疫苗策略是否可以在人類中產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。因此，本領(lǐng)域需要具有其他的免疫治療方法用于治療或預(yù)防與her-3蛋白的過表達(dá)相關(guān)的乳腺癌和其他惡性腫瘤。本具體實(shí)施方式滿足了這種需求。附圖說明當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)，將更好地理解本發(fā)明中以下詳細(xì)描述的優(yōu)選實(shí)施例。為了說明本發(fā)明的目的，附圖中顯示出了目前優(yōu)選的實(shí)施例。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于附圖中所示實(shí)施例的精確布置和手段。圖1顯示了在許多患者中具有激活cd4t細(xì)胞能力的來自her-3的免疫原性肽(seqidno：1-3，按照出現(xiàn)的順序)。圖2顯示具有10個(gè)肽片段的組的her3全局篩選。圖2還顯示了具有單肽的her3篩選(seqidno：4-7，按照出現(xiàn)的順序)。圖3顯示具有10個(gè)肽片段的組的her3全局篩選。圖3還顯示了具有單肽的her3篩選(seqidno：4-7，按照出現(xiàn)的順序)。圖4顯示具有10個(gè)肽片段的組的her3全局篩選。圖4還顯示了具有單肽的her3篩選(seqidno：1-3，按照出現(xiàn)的順序)。圖5顯示來自不同her3肽的ifn-γ產(chǎn)量。圖6顯示來自不同her3肽的ifn-γ產(chǎn)量。圖7顯示了來自“反向”篩選的ifn-γ產(chǎn)量，從先前鑒定的肽開始，對(duì)肽和her3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化。圖8顯示了來自“反向”篩選的ifn-γ產(chǎn)量，從先前鑒定的肽開始，對(duì)肽和her3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化。圖9顯示了在患者中來自“反向”篩選的ifn-γ產(chǎn)量，該患者先前未用her細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化，從先前鑒定的肽開始，對(duì)肽和her3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化。圖10顯示了在患者中來自“反向”篩選的ifn-γ產(chǎn)量，該患者先前未用her細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化，從全肽文庫開始，對(duì)肽和her3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化。圖11顯示了在患者中來自“反向”篩選的ifn-γ產(chǎn)量，該患者先前未用her細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化，從全肽文庫開始，對(duì)肽和her3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化。圖12顯示了先前未用her細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化的患者的來自“反向”篩選的ifn-γ產(chǎn)量，從肽開始，對(duì)肽和her3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域敏化。圖13顯示了供體#upcc15107-24中的連續(xù)肽篩選。圖14顯示了供體#upcc15107-38中的連續(xù)肽篩選。圖15顯示了供體#upcc15107-38和upcc15107-24中的“反向”敏化。圖16顯示了供體#upcc15107-30和upcc15107-32中的免疫原性her3表位-脈沖的dc1敏化cd4+th1和克服抗her3免疫耐受性(兩個(gè)患者具有已知的對(duì)鑒定的her3肽和/或天然her3ecd的抗her3非反應(yīng)性)。圖17顯示了表明mhcii類異位的免疫原性cd4+her3表位。圖18顯示了在腔室中將激活的her-3cd4+細(xì)胞放置在臨近her-3表達(dá)細(xì)胞旁邊，her-3cd4+細(xì)胞引起her-3表達(dá)細(xì)胞乳腺癌細(xì)胞的凋亡或死亡。圖19顯示了使用her3的ecd作為腫瘤抗原鑒定免疫原性ii類混雜的her3cd4+肽的方法，以產(chǎn)生抗her3th1細(xì)胞免疫。圖20顯示了通過“反向”敏化鑒定的cd4+her3ecd表位的免疫原性的驗(yàn)證。使用所示的單肽進(jìn)行her3ecd篩選。圖21顯示了通過“反向”敏化鑒定的cd4+her3ecd表位的免疫原性的驗(yàn)證的另外結(jié)果。圖22顯示了her染色的免疫組織化學(xué)評(píng)分的照片。圖23a和23b是顯示了在低度異型增生(lgd)或高度異型增生(hgd)的barrett食管中her家族過表達(dá)比率的柱狀圖(圖23a)，和與barrett病變(與癌相關(guān)的hgd)相關(guān)的高度異型增生或無相關(guān)浸潤性癌的高度異型增生中her家族過表達(dá)比率的柱狀圖(圖23b)。圖24a-24c顯示了來自hds(健康供體)至eribc/erposibc(雌激素受體陽性浸潤性乳腺癌(ibc))和tnbcc(三陰性ibc)的抗her3cd4th1細(xì)胞應(yīng)答下降。附圖顯示了系統(tǒng)性cd4+th1細(xì)胞應(yīng)答的ifn-γelispot分析的柱狀圖(左圖)。研究的患者組為：健康供體(hd)；良性乳腺活檢(bd)；her2陽性(“her2pos”)原位導(dǎo)管癌(dcis)；her2浸潤性乳腺癌/her2陽性浸潤性乳腺癌(her2ibc/her2posibc)；雌激素受體浸潤性乳腺癌/雌激素受體陽性浸潤性乳腺癌(eribc/erposibc)；和三陰浸潤性乳腺癌(tnibc)。與各個(gè)柱狀圖的右側(cè)對(duì)應(yīng)的表是個(gè)體比較，通過在同一時(shí)間內(nèi)兩組間“學(xué)生”t檢驗(yàn)得到的。對(duì)所有組進(jìn)行單向方差分析。圖24a顯示了通過elispot測(cè)定的由ifn-γ斑點(diǎn)數(shù)/百萬細(xì)胞測(cè)量的累積抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答，其顯著地從hds下降到bds到dcis到her2posibc到erposibc，最后降到tnibc(分別為90、80、66、79、48、40，p＝0.01)。圖24b顯示了響應(yīng)庫，或具有陽性cd4th1應(yīng)答的her3肽的數(shù)目，顯著地從hds下降到bds到dcis到her2posibc到erposibc，最后到tnibc(分別為1.0、0.6、0.8、0.8、0.5、0.3，p＝0.003)。圖24c顯示了響應(yīng)率，與至少1種肽響應(yīng)的受試者的百分比顯著地從hds下降到bds到dcis到her2posibc到erposibc，最后到tnibc(分別為76.7％、63.6％、53.8％、66.7％、45.0％、33.3％，p＝0.02)。圖25a和25b顯示了cd4t細(xì)胞應(yīng)答的喪失是her3特異性的，因?yàn)樵跍y(cè)試的患者組之間在破傷風(fēng)或抗cd3/cd28刺激方面沒有差異。附圖顯示了系統(tǒng)性cd4+th1細(xì)胞應(yīng)答的ifn-γelispot分析的柱狀圖(左圖)。研究的患者組為：健康供體；良性乳腺活檢；her2陽性原位導(dǎo)管癌；her2浸潤性乳腺癌/her2陽性浸潤性乳腺癌；雌激素受體浸潤性乳腺癌/雌激素受體陽性浸潤性乳腺癌；和三陰浸潤性乳腺癌。與各個(gè)柱狀圖的右側(cè)對(duì)應(yīng)的表是個(gè)體比較，通過在同一時(shí)間內(nèi)兩組間“學(xué)生”t檢驗(yàn)得到的。對(duì)所有組進(jìn)行單因素方差分析。圖25a顯示了在健康供體、良性乳腺活檢、her2陽性原位導(dǎo)管癌、her2浸潤性乳腺癌/her2陽性浸潤性乳腺癌、雌激素受體浸潤性乳腺癌/雌激素受體陽性浸潤性乳腺癌和三陰浸潤性乳腺癌之間，通過elispot測(cè)定的由ifn-γ斑點(diǎn)數(shù)/200,000個(gè)細(xì)胞測(cè)量的破傷風(fēng)反應(yīng)中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(分別為37、30、19、34、24、29，p＝0.01)。圖25b顯示了在健康供體、良性乳腺活檢、her2陽性原位導(dǎo)管癌、her2浸潤性乳腺癌/her2陽性浸潤性乳腺癌、雌激素受體浸潤性乳腺癌/雌激素受體陽性浸潤性乳腺癌和三陰浸潤性乳腺癌之間，通過elspot測(cè)定的由ifn-γ斑點(diǎn)數(shù)/200,000個(gè)細(xì)胞測(cè)量的抗cd3/抗cd28多克隆刺激中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(分別為688、549、804、699、629、675，p＝0.68)。圖26a-26c顯示了抗her3cd4t細(xì)胞反應(yīng)與新輔助化療的復(fù)發(fā)和反應(yīng)相關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。圖26a是四個(gè)柱狀圖，通過初始手術(shù)淋巴結(jié)狀態(tài)下(淋巴結(jié)陽性(“l(fā)n+”或“l(fā)npos”)與淋巴結(jié)陰性(“l(fā)n-”或“l(fā)nneg”))比較ibc患者的免疫應(yīng)答，顯示了累積應(yīng)答沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異(上圖)(分別為40、56，p＝0.12)，響應(yīng)庫(第二圖)(分別為0.4、0.6，p＝0.08)，響應(yīng)率(第三圖)(分別為35.7％、54.8％，p＝0.19)或破傷風(fēng)反應(yīng)(下圖)(分別為22、29，p＝0.35)。圖26b是四個(gè)柱狀圖，其通過至少1年我們?cè)\斷的復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)(無疾病)患者比較ibc患者的免疫應(yīng)答，顯示了具有顯著較低的累積應(yīng)答(上圖)(分比為17、66，p＝0.04)，響應(yīng)庫(第二圖)(分比為0.0、0.6，p<0.05)，響應(yīng)率(第三圖)(分比為0％、55.6％，p＝0.01)，在復(fù)發(fā)性和非復(fù)發(fā)性ibc患者之間的破傷風(fēng)反應(yīng)沒有差異(下圖)(分比為27、35，p＝0.65)。圖26c是四個(gè)柱狀圖，其通過對(duì)新輔助化療(病理完全緩解(“pcr”)對(duì)殘留疾病(“<pcr”))的響應(yīng)比較ibc患者的免疫應(yīng)答。在接受新輔助化療的患者中，與那些具有<pcr的患者相比，具有pcr的患者顯示出顯著更高的累積應(yīng)答(上圖)(分別為144、32，p＝0.004)，響應(yīng)庫(第二圖)(分別為0.8、0.4，p＝0.05)，在pcr和<pcr患者免疫應(yīng)答之間響應(yīng)率(第三圖)(分別為80.0％、27.3％，p＝0.10)或破傷風(fēng)反應(yīng)(下圖)(分別為17、59，p＝0.15)沒有差異。圖27a-27d顯示在絕經(jīng)后hd/bd中抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答顯著升高，但是不隨年齡、種族或妊娠史而不同。圖27a是四個(gè)柱狀圖，其通過年齡(<50歲和>50歲)比較hd患者的免疫應(yīng)答。累積應(yīng)答(上圖)(分別為77、103，p＝0.25)，響應(yīng)庫(第二圖)(分別為0.8、1.1，p＝0.38)，響應(yīng)率(第三圖)(分別為72.0、75.0％，p＝1.0)或破傷風(fēng)反應(yīng)(下圖)(分別為39、30，p＝0.40)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。圖27b是四個(gè)柱狀圖，通過種族(高加索人、非洲裔美國人與其他人)比較hd患者的免疫應(yīng)答。累積應(yīng)答(上圖)(分別為87、83、95，p＝0.96)，響應(yīng)庫(第二圖)(分別為0.9、0.7、1.4，p＝0.31)，響應(yīng)率(分別為69.0％、71.4％、100％，p＝0.35)或破傷風(fēng)反應(yīng)(下圖)(分別為33、51、26，p＝0.30)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。圖27c是四個(gè)柱狀圖，通過妊娠史/胎次(0個(gè)妊娠、1個(gè)或更多個(gè)妊娠)比較hd患者的免疫應(yīng)答。累積應(yīng)答(上圖)(分別為82、91，p＝0.71)，響應(yīng)庫(第二圖)(分別為1.0、0.9，p＝0.62)或響應(yīng)率(第三圖)(分別為76.5％、70.8％，p＝0.74)在妊娠史中沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異。感興趣的是，與具有至少一個(gè)妊娠的相比，未經(jīng)產(chǎn)女性的破傷風(fēng)反應(yīng)(下圖)顯著更高(分別為47、27，p＝0.04)。圖27d是四個(gè)柱狀圖，通過絕經(jīng)狀態(tài)(絕經(jīng)前與絕經(jīng)后)比較hd患者的免疫應(yīng)答。與絕經(jīng)前hd/bd相比，絕經(jīng)后hd/bd顯示出顯著更高的累積應(yīng)答(上圖)(分別為每百萬個(gè)細(xì)胞136、70個(gè)，p＝0.005)和響應(yīng)庫(第二圖)(分別為1.4肽、0.8肽，p＝0.03)。絕經(jīng)后和絕經(jīng)前hd/sbds的響應(yīng)率(第三圖)(分別為90.9％、66.7％，p＝0.23)或破傷風(fēng)反應(yīng)(下圖)(分別為38、28，p＝0.37)沒有差異。圖28是elispot線性測(cè)定圖。通過操作者，elispot測(cè)定法確定為線性和精確的，該操作者通過將已知的抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答的系列稀釋到培養(yǎng)基中進(jìn)行本研究的所有測(cè)定。累積應(yīng)答遵循線性回歸曲線，該曲線來自稀釋度1.0、0.1、0.01、0.001(每百萬細(xì)胞分別為230、35、12、5個(gè)點(diǎn)，p<0.0001，r2＝0.88)。發(fā)明詳述本實(shí)施方式提供了her家族蛋白質(zhì)的分離肽以及其它受體酪氨酸激酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了her1、her3和c-met蛋白中的一種或多種的分離肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽代表her1的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽代表her3的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽代表c-met的表位。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)的相應(yīng)her家族的表位以及其他受體酪氨酸激酶是免疫原性的。本實(shí)施方式另外提供了包含一種或多種本實(shí)施方式的肽的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了嵌合肽，其中所述嵌合肽包含一種或多種本實(shí)施方式的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中包括包含多價(jià)肽的組合物。多價(jià)肽包括兩種或更多種本發(fā)明的肽。另外提供了刺激免疫應(yīng)答的方法和治療受試者中的癌癥的方法。還提供了用于治療和預(yù)防疾病用途的疫苗。如本文所述的，本實(shí)施方式的肽能夠單獨(dú)的或包含在嵌合肽中引發(fā)免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是體液應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的肽提供保護(hù)作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，her3表達(dá)可以用作胃食管結(jié)合部癌前病變中腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，由包括使用her3mhcii類免疫原性肽來確定抗her3cd4th1的喪失。定義除非另有定義，否則本發(fā)明使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的一般技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。雖然與本發(fā)明所述相似或等同的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)或測(cè)試，仍將優(yōu)選的方法和材料進(jìn)行了描述。通常，本發(fā)明使用的術(shù)語和細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機(jī)化學(xué)和核酸化學(xué)和雜交中的實(shí)驗(yàn)步驟是本領(lǐng)域中公知并且常用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于合成核酸和肽。技術(shù)和步驟通常按照本領(lǐng)域中的常規(guī)方法和本文獻(xiàn)通篇提供的各種一般性參考文獻(xiàn)進(jìn)行的(例如sambrookandrussell,2012,molecularcloning,alaboratoryapproach,coldspringharborpress,coldspringharbor,ny,和ausubel等,2012,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,ny)。本發(fā)明使用的術(shù)語和下文所述的分析化學(xué)和有機(jī)合成中采用的實(shí)驗(yàn)方法是本領(lǐng)域中公知且常用的那些。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其修改用于化學(xué)合成和化學(xué)分析。正如本發(fā)明所使用的，以下每個(gè)術(shù)語的含義與其在本章節(jié)中的含義相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明使用的冠詞“一種”是指冠詞語法對(duì)象的一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))。例如“一種元件”是指一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。當(dāng)涉及可測(cè)量的值例如數(shù)量、持續(xù)時(shí)間等時(shí)，本發(fā)明所用的“約”是指包括定值±20％，或±10％，或±5％，或±1％，或±0.1％的變化，因?yàn)檫@些變化適于實(shí)施所公開的方法。當(dāng)術(shù)語“異?！庇迷谏矬w、組織、細(xì)胞或其組分的上下文中時(shí)，是指那些生物體、組織、細(xì)胞或其組分在至少一種可觀察或可檢測(cè)的特征(例如年齡、治療、時(shí)間等)中不同于那些顯示正常(期望的)的各自特征的生物體、組織、細(xì)胞或其組分。對(duì)于一種細(xì)胞或組織類型來說是正?；蝾A(yù)期的特征對(duì)于不同的細(xì)胞或組織類型可能是異常的。如本發(fā)明所用的用于乳腺癌的“輔助治療”是指在主要治療(即手術(shù))后給予的任何治療，以增加長期存活的機(jī)會(huì)。“新輔助或新-輔助療法”是在主要治療之前給予的治療。本發(fā)明所用的術(shù)語“抗原”或“ag”定義為引發(fā)免疫應(yīng)答的分子。這種免疫應(yīng)答可能涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細(xì)胞的活化，或兩者都包括。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，任何大分子，實(shí)際上包括所有的蛋白質(zhì)或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組dna。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，包含編碼引發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的部分核苷酸序列或核苷酸序列的任何dna編碼如本發(fā)明所用的術(shù)語“抗原”。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，抗原不需要僅由基因的全長核苷酸序列編碼。顯而易見的是，本發(fā)明包括但不限于使用多于一個(gè)基因的部分核苷酸序列，并且這些核苷酸序列進(jìn)行不同的組合以引發(fā)所需的免疫應(yīng)答。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，抗原不需要由“基因”編碼。顯而易見的是，抗原可以合成產(chǎn)生的或可以衍生自生物樣品。這樣的生物樣品可以包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或生物流體。“抗原呈遞細(xì)胞”(apc)是能夠激活t細(xì)胞的細(xì)胞，其包括但不限于單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(dc)?！翱乖?fù)載的apc”或“抗原脈沖的apc”包括已暴露于抗原并被抗原活化的apc。例如，apc可以在體外(例如在有抗原存在的培養(yǎng)期間)負(fù)載ag。apc也可以通過暴露于抗原而在體內(nèi)被負(fù)載?！翱乖?fù)載的apc”通常以兩種方式之一制備：(1)稱為抗原肽的小肽片段直接“脈沖”到apcs的外部；或(2)apc與完全蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)顆粒孵育，然后完全蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)顆粒由apc攝取。這些蛋白質(zhì)通過apc被消化成小的肽片段，并且最終被運(yùn)輸并呈遞在apc表面上。此外，還可以通過將編碼抗原的多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中來產(chǎn)生負(fù)載抗原的apc?！翱筯er3應(yīng)答”、“抗her3cd4th1應(yīng)答”、“抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答”等是指特異性針對(duì)her3蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明使用的術(shù)語“抗腫瘤效應(yīng)”是指一種生物效應(yīng)，其可以通過腫瘤體積的減少、腫瘤細(xì)胞數(shù)目的減少、轉(zhuǎn)移數(shù)目的減少、預(yù)期壽命的增加或改善與癌性病癥相關(guān)的各種生理癥狀來證實(shí)?！翱鼓[瘤效應(yīng)”也可以通過本發(fā)明的肽、多核苷酸、細(xì)胞和抗體的首先預(yù)防腫瘤發(fā)生的能力來證實(shí)。本發(fā)明使用的術(shù)語“自身免疫性疾病”定義為由自身免疫應(yīng)答引起的失調(diào)。自身免疫性疾病是對(duì)自身抗原的不適當(dāng)和過度反應(yīng)的結(jié)果。自身免疫性疾病的實(shí)例包括但不限于艾迪森疾病、斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克羅恩氏病、糖尿病(i型)、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解、附睪炎、腎小球腎炎、格雷夫斯病綜合征、吉蘭-巴雷綜合癥、橋本氏病、溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、尋常型天皰瘡、牛皮癬、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征、脊椎關(guān)節(jié)病、甲狀腺炎、血管炎、白癜風(fēng)、粘液性水腫、惡性貧血、潰腸性結(jié)腸炎等。如本發(fā)明使用的術(shù)語“自體的”意指來源于相同個(gè)體的任何材料，其隨后將被重新引入個(gè)體中。本發(fā)明使用的術(shù)語“b細(xì)胞”定義為源自骨髓和/或脾的細(xì)胞。b細(xì)胞可以發(fā)展成產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞。本發(fā)明使用的術(shù)語“癌癥”定義為細(xì)胞的過度增殖，其具有獨(dú)特性狀-喪失正常控制-導(dǎo)致不受控制的生長，缺乏分化，局部組織侵入和/或轉(zhuǎn)移。實(shí)例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、生殖細(xì)胞腫瘤和類似病癥?！癱d4+th1細(xì)胞”、“th1細(xì)胞”、“cd4+t輔助型1細(xì)胞”、“cd4+t細(xì)胞”等被定義為表達(dá)表面蛋白cd4和產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子ifn-γ的t輔助細(xì)胞的一種亞型。也參見，“t輔助細(xì)胞”?！袄鄯e應(yīng)答”是指患者組的組合免疫應(yīng)答，表示為來自給定患者組的所有mhcii類結(jié)合肽的反應(yīng)點(diǎn)的總和(來自ifn-γelispot分析的每106個(gè)細(xì)胞的點(diǎn)形成細(xì)胞“sfc”)?！癲c疫苗接種”、“dc免疫”、“dc1免疫”等是指使用自體樹突狀細(xì)胞來管理免疫系統(tǒng)識(shí)別特定分子并針對(duì)它們產(chǎn)生特異性應(yīng)答的策略。術(shù)語“樹突狀細(xì)胞”或“dc”是一種抗原呈遞細(xì)胞，其存在于體內(nèi)、體外、離體或在宿主或受試者中，或其可源自造血干細(xì)胞或單核細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞及其前體可以從多種淋巴器官例如脾、淋巴結(jié)以及骨髓和外周血中分離。樹突狀細(xì)胞具有薄片(薄片狀偽足)的特征形態(tài)，該薄片在多個(gè)方向上遠(yuǎn)離樹突狀細(xì)胞體延伸。通常，樹突狀細(xì)胞表達(dá)高水平的mhc和共刺激分子(例如b7-1和b7-2)。樹突狀細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)t細(xì)胞的抗原特異性分化，并能以發(fā)起在體外和體內(nèi)初級(jí)t細(xì)胞應(yīng)答。在疫苗生產(chǎn)的環(huán)境中，“活化的dc”是已經(jīng)暴露于toll樣受體激動(dòng)劑例如脂多糖“l(fā)ps”的dc。活化的dc可以或可不負(fù)載有抗原。“疾病”是動(dòng)物的一種健康狀態(tài)，其中動(dòng)物不能維持體內(nèi)平衡，并且如果疾病沒有改善，則動(dòng)物的健康會(huì)繼續(xù)惡化。動(dòng)物中的“失調(diào)”是一種健康狀態(tài)，其中動(dòng)物能夠維持體內(nèi)平衡，但是動(dòng)物的健康狀況不如沒有失調(diào)時(shí)那樣良好。未經(jīng)治療，失調(diào)不一定引起動(dòng)物健康狀態(tài)的進(jìn)一步降低。如果患者經(jīng)歷的疾病或失調(diào)的至少一種體征或癥狀的嚴(yán)重性或頻率降低，則疾病或失調(diào)是“減輕”的?！坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊痹诒景l(fā)明中可互換使用，并且是指如本發(fā)明所述的有效實(shí)現(xiàn)特定生物學(xué)結(jié)果的化合物、制劑、材料或組合物的量。這樣的結(jié)果可以包括但不限于通過本領(lǐng)域任何合適的方法測(cè)定的病毒感染的抑制。如本發(fā)明所用，術(shù)語“內(nèi)源的”是指來自或產(chǎn)生于生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)內(nèi)的任何材料。如本發(fā)明所用，術(shù)語“外源的”是指從生物體、細(xì)胞、組織或系統(tǒng)外部引入或產(chǎn)生的任何物質(zhì)?！癶er受體”是屬于her受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，包括egfr(erbb1，her1)，her2(erbb2)，her3(erbb3)和her4(erbb4)受體。her受體通常包含：胞外結(jié)構(gòu)域，其可以結(jié)合her配體和/或與另一個(gè)her受體分子二聚化；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和具有可被磷酸化的幾個(gè)酪氨酸殘基的羧基末端信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。her受體可以是“天然序列”her受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選地，her受體是天然序列人類her受體。“her途徑”是指由her受體家族介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)?！癶er激活”是指任何一種或多種her受體的激活或磷酸化。通常，her活化導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如其由her受體的細(xì)胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化her受體或底物多肽中的酪氨酸殘基導(dǎo)致的)。her激活可以通過her配體與包含目標(biāo)her受體的her二聚體結(jié)合來介導(dǎo)。her配體與her二聚體的結(jié)合可激活二聚體中一個(gè)或多個(gè)her受體的激酶結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)her受體中的酪氨酸殘基的磷酸化和/或另外的底物多肽中的酪氨酸殘基的磷酸化，例如akt或mapk細(xì)胞內(nèi)激酶?！癶er2”是人表皮生長因子受體(“egfr”)家族的成員。her2在約20-25％的人乳腺癌中過表達(dá)，并在許多其它癌癥中表達(dá)?！癶er2pos”是一種乳腺癌以及許多其他類型的癌癥的分類或分子亞型。her2陽性目前通過fish(熒光原位雜交)測(cè)定的基因擴(kuò)增和病理染色的強(qiáng)度2+或3+進(jìn)行定義?！癶er2neg”通過fish測(cè)定的基因擴(kuò)增的缺乏進(jìn)行定義，并且在大多數(shù)情況下可以包括0至2+的病理染色范圍?！癶er3”和“erbb3”是指所公開的受體多肽，例如，美國專利號(hào)5,183,884和5,480,968以及kraus等人pnas(usa)86:9193-9197(1989)?！癶er3胞外結(jié)構(gòu)域”或“her3ecd”是指位于細(xì)胞外部的her3結(jié)構(gòu)域，其錨定于細(xì)胞膜或在循環(huán)中，包括其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，her3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域：結(jié)構(gòu)域i、結(jié)構(gòu)域ii、結(jié)構(gòu)域iii和結(jié)構(gòu)域iv。在一個(gè)實(shí)施方案中，her3ecd包含氨基酸1-636(編號(hào)包括信號(hào)肽)。在一個(gè)實(shí)施方案中，her3結(jié)構(gòu)域iii包含氨基酸328-532(編號(hào)包括信號(hào)肽)。如本發(fā)明所用的“her3免疫原性肽”、“her3結(jié)合肽”、“her3表位”等是指衍生自或基于her3蛋白，特別是her3ecd的序列及其等同物的mhcii類肽。her3肽可以激活許多患者的cd4t細(xì)胞。所述肽可用于脈沖樹突狀細(xì)胞并教導(dǎo)t細(xì)胞識(shí)別her3。her3在三陰性乳腺癌中表達(dá)，并且可以在erpos乳腺癌中賦予針對(duì)抗-雌激素的抗性。her3也在其它癌癥中表達(dá)，包括黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和轉(zhuǎn)移性腦腫瘤。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，如下鑒定了四種her3免疫原性肽(表位)或結(jié)合肽：p12(肽56-70):cevvmgnleivltgh(seqidno:4)；p81(肽401-415):swpphmhnfsvfsnl(seqidno:5)；p84(肽416-430):ttiggrslynrgfsl(seqidno:6)；和p91(肽451-465):agriyisanrqlcyh(seqidno:7)。本發(fā)明所用的“同源”是指兩個(gè)聚合物分子之間，例如兩個(gè)核酸分子之間，例如兩個(gè)dna分子或兩個(gè)rna分子之間，或兩個(gè)多肽分子之間的亞基序列相似性。當(dāng)兩個(gè)分子兩者中的亞基位置被相同的單體亞基占據(jù)時(shí)，例如，如果兩個(gè)dna分子中每一個(gè)dna的位置被腺嘌呤占據(jù)，則它們?cè)谠撐恢檬峭耆?00％同源的。兩個(gè)序列之間的同源性百分比是匹配或同源位置數(shù)目的直接函數(shù)，例如，如果兩個(gè)化合物序列中位置的一半(例如，聚合物長度上的十個(gè)亞基中的五個(gè)位置)是同源的，則兩個(gè)序列是50％相同，如果90％的位置，例如10個(gè)中的9個(gè)匹配或同源，則兩個(gè)序列具有90％的同源性。例如，dna序列5'attgcc3'和5'tatggc3'具有50％的同源性。此外，當(dāng)本發(fā)明使用術(shù)語“同源性”或“同一性”來指核酸和蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)將其解釋為應(yīng)用于核酸和氨基酸序列水平的同源性或同一性。術(shù)語“過度增殖性疾病”定義為由細(xì)胞過度增殖引起的疾病。示例性的過度增殖性疾病包括但不限于癌癥或自身免疫性疾病。其它過度增殖性疾病可包括例如血管閉塞、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化或炎性腸病。如本發(fā)明所用“教材”包括可用于傳達(dá)本發(fā)明的組合物和方法的有用性的出版物、記錄、圖表或任何其它表達(dá)介質(zhì)。本發(fā)明試劑盒的教材可以是如粘附到含有本發(fā)明的核酸、肽和/或組合物的容器中，或者與含有核酸、肽和/或組合物的容器一起運(yùn)輸?；蛘?，教材可以與容器分開裝運(yùn)，目的是接受者協(xié)同使用教材和化合物。如本發(fā)明所用的“免疫應(yīng)答”是指響應(yīng)于抗原引入的宿主免疫系統(tǒng)的激活，如哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的激活。免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞或體液應(yīng)答的形式，或兩者兼有?！胺蛛x的”是指從天然狀態(tài)改變或除去。例如，天然存在于活體動(dòng)物中的核酸或肽不是“分離的”，但是與其天然狀態(tài)的共存材料部分或完全分離的相同核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以以基本上純化的形式存在，或可以存在于非天然環(huán)境中，例如宿主細(xì)胞。本發(fā)明所用術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指與未接受治療或未使用化合物的受試者中的應(yīng)答水平相比，和/或與在其它方面相同但未經(jīng)治療的受試者中的應(yīng)答水平相比，介導(dǎo)受試者中應(yīng)答水平的可檢測(cè)的增加或降低。該術(shù)語包括干擾和/或影響天然信號(hào)或應(yīng)答，從而在受試者，優(yōu)選人類中介導(dǎo)有益的治療反應(yīng)。通過分析每個(gè)受試者組的抗her3cd4+th1免疫應(yīng)答來定義cd4+th1應(yīng)答的“度量”或“免疫應(yīng)答的度量”：(a)總抗her3響應(yīng)性(表示為對(duì)≥1種免疫原性肽響應(yīng)的受試者的百分比)；(b)響應(yīng)庫(表示為每個(gè)受試組識(shí)別的免疫原性肽的平均數(shù)(n))；和(c)累積應(yīng)答(表示為來自每個(gè)受試組的4個(gè)mhcii類her3免疫原性肽的反應(yīng)點(diǎn)(來自ifn-γelispot分析的每106個(gè)細(xì)胞的點(diǎn)形成細(xì)胞“sfc”)的總和)。如本發(fā)明所用的“肽”、“蛋白質(zhì)”或“多肽”可以指氨基酸的連接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然和合成的修飾或組合。如本發(fā)明所用，“群體”包括提及包括同質(zhì)、基本上同質(zhì)或異質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的分離培養(yǎng)物。通常，“群體”也可以被認(rèn)為是“分離的”細(xì)胞培養(yǎng)物。受體酪氨酸激酶(“rtk”)是許多多肽生長因子、細(xì)胞因子和激素的高親和力細(xì)胞表面受體。rtk的人egf受體(“her”)家族調(diào)節(jié)多種生物過程，包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和存活。家族由四個(gè)成員her1(erbb1)、her2(neu或erbb2)、her3(erbb3)和her4(erbb4)組成。如本發(fā)明所用，“重組細(xì)胞”是包含重組多核苷酸的宿主細(xì)胞?！绊憫?yīng)率”或“抗her3應(yīng)答率”在本發(fā)明中可互換使用，意指響應(yīng)4種her3免疫原性肽中至少1種的受試者的百分比?！绊憫?yīng)庫”定義為每個(gè)受試者組識(shí)別的her3免疫原性肽的平均數(shù)(“n”)。如本發(fā)明所用的“樣品”或“生物樣品”是指來自受試者的生物材料，包括但不限于器官、組織、外來體、血液、血漿、唾液、尿液和其他體液。樣品可以是從受試者獲得的任何來源的材料。如本發(fā)明所用的“信號(hào)1”通常是指從激活的dc傳遞到t細(xì)胞的第一生化信號(hào)。信號(hào)1由在dc表面表達(dá)的抗原提供，并通過t細(xì)胞受體由t細(xì)胞感測(cè)。如本發(fā)明所用的“信號(hào)2”通常是指由dc提供到t細(xì)胞的第二信號(hào)。信號(hào)2由激活的dc上的“共刺激”分子提供，通常是cd80和/或cd86(雖然已知有其他共刺激分子)，并且通過表面受體cd28由t細(xì)胞感測(cè)。如本發(fā)明所用的“信號(hào)3”通常是指由激活的dc產(chǎn)生的可溶性蛋白質(zhì)(通常為細(xì)胞因子)產(chǎn)生的信號(hào)。這些信號(hào)通過t淋巴細(xì)胞上的受體來感測(cè)。第三個(gè)信號(hào)指示t細(xì)胞應(yīng)該獲得哪些表型或功能特征以最好地處理當(dāng)前的威脅。本發(fā)明所用的術(shù)語“特異性結(jié)合”是指分子，例如抗體識(shí)別并結(jié)合另一種分子或特征，但基本上不識(shí)別或結(jié)合樣品中的其他分子或特征。術(shù)語“受試者”、“患者”、“個(gè)體”等在本發(fā)明中可互換使用，并且指可適用于本發(fā)明所述方法的任何動(dòng)物或其無論是體外還是原位的細(xì)胞。在某些非限制性實(shí)施方案中，患者、受試者或個(gè)體是人。本發(fā)明使用的術(shù)語“靶向治療”是指使用藥物或其他物質(zhì)的癌癥治療，其干擾參與癌細(xì)胞生長的特定靶分子，但通常對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒有損害從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果。相比之下，傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性化療藥物作用于所有活躍分裂的細(xì)胞。在乳腺癌治療單克隆抗體中，特別是曲妥珠單抗/以her2/neu受體為靶向。本發(fā)明使用的術(shù)語“t細(xì)胞”定義為參與多種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的胸腺衍生的細(xì)胞。本發(fā)明關(guān)于細(xì)胞使用的術(shù)語“t輔助”指本領(lǐng)域技術(shù)人員可識(shí)別的包括不同細(xì)胞類型的淋巴細(xì)胞(白血細(xì)胞或白血球)的亞組。特別地，根據(jù)本發(fā)明公開的t輔助細(xì)胞包括效應(yīng)th細(xì)胞(例如th1、th2和th17)。這些th細(xì)胞分泌可刺激其他白細(xì)胞或與其他白細(xì)胞相互作用的細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明中關(guān)于細(xì)胞使用的術(shù)語“t輔助細(xì)胞”、“輔助t細(xì)胞”、“th細(xì)胞”等表示本領(lǐng)域技術(shù)人員可識(shí)別的包括不同細(xì)胞類型的淋巴細(xì)胞(白血細(xì)胞或白血球)的亞組。特別地，t輔助細(xì)胞是效應(yīng)t細(xì)胞，其主要功能是促進(jìn)其他b和t淋巴細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞的活化和功能。輔助t細(xì)胞分化為稱為“th1”或“1型”和“th2”或“2型”表型的兩種主要亞型。這些th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)或肽，該細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)或肽可刺激其他白細(xì)胞或與其他白細(xì)胞相互作用。如本發(fā)明所用的“th1細(xì)胞”、“cd4+th1細(xì)胞”、“cd4+t輔助1型細(xì)胞”、“cd4+t細(xì)胞”等是指表達(dá)表面糖蛋白cd4的成熟t細(xì)胞。當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞(“apc”)例如樹突狀細(xì)胞的表面上表達(dá)的mhcii類分子向cd4+t輔助細(xì)胞呈遞肽抗原時(shí)，cd4+t輔助細(xì)胞被激活。當(dāng)通過mhc-抗原復(fù)合物激活cd4+t輔助細(xì)胞時(shí)，其分泌高水平的細(xì)胞因子例如干擾素-γ(“ifn-γ”)。這樣的細(xì)胞對(duì)于存在于宿主細(xì)胞內(nèi)的某些引起疾病的微生物被認(rèn)為是高度有效的，并且對(duì)人類癌癥中對(duì)抗宿主細(xì)胞內(nèi)生活的某些致病微生物以及癌癥的抗腫瘤反應(yīng)是至關(guān)重要的。如本發(fā)明所用的“th17t細(xì)胞”是指產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子il-17和il-22并被認(rèn)為對(duì)于在粘膜表面上存活的致病微生物是高度有效的t細(xì)胞，。“治療有效量”是本發(fā)明化合物的量，其當(dāng)施用于患者時(shí)改善疾病的癥狀。構(gòu)成“治療有效量”的本發(fā)明化合物的量根據(jù)化合物、疾病狀態(tài)及其嚴(yán)重性、待治療患者的年齡等而變化。治療有效量可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員考慮到他自己的知識(shí)和本公開內(nèi)容來常規(guī)地確定。術(shù)語“治療”是指本發(fā)明所述的治療或預(yù)防措施。“治療”方法是對(duì)需要這種治療的受試者施用本發(fā)明的組合物，例如患有疾病或失調(diào)的受試者，或最終可能獲得這樣的疾病或失調(diào)的受試者，為了預(yù)防、治愈、延遲、降低嚴(yán)重性或改善失調(diào)或復(fù)發(fā)失調(diào)的一種或多種癥狀，或者為了延長受試者的存活使其超過在沒有這種治療的情況下預(yù)期的存活時(shí)間?！叭幮浴焙汀皌n”乳腺癌是指任何對(duì)雌激素受體(“er”)、孕酮受體(“pr”)和her2測(cè)試為陰性的乳腺癌細(xì)胞。本發(fā)明使用的術(shù)語“疫苗”定義為一種施用給動(dòng)物后引發(fā)免疫應(yīng)答的材料，其中動(dòng)物優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人類。在引入受試者后，疫苗能夠引發(fā)免疫應(yīng)答，包括但不限于抗體、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或其他細(xì)胞應(yīng)答。“變體”是指通過氨基酸的插入、缺失或保守取代，氨基酸序列發(fā)生變化但保留至少一種生物活性的肽或多肽。變體還可以指具有與參照蛋白質(zhì)基本相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，參照蛋白質(zhì)具有保留至少一種生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守取代，即用具有相似性質(zhì)(例如親水性，帶電區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸替換氨基酸在本領(lǐng)域中被認(rèn)為通常涉及微小的改變。這些微小的變化可以部分地通過考慮氨基酸的親水指數(shù)來鑒定，如本領(lǐng)域所理解的(kyte等,j.mol.biol.157:105-132(1982))。氨基酸的親水指數(shù)基于其疏水性和電荷的考慮。本領(lǐng)域已知，相似親水指數(shù)的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白質(zhì)功能。在一個(gè)方面，具有親水指數(shù)為±2的氨基酸被取代。氨基酸的親水性也可以用于揭示將導(dǎo)致蛋白質(zhì)保留生物學(xué)功能的取代?？紤]肽中的氨基酸的親水性，其允許計(jì)算該肽的最大局部平均親水性，美國專利us4,554,101已報(bào)道的有用量度與抗原性和免疫原性良好地相關(guān)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。具有相似親水性值的氨基酸的取代可導(dǎo)致肽保留生物活性，例如免疫原性，如本領(lǐng)域所知。可用親水性值彼此在±2內(nèi)的氨基酸進(jìn)行取代。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性值均受該氨基酸的特定側(cè)鏈的影響。與該觀察結(jié)果一致，與生物功能相符合的氨基酸取代被理解為取決于氨基酸的相對(duì)相似性，特別是那些氨基酸的側(cè)鏈，如通過疏水性、親水性、電荷、大小和其他性能所顯示的。范圍：貫穿本公開，本發(fā)明的各個(gè)方面可以用范圍形式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，范圍表格的描述僅僅是為了方便和簡潔，并且不應(yīng)被解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的不靈活限制。因此，范圍的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為已經(jīng)具體公開了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值。例如，對(duì)諸如1至6的范圍的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為已經(jīng)具體公開了子范圍，例如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及該范圍內(nèi)的單個(gè)數(shù)值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6，且無論被描述的范圍的寬度如何，這種解釋都適用。發(fā)明詳述本實(shí)施方式提供了包含her家族蛋白的肽以及其它受體酪氨酸激酶的免疫組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種或多種her-1、her-3和c-met蛋白中的分離的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可用于引發(fā)免疫應(yīng)答。包含本發(fā)明的肽的組合物可用作初始保護(hù)的預(yù)防性治療劑，以及可用作治療正在進(jìn)行的情況的治療劑。本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防癌癥的方法。這樣的方法包括向有需要的受試者施用本發(fā)明的肽或肽的組合的步驟。施用這種肽導(dǎo)致抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明提供了在受試者中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括向受試者施用本發(fā)明的肽或肽組合以及藥物組合物和由其衍生的細(xì)胞組合物的步驟。本發(fā)明包括在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)t細(xì)胞應(yīng)答的方法。該方法包括施用特異性誘導(dǎo)t細(xì)胞增殖的抗原呈遞細(xì)胞(apc)。在一個(gè)實(shí)施方案中，方法包括施用已采用本發(fā)明的肽脈沖過的樹突狀細(xì)胞疫苗，從而特異性誘導(dǎo)針對(duì)對(duì)應(yīng)于所述肽的抗原的t細(xì)胞增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的肽脈沖的apc可用于培養(yǎng)擴(kuò)增t細(xì)胞。使用apc擴(kuò)增t細(xì)胞，一旦獲得足夠數(shù)量的抗原特異性t細(xì)胞以，就將如此獲得的抗原特異性t細(xì)胞給予哺乳動(dòng)物，從而在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答。本發(fā)明包括激活的dc的制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，dc制劑的純度大于90％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，dc制劑被完全激活。例如，用dc激活方案激活dc，包括使dc與tlr激動(dòng)劑(例如lps)接觸進(jìn)行激活。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過鈣促動(dòng)治療與其它增強(qiáng)不同第三信號(hào)細(xì)胞因子的dc激活方案(例如激活劑)的結(jié)合使dc活化。本發(fā)明包括通過任何dc激活方案激活的成熟的、抗原負(fù)載的dc。本發(fā)明的dc產(chǎn)生所需水平的細(xì)胞因子和趨化因子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了脈沖和激活細(xì)胞的方法，由此細(xì)胞在冷凍保存后保持活性狀態(tài)。本發(fā)明的dc制劑的益處在于，來自于單次白細(xì)胞分離術(shù)(從患者收集)的細(xì)胞有效地冷凍保存為初始疫苗加上多個(gè)“加強(qiáng)”劑量(例如10個(gè)或更多)的形式，在沒有任何專門的細(xì)胞處理設(shè)施或進(jìn)一步要求的質(zhì)量控制測(cè)試的情況下，其可以根據(jù)需要在遠(yuǎn)程治療位置解凍。本發(fā)明還涉及這些激活的dc的冷凍保存，以保留了解凍后它們?cè)诔蔬f抗原中以及在各種細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生中的效力和功能的方式，使得冷凍保存和隨后解凍的激活的dc與新鮮收獲和激活的dc一樣具有臨床有效性。如本發(fā)明所預(yù)期的，本發(fā)明提供了一種用于產(chǎn)生和冷凍保存在產(chǎn)生對(duì)t細(xì)胞更強(qiáng)信號(hào)的方面具有優(yōu)異功能的dc的方法，并因此產(chǎn)生更有效的基于dc的疫苗。通過有效冷凍保存這樣的細(xì)胞，可以儲(chǔ)存和解凍樣品用于以后使用，從而減少在疫苗生產(chǎn)期間重復(fù)分離和淘析過程的需要。能夠冷凍dc，然后將其在后期解凍是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@意味著單輪疫苗生產(chǎn)可以分成小部分，冷凍離開，然后在數(shù)星期、數(shù)月、數(shù)年的療程內(nèi)一次一個(gè)地給予患者，以給予加強(qiáng)免疫的“加強(qiáng)”疫苗接種。本實(shí)施方案還包括采用her3表達(dá)作為胃食管結(jié)合部(也稱為barrett食管)的癌前病變中腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物的用途。該標(biāo)志物在浸潤性胃食管癌中具有預(yù)后和治療用途。組合物本發(fā)明提供了her家族蛋白質(zhì)的分離肽以及其它受體酪氨酸激酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了her-1、her-3和c-met蛋白中的一種或多種的分離肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽代表相應(yīng)的her或c-met蛋白的表位。在一些實(shí)施方案中，相應(yīng)的her或c-met蛋白的表位是免疫原性的。本發(fā)明提供了包含一種或多種本發(fā)明的肽的組合物。本發(fā)明還提供了包含一種或多種嵌合肽的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合肽包括相應(yīng)的her或c-met蛋白的一個(gè)或多個(gè)表位。另外，本發(fā)明提供了具有一種或多種多價(jià)肽的組合物。這些多價(jià)肽包括兩個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的表位。本發(fā)明包括使用本發(fā)明的組合物在受試者中刺激免疫應(yīng)答的方法和治療癌癥的方法，還提供了用于治療和預(yù)防用途的疫苗。本發(fā)明的表位能夠單獨(dú)地或如本文所述的包含在嵌合肽中引起免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是體液應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答是細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明的表位或肽提供保護(hù)作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的her-3表位或其它肽包括：p11-13(肽51-75):klyercevvmgnleivltghnadlsflqw(seqidno:1)；p81-83(肽401-425):swpphmhnfsvfsnlttiggrslyn(seqidno:2)；p84-86(肽416-440):ttiggrslynrgfsllimknlnvts(seqidno:3)；p12(肽56-70):cevvmgnleivltgh(seqidno:4)；p81(肽401-415):swpphmhnfsvfsnl(seqidno:5)；p84(肽416-430):ttiggrslynrgfsl(seqidno:6)；p91(肽451-465):agriyisanrqlcyh(seqidno:7)。本發(fā)明的her-3肽或任何肽可以是環(huán)化的或線性的。當(dāng)環(huán)化時(shí)，表位可以以任何合適的方式環(huán)化。例如，可以在選擇的半胱氨酸(cys)對(duì)之間形成二硫鍵，以提供期望的確認(rèn)。據(jù)信，環(huán)化表位的形成可以提供改善體液應(yīng)答的構(gòu)象，從而提高保護(hù)效果。由seqidno：4定義的her-3表位代表her-3蛋白的位置56-70。由seqidno：5定義的her-3表位代表her-3蛋白的位置401-415。由seqidno：6定義的her-3表位代表her-3蛋白的位置416-430。由seqidno：7定義的her-3表位代表her-3蛋白的位置451-465。如本發(fā)明所述，本發(fā)明的her-3表位還包括肽，其為由seqidnos定義的肽的功能等同物。這種功能等同物具有改變的序列，其中相應(yīng)的her-3表位序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代，或其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸從相應(yīng)的參考序列缺失或添加到相應(yīng)的參考序列。例如，可以向氨基末端、羧基末端或兩者添加1至3個(gè)氨基酸。在一些實(shí)例中，her-3表位是糖基化的。在其它實(shí)例中，her-3表位可以是her-3表位的逆向-反轉(zhuǎn)式異構(gòu)體。逆向-反轉(zhuǎn)修飾包括肽主鏈內(nèi)所有酰胺鍵的逆轉(zhuǎn)。這種逆轉(zhuǎn)可以通過逆轉(zhuǎn)序列的方向并通過使用d-氨基酸而不是l-氨基酸翻轉(zhuǎn)每個(gè)氨基酸殘基的手性來實(shí)現(xiàn)。這種逆向-反轉(zhuǎn)式異構(gòu)體形式可以保留至少一些肽鍵的平面性和構(gòu)象限制?？梢赃M(jìn)行非保守氨基酸取代和/或保守取代。當(dāng)取代的氨基酸與參考序列中的相應(yīng)氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)時(shí)，取代是保守的氨基酸取代。舉例來說，保守氨基酸取代包括用另一個(gè)取代一個(gè)脂肪族或疏水性氨基酸，例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；用另一個(gè)取代一個(gè)含羥基的氨基酸，例如絲氨酸和蘇氨酸；用另一個(gè)取代一個(gè)酸性殘基，例如谷氨酸或天冬氨酸；用另一個(gè)取代一個(gè)含酰胺殘基，例如天冬酰胺和谷氨酰胺；用另一個(gè)取代一個(gè)芳族殘基，例如苯丙氨酸和酪氨酸；用另一個(gè)取代一個(gè)堿性殘基，例如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和用另一個(gè)取代一個(gè)小氨基酸，例如丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸和甘氨酸。在一些實(shí)例中，缺失和添加位于本發(fā)明的肽的序列之一的氨基末端、羧基末端或兩者。例如，her-3表位等價(jià)物與相應(yīng)的her-3表位序列具有至少70％同一性，至少80％同一性，至少85％同一性，至少90％同一性，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性。每個(gè)參考序列的10個(gè)氨基酸至少90％相同的序列具有不超過1個(gè)改變，即任何缺失、添加或取代的組合。通過使用本領(lǐng)域已知或開發(fā)的程序?qū)⒆凅w的氨基酸序列與參考序列進(jìn)行比較來確定同一性百分比。功能等同物比相應(yīng)的her-3表位序列更長，功能等同物可以具有與野生型her-3蛋白中her-3表位序列和位于her-3表位序列側(cè)翼的序列至少90％相同的序列。her-3表位的功能等同物可以通過修飾表位的序列，然后測(cè)定所得多肽刺激免疫應(yīng)答的能力，例如抗體的產(chǎn)生來鑒定。這樣的抗體可以在多種體液包括血清和腹水中發(fā)現(xiàn)。簡而言之，從溫血?jiǎng)游?例如人)分離體液樣品，對(duì)于其需要確定是否存在對(duì)her-3多肽特異的抗體。在足以允許在多肽和蛋白質(zhì)特異性抗體之間形成免疫復(fù)合物的條件和時(shí)間下，將體液與her-3多肽培養(yǎng)，然后優(yōu)選使用elisa技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)本發(fā)明的其它實(shí)施方案，提供了嵌合肽和包含一個(gè)或多個(gè)嵌合肽的組合物。根據(jù)各種實(shí)施方案，嵌合肽包含her-3表位、另一表位以及將her-3表位與另一表位連接的接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，其它表位可以包括但不限于另一個(gè)her-3表位、her-1表位、her-2表位和c-met表位。還應(yīng)當(dāng)理解，可以使用任何合適的接頭。例如，根據(jù)所使用的表位，her-3表位可以連接到另一表位的氨基或羧基末端。其它表位的位置和選擇取決于her-3表位的結(jié)構(gòu)特征，無論是α螺旋或β轉(zhuǎn)角或鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭可以是長度為約2至約15個(gè)氨基酸，約2至約10個(gè)氨基酸或約2至約6個(gè)氨基酸的肽。嵌合肽可以是線性的或環(huán)化的。另外，her-3表位、其它表位和/或接頭可以是逆向-反轉(zhuǎn)形式。因此，her-3表位可以是逆向-反轉(zhuǎn)形式?；蛘?，her-3表位和其他表位可以是逆向-反轉(zhuǎn)形式。在另一個(gè)實(shí)例中，her-3表位、其他表位和接頭可以是逆向-反轉(zhuǎn)形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽可以以在混合物中的形式而不是嵌合肽的形式。在任何情況下，包含肽的本發(fā)明的組合物可以是用于脈沖抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突狀細(xì)胞)以產(chǎn)生細(xì)胞疫苗的有用試劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含肽的本發(fā)明的組合物可以是用于誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的有用的免疫原。本發(fā)明的組合物還可用于免疫受試者并延緩或預(yù)防腫瘤發(fā)展。本發(fā)明的組合物可以用于疫苗中以提供保護(hù)效果。根據(jù)本發(fā)明的另外實(shí)施方案，提供了包含兩種或更多種本發(fā)明的肽或嵌合肽的混合物的組合物。在一些實(shí)例中，兩種或更多種嵌合肽中的每一種的her-3表位是不同的。在其它實(shí)例中，her-3表位之一選自seqidnos：1-7。本發(fā)明的肽，包括嵌合肽，可以使用熟知的技術(shù)制備。例如，可以使用重組dna技術(shù)或化學(xué)合成，合成制備肽。本發(fā)明的肽可以單獨(dú)合成或作為由兩個(gè)或更多個(gè)肽組成的更長的多肽合成。本發(fā)明的肽優(yōu)選是分離的，即基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白及其片段。本發(fā)明的肽和嵌合肽可以使用市售的肽合成儀合成。例如，kaumaya等人在“denovo”engineeringofpeptideimmunogenicandantigenicdeterminantsaspotentialvaccines，inpeptides，design，synthesisandbiologicalactivity(1994)，第133-164頁”中描述的化學(xué)方法可以使用，其通過引用將其并入本文。例如，her-3表位可以與另一表位共線性合成以形成嵌合肽。肽合成可以使用fmoc/t-but化學(xué)進(jìn)行。肽和嵌合肽可以以任何合適的方式環(huán)化。例如，可以使用差異保護(hù)的半胱氨酸殘基、碘氧化、加水以促進(jìn)acm基團(tuán)的去除和伴隨形成二硫鍵和/或甲硅烷基氯-亞砜方法來獲得二硫鍵。肽和嵌合肽也可以使用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)和衍生自編碼表位或肽的dna構(gòu)建體的rna分子產(chǎn)生。或者，表位或嵌合肽通過用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，然后誘導(dǎo)多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)來制備，此表達(dá)載體包含編碼相應(yīng)表位或嵌合肽的dna序列。對(duì)于重組產(chǎn)生，通過常規(guī)方法將包含編碼表位、嵌合肽或其變體的一個(gè)或多個(gè)序列的重組構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞，所述常規(guī)方法例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、deae-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、顯微注射、陽離子脂質(zhì)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、刮擦、彈道引入或感染。本發(fā)明的肽可以含有修飾，例如糖基化、側(cè)鏈氧化或磷酸化；只要所述修飾不破壞肽的生物活性即可。其它修飾包括摻入d-氨基酸或其他可用于例如增加肽的血清半衰期的氨基酸模擬物。本發(fā)明的肽可以作為組合制備，其包括兩種或更多種本發(fā)明的肽，用作用于疾病的疫苗，例如，癌癥。肽可以在混合物中或可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)彼此綴合。例如，肽可以單個(gè)多肽序列進(jìn)行表達(dá)。組合中的肽可以相同或不同。本發(fā)明還應(yīng)當(dāng)解釋為包括本發(fā)明的肽(或編碼其的dna)的“突變體”、“衍生物”和“變體”，其中突變體、衍生物和變體是在一個(gè)或多個(gè)更多的氨基酸(或當(dāng)提及編碼其的核苷酸序列時(shí)，在一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)中改變)中改變的肽，使得所得的肽(或dna)與本文所述的序列不同，但具有與本文公開的肽具有相同的生物學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明還提供編碼至少一種肽的多核苷酸，所述肽選自具有seqidnos：1-7中任一個(gè)或多個(gè)序列的肽。核酸序列包括轉(zhuǎn)錄成rna的dna序列和翻譯成肽的rna序列。根據(jù)其它實(shí)施方案，本發(fā)明的多核苷酸是從本發(fā)明的肽的氨基酸序列推斷的。如本領(lǐng)域已知的，由于冗余密碼子，幾個(gè)替代的多核苷酸是可能的，同時(shí)保留翻譯肽的生物活性。此外，本發(fā)明包括分離的核酸，此核酸編碼與本發(fā)明公開的肽具有基本同源性的肽。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明的肽的分離的核酸的核苷酸序列是“基本上同源的”，即約60％同源，更優(yōu)選約70％同源，甚至更優(yōu)選約80％同源，更優(yōu)選約90％同源，甚至更優(yōu)選約95％同源，甚至更優(yōu)選約99％同源于編碼本發(fā)明的肽的分離的核酸的核苷酸序列。應(yīng)當(dāng)清楚地理解，本發(fā)明的范圍包括同源物、類似物、變體、衍生物和鹽，包括更短和更長的肽和多核苷酸，以及具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核酸取代的肽和多核苷酸類似物，以及本領(lǐng)域已知的氨基酸或核酸衍生物、非天然氨基或核酸和合成氨基或核酸，規(guī)定這些修飾必須保持原始分子的生物學(xué)活性。具體地，根據(jù)本發(fā)明的原理公開了活性肽的任何活性片段以及延伸物、綴合物和混合物。本發(fā)明應(yīng)解釋為包括與本發(fā)明所述和所參考的核酸同源的任何和所有分離的核酸，只要這些同源dna具有本發(fā)明公開的肽的生物活性即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的核酸包括編碼本發(fā)明的肽及其任何修飾形式的rna或dna序列，包括dna或rna的化學(xué)修飾，其使得核苷酸序列在其不含細(xì)胞或當(dāng)其與細(xì)胞相關(guān)時(shí)更穩(wěn)定。核苷酸的化學(xué)修飾也可以用于增強(qiáng)核苷酸序列被細(xì)胞吸收的效率或其在細(xì)胞中表達(dá)的效率。本發(fā)明涵蓋核苷酸序列的任何和所有修飾組合。進(jìn)一步，任何數(shù)量的程序可以用于使用本領(lǐng)域公知的重組dna方法產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)的突變體、衍生物或變體形式，如于sambrook和russell(同上)，和ausubel等人描述的方法。通過改變編碼多肽的dna序列，在肽或多肽中引入氨基酸變化的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在這些地方、其他地方和論文中也詳細(xì)描述。編碼本發(fā)明的肽的核酸可以摻入合適的載體中，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些載體在本領(lǐng)域是公知的。含有它們的核酸或載體可有效地轉(zhuǎn)移到所需細(xì)胞中，該細(xì)胞優(yōu)選來自患者。有利地，本發(fā)明提供了一種現(xiàn)成的組合物，其允許快速修改患者自身的細(xì)胞(或另一種哺乳動(dòng)物的細(xì)胞)以快速和容易地產(chǎn)生具有優(yōu)異的癌細(xì)胞殺傷性質(zhì)的修飾細(xì)胞。載體在其它相關(guān)方面，本發(fā)明包括編碼一種或多種具有選自seqidnos：1-7組成的組中的序列的肽的分離核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括編碼一種或多種本發(fā)明的肽的核酸序列，其可操作地連接至包含啟動(dòng)子/調(diào)節(jié)序列的核酸，使得核酸優(yōu)選能夠指導(dǎo)核酸編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。因此，本發(fā)明包括用于將外源dna引入細(xì)胞中并伴隨外源dna在細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體和方法，例如sambrook等人(2012,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,newyork)，ausubel等人(1997,currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork)所述。將期望的多核苷酸摻入載體中以及載體的選擇是本領(lǐng)域公知的，如sambrook等人(同上)和ausubel等人(同上)所述?？梢詫⒍嗪塑账峥寺〉蕉喾N類型的載體中。然而，本發(fā)明不應(yīng)被解釋為限于任何特定載體。相反，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)解釋為包括本領(lǐng)域中容易獲得和/或公知的大量載體。例如，本發(fā)明的多核苷酸可以克隆到載體中，載體包括但不限于質(zhì)粒、噬菌粒、噬菌體衍生物、動(dòng)物病毒和粘粒。特別感興趣的載體包括表達(dá)載體、復(fù)制載體、探針產(chǎn)生載體和測(cè)序載體。在具體實(shí)施方案中，表達(dá)載體選自病毒載體、細(xì)菌載體和哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體。存在許多包含至少部分或全部上述組合物的表達(dá)載體系統(tǒng)。基于原核和/或真核生物載體的系統(tǒng)可以用于本發(fā)明以產(chǎn)生多核苷酸或其同源多肽。許多這樣的系統(tǒng)在商業(yè)上可廣泛獲得。進(jìn)一步，表達(dá)載體可以以病毒載體的形式向細(xì)胞提供。病毒載體技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且如sambrook等人(2012)和在ausubel等人(1997)以及其他病毒學(xué)和分子生物學(xué)手冊(cè)所述?？捎米鬏d體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體含有在至少一種生物體中有功能的復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、方便的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)和一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記(參見wo01/96584，wo01/29058和美國專利號(hào)6,326,193)。為了表達(dá)本發(fā)明的所需核苷酸序列，每個(gè)啟動(dòng)子中的至少一個(gè)模塊用于定位rna合成的起始位點(diǎn)。其最熟知的實(shí)例是tata盒，但是在缺少tata盒的一些啟動(dòng)子中，例如哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子和sv40基因的啟動(dòng)子，覆蓋起始位點(diǎn)本身的離散元件有助于固定起始位置。另外的啟動(dòng)子元件，即增強(qiáng)子，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。通常，這些啟動(dòng)子元件位于起始位點(diǎn)上游30-110bp的區(qū)域，盡管最近已經(jīng)顯示許多啟動(dòng)子也包含起始位點(diǎn)下游的功能元件。啟動(dòng)子元件之間的間隔通常是柔性的，使得當(dāng)元件相對(duì)于彼此反轉(zhuǎn)或移動(dòng)時(shí)可保持啟動(dòng)子功能。在胸苷激酶啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子元件之間的間隔可以在活性開始下降之前增加至50bp。根據(jù)啟動(dòng)子，可以看出個(gè)別元件可以協(xié)同地或獨(dú)立地起作用以激活轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子可以是與基因或多核苷酸序列天然相關(guān)的啟動(dòng)子，如通過分離位于編碼區(qū)段和/或外顯子上游的5'非編碼序列可以獲得的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以稱為“內(nèi)源的”。類似地，增強(qiáng)子可以是與位于該序列下游或上游的多核苷酸序列天然相關(guān)的增強(qiáng)子?；蛘?，通過將編碼多核苷酸片段置于重組或異源啟動(dòng)子的控制下獲得某些優(yōu)點(diǎn)，所述啟動(dòng)子是指在其天然環(huán)境中通常不與多核苷酸序列相關(guān)的啟動(dòng)子。重組或異源增強(qiáng)子還指在其天然環(huán)境中通常不與多核苷酸序列結(jié)合的增強(qiáng)子。此類啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可以包括其他基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，以及從任何其他原核、病毒或真核細(xì)胞分離的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，以及非“天然存在的”啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，即含有不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的不同元件，和/或改變表達(dá)的突變。除了合成產(chǎn)生啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的核酸序列外，可以使用重組克隆和/或核酸擴(kuò)增技術(shù)(包括pcrtm)，并結(jié)合本發(fā)明公開的組合物(美國專利4,683,202，美國專利5,928,906)產(chǎn)生序列。此外，還可以預(yù)見也可以使用控制序列，此控制序列刻指導(dǎo)序列在非核細(xì)胞器如線粒體、葉綠體等中轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。自然地，重要的是采用啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子有效地指導(dǎo)細(xì)胞類型、細(xì)胞器和生物體中的dna區(qū)段的表達(dá)。分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知道如何使用啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和細(xì)胞類型組合用于蛋白質(zhì)表達(dá)，例如參見sambrook等(2012)。所使用的啟動(dòng)子可以是組成型、組織特異性、誘導(dǎo)型和/或在適當(dāng)條件下用于指導(dǎo)引入的dna區(qū)段的高水平表達(dá)是有用，例如有利于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白和/或肽。啟動(dòng)子可以是異源或內(nèi)源的。本發(fā)明提供的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中示例的啟動(dòng)子序列是立即早期巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子序列。該啟動(dòng)子序列是強(qiáng)組成型啟動(dòng)子序列，其能夠驅(qū)動(dòng)與其可操作地連接的任何多核苷酸序列的高水平表達(dá)。然而，也可以使用其它組成型啟動(dòng)子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)長末端重復(fù)序列(ltr)啟動(dòng)子、moloney病毒啟動(dòng)子、禽白血病病毒啟動(dòng)子、eb病毒立即早期啟動(dòng)子、rous肉瘤病毒啟動(dòng)子，以及人基因啟動(dòng)子，例如但不限于肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、肌球蛋白啟動(dòng)子、血紅蛋白啟動(dòng)子和肌肉肌酸啟動(dòng)子。此外，本發(fā)明不應(yīng)限于使用組成型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。在本發(fā)明中使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子提供了能夠啟動(dòng)多核苷酸序列表達(dá)的分子開關(guān)，當(dāng)期望這種表達(dá)時(shí)，它可操作地連接，或者當(dāng)不需要表達(dá)時(shí)關(guān)閉表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于金屬硫蛋白啟動(dòng)子、糖皮質(zhì)激素啟動(dòng)子、孕酮啟動(dòng)子和四環(huán)素啟動(dòng)子。此外，本發(fā)明包括組織特異性啟動(dòng)子的使用，該啟動(dòng)子僅在所需組織中有活性。為了評(píng)估編碼本發(fā)明的肽的核苷酸序列的表達(dá)，待導(dǎo)入細(xì)胞中的表達(dá)載體還可以含有選擇性標(biāo)記基因或報(bào)告基因或兩者，以便于從試圖通過病毒載體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞群體中鑒定和選擇表達(dá)細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，可選擇標(biāo)記可以攜帶在單獨(dú)的dna片段上并用于共轉(zhuǎn)染程序。選擇標(biāo)記和報(bào)告基因兩者可以與調(diào)節(jié)序列適當(dāng)側(cè)接，以使得能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。有用的可選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。報(bào)告基因用于鑒定潛在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和用于評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)序列的功能。編碼易于測(cè)定的蛋白質(zhì)的報(bào)道基因是本領(lǐng)域熟知的。通常，報(bào)道基因是不存在于受體生物體或組織中或由受體生物體或組織表達(dá)的基因，并且編碼蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)的表達(dá)通過一些容易檢測(cè)的性質(zhì)(例如酶活性)表現(xiàn)。報(bào)道基因的表達(dá)是在將dna引入受體細(xì)胞后的合適時(shí)間測(cè)定的。合適的報(bào)道基因可以包括編碼熒光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌的堿性磷酸酶或綠色熒光蛋白基因的基因(參見例如ui-tei等人，2000febslett.479：79-82)。合適的表達(dá)系統(tǒng)是公知的，并且可以使用熟知的技術(shù)制備或商業(yè)獲得。內(nèi)部缺失構(gòu)建體可以使用獨(dú)特的內(nèi)部限制性位點(diǎn)或通過非唯一性限制性位點(diǎn)的部分消化產(chǎn)生。然后可將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到顯示高水平的sirna多核苷酸和/或多肽表達(dá)的細(xì)胞中。通常，具有最小5'側(cè)翼區(qū)的構(gòu)建體被鑒定為啟動(dòng)子，此最小5'側(cè)翼區(qū)顯示報(bào)道基因的最高水平表達(dá)。這樣的啟動(dòng)子區(qū)域可以連接到報(bào)告基因并用于評(píng)估調(diào)節(jié)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄能力的試劑。疫苗在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的肽的疫苗。本發(fā)明的疫苗可以提供特定肽的任何組合，所述特定肽是用于特定預(yù)防或治療需要治療的受試者中的癌癥的。本發(fā)明的疫苗可以誘導(dǎo)抗原特異性t細(xì)胞和/或高滴度抗體應(yīng)答，從而誘導(dǎo)或引發(fā)針對(duì)表達(dá)抗原的癌癥或腫瘤的或?qū)Ρ磉_(dá)抗原的癌癥或腫瘤反應(yīng)的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)或引發(fā)的免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞、體液或細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)或引起的細(xì)胞免疫應(yīng)答可以包括干擾素-γ(ifn-γ)和/或腫瘤壞死因子α(tnf-α)的誘導(dǎo)或分泌。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗癌疫苗。疫苗可以包含一種或多種癌抗原。該疫苗可以預(yù)防腫瘤生長。該疫苗可以減少腫瘤生長。該疫苗可以預(yù)防腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。取決于癌抗原，疫苗可以靶向治療乳腺癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、血癌、頭頸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、復(fù)發(fā)性呼吸道乳頭狀瘤、肛門癌、子宮頸癌、腦癌等。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，疫苗可以通過誘導(dǎo)來介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的清除或阻止生長，誘導(dǎo)方式包括：(1)體液免疫通過b細(xì)胞應(yīng)答產(chǎn)生所需的抗體；(2)增加細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞如cd8+(ctl)以攻擊和殺死腫瘤細(xì)胞；(3)增加t輔助細(xì)胞應(yīng)答；(4)并通過ifn-γ和tfn-α或優(yōu)選所有上述物質(zhì)增加炎癥反應(yīng)。疫苗可以使無腫瘤存活增加30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％44％和45％。疫苗可以在免疫后將腫瘤質(zhì)量減少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％。與未施用疫苗的受試者中的細(xì)胞免疫應(yīng)答相比，疫苗可以在施用疫苗的受試者中增加細(xì)胞免疫應(yīng)答約50倍至約6000倍，約50倍至約5500倍，約50倍至約5000倍，約50倍約100倍至約6000倍，約150倍至約6000倍，約200倍至約6000倍，約250倍至約6000倍或約300倍至約6000倍。在一些實(shí)施方案中，與未施用疫苗的受試者中的細(xì)胞免疫應(yīng)答相比，疫苗可以在施用疫苗的受試者中增加細(xì)胞免疫應(yīng)答約50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。與未施用疫苗的受試者中的ifn-γ水平相比，疫苗可以在施用疫苗的受試者中增加干擾素γ(ifn-γ)水平約50倍至約6000倍、約50倍至約5500倍、約50倍至約5000倍、約50倍至約4500倍、約100倍至約6000倍、約150倍至約6000倍、約200倍至約6000倍、約250倍至約6000倍或約300倍至約6000倍。在一些實(shí)施方案中，與未施用疫苗的受試者中的ifn-γ水平相比，疫苗可以使施用疫苗的受試者的ifn-γ水平增加約50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍、600倍、650倍、700倍、750倍、800倍、850倍、900倍、950倍、1000倍、1100倍、1200倍、1300倍、1400倍、1500倍、1600倍、1700倍、1800倍、1900倍、2000倍、2100倍、2200倍、2300倍、2400倍、2500倍、2600倍、2700倍、2800倍、2900倍、3000倍、3100倍、3200倍、3300倍、3400倍、3500倍、3600倍、3700倍、3800倍、3900倍、4000倍、4100倍、4200倍、4300倍、4400倍、4500倍、4600倍、4700倍、4800倍、4900倍、5000倍、5100倍、5200倍、5300倍、5400倍、5500倍、5600倍、5700倍、5800倍、5900倍或6000倍。本發(fā)明的疫苗可以具有有效疫苗所需的特征，例如安全，使得疫苗本身不引起疾病或死亡；防止疾?。徽T導(dǎo)中和抗體；誘導(dǎo)保護(hù)性t細(xì)胞應(yīng)答；并易于給藥、副作用少、生物穩(wěn)定性高和每劑量的成本低。疫苗可以通過含有如下討論的癌抗原來實(shí)現(xiàn)這些特征中的一些或全部。負(fù)載(脈沖)免疫細(xì)胞的產(chǎn)生本發(fā)明包括已經(jīng)暴露于抗原或本發(fā)明的肽的、或用抗原或本發(fā)明的肽“脈沖”的細(xì)胞。例如，apc(例如dc)可以在體外加載ag，例如通過在抗原存在下離體培養(yǎng)，或通過暴露于抗原體內(nèi)培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將容易理解apc可以通過將apc暴露于抗原一段時(shí)間的方式被“脈沖化”，該時(shí)間足以促進(jìn)該抗原在apc表面上呈遞。例如，apc可以暴露于被稱為抗原肽的小肽片段形式的抗原，其直接“脈沖”至apc的外部(mehta-damani等人，1994)；或apc可以與完全蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)顆粒培養(yǎng)，然后通過apc攝取。這些整個(gè)蛋白被apc消化成小的肽片段，并最終攜帶并呈遞在apc表面上(cohen等人，1994)。肽形式的抗原可通過本發(fā)明所述的標(biāo)準(zhǔn)“脈沖”技術(shù)暴露于細(xì)胞。不希望受任何特定理論的束縛，外源或自身抗原形式的抗原由本發(fā)明的apc加工以保留抗原的免疫原性形式。抗原的免疫原性形式意味著通過片段化處理抗原以產(chǎn)生可被免疫細(xì)胞(例如t細(xì)胞)識(shí)別并刺激免疫細(xì)胞的抗原形式。優(yōu)選地，這種外源或自身抗原是通過apc加工成肽的蛋白質(zhì)。由apc產(chǎn)生的相關(guān)肽可以被提取和純化以用作免疫原性組合物。由apc處理的肽也可用于誘導(dǎo)對(duì)由apc處理的蛋白質(zhì)耐受性。負(fù)載抗原的apc，或者稱為本發(fā)明的“脈沖apc”，是通過在體外或體內(nèi)將apc暴露于抗原產(chǎn)生的。在apc在體外脈沖的情況下，可以將apc鋪在培養(yǎng)皿上，并以足夠的量和足夠的時(shí)間暴露于抗原，以允許抗原結(jié)合apc。實(shí)現(xiàn)抗原與apc結(jié)合所需的量和時(shí)間可以通過使用本領(lǐng)域已知的或本文另外公開的方法來確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法，例如免疫測(cè)定或結(jié)合測(cè)定，可用于暴露于抗原后檢測(cè)apc上抗原的存在。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，apc可以用載體轉(zhuǎn)染，此載體允許apc表達(dá)特異性蛋白質(zhì)。然后可以將由apc表達(dá)的蛋白質(zhì)加工并呈遞在細(xì)胞表面上。然后可以將轉(zhuǎn)染的apc用作免疫原性組合物，以產(chǎn)生對(duì)由載體編碼的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。如本文其他地方所討論的，可以制備載體以包括特定多核苷酸，此特定多核苷酸編碼和表達(dá)需要免疫原性應(yīng)答的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染細(xì)胞。更優(yōu)選地，使用腺病毒載體用于感染細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以通過修飾病毒載體以編碼被apc上的受體識(shí)別的蛋白質(zhì)或其部分來靶向apc，由此載體對(duì)apc受體的占據(jù)將啟動(dòng)載體的內(nèi)吞作用，允許加工和呈遞由病毒載體的核酸編碼的抗原。由病毒遞送的核酸可以原產(chǎn)于病毒，當(dāng)在apc上表達(dá)時(shí)，其編碼病毒蛋白，然后將其加工并呈遞在apc的mhc受體上。如本發(fā)明所預(yù)期的，多種方法可用于將多核苷酸轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中。方法包括但不限于磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔、膠體分散系統(tǒng)(即大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體)。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且在公開的文獻(xiàn)中描述，以使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠執(zhí)行這些方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼抗原的多核苷酸可以克隆到表達(dá)載體中，并且可以將載體引入apc中，否則產(chǎn)生負(fù)載的apc。將各種類型的載體和將核酸引入細(xì)胞的方法在可獲得的公開文獻(xiàn)中進(jìn)行了討論。例如，表達(dá)載體可以通過物理、化學(xué)或生物手段轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。參見，例如，sambrook等(2012，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，newyork)和ausubel等(1997，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork)。引入包含編碼抗原的多核苷酸的表達(dá)載體產(chǎn)生脈沖細(xì)胞是容易理解的。本發(fā)明包括用于脈沖apc的各種方法，包括但不限于用蛋白質(zhì)、cdna或mrna形式的完整抗原來負(fù)載apc。然而，本發(fā)明不應(yīng)被解釋為限于用于脈沖apc的抗原的特定形式。相反，本發(fā)明包括本領(lǐng)域已知的用于產(chǎn)生負(fù)載抗原的apc的其它方法。優(yōu)選地，用編碼限定的抗原的mrna轉(zhuǎn)染apc?？梢允褂煤线m的引物和與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)偶聯(lián)的逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)在體外快速產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于其序列已知的基因產(chǎn)物的mrna。用mrna轉(zhuǎn)染apc提供了優(yōu)于用于產(chǎn)生脈沖apc的其它抗原負(fù)載技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。例如，從微量組織(即腫瘤組織)擴(kuò)增rna的能力將apc的使用擴(kuò)展到大量患者的疫苗接種中。對(duì)于可用作疫苗的抗原組合物，抗原組合物必須在細(xì)胞、組織或哺乳動(dòng)物(例如人)中誘導(dǎo)針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。如本發(fā)明所用，“免疫組合物”可包含抗原(例如肽或多肽)、編碼抗原(例如抗原表達(dá)載體)的核酸或表達(dá)或呈遞抗原或細(xì)胞組分的細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，抗原組合物包含或編碼本發(fā)明所述的任何抗原的全部或部分或其免疫功能等價(jià)物。在其它實(shí)施方案中，抗原組合物處于包含另外的免疫刺激劑或編碼此類試劑的核酸的混合物中。免疫刺激劑包括但不限于額外的抗原、免疫調(diào)節(jié)劑、抗原呈遞細(xì)胞或佐劑。在其它實(shí)施方案中，一種或多種另外的試劑以任何組合與抗原或免疫刺激劑共價(jià)鍵合。在某些實(shí)施方案中，抗原組合物綴合至或包含hla錨定基序氨基酸。如本發(fā)明所預(yù)期的，疫苗可以在其核酸和/或細(xì)胞組分的組成方面不同。在非限制性實(shí)例中，編碼抗原的核酸也可以與佐劑一起配制。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明所述的各種組合物可以進(jìn)一步包含另外的組分。例如，一種或多種疫苗組分可以包含在脂質(zhì)或脂質(zhì)體中。在另一個(gè)非限制性實(shí)例中，疫苗可包含一種或多種佐劑。根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本發(fā)明的疫苗及其各種組分可以通過本文公開的或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法制備和/或施用。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的抗原組合物可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備，包括但不限于通過固相合成和通過hplc從化學(xué)反應(yīng)的其它產(chǎn)物中純化的化學(xué)合成，或通過在體外翻譯系統(tǒng)或活細(xì)胞中表達(dá)編碼包含本發(fā)明抗原的肽或多肽的核酸序列(例如dna序列)而產(chǎn)生。另外，抗原組合物可以包含從生物樣品中分離的細(xì)胞組分。將抗原組合物分離并廣泛透析以除去一種或多種不希望的小分子量分子和/或凍干以更容易地配制成所需載體。還應(yīng)當(dāng)理解，在疫苗組分中制備的其它氨基酸、突變、化學(xué)修飾等(如果有的話)優(yōu)選基本上不干擾抗原識(shí)別表位序列。抗原呈遞細(xì)胞治療本發(fā)明包括產(chǎn)生在其表面上呈遞本發(fā)明肽的apc群體(例如樹突狀細(xì)胞；dc)的方法，其可隨后用于治療。這種方法可以在已經(jīng)從患者獲得的細(xì)胞樣品上離體進(jìn)行。因此，以這種方式產(chǎn)生的apc可制備用于治療或預(yù)防癌癥的藥劑。細(xì)胞應(yīng)該被個(gè)體的免疫系統(tǒng)接受，因?yàn)樗鼈儊碜栽搨€(gè)體。將以這種方式產(chǎn)生的細(xì)胞遞送至它們最初從其獲得的個(gè)體，從而形成本發(fā)明的治療實(shí)施方案。dcs源自用作抗原呈遞細(xì)胞(apc)的多能性單核細(xì)胞。dcs在外周組織中是普遍存在的，其中它們被制備以捕獲抗原。在抗原捕獲后，dcs將抗原加工成小肽并移向次級(jí)淋巴器官。在淋巴器官內(nèi)，dcs向天然t細(xì)胞呈遞抗原肽，從而引發(fā)極化t細(xì)胞分化的信號(hào)級(jí)聯(lián)。暴露后，dcs存在與mhci類或ii類結(jié)合肽結(jié)合的抗原分子，并激活cd8+或cd4+t細(xì)胞(steinman，1991，annu.rev.immunol.9：271-296；banchereau等，1998，nature392,245-252；steinman，等,2007，nature449：419-426；ginhoux等，2007，j.exp.med.204：3133-3146；banerjee等，2006，blood108：2655-2661；sallusto等，1999，j.exp.med.189：611-614；reid等，2000，curr.opin.immunol.12：114-121；bykovskaia等，1999，j.leukoc.biol.66：659-666；clark等，2000，microbesinfect.2：257-272)。dcs負(fù)責(zé)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)、協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)，并且還用于協(xié)調(diào)先天方式的效應(yīng)器和免疫系統(tǒng)的適應(yīng)方式之間的通信。這些特征使得dcs成為免疫治療的強(qiáng)有力的候選者。dcs具有通過巨噬細(xì)胞增多和受體介導(dǎo)的胞吞作用對(duì)環(huán)境進(jìn)行取樣的獨(dú)特能力(gerner等，2008,j.immunol.181:155–164；stoitzner等，2008,cancerimmunol.immunother57:1665-1673；lanzevecchiaa.,1996,curr.opin.immunol.8:348-354；delamarre等，2005,science,307(5715):1630-1634)。dcs還需要成熟信號(hào)以增強(qiáng)其抗原呈遞能力。dcs通過提供額外的成熟信號(hào)例如tnf-α、cd40l或鈣信號(hào)傳導(dǎo)劑來上調(diào)表面分子(例如cd80和cd86(也稱為第二信號(hào)分子))的表達(dá)(czerniecki等，1997,.j.immunol.159:3823-3837；bedrosian等，2000,j.immunother.23:311-320；mailliard等，2004,cancerres.64,5934-5937；brossart等，1998,blood92:4238-4247；jin等，2004,hum.immunol.65:93-103)。已經(jīng)確定包括tnf-α、il-1β、il-6和前列腺素e2(pge2)的細(xì)胞因子的混合物具有使dcs成熟的能力(jonuleit等，2000,arch.derm.res.292:325-332)。dc還可以在用抗原脈沖前用鈣離子載體成熟。除了病原體識(shí)別受體，如pkr和mda-5(kalali等，2008,j.immunol.181:2694-2704；nallagatla等，2008,rnabiol.5(3):140-144)，dcs還含有一系列受體，稱為toll樣受體(tlr)，其也能夠感測(cè)來自病原體的危險(xiǎn)。當(dāng)這些tlr被觸發(fā)時(shí)，在dcs中誘導(dǎo)一系列激活變化，這導(dǎo)致t細(xì)胞的成熟和信號(hào)傳導(dǎo)((boullart等，2008,cancerimmunol.immunother.57(11):1589-1597；kaisho等，2003,curr.mol.med.3(4):373-385；pulendran等，2001,science293(5528):253-256；napolitani等，2005,nat.immunol.6(8):769-776)。dc可以激活和延長細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的各種臂，例如自然殺傷γ-δt細(xì)胞和α-βt細(xì)胞，并且一旦激活，dcs保持其免疫能力(steinman,1991,annu.rev.immunol.9:271-296；banchereau等，1998,nature392:245-252；reid等，2000,curr.opin.immunol.12:114-121；bykovskaia等，1999,j.leukoc.biol.66:659-666；clark等，2000,microbesinfect.2:257-272)。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的一種或多種肽誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞(apc)的方法。apc可以通過誘導(dǎo)來自外周血單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞，然后在體外/離體或體內(nèi)與本發(fā)明的一種或多種肽接觸(刺激)來誘導(dǎo)。當(dāng)將本發(fā)明的肽施用于有需要的哺乳動(dòng)物時(shí)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)具有本發(fā)明的肽的apc，此肽固定于apc上?；蛘?，在將本發(fā)明的肽固定到apc后，可以將細(xì)胞作為疫苗施用給受試者。例如，離體施用可以包括以下步驟：從哺乳動(dòng)物收集apc，并使apc與本發(fā)明的肽接觸。本發(fā)明還提供apc，其呈遞hla抗原與本發(fā)明的一種或多種肽之間形成的復(fù)合物。通過與本發(fā)明的肽或編碼此類肽的核苷酸接觸獲得的apc優(yōu)選來源于作為治療和/或預(yù)防的目標(biāo)的受試者，并且可以作為疫苗單獨(dú)或與其他藥物組合施用，其他藥物包括本發(fā)明的肽、外來體或t細(xì)胞。本發(fā)明提供了在上下文中的免疫治療下刺激apc(優(yōu)選dcs)以刺激哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答的組合物和方法。dcs可以通過用本發(fā)明的肽或肽的組合刺激它們被操縱，并使dcs成熟，以便它們?cè)谟行枰牟溉閯?dòng)物中刺激抗腫瘤免疫。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)t細(xì)胞應(yīng)答的方法。所述方法包括施用apc，例如dc，其中所述apc通過使apc與本發(fā)明的肽或肽組合接觸被激活，從而產(chǎn)生負(fù)載肽的apc。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及所產(chǎn)生的新的apc及其用于尤其擴(kuò)增所需t細(xì)胞、激活t細(xì)胞、擴(kuò)增特異性t細(xì)胞以及涉及與使用本發(fā)明的肽負(fù)載apc和肽的t細(xì)胞的擴(kuò)增和刺激相關(guān)的許多治療用途。在一些情況下，oct4刺激的dcs可以用于擴(kuò)展肽特異性t細(xì)胞。本發(fā)明涉及一種發(fā)現(xiàn)，其為與本發(fā)明的肽或肽組合接觸的dc可用于誘導(dǎo)肽特異性t細(xì)胞的擴(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到與本發(fā)明的肽接觸的dcs被認(rèn)為是引發(fā)或負(fù)載肽的。本發(fā)明負(fù)載肽的dcs可用于引發(fā)針對(duì)所需抗原(例如her-3)的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明負(fù)載肽的dcs可用于治療與her-3的失調(diào)表達(dá)相關(guān)的疾病。治療疾病的方法本發(fā)明還包括治療和/或預(yù)防由病原微生物、自身免疫失調(diào)和/或過度增殖性疾病引起的疾病的方法?？梢酝ㄟ^使用本發(fā)明治療或預(yù)防的疾病包括由病毒、細(xì)菌、酵母、寄生蟲、原生動(dòng)物、癌細(xì)胞等引起的疾病。本發(fā)明的藥物組合物可以用作廣義免疫增強(qiáng)劑(dc激活組合物或系統(tǒng))，因此可用于治療疾病。可以使用本發(fā)明的藥物組合物治療和/或預(yù)防的示例性疾病包括但不限于病毒病原學(xué)的感染，例如hiv、流感、皰疹、病毒性肝炎、eb病毒、脊髓灰質(zhì)炎、病毒性腦炎、麻疹、水痘、乳頭瘤病毒等；或細(xì)菌病原學(xué)感染，如肺炎、結(jié)核病、梅毒等；或寄生蟲病原學(xué)的感染，例如瘧疾、錐蟲病、利什曼病、滴蟲病、阿米巴病等?？梢允褂帽景l(fā)明的藥物組合物(轉(zhuǎn)導(dǎo)的dc、表達(dá)載體、表達(dá)構(gòu)建體等)治療或預(yù)防的癌前或增生狀態(tài)，包括但不限于例如結(jié)腸息肉、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、乳腺病變等癌前或增生狀態(tài)。可以使用本發(fā)明的組合物治療的本發(fā)明的癌癥，包括但不限于原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗狀細(xì)胞癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、胃腸癌、腦癌、膀胱癌、子宮頸癌等。可以使用本發(fā)明的dc激活系統(tǒng)治療的其它過度增殖性疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、骨關(guān)節(jié)炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纖維瘤、血管閉塞、再狹窄、動(dòng)脈粥樣硬化、癌前病變(例如腺瘤性增生和前列腺上皮內(nèi)瘤變)、原位癌、口腔毛狀白斑或牛皮癬。可以使用本發(fā)明的組合物治療的自身免疫性失調(diào)包括但不限于aids、阿狄森氏病、成人呼吸窘迫綜合征、過敏、貧血、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、支氣管炎、膽囊炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、特應(yīng)性皮炎、皮肌炎、糖尿病、肺氣腫、結(jié)節(jié)性紅斑、萎縮性胃炎、腎小球性腎炎、痛風(fēng)、格雷夫斯病、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、腸易激綜合征、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、心肌或心包炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、胰腺炎、多發(fā)性肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、干燥綜合征和自身免疫性甲狀腺炎；癌癥的并發(fā)癥、血液透析和體外循環(huán)；病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲、原生動(dòng)物和蠕蟲感染；和創(chuàng)傷。在治療方法中，本發(fā)明組合物的給藥可以是“預(yù)防性”或“治療性”目的。當(dāng)預(yù)防性地提供時(shí)，本發(fā)明的組合物在任何癥狀之前提供，但是在具體實(shí)施方案中，在一種或多種癥狀發(fā)作后提供疫苗以防止進(jìn)一步癥狀發(fā)展或防止現(xiàn)有癥狀變得更差。組合物的預(yù)防性給藥用于預(yù)防或改善任何隨后的感染或疾病。當(dāng)以治療性提供時(shí)，在感染或疾病的癥狀發(fā)作時(shí)或之后提供藥物組合物。因此，本發(fā)明可以在預(yù)期暴露于致病劑或疾病狀態(tài)之前或在感染或疾病開始之后提供。組合物的有效量將是實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的所選擇的結(jié)果的劑量，并且這樣的劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員作為常規(guī)事項(xiàng)來確定。例如，用于治療針對(duì)癌癥或病原體的免疫系統(tǒng)缺陷的有效量可以是引起免疫系統(tǒng)活化所需的劑量，導(dǎo)致在暴露于抗原時(shí)發(fā)生抗原特異性免疫應(yīng)答。該術(shù)語也與“足夠量”同義。對(duì)于任何具體應(yīng)用的有效量可以根據(jù)諸如所治療的疾病或失調(diào)、所施用的特定組合物、受試者的大小和/或疾病或失調(diào)的嚴(yán)重性等因素而變化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗(yàn)確定本發(fā)明的特定組合物的有效量，而不需要過度的實(shí)驗(yàn)。疫苗制劑本發(fā)明還包括適用于免疫治療的疫苗制劑。在某些實(shí)施方案中，疫苗制劑用于預(yù)防和/或治療疾病，例如癌癥和感染性疾病。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明對(duì)患者施用的用于預(yù)防和/或治療癌癥的疫苗可以在去除癌癥的外科手術(shù)之前或之后進(jìn)行，在用于治療癌癥的化學(xué)治療方法之前或之后進(jìn)行，以及在用于治療癌癥的放射治療之前或之后及其任何組合進(jìn)行。在其它實(shí)施方案中，疫苗制劑可以與另一種組合物或藥物產(chǎn)品聯(lián)合或組合施用于患者。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明還可以用于預(yù)防個(gè)體中的癌癥，此個(gè)體沒有癌癥但可能處于患癌癥風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明制備的癌癥疫苗的施用廣泛適用于預(yù)防或治療癌癥，該癌癥一定程度上取決于對(duì)癌癥疫苗的抗原形成部分的選擇?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的實(shí)踐適當(dāng)治療的癌癥包括但不限于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、腎癌、骨癌、肝癌、食道瘤、腦瘤、睪丸瘤、子宮瘤和各種白血病和淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以源自待治療的腫瘤或癌細(xì)胞。例如，在肺癌的治療中，肺癌細(xì)胞將如上文所述進(jìn)行治療以產(chǎn)生肺癌疫苗。類似地，乳腺癌疫苗、結(jié)腸癌疫苗、胰腺癌疫苗、胃癌疫苗、膀胱癌疫苗、腎癌疫苗等，按照實(shí)踐，將作為免疫治療劑被生產(chǎn)和應(yīng)用，以預(yù)防和/或治療產(chǎn)生疫苗的腫瘤或癌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如所述的，根據(jù)本發(fā)明的疫苗還可以通過收集由病原體流入培養(yǎng)基中的相關(guān)抗原被制備以治療影響哺乳動(dòng)物的各種感染性疾病。由于通過引起相同疾病的不同種類的生物體表達(dá)的免疫原性和保護(hù)性抗原的類型中存在異質(zhì)性，可以通過從表達(dá)不同的重要抗原的生物體庫制備疫苗來制備多價(jià)疫苗。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗可以通過結(jié)節(jié)內(nèi)注射施用到腹股溝淋巴結(jié)中。或者，根據(jù)疫苗靶標(biāo)，疫苗可以經(jīng)皮內(nèi)或皮下施用于被治療患者的四肢、手臂和腿。盡管該方法通常對(duì)于黑色素瘤和其它癌癥(包括預(yù)防或治療感染性疾病)是令人滿意的，但是也可以使用其它給藥途徑，例如肌肉內(nèi)或進(jìn)入血流。另外，疫苗可以與佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑一起給予以增強(qiáng)疫苗的活性和患者的反應(yīng)。此類佐劑和/或免疫調(diào)節(jié)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，并且在可獲得的公開文獻(xiàn)中容易描述。如本發(fā)明所預(yù)期的，并且取決于所產(chǎn)生的疫苗類型，如果需要，可以通過在生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐或其它適于大量生長細(xì)胞的容器或裝置中培養(yǎng)細(xì)胞來擴(kuò)大疫苗的產(chǎn)量。在這樣的裝置中，定期、頻繁或連續(xù)地收集培養(yǎng)基，以在這些材料或抗原降解之前，從培養(yǎng)基中回收任何材料或抗原。如果需要，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生和回收的包含疫苗或抗原的裝置或組合物，此裝置或組合物適于持續(xù)或間歇釋放，實(shí)際上，植入體內(nèi)或局部施用于體內(nèi)，以使這種材料相對(duì)緩慢或定時(shí)釋放到體內(nèi)。疫苗制備中的其它步驟可以個(gè)體化以滿足特定疫苗的要求。這樣的附加步驟本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解。例如，某些收集的抗原材料可以被濃縮并且在一些情況下用洗滌劑處理并超速離心以除去移植同種異體抗原。her3表達(dá)作為疾病的診斷和治療的生物標(biāo)志物在另一個(gè)實(shí)施方案中，her3表達(dá)可以用作具有barrett食管的和高度異常結(jié)構(gòu)(hgd)的患者中的隱匿性侵入性疾病的生物標(biāo)志物。本發(fā)明另外考慮的是以her3或cmet為標(biāo)靶的治療劑，其可以在一些患者中提供胃食管癌的二級(jí)預(yù)防。本發(fā)明所述的這些方法絕不是全部包括的，并且適合于具體應(yīng)用的其它方法對(duì)于普通技術(shù)人員是顯而易見的。此外，組合物的有效量可以通過類似于已知發(fā)揮所需效果的化合物進(jìn)一步估計(jì)。具體實(shí)施方式通過參考以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例僅僅是為了說明的目的，并且不旨在是限制性的，除非另有規(guī)定。因此，本發(fā)明決不應(yīng)被理解為限于以下實(shí)施例，而是應(yīng)當(dāng)理解為涵蓋由于本發(fā)明提供的傳授內(nèi)容而變得明顯的任何以及所有變化形式。無需進(jìn)一步描述，相信本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用前述說明和以下說明性實(shí)施例來制造和利用本發(fā)明，并實(shí)踐要求保護(hù)的方法。因此，以下實(shí)施例具體指出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本公開的其余部分。實(shí)施例1：創(chuàng)建針對(duì)引起乳腺癌和其他實(shí)體癌癥的其他受體酪氨酸激酶的肽疫苗設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以開發(fā)針對(duì)那些被認(rèn)定為brca突變攜帶者的患者的替代療法。也就是說，對(duì)遺傳上具有乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的、正在尋求二尖乳房切除術(shù)的替代品的年輕患者來說存在未滿足的需求。具有乳腺癌基因突變brca1/brca2的女性具有70％的發(fā)展成乳腺癌的終生風(fēng)險(xiǎn)，并且brca1突變攜帶者經(jīng)常發(fā)展三陰性乳腺癌。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以開發(fā)用于該組的疫苗并評(píng)價(jià)其在免疫誘導(dǎo)試驗(yàn)中的安全性這是疫苗接種用于初始預(yù)防乳腺癌的第一次嘗試。還將包括brca2突變攜帶者以觀察是否可使用本發(fā)明的多價(jià)疫苗預(yù)防雌激素受體陽性乳腺癌。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以研究乳腺癌中的受體酪氨酸激酶表達(dá)和來自brca突變攜帶者的dcis。觀察到來自brca突變攜帶者的腫瘤早期常常過表達(dá)c-met致癌基因和her-3，而來自非突變或散發(fā)性病人的腫瘤表達(dá)her-2和her-3。這是重要的，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明所公開的內(nèi)容，現(xiàn)在已知腫瘤免疫治療的靶標(biāo)可用于開發(fā)用于散發(fā)性和brca突變攜帶者的疫苗。這是使用免疫應(yīng)答預(yù)防有針對(duì)性的第一個(gè)區(qū)別特征。因此，本發(fā)明包括用于開發(fā)疫苗的組合物和方法及其用于預(yù)防作為雙側(cè)乳房切除術(shù)的替代物的用途。創(chuàng)建肽疫苗her家族由參與多種癌癥的四種相關(guān)信號(hào)分子-her-1、her-2、her-3和her-4組成。已知在20％至30％的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)her-2的過表達(dá)。本文提供的結(jié)果證明其他her家族成員參與早期和浸潤性乳腺癌以及其他癌癥。例如，her-1在少數(shù)乳腺癌上表達(dá)，通常是三陰性乳腺癌。c-met是參與激活her-3的許多癌癥的復(fù)發(fā)的生長因子受體。her-3在結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中過表達(dá)。her-3在大量的dcis損傷和乳腺癌中表達(dá)。在接受her-2疫苗的一些患者中，在手術(shù)時(shí)可以在殘留dcis中檢測(cè)到her-3。作為這些發(fā)現(xiàn)的結(jié)果，除乳腺癌中的her-2，以這些分子為標(biāo)靶的可能性被認(rèn)為是有益的。已鑒定的來自her-3的免疫原性肽(圖1和圖2)如下：p11-13(肽51-75):klyercevvmgnleivltghnadlsflqw(seqidno:1)；p81-83(肽401-425):swpphmhnfsvfsnlttiggrslyn(seqidno:2)；p84-86(肽416-440):ttiggrslynrgfsllimknlnvts(seqidno:3)；p12(肽56-70):cevvmgnleivltgh(seqidno:4)；p81(肽401-415):swpphmhnfsvfsnl(seqidno:5)；p84(肽416-430):ttiggrslynrgfsl(seqidno:6)；和p91(肽451-465):agriyisanrqlcyh(seqidno:7)。本文提供的結(jié)果證明這些肽可以激活許多患者的cd4t細(xì)胞。所述肽可用于脈沖樹突狀細(xì)胞并訓(xùn)練t細(xì)胞識(shí)別her-3。her-3在三陰性乳腺癌中表達(dá)，并且可以在er陽性乳腺癌中賦予針對(duì)抗-雌激素的抗性。her-3也在其他癌癥中表達(dá)，該癌癥包括黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和轉(zhuǎn)移性腦腫瘤。不希望受任何特定理論的束縛，來自分子的細(xì)胞內(nèi)部分的肽也可能是有利的?；诒景l(fā)明提供的公開內(nèi)容，基于鑒定her-3的免疫原性肽的方法可以篩選和鑒定出her-1和c-met受體酪氨酸激酶分子的免疫原性肽。本發(fā)明的免疫原性肽可用于制備用于乳腺癌以及其它癌癥的多價(jià)預(yù)防性疫苗。本發(fā)明提供的結(jié)果顯示了her-2的姐妹蛋白在乳腺癌中作用的鑒定。這些姐妹蛋白可以有效靶向，并可以開發(fā)其他實(shí)體瘤的疫苗?？捎糜诎邢騢er-1和her-3的肽已經(jīng)開發(fā)了。在dcis中，特別地，已經(jīng)鑒定了在疫苗接種之前和之后患者中的特異性抗her-1、her-2和her-3應(yīng)答，其為可用于預(yù)防早期癌癥或治療有dcis的女性的多價(jià)疫苗的開發(fā)提供支持。本發(fā)明的組合物可用于治療其它癌癥，包括但不限于結(jié)腸癌、黑色素瘤、腦腫瘤、肺癌、卵巢癌和其他腫瘤。黑色素瘤黑色素瘤是一種侵略性皮膚癌，如果不及早被發(fā)現(xiàn)，可能是致命的。使用標(biāo)準(zhǔn)樹突狀細(xì)胞疫苗在小鼠中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中樹突狀細(xì)胞被工程化以顯示導(dǎo)致約70％的黑色素瘤的突變蛋白(braf)。用這些樹突狀細(xì)胞接種保護(hù)小鼠免受黑色素瘤細(xì)胞攻擊，證明可以開發(fā)用于黑素瘤的疫苗。不希望受任何特定理論的束縛，braf和her-3靶向的組合可用于治療黑素瘤以及其它癌癥，包括但不限于實(shí)體癌癥，例如結(jié)腸癌、胰腺癌和肺癌以及其它胃腸道腫瘤。此外，已經(jīng)表明黑素瘤腫瘤使用b細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，因此認(rèn)為消除某些b細(xì)胞可以改善治療?？梢栽O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來評(píng)估是否將腫瘤微環(huán)境改變?yōu)閠h1型應(yīng)答可以幫助防止逃逸。在一些情況下，本發(fā)明的疫苗可用于治療已經(jīng)擴(kuò)散的黑素瘤。在一些情況下，本發(fā)明提供了用于消除剩余細(xì)胞的治療，該剩余細(xì)胞通常對(duì)藥物治療具有抗性。實(shí)施例2：來自于用于疫苗接種中的腫瘤抗原的mhcii類-混雜的cd4+肽的鑒定新策略盡管在歷史上細(xì)胞毒性cd8+t淋巴細(xì)胞(ctl)被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的主要效應(yīng)物，但是在各種腫瘤類型中單獨(dú)用cd8+疫苗加強(qiáng)ctl應(yīng)答產(chǎn)生了不可預(yù)測(cè)的臨床結(jié)果，可能是因?yàn)闆]有足夠的cd4+t淋巴細(xì)胞幫助下ctl功能次優(yōu)。cd4+t輔助1型(th1)細(xì)胞分泌inf-γ/tnf-α，誘導(dǎo)腫瘤衰老和凋亡。因此，將cd4+表位成功摻入癌癥疫苗構(gòu)建和產(chǎn)生持久的抗原特異性cd4+免疫仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。使用her3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)作為候選“癌驅(qū)動(dòng)(oncodriver)”腫瘤抗原，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以鑒定免疫原性her3cd4+肽，其展示ii類混雜性并產(chǎn)生用于包含在疫苗構(gòu)建體中的抗her3cd4+免疫。現(xiàn)在描述這些實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法。材料和方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)使用her3的ecd作為腫瘤抗原來鑒定免疫原性ii類混雜的her3cd4+肽，以產(chǎn)生抗her3th1細(xì)胞免疫。實(shí)驗(yàn)方案概述從her3ecd創(chuàng)建15-mer長肽的文庫，肽中5個(gè)氨基酸重疊。將這些肽脈沖到來自供體的單核細(xì)胞衍生的dc上，并成熟為1型極化(dc1；il-12分泌)表型。收獲dc1并與純化cd4+t細(xì)胞共培養(yǎng)，該cd4+t細(xì)胞來自我們dcis疫苗研究中具有已知抗her-3th1應(yīng)答的受試者。使用具有10個(gè)肽的大庫，并且通過對(duì)cd4+t細(xì)胞的干擾素γ(ifn-γ)分泌進(jìn)行測(cè)量，將鑒定過程逐漸縮小至單個(gè)反應(yīng)性表位如。在篩選5-6個(gè)受試者時(shí)，鑒定到4肽似乎在大多數(shù)供體反應(yīng)，這4個(gè)肽為her356-70(seqidno：4)、her3401-415(seqidno：5)、her3416-430(seqidno：6)和her3451-465(seqidno：7)。鑒定了對(duì)her3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cd4+t細(xì)胞識(shí)別沒有反應(yīng)性的受試者，并用4種her3肽對(duì)其dc1進(jìn)行脈沖，并將脈沖的dc1與cd4t細(xì)胞一起培養(yǎng)一周，然后測(cè)試脈沖的dc1對(duì)her2肽的反應(yīng)性和對(duì)細(xì)胞外her3蛋白的反應(yīng)。在所有情況下，至少1個(gè)肽引起對(duì)脈沖到單核細(xì)胞上的肽和整個(gè)her3蛋白的識(shí)別，由此表明初次敏化離體發(fā)生。還顯示，健康供體可以對(duì)這些肽發(fā)生反應(yīng)并且在存在抗her3th1應(yīng)答喪失的三陰性乳腺癌患者中起反應(yīng)。參見gala,k.等，clin.cancerres2014；20:1410-1416和datta,j.等，“progressivelossofanti-her2cd4+t-helpertype1responseinbreasttumorigenesisandthepotentialforimmunerestoration”.oncoimmunology(即將出版)。實(shí)驗(yàn)方案要點(diǎn)如圖19所示：·包含123個(gè)重疊的15個(gè)氨基酸長度的肽片段的文庫從her3細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)產(chǎn)生，該肽片段被5個(gè)氨基酸重疊。·來自供體的自體單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞(dc)通過gm-csf、ifn-γ和lps迅速成熟為1型極化(dc1→il-12分泌)表型，并用相關(guān)肽(如her3ecd或her3cd4+肽，如圖所示)脈沖。通過制備il-12，dc1極化th1應(yīng)答?！な斋@的dc1s與純化的cd4+t細(xì)胞在8-10天的共培養(yǎng)中一起敏化。·再用未成熟dc(idc)刺激敏化的cd4+t細(xì)胞(其大部分預(yù)期成為抗原特異性)，該未成熟dc(idc)用感興趣的特異性cd4+肽(例如her3文庫肽簇)或不相關(guān)的ii類肽對(duì)照進(jìn)行脈沖。·然后收獲來自這些共培養(yǎng)物的上清液。通過ifn-γelisa測(cè)量，如果ifn-γ產(chǎn)生量是無關(guān)對(duì)照的至少兩倍，則th1應(yīng)答被認(rèn)為是抗原特異性的?！べe夕法尼亞大學(xué)醫(yī)院的臨床免疫實(shí)驗(yàn)室對(duì)捐贈(zèng)者進(jìn)行hla-dr、dp、dq分型，以評(píng)估cd4+th1應(yīng)答的mhcii型混雜性。從her3-ecd產(chǎn)生包含123個(gè)重疊的15個(gè)氨基酸長度的肽片段的文庫。來自供體的自體單核細(xì)胞衍生的dcs成熟為dc1，并用her3-ecd脈沖。收獲的dc1與純化的cd4t細(xì)胞共培養(yǎng)。10天后，再刺激將敏化的cd4t細(xì)胞對(duì)抗未成熟dc(idc)，該未成熟dc(idc)用her3文庫肽簇或不相關(guān)的cd4對(duì)照肽進(jìn)行脈沖。通過ifn-γelisa測(cè)量，如果ifn-γ產(chǎn)生量是無關(guān)對(duì)照的至少兩倍，則th1應(yīng)答被認(rèn)為是抗原特異性的。實(shí)驗(yàn)分3個(gè)步驟進(jìn)行：1)針對(duì)接種her2脈沖的dc1疫苗后具有已知的抗her3ecd反應(yīng)性的乳腺癌患者，鑒定其免疫原性cd4+肽；2)通過“反向”敏化方法，在相同的患者中證實(shí)這些肽的免疫原性；3)接種疫苗后具有已知的抗-her3ecd無反應(yīng)性的患者，鑒定其cd4+肽，以觀察細(xì)胞是否對(duì)天然her3ecd致敏，從而克服/消除自身抗原(如her3)耐受性。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行說明her3ecd肽文庫的連續(xù)篩選以鑒定可由her3ecd致敏的cd4+th1細(xì)胞識(shí)別的免疫原性表位最初在具有已知抗her3ecd反應(yīng)性的5名乳腺癌患者中進(jìn)行th1敏化，以鑒定單個(gè)免疫原性her3cd4+表位。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，her3ecd敏化的cd4+th1依次再被10肽簇(1-10、11-20等)刺激，再變窄為3-肽簇(1-3、6-6、7-10等)，并最終獲得單一免疫原性her3肽。代表性篩選在圖2、13和14中顯示。四種免疫原性肽-her3(56-70)(seqidno：4)、her3(401-415)(seqidno：5)、her3(416-430)(seqidno：6)和her3(451-465)(seqidno：7)被可重復(fù)地鑒定并且跨hla-dr、dp和dq亞型混雜。當(dāng)使用被四種鑒定過的her3肽脈沖過的dc1使來自4個(gè)非her3反應(yīng)性供體的th1細(xì)胞致敏，并且隨后挑戰(zhàn)識(shí)別her3ecd脈沖的idc時(shí)，所有供體不僅對(duì)個(gè)體免疫原性her3肽顯示了成功的敏化，而且也能識(shí)別天然her3-ecd。本發(fā)明提供的結(jié)果證明用重疊的腫瘤抗原衍生的肽文庫脈沖的dc1可以鑒定用于cd4t細(xì)胞疫苗開發(fā)中的混雜ii類肽。在這項(xiàng)研究中，免疫原性her3cd4肽有效地克服了對(duì)自體腫瘤抗原的免疫耐受性。在疫苗構(gòu)建中，這些her3cd4肽可以被應(yīng)用于攜帶her3過表達(dá)的癌癥患者中。此外，這些結(jié)果代表了一種新策略，其使用dc1-th1平臺(tái)，用于快速和可重復(fù)地鑒定來自任何腫瘤抗原的ii類混雜免疫原性cd4表位，用于癌癥免疫治療。下表1顯示了具有已知抗her3反應(yīng)性的患者中免疫原性cd4+her3ecd肽的初步鑒定結(jié)果。表2顯示了通過連續(xù)篩選鑒定的四種免疫原性her3cd4+表位的氨基酸序列。表1-四種免疫原性肽-her356-70(seqidno：4)、her3401-415(seqidno：5)、her3416-430(seqidno：6)、her3451-465(seqidno：7)-在先前對(duì)her3ecd敏化的供體中可重復(fù)鑒定供體#her356-70her3401-415her3416-430her3451-46515107-38√√15107-24√√√15107-26√√√√26113-03√√√√15107-31√√表2-免疫原性her3cd4+表位的氨基酸序列her356-70cevvmgnleivltgh(seqidno:4)her3401-415swpphmhnfsvfsnl(seqidno:5)her3416-430ttiggrslynrgfsl(seqidno:6)her3451-465agriyisanrqlcyh(seqidno:7)通過“反向”敏化，對(duì)鑒定的cd4+her3ecd表位的免疫原性的確認(rèn)-如單個(gè)表位敏化的cd4+th1識(shí)別天然her3ecd的能力圖15顯示在具有已知her3ecd反應(yīng)性的供體中，cd4+t細(xì)胞被各自的供體特異性的免疫原性her3表位-脈沖的dc1敏化，并用各自的her3表位和天然her3ecd脈沖的idc再刺激。圖20和21顯示了“反向”敏化的其它結(jié)果用免疫原性her3表位-脈沖的dc1敏化的cd4+th1似乎消除了抗her3免疫自身耐受性如圖16所示，當(dāng)使用用四種鑒定的her3肽脈沖的dc1使來自四個(gè)her3ecd非反應(yīng)性供體的cd4+th1細(xì)胞敏化，并且隨后挑戰(zhàn)識(shí)別her3ecd脈沖的idc時(shí)，證明了所有供體不僅對(duì)單個(gè)her3表位顯示了成功敏化，而且也證明了可識(shí)別天然her3ecd。cd4+her3表位顯示mhcii類混雜性使用her3的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)作為候選的“致癌驅(qū)動(dòng)”腫瘤抗原，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以鑒定免疫原性her3cd4+肽，該肽顯示了ii類混雜性并產(chǎn)生可用于疫苗構(gòu)建體的抗her3cd4+免疫，如圖17所示。來自腫瘤抗原的肽本發(fā)發(fā)明提供的結(jié)果證明：●用重疊的腫瘤抗原衍生的肽文庫脈沖的dc1可以鑒定用于cd4+t細(xì)胞疫苗開發(fā)的混雜性mhcii類肽?！衩庖咴詇er3cd4+肽有效克服了對(duì)自體腫瘤抗原的免疫耐受性。·這些結(jié)果代表了一種新策略，其使用dc1-th1平臺(tái)，用于快速和可重復(fù)地鑒定來自任何腫瘤抗原的ii類混雜免疫原性cd4表位，用于癌癥免疫治療?！ぴ谝呙鐦?gòu)建中使用這些her3cd4+肽，需要對(duì)攜帶her3過表達(dá)的癌癥的患者進(jìn)行研究。實(shí)施例3：her3表達(dá)是胃食管結(jié)合部的癌前病變中腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物包括her家族成員的rtk過表達(dá)在浸潤性胃食管癌中具有預(yù)后和治療意義。在癌變前胃食管損傷中的rtk表達(dá)尚未廣泛研究。barrett的食管，或在遠(yuǎn)端食管中存在化生性柱狀上皮，易于發(fā)生食管腺癌(cameron,a.j.等,gastroenterology109(5):1541-6(1995))。雖然從異常結(jié)構(gòu)到浸潤性惡性腫瘤的組織學(xué)轉(zhuǎn)變被充分表征，但化生細(xì)胞中的癌發(fā)生涉及不完全了解的遺傳改變。幾個(gè)最近的報(bào)告已確定人類表皮生長因子受體2(her2)表達(dá)在帶有異常結(jié)構(gòu)的barrett食管病變的亞型中。(almhanna,k.,等,appl.immunohistochem.mol.morphol.july162015)(almhanna,等.)；fassan,m.,等,histopathology61(5):769-76(2012)(fassan,等.)；和rossi,e.,等,j.cell.mol.med.13(9b):3826-33(2009)(rossi,等))。此外，her2表達(dá)的速率與發(fā)育異常的程度相關(guān)，暗示了腫瘤發(fā)生中的相關(guān)途徑。在許多更常見的惡性腫瘤包括乳腺癌、肺癌和胃腸癌(yokata,j.等,lancet1:765-767(1986))以及食管胃癌中已經(jīng)證實(shí)了rtk分子的過表達(dá)，該rtk分子包括her家族的成員(her1、her2和her3)和cmet、間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化因子。在乳腺癌亞組中her2過表達(dá)的鑒定、her2過表達(dá)與更具浸潤性的生物學(xué)的關(guān)聯(lián)性以及her2與單克隆抗體的有效靶向性是用于治療實(shí)體瘤的靶向治療的進(jìn)展中的關(guān)鍵事件(joensuu,h.,等,n.eng.j.med.354(8):809-20(2006))。這一經(jīng)驗(yàn)為靶向rtk分子治療其他惡性腫瘤的進(jìn)一步努力提供了基礎(chǔ)。her2過表達(dá)已經(jīng)在少數(shù)胃癌中得到證實(shí)，并已在轉(zhuǎn)移性位置中用曲妥珠單抗對(duì)其進(jìn)行靶向，其對(duì)結(jié)果的影響適中(bang,y.j.,等,lancet376(9742)687-97(2010)(bang,等.))。與更遠(yuǎn)端胃腺癌相比，her2過表達(dá)在近端胃和胃食管結(jié)合處更頻繁(rajagopal,i.,等,j.clin.diagn.res.9(3):ec06-10(2015))，并已在轉(zhuǎn)移性位置中用曲妥珠單抗對(duì)其進(jìn)行靶向，其對(duì)結(jié)果的影響適中(bang,等和fichter,c.d.,等,int.j.cancer135(7):1517-30(2014)(fichter,等))。在大多數(shù)研究中，her1和her3在胃癌中的表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)(kandel,c.,等,j.clin.pathol.67(4):307-12(2014)和hayashi,m.,等,clin.cancerres.14(23):7843-9(2008))。cmet的過表達(dá)與食管腺癌中的不良預(yù)后相關(guān)，并且cmet依賴性的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制調(diào)節(jié)了her1和her3的活性(liu,x.,等,clin.cancerres.17(22):7127-38(2011))。這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步努力表征胃食管胃癌和前體病變中的rtk表達(dá)提供了理論依據(jù)。在食管胃癌和前體病變中鑒定rtk表達(dá)。下面描述的研究旨在表征在胃食管連接的異常病變中的rtk表達(dá)，以努力鑒定用于治療和初級(jí)預(yù)防的潛在靶標(biāo)。方法在賓夕法尼亞大學(xué)的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)批準(zhǔn)后，對(duì)來自73例具有barrett食管異常結(jié)構(gòu)的患者(低度異常結(jié)構(gòu)(lgd)，n＝32，或高度異常結(jié)構(gòu)(hgd)，n＝59)的臨床記錄和組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行了回顧分析。將從2003年至2012年的來自存儲(chǔ)的內(nèi)鏡活檢的和粘膜切除的標(biāo)本的福爾馬林固定和石蠟包埋的組織塊在5μm加載玻片(fisherscientific，waltham，ma)上切片，隨后脫蠟并再水合。所有活檢材料對(duì)her1(克隆h11；1:50；dako)、her2(herceptest，dako，carpinteria，ca)和her3(克隆rtj.2；1:30；santacruzbiotechnology，dallas，tx)(leicabond-iii儀器)進(jìn)行免疫染色，并由單個(gè)病理學(xué)家在顯微鏡(leicabond-iii)下評(píng)價(jià)。膜3+her染色被認(rèn)為是陽性的，如在圖22中所見的≥10％的腫瘤細(xì)胞中的膜2+her2染色。當(dāng)有足夠的組織可用時(shí)，在42例中進(jìn)行cmet免疫組織化學(xué)染色；≥50％的腫瘤細(xì)胞中的中度或強(qiáng)的膜染色是陽性的。rtk過表達(dá)與臨床數(shù)據(jù)相關(guān)，用于評(píng)估配對(duì)的異常結(jié)構(gòu)-腺癌活檢標(biāo)本與浸潤性癌的關(guān)聯(lián)性或?qū)﹄S后活檢標(biāo)本的腺癌的診斷與浸潤性癌的關(guān)聯(lián)性。統(tǒng)計(jì)分析對(duì)所有分析使用雙尾測(cè)試。描述性統(tǒng)計(jì)被表示為分類變量的頻率和連續(xù)變量的中值(四分位數(shù)間距(iqr))。pearson'sχ2或fisher精確檢驗(yàn)和wilcoxon秩和檢驗(yàn)分別用于分析分類和連續(xù)變量。p值≤0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；所有測(cè)試都是雙側(cè)的。使用spssv22.0進(jìn)行分析(ibm,armonk,ny)。結(jié)果通過免疫組織化學(xué)法鑒定和分析了總共73名具有低度barrett食管異常結(jié)構(gòu)(n＝32)或高度barrett食管異常結(jié)構(gòu)(n＝59)的患者的her1、her2、her3和cmet表達(dá)。群組的中位年齡為65歲(iqr60-73歲)；81.9％為男性，87.5％為白種人。在群組中飲酒率為14.3％，主動(dòng)吸煙率為6.3％，而55.6％為原吸煙者，26.4％有惡性家族史。在測(cè)量的臨床和人口統(tǒng)計(jì)變量中l(wèi)gd和hgd群組之間沒有顯著差異，如下表3所示。表3具有barrett食管異常結(jié)構(gòu)群組的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征，以及低級(jí)和高級(jí)的單變量比較異常結(jié)構(gòu)患者與低度異常結(jié)構(gòu)(lgd)相比，高度異常結(jié)構(gòu)(hgd)與her1(22.4％對(duì)3.1％，p＝0.016)、her2(5.3％對(duì)0.0％，p＝0.187)和her3(45.6％對(duì)9.4％<0.001)的過表達(dá)相關(guān)。有6例foci浸潤性食管腺癌患者與異常結(jié)構(gòu)病變相關(guān)，所有這些的產(chǎn)生都與hgd(hgd：10.2％對(duì)比lgd：0.0％，p<0.001)相關(guān)聯(lián)。另有9名患者在隨后的活檢標(biāo)本(hgd：17.0％對(duì)比.lgd：0.0％，p＝0.017)上被診斷為浸潤性食管腺癌。與沒有侵潤性癌病灶的患者(71.4％對(duì)38.6％，p＝0.032)相比，her3，而不是her1或her2(her1(26.7％比20.5％，p＝0.616)和her2(14.3％比2.3％，p＝0.077)的增加)的過表達(dá)與hgd病變相關(guān)聯(lián)，如圖23a和23b所示。在42個(gè)(42.9％)評(píng)估樣品中的18個(gè)中觀察到cmet的過表達(dá)，并且與lgd樣品相比，在hgd中觀察到更多的cmet(58.3％對(duì)36.7％，p＝0.200)，并且最常與her3(62.5％的her3陽性標(biāo)本與38.2％的her3陰性標(biāo)本(p＝0.212))共表達(dá)。在her1陽性(p＝0.729)或her2陽性(p＝na)樣品中沒有觀察到類似趨勢(shì)。42例(5.6％)患者中有一例確診浸潤性癌；cmet在該患者中過表達(dá)(p＝0.243)。討論：對(duì)胃食管連接的異常結(jié)構(gòu)病變中的rtk表達(dá)的分析證實(shí)：(1)her家族蛋白在barrett食管異常結(jié)構(gòu)中上調(diào)；(2)her家族和cmet過表達(dá)的頻率與異常結(jié)構(gòu)程度呈正相關(guān)；和(3)her蛋白上調(diào)，特別是在異常結(jié)構(gòu)病變中，與相關(guān)侵襲性癌癥的發(fā)生率增加相關(guān)。因此，her3可以用作具有barrett食管和hgd的患者的隱匿性侵入性疾病的生物標(biāo)志物。此外，以her3或cmet為靶向的治療劑可以在患者亞組中提供胃食管癌的二級(jí)預(yù)防。先前對(duì)barrett食管中her表達(dá)的評(píng)估已經(jīng)限于對(duì)少數(shù)病例中過表達(dá)的her2的評(píng)估，參見almhanna等人，fassan等人和rossi等人。本研究中her2過表達(dá)存在于3.3％的活檢標(biāo)本中，低于her1或her3過表達(dá)的速率。這種模式與her家族蛋白在侵入性胃食管連接癌中的表達(dá)一致，其中her3比her2過表達(dá)更為常見(fichter等)。隨著從lgd進(jìn)展到hgd，her3蛋白的過表達(dá)增加，特別是her3頻繁的過度表達(dá)代表著新穎性，雖然并沒有意料之外的發(fā)現(xiàn)。her受體的同源和異源二聚化驅(qū)動(dòng)信號(hào)激活；在其他腫瘤類型中觀察到her家族的多個(gè)成員的聚簇過表達(dá)。與之結(jié)合的，活化的c-met正調(diào)節(jié)her1和her311的活性。實(shí)際上，這些受體之間的相互作用為以多種rtk為標(biāo)靶的多價(jià)治療方法提供了理論依據(jù)(baselga,j.,等,n.eng.j.med.366(2):109-19(2012)；waddell,t.,等,lancetoncol.14(6):481-489(2013))。本數(shù)據(jù)還暗示靶向二次預(yù)防胃食管癌的機(jī)會(huì)還沒有被開發(fā)。以前在乳腺導(dǎo)管原位癌(dcis)中靶向her2的表達(dá)已經(jīng)被作為目標(biāo)并具有了有希望的結(jié)果(參見u.s.publishedapplicationus2015/0323547a1；u.s.ser.no.14/985,303fileddecember30,201；,datta,j.等,oncoimmunology4:8e1022301(2015)doi:10.1080/2162402x.2015.1022301；datta,j.等,breastcancerres.17(1):71(2015))。這種方法對(duì)胃腸惡性腫瘤而言仍是距離遙遠(yuǎn)的目標(biāo)。盡管如此，目前barrett食管的治療方法，包括內(nèi)鏡切除術(shù)和消融方式以及根治性手術(shù)都有明顯的局限性。減少發(fā)病率和減少浸潤性癌的風(fēng)險(xiǎn)的可選擇性策略是需要的。這種在胃食管連接的異常結(jié)構(gòu)病變中的rtk表達(dá)的分析證實(shí)：(1)her家族蛋白在具有異常結(jié)構(gòu)的barrett食管中上調(diào)；(2)her家族和cmet過表達(dá)的頻率與異常結(jié)構(gòu)程度呈正相關(guān)；和(3)her蛋白上調(diào)，特別是在異常結(jié)構(gòu)病變中，與相關(guān)侵襲性癌癥的發(fā)生率增加相關(guān)。因此，her3可以用作具有barrett食管和hgd患者的隱匿性侵入性疾病的生物標(biāo)志物。此外，以her3或cmet為標(biāo)靶的治療劑可以在患者亞組中提供胃食管癌的二級(jí)預(yù)防。總之，本數(shù)據(jù)表明了在胃食管結(jié)合部的高等級(jí)異常結(jié)構(gòu)病變中，特別是具有隱匿性浸潤性癌的胃食管結(jié)合部的高等級(jí)異常結(jié)構(gòu)病變中her3的頻繁過表達(dá)和惡性轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)可以證明對(duì)于表達(dá)her3的異常結(jié)構(gòu)病變有更積極的管理方法，并為her3靶向的治療劑在早期疾病環(huán)境中的未來應(yīng)用提供理論依據(jù)，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。我們以前展示了在her-2pos乳腺腫瘤發(fā)生過程中天然抗her-2cd4th1的進(jìn)行性損失。這種應(yīng)答的喪失與對(duì)新輔助治療缺乏病理完全緩解(“pcr”)有關(guān)，并與乳腺癌復(fù)發(fā)的升高的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并且可以用疫苗接種恢復(fù)。下面的實(shí)施例4研究了在乳腺腫瘤發(fā)生期間抗her3th1應(yīng)答是否存在類似的損失。實(shí)施例4：在乳腺腫瘤發(fā)生中出現(xiàn)了抗her3cd4th1的喪失并且與結(jié)果負(fù)相關(guān)實(shí)施例4總體摘要我們以前展示了在her2pos乳腺腫瘤發(fā)生過程中天然抗her2cd4th1的進(jìn)行性損失。這種應(yīng)答的喪失與對(duì)新輔助治療缺乏病理完全緩解(“pcr”)有關(guān)，并與乳腺癌復(fù)發(fā)的升高的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，并且可以用疫苗接種恢復(fù)。該實(shí)施例研究了在乳腺腫瘤發(fā)生期間是否存在類似的抗her3th1應(yīng)答的損失。收集了來自131名受試者的外周血，包括健康供體(“hd”)、良性乳腺疾病(“bd”)患者、原位導(dǎo)管癌患者(“dcis”)和浸潤性乳腺癌(“ibc”)患者。通過酶聯(lián)免疫吸附(elispot)測(cè)定法測(cè)試對(duì)上文實(shí)施例1和2中鑒定的四種不同her3免疫原性肽的免疫應(yīng)答，并分析免疫應(yīng)答的所有量度。從hds到ibc的抗her3應(yīng)答有顯著下降。三陰性(“tn”)ibc在所有三個(gè)免疫參數(shù)中具有最低的響應(yīng)。三種免疫參數(shù)中，hds具有比erposibc和tnibc患者二者顯著更高的免疫應(yīng)答。有趣的是，her2posibc顯示類似于hds和bds的免疫應(yīng)答。與沒有隨后復(fù)發(fā)的患者或?qū)π螺o助治療具有pcr的患者相比，患有復(fù)發(fā)性乳腺癌和對(duì)新輔助治療缺乏pcr的患者具有顯著更低的抗her3cd4th1應(yīng)答。因此，發(fā)現(xiàn)cd4th1抗her3在乳腺腫瘤發(fā)生期間損失，最顯著地是在tnibc中，這組的治療選擇有限且對(duì)her3過表達(dá)的預(yù)后顯著更差。這些發(fā)現(xiàn)具有試圖恢復(fù)這種應(yīng)答以防止復(fù)發(fā)的意義。背景幾乎八分之一的婦女將在其一生中會(huì)發(fā)展乳腺癌。其中，過度表達(dá)her2的癌癥與較高的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率和總體較差的預(yù)后相關(guān)。曲妥珠單抗(一種針對(duì)her2的單克隆抗體)的引入已顯著延長了her2陽性癌癥患者的無進(jìn)展生存期和總生存期，這些指出了her2在調(diào)節(jié)乳腺癌進(jìn)展中的關(guān)鍵作用(giordanos.h.,等,j.clin.oncol.(2014):jco-2013[publishedonlinebeforeprintmay5,2014,doi:10.1200/jco.2013.54.0948])。免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)her2表達(dá)的腫瘤中起關(guān)鍵作用。之前已經(jīng)顯示，從健康受試者到her2posdcis到her2posibc，但不包括her2negibc的天然抗her2cd4t細(xì)胞應(yīng)答有逐步下降。此外，較低的抗her2免疫應(yīng)答與隨后的乳腺癌復(fù)發(fā)相關(guān)，而較高的抗her2免疫應(yīng)答與對(duì)新輔助化療的病理完全緩解相關(guān)，暗示免疫系統(tǒng)在her2pos腫瘤發(fā)生中的作用。參見datta,j.,等,oncoimmunology4(10):e1027474.doi:10.1080/2162402x.2015.1022301(2015)andu.s.publishedapplicationus2015/0323547a1(collectivelyhereinafter,“datta,等”)。我們小組已經(jīng)開發(fā)了her2脈沖樹突狀細(xì)胞疫苗，其在dcis和ibc患者中恢復(fù)抗her2cd4和cd8t細(xì)胞應(yīng)答。sharma,a.,等,cancer118(17):4354-4362(2012)；koski,g.k.,等,j.immunother.35(1):54-65(2102)；andu.s.publishedapplicationus2015/0323547a1。her2是egfr家族的成員，egfr家族是也包括her1和her3的一組rtk。雖然眾所周知her2自身二聚化，但是her3在信號(hào)傳導(dǎo)中的作用不太清楚，并且它可能與自身和her2均發(fā)生二聚化。her3與her2的二聚化已被提出是用曲妥珠單抗治療的乳腺癌患者中的逃避機(jī)制。czopek,j.,等,contemp.oncol.17(5):446-9(2013)(“czopek,等”)andbae,s.y.,等,breastcancerres.treat.139(3):741-50(2013)(“bae,等”)。帕妥珠單抗是市場(chǎng)上最近添加的一種腫瘤藥物，作為第一個(gè)獲得fda批準(zhǔn)作為新輔助治療的腫瘤藥物的帕妥珠單抗抑制her2/her3二聚化，并且當(dāng)與曲妥珠單抗聯(lián)合用于乳腺癌患者時(shí)，已證明對(duì)整體存活有益處。jhaveri,k.,等,j.natl.compr.canc.netw.12(4):591-8(2014)andharbeck,n.,等,breastcare8(1):49-55(2013)。her3的表達(dá)在乳腺癌亞型中不太清楚，盡管在一些er陽性、her2陽性和三陰性(“tn”)亞型中觀察到其的過表達(dá)。moeder,c.,等,cancer115(11):2400-9(2009)。感興趣的是，雖然her3過表達(dá)可能在her2posibc中更常見，但其預(yù)后價(jià)值在tnibc中更顯著。盡管her3在erpos/her2posibc中的表達(dá)不影響無病生存(“dfs”)或總生存(“os”)，但是tnibc中的her3表達(dá)與更差的5年dfs和10年os相關(guān)。bae等和czopek等。值得注意的是，根據(jù)定義具有her3過表達(dá)的tnibc患者是沒有任何經(jīng)典治療選擇的，具有her3過表達(dá)的tnibc患者的相當(dāng)多的部分可受益于可識(shí)別的新靶標(biāo)。尚不清楚抗her3cd4th1應(yīng)答是否存在于健康的供體中以及這種應(yīng)答是否在乳腺腫瘤發(fā)生期間改變。本研究尋求這些問題的答案。方法受試者記錄共有131名受試者符合研究標(biāo)準(zhǔn)，并在知情同意的情況下連續(xù)登記在賓夕法尼亞大學(xué)。這項(xiàng)研究由賓夕法尼亞大學(xué)的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)和abramson癌癥中心在受試者入組前批準(zhǔn)。在這131名受試者中，其中9名患者的外周血單核細(xì)胞不足以進(jìn)行測(cè)定，剩余122名受試者具有免疫應(yīng)答數(shù)據(jù)以供復(fù)查。在健康供體(hd，n＝30)、良性乳腺疾病(bd，n＝11)、dcis(n＝13)、her2posibc(n＝21)、erpos浸潤性乳腺癌(erposibc，n＝20)和三陰性ibc(tnibc，n＝27)之間對(duì)四種不同her3免疫原性肽的cd4t細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行了比較。外周血單核細(xì)胞收集通過靜脈穿刺收集外周血。將血液以1：1的比例在hank's緩沖液或pbs中稀釋，并將淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基在錐形管中在稀釋的血液之下分層。然后通過在1200rpm下密度離心30分鐘，分離血液。收集單核細(xì)胞層，并在hank's緩沖液或pbs中洗滌兩次。計(jì)數(shù)細(xì)胞并以每毫升10百萬個(gè)細(xì)胞重懸，并在-80℃冷凍24-48小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至負(fù)200℃，其中細(xì)胞保持儲(chǔ)存直到實(shí)驗(yàn)測(cè)定。測(cè)量抗her3cd4th1應(yīng)答通過elispot測(cè)定，根據(jù)制造商的方案測(cè)量抗her3cd4th1細(xì)胞應(yīng)答。簡言之，用70％乙醇活化96孔pvdf膜平板，用pbs洗滌，然后用抗-ifn-γ(抗-ifn-γ)抗體包被，并在4℃溫育過夜。24小時(shí)后，再次用pbs洗滌平板，然后用含有10％人血清的iscove's培養(yǎng)基封閉1小時(shí)。將外周血單核細(xì)胞在37℃解凍，在pbs或hank's緩沖液中洗滌，計(jì)數(shù)并以1百萬細(xì)胞/毫升重懸，然后以每孔200,000個(gè)細(xì)胞用四種免疫原性her3肽：p12(肽56-70)：cevvmgnleivltgh(seqidno:4)；p81(肽401-415)：swpphmhnfsvfsnl(seqidno:5)；p84(肽416-430)：ttiggrslynrgfsl(seqidno:6)；和p91(肽451-465)：agriyisanrqlcyh(seqidno:7)，抗-cd3/cd28(多克隆刺激物，陽性對(duì)照)破傷風(fēng)類毒素(santacruzbiotechnology，dallas，tx)或無(無刺激對(duì)照)。一式三份進(jìn)行測(cè)定。將平板在38℃下溫育48小時(shí)。48小時(shí)后，用pbs洗滌平板，然后加入生物素化的抗-ifn-γ抗體，將平板在38℃溫育2小時(shí)。再次用pbs洗滌板，加入鏈霉抗生物素-hrp，將板在38℃下培養(yǎng)1小時(shí)。最后，用pbs洗滌板，然后加入tmb底物溶液。5分鐘后，用自來水充分洗滌，停止顯色。將板在4℃下干燥過夜。免疫反應(yīng)分析通過免疫斑點(diǎn)軟件給斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。對(duì)三個(gè)參數(shù)或度量進(jìn)行定量以確定免疫應(yīng)答：(1)累積應(yīng)答或在每百萬細(xì)胞中對(duì)所有四種her3免疫原性肽在斑點(diǎn)方面的總和的應(yīng)答，(2)響應(yīng)庫，或每個(gè)受試者中具有20個(gè)或更多個(gè)斑點(diǎn)的的肽數(shù)，和(3)響應(yīng)率或響應(yīng)至少一種肽的受試者的百分比(定義閾值為20個(gè)或更多個(gè)點(diǎn))。每200,000個(gè)細(xì)胞斑點(diǎn)中的破傷風(fēng)應(yīng)答和每200,000個(gè)細(xì)胞的斑點(diǎn)中的抗cd3/cd28應(yīng)答也被定量為對(duì)照。所有免疫反應(yīng)指標(biāo)通過graphpadprism軟件分析。結(jié)果研究對(duì)象特征共有131名受試者符合研究標(biāo)準(zhǔn)，并在賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)院獲得知情同意書。9名受試者用于分析的細(xì)胞不足，剩下122名受試者。其中，平均年齡為50歲，從25歲到83歲，72.1％為白種人，18.0％為非裔美國人，9.8％為另一種族。受試者分為五組：hds(n＝30)、bds(n＝11)、dcis(n＝13)、her2posibc(n＝21)、erposibc(n＝20)27)。在68名ibc受試者中，35(51.5％)是i階段、22(32.4％)是ii階段、9(13.2％)是iii階段、2(2.9％)是iv階段。52例(76.5％)接受了化療和/或赫賽汀和/或他莫昔芬治療，16例(23.5％)為初次治療。三個(gè)dcis患者和三個(gè)her2posibc患者接受her2脈沖樹突狀細(xì)胞疫苗接種。其它特性報(bào)告在下表4中。表4研究對(duì)象的特征從健康捐贈(zèng)者到浸潤性乳腺癌亞型的cd4th1細(xì)胞抗her3免疫應(yīng)答有降低比較hds、bds、dcis、her2posibc、erposibc和tnibc，三種免疫參數(shù)都下降，在tnibc中達(dá)到最低點(diǎn)：累積應(yīng)答(90對(duì)80對(duì)66對(duì)79對(duì)48對(duì)40，p＝0.01，分別如圖24a所示)，響應(yīng)庫(1.0對(duì)0.6對(duì)0.8對(duì)0.8對(duì)0.5對(duì)0.3，p＝0.003,分別如圖24b所示)和響應(yīng)率(76.7％對(duì)63.6％對(duì)53.8％對(duì)66.7％對(duì)45.0％對(duì)33.3％，p＝0.02，分別如圖24c所示)。值得注意的是，在hds與tnibc患者的所有三種免疫參數(shù)中：累積應(yīng)答(90對(duì)40，p＝0.002)、響應(yīng)庫(1.0對(duì)0.3，p＝0.002)和響應(yīng)率(76.7％對(duì)33.3％，p＝0.001)，這些差異不僅在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更高，而且也超過一倍以上。與tnibc患者相比，bds具有顯著更高的累積應(yīng)答(分別為40對(duì)80，p＝0.007)，dcis患者具有顯著更高的響應(yīng)庫(分別為0.8對(duì)0.3，p＝0.04)，her2posibc具有顯著更高的響應(yīng)庫(分別為0.3對(duì)0.8，p＝0.01)和響應(yīng)率(分別為33.3％對(duì)66.7％，p＝0.04)。erposibc患者具有第二低的抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答，并且與hds相比在所有三種免疫參數(shù)中顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更低的應(yīng)答：累積應(yīng)答(分別為48對(duì)90，p＝0.03)，響應(yīng)庫(分比為0.5對(duì)1.0，p＝0.008)和響應(yīng)率(分別為45.0％對(duì)76.7％，p＝0.03)。值得注意的是，her2posibc抗her3應(yīng)答與hds、bds或dcis受試者沒有顯著差異。在浸潤性乳腺癌患者中較低的cd4th1細(xì)胞抗her3免疫應(yīng)答是her3特異性的，并且不能歸因于免疫應(yīng)答的廣泛缺陷分析破傷風(fēng)應(yīng)答和具有抗cd3/cd28應(yīng)答的多克隆刺激，以比較和控制總體免疫應(yīng)答性。通過elispot測(cè)定每200,000個(gè)細(xì)胞的斑點(diǎn)可知，cd4th1細(xì)胞抗破傷風(fēng)應(yīng)答在hds、bds、dcis、her2posibc、erposibc或tnibc患者之間沒有差異(分別為37對(duì)30對(duì)19對(duì)34對(duì)24對(duì)29，p＝0.65，如圖25a所示)。重要的是，hds和tnibc患者之間的抗破傷風(fēng)應(yīng)答是相似的(37對(duì)29，p＝0.37)，但這兩組患者具有最不同的抗her3cd4th1細(xì)胞應(yīng)答。同樣，在用抗cd3cd28的多克隆刺激中沒有差異，每個(gè)組中的大多數(shù)受試者具有太多穩(wěn)固的斑點(diǎn)發(fā)育以至于不能計(jì)數(shù)。在可計(jì)數(shù)的那些中，hds、bds、dcis、her2posibc、erposibc或tnibc患者(分別為688對(duì)549對(duì)804對(duì)699對(duì)629對(duì)675，p＝0.68，見圖25b)之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異。浸潤性乳腺癌患者的抗her3cd4th1細(xì)胞應(yīng)答與腫瘤侵襲的預(yù)后和特征相關(guān)為了確定抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答是否與腫瘤侵襲的特征相關(guān)，通過初始手術(shù)中淋巴結(jié)狀態(tài)(淋巴結(jié)陽性(“l(fā)npos”)、淋巴結(jié)陰性(“l(fā)nneg”))，對(duì)于新輔助化療的診斷和反應(yīng)至少1年的患者的復(fù)發(fā)與非復(fù)發(fā)狀態(tài)(病理性完全應(yīng)答(“pcr”)、殘留疾病(“<pcr”))來比較ibc患者的免疫應(yīng)答。在所有三個(gè)參數(shù)中，雖然與lnneg患者(n＝31)相比，lnposibc患者(n＝28)具有總體較低的免疫應(yīng)答，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，三個(gè)參數(shù)為：累積應(yīng)答(分別為40對(duì)56，p＝0.12)、響應(yīng)庫(分別為0.4對(duì)0.6，p＝0.08)和響應(yīng)率(分別為35.7％對(duì)54.8％，p＝0.19)，如圖26a所示。值得注意的是，lnpos受試者包括新輔助化療后有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的受試者。新輔助化療后lnneg的受試者從分析中排除了，因?yàn)椴恢涝谥委熤八麄兪欠裼薪Y(jié)節(jié)。在診斷至少一年的患者中，與那些保持無疾病(n＝36)的患者相比，那些患有復(fù)發(fā)性乳腺癌(局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，n＝7)的患者在三個(gè)免疫參數(shù)中顯示出顯著較低的抗her3應(yīng)答，三個(gè)免疫參數(shù)為：累積應(yīng)答(分別為17對(duì)66，分別為p＝0.04)、響應(yīng)庫(分別為0.0對(duì)0.6，p<0.05)和響應(yīng)率(分別為0％對(duì)診斷后55.6％，p＝0.01)如圖26b所示。最后，在接受新輔助化療(n＝16)的患者中，pcr組(n＝5)與<pcr組(n＝11)相比具有顯著更高的累積應(yīng)答(分別為144對(duì)32，p＝0.004)和響應(yīng)庫(分別為0.8對(duì)0.4，p＝0.05)，如圖26c所示。pcr組和<pcr組(分別為80.0％與27.3％，p＝0.10)之間在響應(yīng)率方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。應(yīng)注意，lnpos和lnneg患者(分別為22對(duì)29，p＝0.35)，復(fù)發(fā)患者與非復(fù)發(fā)患者(分別為27對(duì)35，p＝0.65)和pcr與<pcr(分別為17、59，p＝0.15)在破傷風(fēng)應(yīng)答中沒有差異。因此，具有更具侵襲性腫瘤特征的ibc患者中較低的cd4th1細(xì)胞應(yīng)答是her3特異性的。抗her3cd4th1細(xì)胞反應(yīng)的健康捐助者特征在hd和bd中的抗her3cd4th1應(yīng)答是根據(jù)年齡(<50年(n＝25)或≥50年(n＝16))、種族(高加索人(n＝29)、非裔美國人(n＝12)或其他(n＝5))、妊娠狀態(tài)(0(n＝17)或1個(gè)或多個(gè)妊娠(n＝24))和絕經(jīng)狀態(tài)(絕經(jīng)前(n＝30))進(jìn)行比較的。根據(jù)年齡(圖27a)、種族(圖27b)或先前懷孕史(圖27c)、累積肽反應(yīng)、響應(yīng)庫或響應(yīng)率沒有差異。然而，如圖27d所示，與絕經(jīng)前的婦女相比，絕經(jīng)后的婦女有顯著更高的累積應(yīng)答(每百萬細(xì)胞136對(duì)70個(gè)點(diǎn)，p＝0.005)(上圖)和響應(yīng)庫(分別為1.4對(duì)0.8肽，p＝0.03)(第二圖)。在響應(yīng)率方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(分別為90.9％、66.7％，p＝0.23)(第三圖)。絕經(jīng)前婦女和絕經(jīng)后婦女的破傷風(fēng)應(yīng)答之間也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(下圖)，表明絕經(jīng)狀態(tài)中免疫應(yīng)答的差異是her3特異性的。elispot分析是通過線性精度測(cè)定來證明是精確的在我們的實(shí)驗(yàn)室，elispot測(cè)定法之前已經(jīng)驗(yàn)證。為了確認(rèn)在進(jìn)行本研究所有實(shí)驗(yàn)的操作者下該試驗(yàn)的精確度，用來自已知的高抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答者的系列稀釋液進(jìn)行線性精密測(cè)定。將外周血單核細(xì)胞從1.0至0.1至0.01至0.001的濃度系列稀釋到培養(yǎng)基中，并以每百萬個(gè)細(xì)胞的斑點(diǎn)來測(cè)量累積的抗her3免疫應(yīng)答。圖28顯示，累積值分別從230、35、12至5的點(diǎn)(p<0.0001，r＝0.88)線性下降。討論免疫系統(tǒng)知識(shí)在癌癥發(fā)展、進(jìn)展和預(yù)后中的作用的正在迅速擴(kuò)大。已經(jīng)確定的是，免疫缺陷狀態(tài)增加癌癥發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，不僅對(duì)來自病毒來源的腫瘤是這樣，而且對(duì)來自非病毒來源的腫瘤也是這樣。boshoff,c.,等，naturerev.cancer2:373-82(2002)；sheil,a.g.,worldj.surg.10:389-96(1986)；penn,i.,transplantation61:274-78(1996)；andpenn,i.,transplantation60:1485-91(1995)。還已知某些免疫表型與乳腺癌相關(guān)；循環(huán)炎癥細(xì)胞因子tnf-α和il-6在乳腺癌患者中較高，并且低cd4+/cd8+t細(xì)胞比率與更具侵襲性的乳腺癌表型相關(guān)，而腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞與一些乳腺癌中更好的預(yù)后相關(guān)。alokail,m.s.,等,med.oncol.31(8):38(2014)doi:10.1007/s12032-014-0038-0；jai,y.,等,med.oncol.31:981(2014)；andmatsumoto,h.,等，j.clin.pathol.doi:10.1136/jclinpath-2015-202944。然而，針對(duì)其他免疫活性宿主中特定分子癌驅(qū)動(dòng)的免疫識(shí)別損失的證據(jù)相對(duì)較新。只有最近才顯示，從健康捐助者到her2posdcis到her2posibc的天然抗her2cd4th1細(xì)胞應(yīng)答下降，領(lǐng)先研究之一顯示在乳腺腫瘤發(fā)生中針對(duì)這種特異性癌驅(qū)動(dòng)的免疫應(yīng)答受到了損失。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地理解，對(duì)這種特定損失的鑒定和理解對(duì)于特異性免疫靶向治療將具有很大的潛力。這項(xiàng)研究表明：(1)從hds到erpos和tnibc，抗her3cd4th1細(xì)胞反應(yīng)下降；(2)抗her3應(yīng)答與預(yù)后相關(guān)，特別是較低的應(yīng)答與復(fù)發(fā)相關(guān)，而較高的應(yīng)答與新輔助化療的pcr相關(guān)；和(3)絕經(jīng)后hd具有顯著更高的抗her3免疫應(yīng)答。所有這些發(fā)現(xiàn)將具有抗her3cd4th1細(xì)胞應(yīng)答的診斷和臨床用途?？筯er3cd4th1細(xì)胞應(yīng)答在hd中最高，在tnibc中最低，其中tnibc的預(yù)后比其他類型的ibc的預(yù)后受her3過表達(dá)的影響更嚴(yán)重其。bae等和czopek,j.等。盡管her3表達(dá)在目前研究的ibc患者的群體中是未知的，但與her2posibc群體相比，tnibc和erposibc組可能具有更高水平的her3表達(dá)，其顯示與hds相似的應(yīng)答。事實(shí)上，我們以前的研究表明抗her2cd4th1細(xì)胞應(yīng)答直接與her2表達(dá)相關(guān)；抗her2cd4th1細(xì)胞在her2posibc中，而不是her2negibc中有顯著下降。與表達(dá)受體的乳腺癌相比，her3不僅對(duì)tnibc的預(yù)后具有更大的影響，而且甚至在tnibc中，與her2(1+)腫瘤相比，其可能對(duì)her2(0)的預(yù)后具有更大的影響。schmidt,g.,等,arch.gynecol.obstet.290:1221-29(2014)。這可以部分解釋her2posibc和hd之間的免疫應(yīng)答的相似性。如果腫瘤已經(jīng)由于her2過表達(dá)而增殖，則對(duì)腫瘤進(jìn)展而言就沒有驅(qū)動(dòng)使其逃避免疫監(jiān)視。然而，如果免疫系統(tǒng)已經(jīng)識(shí)別her2并以her2為靶向，腫瘤就可能適應(yīng)her3過表達(dá)，免疫逃避對(duì)腫瘤細(xì)胞的生存而言就成了進(jìn)化有利的。有趣的是，erposibc顯示類似于tnibc的抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答，并且顯著低于hds或her2posibc的抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答。盡管與tnibc相比，her3表達(dá)在erposibc中的預(yù)后顯著性較小，但證據(jù)表明her3mrna表達(dá)與er表達(dá)正相關(guān)。fujiwara,s.,等,breastcancer21:472-81(2014)。這可以解釋在該ibc亞組中觀察到的較低的免疫應(yīng)答。具有復(fù)發(fā)性疾病的乳腺癌患者與保持無疾病的患者相比具有較低的抗her3cd4th1應(yīng)答，這表明免疫監(jiān)視可能是長期治療成功的重要機(jī)制。復(fù)發(fā)患者更可能具有高h(yuǎn)er3表達(dá)的腫瘤，這點(diǎn)是可能的，高h(yuǎn)er3表達(dá)的腫瘤本身與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和更差的總體存活的更高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。li,q.,等,oncologyreports30:2563-70(2013)；smirnova,t.,等,oncogene31:706-15(2012)；andocana,a.,等,j.n.c.i.105(4):266-73(2013)。此外，已經(jīng)提出免疫編輯作為逃避機(jī)制，由此通過免疫系統(tǒng)選擇性地消除腫瘤細(xì)胞，直到它們進(jìn)化以表達(dá)逃避免疫識(shí)別的分子癌驅(qū)動(dòng)，如her3。dunn,g.p.,等，natureimmunology3(11):991-8(2008)。因此，her3表達(dá)可能是由于缺乏免疫監(jiān)視，其之后增強(qiáng)復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。有趣的是，最近的證據(jù)表明復(fù)發(fā)性腫瘤在病理學(xué)上可能與原發(fā)性腫瘤不相同。原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤之間對(duì)于孕酮受體的不一致率特別高，并且任何類型的不一致都指示復(fù)發(fā)性腫瘤的預(yù)后較差。idirisinghe,p.k.a.,等,am.j.clin.pathol.133:416-29(2010)；broom,r.j.,等,anticancerresearch29:1557-62(2009)；andliedtke,c.,等,annalsofoncology20:1953-58(2009)。據(jù)信，目前還沒有研究比較原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤之間的her3表達(dá)；her3表達(dá)在原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤之間是否不一致是未知的以及her3表達(dá)是否可以代表復(fù)發(fā)發(fā)生的逃避機(jī)制也是未知的。如果答案是肯定的，靶向具有低抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答的患者可以提高免疫監(jiān)視并幫助防止長期復(fù)發(fā)。還暗示免疫系統(tǒng)在預(yù)后中的作用，對(duì)新輔助化療pcr的患者具有比<pcr的患者顯著更高的抗her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答。已經(jīng)顯示her3信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)了對(duì)靶向治療的獲得性耐藥性。sergina,n.v.,等,nature445:437-41(2007)；andfrogne,t.,等,breastcancerres.treat.114:263-75(2009)。在這里暗示不是獲得性抗性，而是初始抗性，使抗her3免疫反應(yīng)成為最大受益于新輔助治療的患者的潛在的預(yù)后標(biāo)記物。進(jìn)一步的研究應(yīng)該闡明抗her3免疫應(yīng)答是否不僅是預(yù)測(cè)預(yù)后的，而且還可以干預(yù)以促進(jìn)對(duì)治療的應(yīng)答。在本研究中，hd的一個(gè)部分，特別是絕經(jīng)后婦女，表現(xiàn)出更高的抗her3反應(yīng)。然而，不同于以前對(duì)抗her2反應(yīng)的研究結(jié)果，基于懷孕史的結(jié)果是沒有差異的。雖然在生物學(xué)上，更高的抗her2反應(yīng)可以歸因于懷孕中乳房退化和隨后的細(xì)胞蛋白質(zhì)在免疫監(jiān)視下的暴露，乳腺實(shí)質(zhì)中的這種變化在更年期不太可能。press,m.f.,等,oncogene5:953-62(1990)。在成像中已經(jīng)觀察到乳腺密度隨著激素變化(如在絕經(jīng)期中)而變化，這可以模擬在懷孕中的乳房退化，還可以模擬將通常在乳腺組織中表達(dá)的細(xì)胞蛋白暴露于免疫系統(tǒng)。clendenen,t.v.,等,magneticresonanceimaging31:1-9(2013)。另一種解釋可以將絕經(jīng)后婦女中較高的抗her3免疫應(yīng)答歸因于風(fēng)險(xiǎn)差異。各種乳腺癌癌驅(qū)動(dòng)的表達(dá)顯然是具有年齡依賴性：her2posibc隨年齡變得不太可能，而erposibc變得更可能。clark,g.m.,等,j.clin.oncol.2:1102-09(1984)；eppenberger-castori,s.,等,int.j.biochem.andcellbiol.34:1318-30(2002)。此外，這兩種受體彼此不是獨(dú)立的，因?yàn)殡S著年齡的er/pr表達(dá)是her2依賴性的，反之亦然。neven,p.,等,breastcancerres.treat.110:153-59(2008)。tnibc患者，具有最低抗her3免疫應(yīng)答和預(yù)后對(duì)her3過表達(dá)最敏感的組，在絕經(jīng)前婦女中更頻繁地發(fā)生。bae等.andhowlander,n.,等,j.n.c.i.106(5):1-8(2014)。因此，絕經(jīng)前hd的亞組代表發(fā)生tnibc的較高風(fēng)險(xiǎn)的組，而絕經(jīng)后hd代表已經(jīng)超過該較高風(fēng)險(xiǎn)期的組并且實(shí)際上代表患有her2和her3同時(shí)過表達(dá)的乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)較低的組。還值得注意的是，盡管tnibc在年輕女性中更常見，但是其在老年人群中的發(fā)生預(yù)示著更好的預(yù)后，原因未知。aapro,m.等,annalsofoncology23(6):vi52-55(2012)。如果更高的抗her3免疫應(yīng)答確實(shí)是由于更年期組的生物學(xué)機(jī)制而不是風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避組的生物學(xué)機(jī)制，就可能部分解釋了絕經(jīng)后婦女中tnibc的更好的預(yù)后。結(jié)論該實(shí)施例證明了從hds、bds和dcis到erpos和tnibc，抗-her3cd4t細(xì)胞應(yīng)答下降。此外，較低的抗her3反應(yīng)與復(fù)發(fā)和新輔助治療<pcr相關(guān)，表明這種免疫應(yīng)答在浸潤性乳腺癌中也可以發(fā)揮預(yù)后作用。最重要的是，這些結(jié)果反映了先前研究的結(jié)果，其顯示從hds到her2posdcis到her2posibc的天然抗her2免疫應(yīng)答的下降。這種類似的結(jié)果不僅有希望用于確認(rèn)以前的發(fā)現(xiàn)，而且也有希望在尋找分子癌驅(qū)動(dòng)中發(fā)揮更大的免疫系統(tǒng)作用。有趣的是，絕經(jīng)后hds比絕經(jīng)前hd具有顯著更高的免疫反應(yīng)，絕經(jīng)前hd組通常在發(fā)展her3過度表達(dá)的乳腺癌中處于較高風(fēng)險(xiǎn)并且可能指向介導(dǎo)該風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制。確定her3脈沖的dc1疫苗接種是否可以對(duì)her3過表達(dá)的乳腺癌的發(fā)展具有治療和/或風(fēng)險(xiǎn)調(diào)節(jié)作用這點(diǎn)很重要。繼續(xù)檢查免疫系統(tǒng)在其它癌驅(qū)動(dòng)特異性癌癥中的作用也是同樣重要的。結(jié)論之前：從健康供體組到侵入性乳腺癌組，cd4th1細(xì)胞抗her-3免疫應(yīng)答損失，最顯著的是在tnibc組中，該組治療選擇有限且her-3過表達(dá)的預(yù)后顯著更差?？筯er3免疫應(yīng)答還減輕對(duì)治療和預(yù)后的應(yīng)答，其指向潛在的免疫治療靶標(biāo)。向dc1疫苗中加入her3免疫原性肽能夠增加可從疫苗接種中獲益的ibc患者群體。最重要的是，這些結(jié)果驗(yàn)證了以前的發(fā)現(xiàn)，并指向在尋找分子癌驅(qū)動(dòng)中的更大的免疫系統(tǒng)作用。本實(shí)施例的結(jié)果，即為，在乳腺腫瘤發(fā)生中，從hds組到ibc組抗her3cd4+th1顯著損失，其可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解為可用于診斷和治療表達(dá)her3的癌癥，尤其是乳腺癌，特別是三陰性ibc?？梢灶A(yù)期的是可開發(fā)血液測(cè)試以檢測(cè)受試者中循環(huán)抗癌的cd4+th1應(yīng)答從而利用這些發(fā)現(xiàn)。優(yōu)選地，這種血液測(cè)試將使用her3免疫原性肽，例如本文使用的4種列舉的her3免疫原性肽或基于患者所患癌癥類型的能夠在患者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的任何其它mhcii類免疫原性肽。作為非限制性實(shí)例，可以用這種血液測(cè)試監(jiān)測(cè)患有復(fù)發(fā)性乳腺癌和對(duì)新輔助治療缺乏pcr的患者，以確定其抗her3cd4th1應(yīng)答并相應(yīng)地治療。通過患者血液測(cè)試或其他方法檢測(cè)到的低抗her3應(yīng)答可以通過恢復(fù)方法來對(duì)抗，例如疫苗，并且優(yōu)選基于用her3免疫原性肽脈沖/孵育的患者單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞的疫苗，其中her3免疫原性肽例如本發(fā)明實(shí)施例中使用的4種her3免疫原性肽。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地理解，存在恢復(fù)患者免疫應(yīng)答的其它方式。特別地，對(duì)于tnibc患者，該組固有地具有有限的治療選擇，對(duì)其測(cè)量her3應(yīng)答的方法，以及如果需要，通過dc1疫苗恢復(fù)這種應(yīng)答的方法可能證明是非常有價(jià)值的?？筯er3免疫應(yīng)答也可以用作需要新輔助治療的患者的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。her3脈沖的dc1疫苗或其它合適的疫苗可能對(duì)her3過表達(dá)的乳腺癌以及其它表達(dá)her3的癌癥的發(fā)展具有治療和/或風(fēng)險(xiǎn)調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可以被理解為可用于開發(fā)本發(fā)明所預(yù)期的用于診斷和/或治療的陣列血液測(cè)試和測(cè)定。本發(fā)明引用的每件專利、專利申請(qǐng)和出版物的公開內(nèi)容通過引用整體并入本發(fā)明中。雖然已經(jīng)參考具體實(shí)施例公開了本發(fā)明，但是顯然本領(lǐng)域的其他技術(shù)人員可以在不脫離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍的情況下設(shè)計(jì)本發(fā)明的其它實(shí)施例和變化。當(dāng)前第1頁12