專利名稱：治療性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療性肽，特別是在疫苗的制備或者在其他對于感染的治療中及在篩選在感染的治療中具有潛在藥物活性的化合物中有用的治療性肽，。
本發(fā)明的發(fā)明者以前發(fā)現(xiàn)與癌胚抗原有關(guān)的細(xì)胞粘連分子(CEACAM)是粘膜病原物，特別是呼吸道病原物，如腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的受體。CEACAM屬于癌胚抗原(CEA)家族，該家族是免疫球蛋白超家族的一個成員。CEA基因家族包括表面表達(dá)的亞家族(CEA)和分泌型亞家族(妊娠特異的糖蛋白，PSG)。與膜相關(guān)的亞家族被重新界定為CEACAM(與CEA有關(guān)的細(xì)胞粘連分子)20，該亞家族包括許多有關(guān)的糖蛋白，其中CEACAM1在不同的人體組織中表達(dá)得最為廣泛。本發(fā)明的發(fā)明者報導(dǎo)的這些研究中主要使用CEACAM1(以前被命名為CD66a和BGPc)轉(zhuǎn)染了中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，CEACAM1包含四個細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、一個TM區(qū)和一個短(S)或者長(L)的細(xì)胞質(zhì)尾(其分子的表達(dá)式為NA1BA2-TM-S或L)。此外，還使用了包含一個或者多個細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性截短的構(gòu)建體。以前的研究表明腦膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血桿菌主要以許多CEACAM的N端結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)7.9.10。這種靶向定位可以導(dǎo)致對細(xì)胞表面的附著以及對細(xì)胞的侵襲。此外，細(xì)菌可以結(jié)合吞噬細(xì)胞上以及T和B淋巴細(xì)胞上的CEACAM。這種相互作用可以導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡、目標(biāo)細(xì)胞死亡或者免疫功能的抑制，例如在奈瑟氏淋球菌(與腦膜炎奈瑟氏菌的親緣關(guān)系很近)與T和B淋巴細(xì)胞上的CEACAM結(jié)合時導(dǎo)致T和B淋巴細(xì)胞的抑制。
由于CEACAM長期被認(rèn)為與腦膜炎奈瑟氏菌中與外膜不透過性有關(guān)的Opa蛋白相關(guān)，而流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌都不產(chǎn)生Opa蛋白，所以在流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌中發(fā)現(xiàn)存在CEACAM結(jié)合配基對于本發(fā)明的發(fā)明者來說是個意外。在以下對本發(fā)明的描述中，將特別涉及粘膜的感染，特別是呼吸道膜的感染，或者是耳部的感染(特別是中耳炎)，但是應(yīng)該理解的是，在涉及CEACAM受體的其他部位感染，例如在生殖器粘膜或者尿道中的感染或其他受體結(jié)合過程，或者在可能從粘膜表面散布細(xì)菌的人類其他部位的感染中，本發(fā)明有同樣的作用。
粘膜病原腦膜炎奈瑟氏菌(Nm)、流感嗜血桿菌(Hi)和卡他莫拉菌(Mx)都是人類特異的生物體，存在于上呼吸道中，從那里它們可以散布，導(dǎo)致嚴(yán)重的感染。至少25％的健康個體的鼻咽中攜帶有屬于不同血清群的腦膜炎球菌菌種1。但是，在許多個體中，該生物體侵襲粘膜屏障，導(dǎo)致一種發(fā)展最為迅速并且極為嚴(yán)重的疾病。增加宿主對于腦膜炎球菌感染易感性的確切因素還不完全清楚。而且，血清群特異的疫苗僅僅提供有限的保護(hù)以及B群多糖的非免疫原性增強(qiáng)了對于基礎(chǔ)研究的需要，以理解宿主的易感性，確定重要的亞莢膜特征，這些可以作為對抗腦膜炎球菌的共同目標(biāo)。本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行的研究提供了一種對腦膜炎球菌建群的分子生物學(xué)基礎(chǔ)的理解，和對于腦膜炎球菌群落與人類屏障細(xì)胞(上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)以及吞噬細(xì)胞相互作用性質(zhì)的理解。在最近一些年，對共生奈瑟氏菌的粘膜移殖的基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，以理解主要是無害的群落和偶然出現(xiàn)的但是嚴(yán)重的病原物例如腦膜炎奈瑟氏菌之間相互區(qū)別的特點(diǎn)。此外，這些研究確定了共生奈瑟氏菌是否可以被用作腦膜炎奈瑟氏菌可能的疫苗抗原的載體。
至少75％的健康個體可能攜帶屬于流感嗜血桿菌的菌種2。盡管由于Hib疫苗的結(jié)果，在西方b型疾病的發(fā)病率有了顯著的降低，但是由無法定型的Hi菌株(NTHi)導(dǎo)致的疾病仍然是一個問題。NTHi導(dǎo)致局部以及擴(kuò)散的感染，包括會厭炎、中耳炎、蜂窩織炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、菌血癥和腦膜炎。中耳炎是兒科醫(yī)療界的一個主要問題，而NTHi是兒童在生命第一年中20％以上中耳炎發(fā)病的原因2，3。NTHi還與具有慢性阻塞性肺炎(COPD)和囊腫性纖維化病人的急性復(fù)發(fā)性和持久性感染有關(guān)。是什么決定了這些病人中由NTHi導(dǎo)致的復(fù)發(fā)性感染，或者兒童中中耳炎多次發(fā)作，這還不清楚。
卡他莫拉菌是人類呼吸道中的另一種寄生菌，通常與Hi一起從局部感染病例中分離出。這兩種生物體都與竇炎和哮喘的惡化有關(guān)。Mx是導(dǎo)致兒童中耳炎的第三種最常見病因(據(jù)估計為每年300到400萬病例)。它還導(dǎo)致成年人中的下呼吸道感染，特別是在患COPD的病人中5。在罕見的情況下，它與擴(kuò)散性感染有關(guān)5。Hi和Mx都導(dǎo)致持續(xù)性感染，并且認(rèn)為它們可以通過組織滲透逃過宿主的免疫機(jī)制以及抗生素的作用。已經(jīng)研究了Mx的許多外膜蛋白的粘附性質(zhì)。但是幾乎沒有發(fā)現(xiàn)Mx的細(xì)胞受體，而且許多病原性機(jī)制的詳情有待研究。
呼吸道粘膜病原物的一個基本需要是與呼吸道上皮細(xì)胞建立穩(wěn)固的聯(lián)系。這些人類病原物的目標(biāo)是人類特異的分子，研究必須要有體外培養(yǎng)的人體組織和器官培養(yǎng)。粘附通常由細(xì)菌相和抗原性可變的結(jié)構(gòu)來介導(dǎo)。此外，已經(jīng)愈加清楚地知道病原物的粘附是多方面的，而且環(huán)境適應(yīng)對于粘附的方式起重大的作用。盡管許多最近的研究已經(jīng)開始確定復(fù)雜的細(xì)胞靶向機(jī)制的不同階段，但是對環(huán)境適應(yīng)的詳情或者宿主和微生物體之間的交流還有待描述。
本發(fā)明的發(fā)明者最近進(jìn)行的研究顯示Nm7-9和Hi10，11具有一些獨(dú)特的機(jī)制和另一些共有的機(jī)制，用來靶向某些人類細(xì)胞表面受體的CEACMA12。
而且，本發(fā)明的發(fā)明者最近發(fā)現(xiàn)卡他莫拉菌的臨床分離株也以人類的CEACAM分子為靶向。此外，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種卡他莫拉菌的高分子量外膜蛋白與該受體結(jié)合。已經(jīng)證明CEACAM在不同組織中，包括在呼吸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)提示對CEACAM分子的特異靶向?qū)τ诤粑兰?xì)菌來說是一個特別的有利條件，它可能是由于趨同進(jìn)化的結(jié)果而出現(xiàn)的。
在腦膜炎奈瑟氏菌的粘附因子中有菌毛(傘毛)13.14.15以及外膜不透過蛋白，Opa和Opc15.16。Nm菌毛是長的絲狀蛋白結(jié)構(gòu)，由多個傘毛蛋白亞基組成。一般認(rèn)為它們是莢膜細(xì)菌最重要的粘附素13.14.16，原因是莢膜部分或者全部掩蓋了外膜配基，導(dǎo)致配基的功能效力降低，而在完全莢膜細(xì)菌中菌毛穿過莢膜，仍然具有功能。Opa屬于抗原性可變的蛋白家族，在腦膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟球菌中都存在。在腦膜炎球菌中，有3-4個opa基因座編碼相關(guān)的、具有4個暴露于表面的環(huán)的跨膜蛋白，其中3個基因座有序列變異16，17。另一個跨膜蛋白Opc基本上沒有變異15.16。在過去的12年中，本發(fā)明的發(fā)明者對Nm菌毛的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系、Opa和Opc蛋白的毒力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了奈瑟球菌屬不透過蛋白的兩個人類受體。而且發(fā)明者對表面唾液酸在細(xì)菌與人類靶細(xì)胞相互作用中的功能以及LPS和其他因子在細(xì)胞毒性中的作用進(jìn)行了研究。
發(fā)明者們從結(jié)合CEACAM受體的莫拉菌外膜蛋白中分離出了高分子量配基，從而導(dǎo)致本發(fā)明的出現(xiàn)。
配基的性質(zhì)可以通過其在SDS-PAGE中的遷移模式進(jìn)行描述，其SDS-PAGE遷移特征具有USP家族蛋白的特點(diǎn)，即配基在長時間煮沸后，分裂為分子量在大約60kD到150kD之間的單體。
在Mx菌株ATCC 25238(MX2)中的配基被鑒定為UspA1，并且測定了其氨基酸序列。該配基的特點(diǎn)被進(jìn)一步研究，以確定受體結(jié)合的區(qū)域或者結(jié)構(gòu)域，即結(jié)合受體的肽或者與肽相關(guān)的性質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供從與CEACAM受體結(jié)合的卡他莫拉菌外膜蛋白中分離出來的配基，所述的配基包含一個受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含選自以下的氨基酸序列圖6所示的序列中463到863殘基、527到668殘基、527到863殘基、427到623殘基、427到668殘基以及427到863殘基，或者包含上述序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡并物或羥基化、磺化或者糖基化產(chǎn)物，或者其他次級加工產(chǎn)物。
在這里使用配基一詞，既是指與受體結(jié)合的整個分子，又是指上述分子的包括使配基保持受體結(jié)合性質(zhì)的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何部分。因此“配基”包含了僅僅由受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成的分子，即受體結(jié)合所需的一個或者幾個肽區(qū)域。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了由選自以下的氨基酸序列組成的配基圖6所示的序列中463到863殘基、527到668殘基、527到863殘基、427到623殘基、427到668殘基以及427到863殘基，或者所述配基是由上述序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡并物或羥基化、磺化或者糖基化產(chǎn)物或其他次級加工產(chǎn)物所組成。
由于在Mx中存在雜合蛋白，它們可能含有來自UspA1和UspA2兩個蛋白的嵌合表位23，所以結(jié)構(gòu)和/或功能上等價的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以在其他的類Usp-A蛋白中出現(xiàn)。包含這種等價受體結(jié)構(gòu)域的配基也屬于本發(fā)明的范疇。
優(yōu)選地，配基或者受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域適用于感染的預(yù)防或者治療。
本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明配基蛋白的核酸序列，以及所述核酸序列的同源物、多態(tài)物(polymorphism)、簡并物以及剪切變異體。
本發(fā)明的配基或者其組合，可以被用于疫苗或者感染的其他預(yù)防性處理。
疫苗或者其他的感染預(yù)防性處理可以包含任何已知的佐劑、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體、防腐劑及其類似物，以提供藥物上可以接受的配基制劑，用于治療病人。
本發(fā)明還提供了藥物上可以接受的用于醫(yī)療的配基制劑。
藥物上可以接受的配基制劑可以用于治療或者預(yù)防任何涉及到CEACAM受體的疾病，例如治療或者預(yù)防感染、呼吸道疾病、腫瘤性疾病以及與腫瘤病相關(guān)的病癥和血管新生。
優(yōu)選地，在進(jìn)行感染治療時，感染是粘膜的感染或者是通過粘膜出現(xiàn)的，特別是呼吸道感染。
最優(yōu)選地，配基被用作針對腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的疫苗或者用于對這些細(xì)菌的其他預(yù)防或治療。理想地，配基被用作針對中耳炎的疫苗或者中耳炎的其他預(yù)防或治療。
進(jìn)一步說，本發(fā)明的配基還可以用于鑒別新型阻滯劑，可用作治療藥劑，以保護(hù)易感群體和一般公眾免受許多粘膜病原物的侵害。例如配基可以被用于鑒別受體類似物，這些類似物可以用于上面這些目的。
因此本發(fā)明還提供一種篩選試驗(yàn)，用于鑒別用作治療藥劑的新型阻滯劑，該試驗(yàn)包含下面的步驟篩選可能的治療藥劑模擬本發(fā)明中配基的能力或者其與本發(fā)明中配基的同源性。本發(fā)明進(jìn)一步提供治療藥劑，它們是通過上述的篩選試驗(yàn)鑒別出來的。
有效的疫苗組分可以通過使用本發(fā)明確定的受體靶向機(jī)制信息來制備，例如有生物活性的肽模擬物。這些組分能夠防止細(xì)菌向粘膜上形成菌落或侵襲，并且誘導(dǎo)出具有阻滯、調(diào)理和殺菌作用的抗體。
由于CEACAM分子與癌癥和發(fā)育等過程有關(guān)，所以由本發(fā)明的配基確定的衍生自細(xì)菌的生物活性肽序列可以用于研究在癌癥和發(fā)育中CEACAM的作用。這些肽序列還可以作為潛在的抗癌藥劑，用來控制或者治療血管新生。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了CEACAM受體結(jié)合配基在制備用于治療或者預(yù)防疾病的藥物中的用途，所述疾病中CEACAM受體參與了導(dǎo)致這種疾病的病原物的細(xì)胞靶向，在這種藥物中，配基包含選自以下的氨基酸序列圖6所示的序列中463到863殘基、527到668殘基、527到863殘基、427到623殘基、427到668殘基以及427到863殘基，或者包含上述序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡并物或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物，或者其他次級加工產(chǎn)物。
優(yōu)選地，疾病選自下列疾病組成的組感染，呼吸道疾病、腫瘤性疾病以及與腫瘤病相關(guān)的病癥，和血管新生。
如以上所述的藥物在病原物感染粘膜或者通過粘膜進(jìn)入時是非常有用的。
這里描述的藥物在治療和預(yù)防由卡他莫拉菌導(dǎo)致的感染(疾病)時非常有用。但是這里描述的配基用于制備治療任何涉及CEACAM受體的疾病，例如腦膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血桿菌導(dǎo)致的疾病。
在一個特別優(yōu)選地實(shí)施方案中，疾病是中耳炎。
本發(fā)明的配基還可以被用于治療由其他口腔細(xì)菌導(dǎo)致的疾病，例如齲齒。
現(xiàn)在完全通過非限制性的實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行描述，這些實(shí)施例參考下述附圖。


圖1顯示了只有CEACAM1-Fc(1微克每毫升)可溶性受體構(gòu)建體(白色、左側(cè)的長棒)存在或者在CEACAM1 N-結(jié)構(gòu)域特異抗體YTH71.3(灰色、中間的長棒)存在時，與三個被固定在硝酸纖維素上的Mx菌株的相對結(jié)合水平。在每種情況中CD33-Fc的結(jié)合可以忽略(黑色，右側(cè)的長棒)。菌株1、2、3MX2(ATCC25238)，MX3，MX4(臨床分離株)。結(jié)合的確定使用斑點(diǎn)印跡上層覆蓋的方法，反應(yīng)的強(qiáng)度使用NIH Scion成像程序進(jìn)行光密度分析來定量。
圖2顯示在非解離(未加熱，泳道1)的條件或者煮沸10分鐘后(泳道2)的條件下分離出的菌株MX2蛋白的蛋白質(zhì)印跡。印跡上面覆蓋CEACAM1-Fc(1微克每毫升)孵育，用與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗人Fc抗體以及辣根過氧化物酶的底物來檢測受體的結(jié)合。
圖3顯示了菌株MX2、MX3、MX4的變性全細(xì)胞裂解產(chǎn)物(分別在泳道1-3中)的蛋白質(zhì)印跡。印跡上面覆蓋CEACAM1-Fc(1微克每毫升；a)，抗UspA1肽抗體(10微克每毫升；b)以及抗UspA2肽抗體(10微克每毫升；c)孵育。注意在三個菌株中CEACAM1-Fc結(jié)合蛋白和抗UspA1結(jié)合蛋白具有相似的遷移模式。殘余的未解離的蛋白大小約為250kD(由于使用了堿性磷酸酶測定，具有更高的靈敏度，所以在這里被檢測到)，與CEACAM1-Fc結(jié)合。這些僅僅被抗肽抗體微弱識別，大概是因?yàn)楹铣傻碾闹邪谋砦辉谖醋冃缘牡鞍字袥]有完全暴露，而隨著復(fù)合物的變性而逐漸暴露?？筓spA2抗體與表觀分子量大于200kD在煮沸后仍然未解聚的蛋白結(jié)合，這是UspA2蛋白所具有的一個性質(zhì)。
圖4顯示MX2的CEACAM1結(jié)合蛋白在電洗脫之后用胰蛋白酶消化的肽質(zhì)譜圖譜(4a)。輸入到ProFound蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)匯總于(4b)。鑒定的前10個蛋白以及其概率數(shù)值示于4c。排在第一位的候選者，這里是一個Z分值為2.34的UspA1蛋白，其詳細(xì)情況示于(4d)，其中顯示了匹配的肽的數(shù)目、它們在蛋白質(zhì)中的位置，該蛋白質(zhì)被覆蓋的百分比以及這里未匹配的肽的清單。
圖5顯示了MX2的UspA1經(jīng)過胰蛋白酶消化之后的片段的蛋白質(zhì)印跡。A使用二抗(分別在B和C中使用的山羊抗人Fc和山羊抗兔Ig的混合物)的對照印跡。B覆蓋CEACAM1-Fc以及山羊抗人Fc的印跡。C覆蓋親和純化的抗UspA1肽的兔抗體(ETNNHQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR)(參見圖6)，以及抗兔的免疫球蛋白的印跡。*＝具有分子量標(biāo)記的泳道--在左側(cè)標(biāo)示出來。用雙箭頭指明的肽與CEACAM1-Fc發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)(B)，也和抗UspA1肽的抗體發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)(C)。由于抗UspA1肽抗體與最低分子量的肽(箭頭所指)的結(jié)合，所以該CEACAM結(jié)合片段被鑒定為MX2的UspA1蛋白的天冬酰胺199到賴氨酸863(參見圖6)之間的C末端片段。
圖6顯示了MX2的UspA1蛋白的氨基酸序列。用粗體標(biāo)示了出用于在兔中制備免疫抗血清的UspA1特異的肽。CEACAM結(jié)合區(qū)域包含在劃線的MX2UspA1蛋白的C末端片段中。
圖7顯示了與CEACAM發(fā)生反應(yīng)的胰蛋白酶水解肽的分離。使用1毫克每毫升的胰蛋白酶處理卡他莫拉菌菌株MX2，在37攝氏度處理10分鐘。胰蛋白酶消化的樣品進(jìn)行SDS-PAGE。染色之后，對50kD的區(qū)域進(jìn)行電洗脫過夜。電洗脫出來的蛋白被凍干，用緩沖液重懸后上第二塊膠。膠的一部分轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。在印跡上覆蓋CEACAM1-Fc來確定與CEACAM發(fā)生反應(yīng)的肽條帶。
“*”指的是被送去作N末端序列分析的肽。
圖8顯示MX2的UspA1蛋白在胰蛋白酶消化之后的一個肽的氨基酸序列。所示的50kD胰蛋白酶水解肽(氨基酸463到863)結(jié)合CEACAM以及抗UspA1肽(氨基酸753到780，劃線的)的抗血清。該分子量大約為50kD的CEACAM結(jié)合肽的N末端序列是“ALESNVEEGL”，該序列出現(xiàn)在胰蛋白酶切割位點(diǎn)462號氨基酸之后。
圖9是一幅示意圖，顯示了擴(kuò)增產(chǎn)生uspA1基因片段用于進(jìn)行重組蛋白表達(dá)的引物的位置。由引物P4和P7擴(kuò)增出的DNA編碼CEACAM1結(jié)合位點(diǎn)，還設(shè)計和使用了通過該區(qū)域的其他引物(字母A至I)。
圖10顯示了重組片段4-7的序列。劃線的區(qū)域是具有CEACAM1反應(yīng)性的胰蛋白酶肽的N末端區(qū)域。片段4-7的預(yù)測分子量大約是26kD。加上組氨酸標(biāo)記的片段分子量約為28kD。截短的肽的位置用“T”標(biāo)示出來(參見圖13)。
圖11是一幅示意圖，顯示了用于重組UspA1肽的一般克隆、表達(dá)以及純化策略，如pQE30系統(tǒng)所表示。
圖12是載體pQE30的圖。
圖13顯示了CEACAM1-Fc在印跡覆蓋試驗(yàn)中與重組子4-8的結(jié)合(泳道3)、與4-T的結(jié)合(泳道4)以及與4-7的結(jié)合(泳道5)。泳道1含有梅毒螺旋體對照重組肽，泳道2含有未誘導(dǎo)的包含4-8構(gòu)建體的M15的裂解產(chǎn)物。
圖14的蛋白質(zhì)印跡顯示了重組肽與抗組氨酸標(biāo)記抗體(上)以及與CEACAM-Fc(下)的反應(yīng)性。泳道2到4包含6-8肽，泳道1包含4-8肽作為對照。預(yù)測的肽遷移位置示于右側(cè)。兩個肽都與抗組氨酸標(biāo)記抗體結(jié)合。但是盡管4-8與CEACAM1-Fc結(jié)合，但是6-8則不然。
圖15顯示D-8肽與CEACAM1-Fc結(jié)合(泳道1)，但是不與用作對照的CD33-Fc結(jié)合(泳道2)。此肽的來源由其與抗組氨酸標(biāo)記抗體發(fā)生反應(yīng)得到證實(shí)(泳道3)。
圖16是一幅示意圖，顯示了重組rUspA1片段的相對大小和位置。使用了重組的4-7用于細(xì)菌阻滯試驗(yàn)——參見圖17。
圖17顯示，CHO-CEACAM1轉(zhuǎn)染子在沒有肽(A)的條件下孵育，或者與重組的對照肽(梅毒螺旋體肽)一起孵育(B)，或者與UspA1 r4-7肽(序列與MX2菌株的相應(yīng)，C和D)一起孵育。加入肽的濃度以及細(xì)菌如圖所示，孵育的時間為2小時。在孵育結(jié)束時，漂洗掉未結(jié)合的細(xì)菌，結(jié)合上的細(xì)菌使用抗卡他莫拉菌的多克隆抗血清以及與四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)偶聯(lián)的二抗進(jìn)行檢測。重組的卡他莫拉菌UspA1肽的濃度為1微克每毫升時，已經(jīng)對異源的卡他莫拉菌株(MX1)有了顯著的抑制，且濃度為10微克每毫升時，對于流感嗜血桿菌有顯著的抑制。
實(shí)施例1卡他莫拉菌株通過UspA1蛋白與人CECAM1-Fc結(jié)合在本研究中使用的卡他莫拉菌株(Mx)包括臨床分離物(MX3和MX4)以及從美國模式培養(yǎng)物保藏所購得的參考菌株(ATCC25238，該菌株的一個克隆培養(yǎng)物被命名為MX2)。
受體覆蓋試驗(yàn)顯示Mx與CEACAM1-Fc受體構(gòu)建體結(jié)合為了評價卡他莫拉菌株與CEACAM1的相互作用，將細(xì)菌(大約4-8×106個)加到硝酸纖維素膜上，空氣干燥后使用3％BSA-PBST封閉非特異位點(diǎn)。在硝酸纖維素條上覆蓋CEACAM1-Fc(1-2微克每毫升)或者同時加入CEACAM1的N端結(jié)構(gòu)域抗體YTH71.3。CD33-Fc(1-2微克每毫升)用作陰性對照。根據(jù)以前所述制備嵌合蛋白構(gòu)建體。通過偶聯(lián)辣根過氧化物酶或者堿性磷酸酶的山羊抗人Fc抗體檢測嵌合受體的結(jié)合。顯色底物分別用二氨基聯(lián)苯胺和過氧化氫或者硝基藍(lán)四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。所有的菌株都與CEACAM1-Fc結(jié)合，但是都不與CD33-Fc結(jié)合(圖1)。在單克隆抗體YTH71.3存在時受體的結(jié)合受到抑制，這提示該菌株與受體的N末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合。因此，所有的菌株與只包含N端結(jié)構(gòu)域的CEACAM1的截短的N-Fc構(gòu)建體都有很好的結(jié)合(未顯示結(jié)果)。
卡他莫拉菌中CEACAM1-Fc結(jié)合蛋白的鑒定將未經(jīng)過事先熱處理的或者在100攝氏度煮沸10分鐘的Mx的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物(大約3×107個細(xì)胞)加入到10％雙tris聚丙烯酰胺(Invitrogen)凝膠的各泳道中，在180伏電泳45分鐘。使用標(biāo)準(zhǔn)的印跡條件將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。根據(jù)上面的描述，將可溶性嵌合構(gòu)建體覆蓋在膜上。在每種情況下都觀察到與CEACAM1-Fc特異結(jié)合的單個蛋白。蛋白在凝膠上的遷移顯示為Mx的UspA1蛋白，因?yàn)榧?xì)菌的裂解產(chǎn)物在上樣時若沒有加熱變性則CEACAM1結(jié)合蛋白以＞200kD的表觀分子量遷移，如果裂解產(chǎn)物首先經(jīng)過變性，則CEACAM1結(jié)合蛋白以降低的分子量(大約92kD)遷移(圖2)。
抗UspA1的抗體而非抗類似蛋白UspA2的抗體與Mx菌株的CEACAM1-Fc結(jié)合蛋白有結(jié)合根據(jù)出版的卡他莫拉菌的UspA蛋白的序列設(shè)計肽。即ETNNRQDQKIDQLGYALKEQGQHFNNR(UspA1肽)以及KDEHDKLITANKTAIDANKAS(UspA2肽)。肽通過N末端的半胱氨酸殘基與KLH偶聯(lián)，偶聯(lián)的肽用于免疫兔(每只兔200微克肽)，免疫間隔14天。開始使用完全弗氏佐劑，之后使用不完全弗氏佐劑。在第0天和免疫之后每隔14天進(jìn)行采血。使用與AminoLink Plus柱(Pierce)偶聯(lián)的適宜的肽來純化多克隆抗體。在蛋白質(zhì)印跡覆蓋試驗(yàn)中使用UspA特異的抗體，濃度為1-10微克每毫升，抗體的檢測使用偶聯(lián)堿性磷酸酶的山羊抗兔二抗。印跡的顯色如前所述。三個Mx菌株的CEACAM1-Fc結(jié)合蛋白在SDS-PAGE上的遷移與UspA1抗體結(jié)合蛋白的遷移相同，但是與UspA2抗體結(jié)合蛋白的遷移不同(圖3)。
與CEACAM1-Fc共沉淀的卡他莫拉菌配基被確定為UspA1細(xì)菌的過夜培養(yǎng)物用含有100mM的辛基βD吡喃葡萄糖苷的PBSB重懸，其中含有蛋白酶抑制劑混合物(圖；1mM PMSF，1mM E-64，1μM胃蛋白酶抑制劑A，6nM苯丁抑制素以及100μM EDTA)。樣品在4攝氏度不斷混和過夜。同時將100微升與SepharoseCL-4B偶聯(lián)的蛋白A(Sigma)與20微克的CEACAM1-Fc或者CD33-Fc(做為對照使用)一同孵育，在4攝氏度過夜。然后用PBSB漂洗3次，去掉任何未結(jié)合的受體。15000g離心30分鐘去除不溶的細(xì)菌物質(zhì)?？扇苄缘奶崛∥锓謩e與兩種受體-蛋白A-Separose復(fù)合物之一同在4攝氏度孵育2小時。(比例為5×108個細(xì)菌每微克的受體構(gòu)建體)。在使用50mM的辛基βD吡喃葡萄糖苷和PBSB反復(fù)漂洗之后，在變性條件下用SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡分析樣品。
在與CEACAM1-Fc的共沉淀試驗(yàn)中，MX4產(chǎn)生了一個強(qiáng)烈染色的蛋白條帶(約97kD)，而MX3產(chǎn)生一條相對弱染色的蛋白條帶，約92kD。被共沉淀的蛋白的分子量與那些在受體覆蓋實(shí)驗(yàn)中觀察到的蛋白的分子量相符合(在圖3中顯示)。兩個蛋白都不與CD33-Fc共沉淀。由于被共沉淀的蛋白與抗UspA1肽的抗體結(jié)合，所以它們被進(jìn)一步確定為UspA1蛋白。此外，將MX4蛋白從凝膠上切下來之后，用MALDI-TOF質(zhì)譜對其進(jìn)行分析(見下面)。
通過MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定CEACAM1配基(a)Western覆蓋樣品。MX2和MX3的全細(xì)胞裂解產(chǎn)物在Trench膠中進(jìn)行SDS-PAGE。用電洗脫的方法將與CEACAM1-Fc結(jié)合配基相對應(yīng)的蛋白條帶洗脫出來。將樣品濃縮，加入第二塊膠中的一個泳道中，進(jìn)行電泳，然后對電泳之后適當(dāng)?shù)牡鞍走M(jìn)行膠內(nèi)胰蛋白酶消化。得到的肽使用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化-飛行時間(MALDI-TOF)質(zhì)譜進(jìn)行分析。圖4a顯示了得到的MX2的CEACAM結(jié)合蛋白質(zhì)譜圖譜的一個例子。得到的肽分子量輸入ProFound蛋白鑒定位點(diǎn)中，得到的結(jié)果如圖4b，c所示。在此有10個蛋白的分子量與卡他莫拉菌的UspA1蛋白經(jīng)過胰蛋白酶消化后產(chǎn)生的肽的預(yù)測分子量相配，該片段占UspA1蛋白的大約18％(圖4d)。估算的Z分值為2.34，有力地提示該蛋白是UspA1(Z分值高于1.65就是高于95％；http//129.85.19.192/profound_bin/webProFound.exe)。此外，經(jīng)類似分析，MX2的另一個非結(jié)合的高分子量條帶被確定為UspA2。類似地對于MX3菌株，CEACAM1結(jié)合和非結(jié)合蛋白被分別確定為UspA1和UspA2。
(b)共沉淀的樣品對于MX4，被CEACAM1-Fc共沉淀的蛋白(如上所述)也在一次全分類查詢中經(jīng)MALDI-TOF質(zhì)譜被確定為UspA1，Z分值為2.27。12個肽被匹配上，覆蓋了該蛋白的21％。
因此本研究確定在所述的參考和臨床菌株中卡他莫拉菌通過高分子量蛋白UspA1靶向人CEACAM1。
對UspA1和重組肽的酶切(a)UspA1經(jīng)過胰蛋白酶酶切之后的肽與CEACAM1-Fc結(jié)合使用0.1-1毫克每毫升的胰蛋白酶(Sigma)處理MX2細(xì)菌懸液(1010個細(xì)胞每毫升)，在37攝氏度孵育1-4小時。消化后的裂解產(chǎn)物用SDS-PAGE緩沖液解離，煮沸并且上樣進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上之后，使用受體構(gòu)建體CEACAM1-Fc或者親和純化的抗UspA1肽抗體覆蓋印跡。與受體反應(yīng)的小片段也與抗UspA1的特異抗體結(jié)合(圖5)。
(b)卡他莫拉MX2菌株UspA2蛋白的CEACAM結(jié)合結(jié)構(gòu)域的定位使用1毫克每毫升的胰蛋白酶處理MX2細(xì)菌懸液，37攝氏度孵育10分鐘。
胰蛋白酶消化的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。染色后，對50kD區(qū)域進(jìn)行過夜電洗脫。凍干電洗脫出的蛋白，用緩沖液重懸，上第二塊膠。膠的一部分轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，通過使用CEACAM1-Fc的蛋白質(zhì)印跡覆蓋，確定了與CEACAM反應(yīng)的肽條帶(圖7)。
對應(yīng)于分子量大約50kD和大約150kD的肽進(jìn)行N末端測序。N末端的序列是ALESNVEEGL(大約50kD的肽)和ALESNV(大約150kD的肽)。150kD的蛋白顯然是50kD蛋白的三聚體，因?yàn)樗鼈冇邢嗤腘末端序列。該MX2UspA1肽的N末端序列示于圖8。
(c)重組肽構(gòu)建的由圖6所示的序列中1-449號氨基酸組成的N末端重組MX2肽與CEACAM不發(fā)生結(jié)合。這進(jìn)一步顯示大約50kD的胰蛋白酶消化后的肽(由圖8所示的序列中的463-863號氨基酸組成)，具有包含CEACAM結(jié)合結(jié)構(gòu)域的ALESNVEEGL的N末端序列。
實(shí)施例2在粘膜病原物的多重毒力決定簇上確定受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域腦膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血桿菌通過與CEACAM上的重疊位點(diǎn)結(jié)合的配基靶向人CEACAM分子。本發(fā)明的Mx配基也靶向N結(jié)構(gòu)域?yàn)?。這些觀察結(jié)果顯示了一個令人興奮的可能性，即受體靶向可能涉及許多粘膜病原物配基上的相似特征。
由于Nm和Hi與CEACAM的相互作用受到在表面表達(dá)的可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征影響，這提示它們可能包含相似的關(guān)鍵氨基酸，這些氨基酸的空間構(gòu)型使它們能夠與受體結(jié)合，這些關(guān)鍵氨基酸可能在可變蛋白中是保守的。確實(shí)，我們的研究和其他人的研究提示Opa的兩個高變環(huán)(HV1和HV2)可能參與CEACAM靶向9.18。一項(xiàng)有力的技術(shù)可以確定配基和受體之間相互作用的可能決定簇，該技術(shù)是噬菌體展示，它可以用于確定模擬表位(模擬結(jié)合結(jié)構(gòu)域的隨機(jī)序列)19以及適體(與抑制配基結(jié)合的初始結(jié)構(gòu)更為接近的序列)20。
本發(fā)明還使下面的情況變得十分可行，即與CEACAM結(jié)合的Mx配基結(jié)構(gòu)域會做為其他結(jié)合CEACAM的粘膜病原物的模擬物，并且該配基的結(jié)構(gòu)特征會有助于確定在Nm和Hi的配基靶向CEACAM的N端結(jié)構(gòu)域所需的重要特點(diǎn)。Mx結(jié)構(gòu)域的抗體可能具有確定其他能夠靶向受體中相同、相似或者相近位置區(qū)域的配基的潛力。
目前正在使用已知的蛋白質(zhì)工程方法以及重組DNA技術(shù)來開展確定MX2 UspA1中最小CEACAM1結(jié)合結(jié)構(gòu)域的工作。可以通過以上描述的受體覆蓋試驗(yàn)在體外篩選重組肽，以檢測與受體結(jié)合的MX2結(jié)構(gòu)域。組氨酸標(biāo)記的肽可以在鎳柱上分離，并根據(jù)需要進(jìn)行切割，并用于免疫兔和小鼠，以得到抗體，用于進(jìn)一步的研究。
可以通過檢查其免疫刺激性質(zhì)以及其他功能例如對受體結(jié)合的阻滯，來確定對于生物應(yīng)用具有適宜長度的肽。
實(shí)施例3受體與配基相互作用所需的重要特征由于CEACAM的N端結(jié)構(gòu)域足以使CEACAM與Opa蛋白相互作用，本發(fā)明的發(fā)明者正在使用噬菌體展示技術(shù)，也對CEACAM N端結(jié)構(gòu)域的粘附表位進(jìn)行研究。本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)使用對受體的丙氨酸掃描突變研究了受體上的配基結(jié)合區(qū)域的信息，此研究對于本研究是有所幫助的。還有對于這種情況，也可用配基覆蓋試驗(yàn)對于攜帶有受體序列的嵌合噬菌體進(jìn)行生物淘選(親和濃縮)。
受體類似物具有阻滯多種菌株的潛能，這與產(chǎn)生的Opa蛋白類型無關(guān)，因?yàn)槲覀兊难芯恳呀?jīng)顯示盡管Opa蛋白具有抗原變異，但是對于初級粘附，不同的Opa蛋白需要受體上具有相同的性質(zhì)。另外有趣的是，注意到CEA抗原從腸道粘膜上脫落，并且有可能阻滯大腸桿菌菌株的粘附，而已知大腸桿菌也靶向CEACAM。這已經(jīng)被提出做為一個先天免疫應(yīng)對腸內(nèi)病原物的機(jī)制。因此這些受體類似物用作治療藥劑。
實(shí)施例4與CEACAM結(jié)合的重組卡他莫拉菌UspA1肽的制備概述沿著UspA1的全長由PCR擴(kuò)增出許多片段，使用如圖9所示的引物。如下描述獲得重組肽。在第一輪，發(fā)現(xiàn)與CEACAM1結(jié)合的重組肽由P4和P8引物擴(kuò)增得到的DNA編碼，而不是由P1和P5之間的DNA區(qū)域編碼，而且，P4到P7區(qū)域重組子與CEACAM1結(jié)合，而P6到P8區(qū)域的不能。在P4到P7區(qū)域內(nèi)還使用了其他的引物。D-7區(qū)域保留了與CEACAM結(jié)合的性質(zhì)。4-7片段的序列示于圖10。
對于重組UspA1肽的一般克隆、表達(dá)以及純化策略使用pBAD系統(tǒng)制備UspA1片段1-5。所需的PCR產(chǎn)物以TA克隆到pBAD載體中，并且使用TOP10大腸桿菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增。剩余的步驟如圖11所示，唯一的區(qū)別在于使用阿拉伯糖誘導(dǎo)pBAD。使用pBAD和pQE30(圖11)兩個系統(tǒng)制備片段4-7，得到相似的與CEACAM結(jié)合結(jié)果。剩余的片段使用圖11中的策略進(jìn)行制備。
載體和pQE30表達(dá)系統(tǒng)使用pQE30載體(圖12)以及大腸桿菌菌株M15。M15包含質(zhì)粒pREP4，該質(zhì)粒編碼一個抑制因子，該因子抑制了克隆到pQE30載體中DNA的轉(zhuǎn)錄。加入IPTG濃度達(dá)到1mM抑制了該抑制因子的編碼，則克隆到pQE30中的片段得到轉(zhuǎn)錄。
克隆策略首先將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pCR2.1中。這樣產(chǎn)生了一個穩(wěn)定的宿主，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過限制性酶切(BamHI/PstI)進(jìn)行回收，這也保證了基因片段的兩端都已被切割。pQE30也進(jìn)行類似的酶切并且用凝膠純化回收酶切后的載體，這也保證了兩個限制性位點(diǎn)都已被切割。已經(jīng)酶切的pQE30和UspA1擴(kuò)增產(chǎn)物使用T4DNA連接酶在16攝氏度連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入用氯化鈣處理的大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞中。在含有氨芐青霉素(100微克每毫升)和卡那霉素(25微克每毫升)的LB瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取4-8個菌落在添加有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3-4毫升的培養(yǎng)物離心得到菌體，用堿裂解的方法小量提取質(zhì)粒。經(jīng)過純化的載體如上所述進(jìn)行酶切，檢查uspA1插入片段。包含具有正確插入片段大小的pQE30載體的細(xì)菌在50毫升培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)物用IPTG誘導(dǎo)(見下面)。然后使用蛋白質(zhì)印跡篩選重組蛋白的表達(dá)。此外還對載體進(jìn)行測序，以確定插入片段是否是正確的DNA區(qū)域，并且檢查是否有任何的序列錯誤。
表達(dá)和純化包含pQE30/uspA1構(gòu)建體的M15生長在含有氨芐青霉素(100微克每毫升)和卡那霉素(25微克每毫升)的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)直至OD600＝0.5，然后加入IPTG至濃度為1mM。培養(yǎng)物進(jìn)一步培養(yǎng)3-4小時，離心回收菌體。菌體沉淀物在緩沖液B(8M尿素，50mMTris，10％乙醇，2％Tween，5mM咪唑，pH7)中增溶1-3小時，20,000g離心20分鐘出去膜物質(zhì)。上清與鎳樹脂一起在搖床上孵育1-2小時，然后通過聚丙烯柱。用5-10毫升緩沖液B漂洗剩余的樹脂，使用0.5毫升的洗脫緩沖液(緩沖液B中加入100mM咪唑)洗脫結(jié)合上的蛋白。洗脫的蛋白用SDS-PAGE檢查，然后進(jìn)行透析去掉尿素和其他的鹽類。
重組片段A片段1-5和4-8這些由pBAD系統(tǒng)制備的片段顯示1-5不與CEACAM1結(jié)合而4-8與CEACAM1結(jié)合。
B使用pQE30系統(tǒng)制備的片段4-8，4-8T，4-7以及6-8片段4-8是第一個制備的重組UspA1片段，在印跡覆蓋試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)它與CEACAM1高度親和地結(jié)合。除了全長的4-8重組UspA1肽以外，還觀察到一個較小的、截短的蛋白。該肽(命名為4-T)也與CEACAM1結(jié)合，看起來其表達(dá)水平比4-8要低(圖13)。對pQE30/4-T進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，由于一個錯配(CAA到TAA)導(dǎo)致在殘基谷胺酰胺624處出現(xiàn)一個終止密碼子(參見圖10)。
制備肽4-7和6-8以排除在6-8中出現(xiàn)第二個CEACAM結(jié)合位點(diǎn)的可能性。正如從肽4-T所預(yù)測的那樣，4-7顯示了與CEACAM的結(jié)合(圖13)，而6-8沒有與CEACAM結(jié)合(圖14)。
C由pQE30系統(tǒng)制備的片段D-8和D-7發(fā)現(xiàn)rUspA1片段D-8(圖15)以及D-7(未顯示)與CEACAM1都結(jié)合。
重組肽4-7的生物活性卡他莫拉菌菌株MX1以及流感嗜血桿菌菌株Rd與轉(zhuǎn)染了CEACAM1的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞結(jié)合。它們的結(jié)合可以被卡他莫拉菌的UspA1重組肽4-7抑制，但是不能被對照肽抑制(圖17)。
參考文獻(xiàn)1.Cartwright，K.et al.1995.In Meningococcal Disease.John Wiley &Sons.
2.van Alphen，L.& van Ham，S.M..1994.Rev Med Microbiol 5245.
3.Foxwell，A.R.et al.1998.Microbiol Mol Biol Rev 62294.
4.van Alphen，L.et al.1995.Am J Respir Crit Care Med 1512094.
5.Karalus，R.et al.2000.Microbes & Infection 256.Kraft，M.2000.Clin Chest Med 21301.
7.Virji，M.et al.1996.Mol Microbiol 22929.
8.Virji，M.et al.1996.Mol Microbiol 22941.
9.Virji，M.et al.1999.Mol Microbiol 34538.
10.Virji，M.et al.2000.Mol Microbiol 36784.
11.Hill，D.et al.2001 Mol Microbiol 39850.
12.Hammarstrm，S.1999 Cancer Biol 967.
13.Stephens，D.S.1989.Clin Microbiol Rev 2S104.
14.Virji，M.et al.1991.Mol Microbiol 51831.
15.Achtman，M.1995 Trends Microbiol 3186.
16.Merz，A.J.& So，M.2000 Annu Rev Cell Dev Biol 16423.
17.Woods，J.P.& Cannon，J.G.1990 Infect Immun 58569.
18.Wang，L-F & Yu，M.1996 In Methods Mol Biol 66269(Morris，G.E.ed).Humana Press.
19.Colman-Lerner.2000.Trends Guide p.56(Wilson，E.ed.).
20.Beauchemin，N.，et al.，1999 Exp Cell Res 252243-249.
21.Boulton I.C.& Gray-Owen S.D.2002 Nat Immunol 3(3)229-36.
22.Chen T.et al.，2001 J Leukoc Biol 70(2)335-40.
23.Lafontaine，E.R.，et al.，2000 J Bacteriol 1821364-1373.
24.Virji，M.2001 Trends in Microbiology，9258-259.
權(quán)利要求
1.包含CEACAM受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配基，所述的配基由選自以下的氨基酸序列組成圖6所示序列的殘基463-864、527-668、527-863、427-623、427-668以及427-863，或者所述的配基由上述序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡并物或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物或者其他的次級加工產(chǎn)物組成。
2.包含根據(jù)權(quán)利要求1的配基以及一或多種藥物上可以接受的佐劑、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或者防腐劑的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物用于治療或者預(yù)防感染的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物用于治療或者預(yù)防任何涉及CEACAM受體的疾病的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，用于治療或者預(yù)防感染、呼吸道疾病、腫瘤病以及與腫瘤相關(guān)的病癥和血管新生。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中的任何一項(xiàng)的用途，其中感染是粘膜感染或者通過粘膜出現(xiàn)的感染。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中的感染是由腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌或者卡他莫拉菌引發(fā)的。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的藥物用于治療或者預(yù)防中耳炎的用途。
9.用于鑒定做為治療劑的新型阻滯劑的篩選試驗(yàn)，該試驗(yàn)包含篩選可能的治療劑的模擬根據(jù)權(quán)利要求1中配基的能力或者其與根據(jù)權(quán)利要求1中配基的同源性。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求1的配基以及一或多種藥物上可以接受的佐劑、媒介物、賦形劑、粘合劑、載體或者防腐劑的疫苗。
11.對有需要的個體治療或預(yù)防感染的方法，該方法包含給服有效量的根據(jù)權(quán)利要求2的藥物。
13.基本上根據(jù)本發(fā)明前面參考附圖中的圖6所描述并由圖6給予圖解的配基。
14.基本上根據(jù)本發(fā)明前面所描述的包含權(quán)利要求13的配基的藥物。
15.CEACAM受體結(jié)合配基在生產(chǎn)用于治療或者預(yù)防一些疾病的藥物中的用途，所述疾病中CEACAM受體涉及致病病原物的細(xì)胞靶向，其中該配基包含選自以下的氨基酸序列圖6所示序列的殘基463-864、527-668、527-863、427-623、427-668以及427-863；或者所述的配基包含上述氨基酸序列的片段、同源物、功能等價物、衍生物、簡并物或羥基化、磺化或糖基化產(chǎn)物或者其他的次級加工產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中所述疾病選自感染、呼吸道疾病、腫瘤病和與腫瘤相關(guān)的病癥以及血管新生。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或者16的用途，其中病原物感染粘膜或者通過粘膜進(jìn)入。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17中任何一項(xiàng)的用途，其中導(dǎo)致疾病的病原物選自腦膜炎奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用途，其中所述疾病是中耳炎。
全文摘要
本發(fā)明提供了從與CEACAM受體結(jié)合的卡他莫拉菌外膜蛋白中分離出的配基，所述的配基包含一個受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含選自所公開組的一個氨基酸序列，或者上述序列的一個片段、同源物、功能等價物、衍生物或羥基化、磺化或糖基化的產(chǎn)物或者其次級加工產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了包含所述配基的藥物和疫苗，以及它們在治療和預(yù)防感染中的用途。還提供了鑒定新型治療用化合物的篩選方法。
文檔編號A61K39/00GK1705678SQ200380101766
公開日2005年12月7日 申請日期2003年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月2日
發(fā)明者M·沃基 申請人:布里斯托爾大學(xué)