本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)?zhí)杙ct/us2012/059962，國(guó)際申請(qǐng)日為2012年10月12日，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段申請(qǐng)?zhí)枮?01280050484.x，進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段日期為2014年4月14日，發(fā)明名稱為“bace1的肽抑制劑”的分案申請(qǐng)。序列表本申請(qǐng)包含序列表，其已經(jīng)通過(guò)efs-web以ascii格式提交，并且通過(guò)引用完全結(jié)合在本文中。所述ascii副本，于2012年9月27日生成，命名為gne0394p.txt，大小為52，415字節(jié)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及作為bace1拈抗劑的肽，例如，其抑制或減少bace1活性，并且涉及包含所述肽的組合物。另外的實(shí)施方案包括治療多種神經(jīng)疾病或病癥的方法，以及減少患者中的aβ多肽的方法。背景淀粉狀變性(amyloidosis)不是一種單一的疾病實(shí)體，而是多樣化組的進(jìn)行性疾病過(guò)程，其特征在于稱為淀粉狀蛋白的蠟狀、淀粉樣蛋白的細(xì)胞外組織沉積，淀粉狀蛋白積聚在一個(gè)或多個(gè)器官或機(jī)體系統(tǒng)中。隨著淀粉狀蛋白沉積的積聚，它們開(kāi)始干擾所述器官或機(jī)體系統(tǒng)的正常的功能。存在至少15種不同類型的淀粉狀變性。主要形式為沒(méi)有已知前例的原發(fā)性淀粉狀變性、伴隨一些其他狀況的繼發(fā)性淀粉狀變性和遺傳性淀粉狀變性。多種衰老疾病是基于淀粉狀蛋白樣蛋白或與淀粉狀蛋白樣蛋白相關(guān)，并且部分特征在于淀粉狀蛋白或促進(jìn)發(fā)病機(jī)制以及疾病進(jìn)展的淀粉狀蛋白樣物質(zhì)的細(xì)胞外沉積的積聚。這些疾病包括，但不限于，神經(jīng)病癥，諸如阿爾茨海默病(alzheimer′sdisease，ad)，雷維小體癡呆(lewybodydementia)；唐氏綜合征(down’ssyndrome)；遺傳性腦出血伴淀粉狀變性(hereditarycerebralhemorrhagewithamyloidosis)(荷蘭型)；關(guān)島帕金森-癡呆并發(fā)癥(guamparkinson-dementiacomplex)。基于或與淀粉狀蛋白樣蛋白相關(guān)的其他疾病是進(jìn)展性核上性麻痹(progressivesupranuclearpalsy)、多發(fā)性硬化(multiplesclerosis)、克-雅病(creutzfeldjacobdisease)、帕金森病、hiv相關(guān)的癡呆(hiv-relateddementia)、als(肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotropiclateralsclerosis))、成年型糖尿病(adultonsetdiabetes)、老年性心臟淀粉狀變性(senilecardiacamyloidosis)、內(nèi)分泌腫瘤以及其他，包括黃斑變性(maculardegeneration)。多肽β-淀粉狀蛋白(aβ)可能在阿爾茨海默病(ad)的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。vassar等，j.neurosci.(神經(jīng)科學(xué)雜志)29：12787-12794(2009)。aβ多肽在cns中的積聚導(dǎo)致突觸功能障礙、軸突變性和神經(jīng)元死亡。ad患者的腦表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)病理學(xué)損傷的特征性病理學(xué)，諸如神經(jīng)原纖維纏結(jié)(nfts)和富含淀粉狀蛋白的老年斑。淀粉狀蛋白斑的主要成分是aβ。這些損傷與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)神經(jīng)元群體的大量損失相關(guān)，并且其進(jìn)展伴有與ad相關(guān)的臨床癡呆。aβ是前體蛋白β淀粉狀蛋白前體蛋白(β-app或app)的蛋白水解產(chǎn)物。app是i型跨膜蛋白，其相繼被兩種蛋白酶，即β-和γ-分泌酶切割。β-分泌酶，被稱為β-位淀粉狀蛋白前體蛋白切割酶1(β-siteamyloidprecursorproteincleavingenzyme1，bace1)，其首先切割app以暴露aβ的n-端，由此產(chǎn)生稱為c99的膜結(jié)合的片段。vassar等，j.neurosci.(神經(jīng)科學(xué)雜志)，29：12787-12794(2009)和uniprotkb/swiss-protentryp56817(bace1_human)。然后γ-分泌酶能夠切割c99產(chǎn)生成熟的aβ多肽。產(chǎn)生的aβ具有長(zhǎng)度為38個(gè)氨基酸至43個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的異源c端。42個(gè)氨基酸形式的aβ(aβ42)是原纖維形式的aβ，并且在患有唐氏綜合癥的患者中過(guò)量產(chǎn)生，并且已經(jīng)提示其在ad的早期發(fā)病機(jī)制中起作用。vassar等，j.neurosci.(神經(jīng)科學(xué)雜志)29：12787-12794(2009)。因此，由于對(duì)其的抑制可能抑制aβ產(chǎn)生，bace1已經(jīng)成為治療靶標(biāo)。事實(shí)上，bace1敲除小鼠(bace1-/-)不產(chǎn)生腦aβ，這證實(shí)了bace1是負(fù)責(zé)腦中產(chǎn)生aβ的主要的酶(如果不是唯一的酶)。roberds等，humanmol.genetics(人分子遺傳學(xué))10：1317-1324(2001)。此外，ad模型中的bace1敲除小鼠不形成淀粉狀蛋白斑；認(rèn)知缺陷和膽堿功能性功能障礙也得到恢復(fù)。mcconlogue等，j.biol.chem.(生物化學(xué)雜志)282：26326-26334(2007)；ohno等，neuron(神經(jīng)元)41：27-33(2004)；和laird等，j.neurosci.(神經(jīng)科學(xué)雜志)25：11693-11709(2005)。另外，bace1雜合敲除小鼠具有減少的斑形成，這表明斑減少不需要bace1活性的完全抑制。mcconlogue等，j.biol.chem.(生物化學(xué)雜志)282：26326-26334(2007)。bace-1(hussain，i.等(1999)molcellneurosci(分子細(xì)胞神經(jīng)科學(xué))14：419-27；sinha，s.等(1999)nature(自然)402：537-40；vassar，r.等(1999)science(科學(xué))286：735-41；yan，r.等(1999)nature(自然)402：533-7；lin，x.等(2000)procnatlacadsciusa(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))97：1456-60)及其與底物樣擬肽抑制劑om99-2的復(fù)合的結(jié)構(gòu)(hong，l.等(2000)science(科學(xué))290：150-3)的發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了制藥研發(fā)的新時(shí)代，促進(jìn)多種類型的bace1抑制劑的研發(fā)。第一波抑制劑是小分子擬肽(luo，x.等intjclinexppathol(臨床實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志)3：618-28)，其尚待顯示臨床成功性，部分是由于穿過(guò)血腦屏障(bbb)的挑戰(zhàn)。隨后，多種基于片段和非肽方法已經(jīng)產(chǎn)生了更適于穿過(guò)bbb遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)的化合物(silvestri，r.(2009)medresrev(醫(yī)藥研究綜述)29：295-338；luo，x.等(2010)intjclinexppathol(國(guó)際臨床實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志)3：618-28)。最近，已經(jīng)出現(xiàn)了抗體的研發(fā)(pul，r.等(2011)expertopinbiolther(生物治療的專家觀點(diǎn))11：343-57)。第一類靶向aβ并且將其從循環(huán)中清除，作用為調(diào)節(jié)cns中aβ水平的接收池(sink)。最新一類抗體通過(guò)結(jié)合在外部靶向bace1本身并且作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(atwal，j.k.等(2011)scitranslmed3：84ra43；zhou，l.等(2010)j.biol.chem.(生物化學(xué)雜志)286：8677-8687)。在小鼠和食蟹猴中，抗-bace1不僅減少外周aβ水平，而且還令人驚訝地減少在腦脊液(csf)中的aβ水平。進(jìn)一步改造該抗體通過(guò)雙特異性抗-bace1抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體結(jié)合受體介導(dǎo)的穿過(guò)bbb的胞轉(zhuǎn)作用已經(jīng)導(dǎo)致cns中aβ更有效的藥效學(xué)減少(yu，y.j.等(2011)scitranslmed3：84ra44)。具有有效的bace1治療抑制劑減少患有神經(jīng)疾病和病癥如ad的患者中的aβ產(chǎn)生將是有益的。本文提供的本發(fā)明涉及這樣的抑制劑，包括其在多種方法中的應(yīng)用。本文引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)和公布，通過(guò)引用完全結(jié)合在本文中。發(fā)明概述本發(fā)明提供bace1的肽和多肽抑制劑以及使用其的方法。具體地，所述肽或多肽抑制或減少bace1活性。如下文所述，使用展示在噬菌體顆粒上的首次用于實(shí)驗(yàn)的肽文庫(kù)首先選擇結(jié)合劑，然后篩選抑制劑。這導(dǎo)致以非經(jīng)典方式結(jié)合在活性位點(diǎn)的有效種類的肽抑制劑的發(fā)現(xiàn)。這些肽在兩種酶測(cè)定和基于細(xì)胞的測(cè)定中抑制bace1，導(dǎo)致aβ肽的減少。該肽本身和與bace1復(fù)合的結(jié)構(gòu)顯示出一種之前在蛋白水解酶的活性位點(diǎn)中沒(méi)有觀察到的新型結(jié)合方式。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合bace1的分離的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列x1-s-x2-y-c-r-l-x3-x4-x5-x6-c-(x7)n(seqidno：6)，其中x1是谷氨酸或天冬氨酸；其中x2是甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸；其中x3是亮氨酸或甲硫氨酸；其中x4是甘氨酸、絲氨酸或丙氨酸；其中x5是亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸；其中x6是甘氨酸或丙氨酸；其中x7是甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，并且其中n是0或1。在不同實(shí)施方案中，n是0(seqidno：7)。在其他實(shí)施方案中，n是1(seqidno：8)。在一個(gè)實(shí)施方案中，x3是亮氨酸(seqidno：9)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，x4是甘氨酸(seqidno：10)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，x5是異亮氨酸(seqidno：11)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，x6是甘氨酸(seqidno：12)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，x7是甘氨酸(seqidno：13)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含選自由下列各項(xiàng)組成的組的氨基酸序列的分離的多肽：keesiycrlmglgcg(seqidno：14)(bace018)，nelspycrlmglgcd(seqidno：15)(bace019)，neesmycrllgigcg(seqidno：16)(bace20)和peeslycrllalgcg(seqidno：17)(bace021)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含neesmycrllgigcg(seqidno：16)的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含keesiycrlmglgcg(seqidno：14)的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含nelspycrlmglgcd(seqidno：15)的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含peeslycrllalgcg(seqidno：17)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供基本上由選自由下列各項(xiàng)組成的氨基酸序列組成或由選自由下列各項(xiàng)組成的氨基酸序列組成的分離的多肽：keesiycrlmglgcg(seqidno：14)，nelspycrlmglgcd(seqidno：15)，neesmycrllgigcg(seqidno：16)和peeslycrllalgcg(seqidno：17)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽基本上由neesmycrllgigcg(seqidno：16)的氨基酸序列組成或者由其組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽基本上由keesiycrlmglgcg(seqidno：14)的氨基酸序列組成或者由其組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽基本上由nelspycrlmglgcd(seqidno：15)的氨基酸序列組成或者由其組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽基本上由peeslycrllalgcg(seqidno：17)的氨基酸序列組成或者由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合bace1的分離的多肽，其中所述多肽包含氨基酸序列smycrllgigcg(seqidno：18)(bace31)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽包含氨基酸序列esmycrllgigcg(seqidno：19)(bace030)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽基本上由氨基酸序列esmycrllgigcg(seqidno：19)組成或由其組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合bace1的分離的多肽，其中所述多肽包含在相對(duì)于c端的位置-1和-8具有半胱氨酸、在相對(duì)于c端位置-7具有精氨酸或精氨酸類似物并且在相對(duì)于c端的位置-6具有亮氨酸的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在相對(duì)于c端的位置-7的氨基酸是精氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽在相對(duì)于c端的位置0，-2和-4包含小氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在相對(duì)于c端的位置0，-2和-4的氨基酸為甘氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽在相對(duì)于c端的位置-3包含疏水殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽在相對(duì)于c端的位置-5包含亮氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽在相對(duì)于c端的位置-9包含酪氨酸或苯丙氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在相對(duì)于c端的位置-9的氨基酸是酪氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽在相對(duì)于c端的位置-10包含大體積疏水殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽在相對(duì)于c端的位置-11包含絲氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽在相對(duì)于c端的位置-12包含酸性殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在相對(duì)于c端的位置-12的氨基酸是谷氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，在位置0，-2和-4的氨基酸是小氨基酸；其中在位置-3的氨基酸是疏水殘基；其中在位置-5的氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；其中在位置-7的氨基酸是精氨酸；其中在位置-9的氨基酸是酪氨酸或苯丙氨酸；其中在位置-10的氨基酸是大體積疏水殘基；其中在位置-11的氨基酸是絲氨酸；并且其中在位置-12的氨基酸是酸性氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在位置0，-2和-4的氨基酸是甘氨酸；其中在位置-3的氨基酸是疏水殘基；其中在位置-5的氨基酸是亮氨酸；其中在位置-7的氨基酸是精氨酸；其中在位置-9的氨基酸是酪氨酸；其中在位置-10的氨基酸是大體積疏水殘基；其中在位置-11的氨基酸是絲氨酸；并且其中在位置-12的氨基酸是谷氨酸。在不同的實(shí)施方案中，所述多肽包含選自表2和圖2中列出的bace結(jié)合肽的序列的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽直接與至少一個(gè)特定的bace1殘基相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，在位置-7的精氨酸與bace1的天冬氨酸32和天冬氨酸228形成鹽橋。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在位置-9的酪氨酸結(jié)合bace1的y環(huán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在位置-12的谷氨酸與bace1的精氨酸235形成鹽橋。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽結(jié)合bace1在p側(cè)的底物溝。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽結(jié)合bace1在p側(cè)的底物溝，其肽鍵朝向與底物方向相反的方向。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的多肽，所述多肽特異性結(jié)合bace1并且包含含有選自表2和圖2中列出的氨基酸序列的肽的氨基酸序列的c端、n端或中間氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述c端氨基酸序列選自keesiycrlmglgcg(seqidno：14)，nelspycrlmglgcd(seqidno：15)，esmycrllgigcg(seqidno：19)和peeslycrllalgcg(seqidno：17)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供任一種上述多肽，其中所述多肽與細(xì)胞毒性劑或增強(qiáng)細(xì)胞進(jìn)入的氨基酸序列標(biāo)簽綴合或融合。在不同實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性劑是化療劑或化療藥、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如，蛋白毒素，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述增強(qiáng)細(xì)胞進(jìn)入的氨基酸序列標(biāo)簽是細(xì)胞穿透肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白包括bace1結(jié)合肽與通常進(jìn)行通過(guò)血腦屏障的吸收介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)作用或受體介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)作用的蛋白的氨基酸序列的融合體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供與任一種上述多肽競(jìng)爭(zhēng)與bace1結(jié)合的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供任一種上述多肽，其中所述多肽抑制內(nèi)源性bace1蛋白水解活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合本發(fā)明的多肽的抗體或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的多肽的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供包含本發(fā)明的多肽和藥用載體的藥物制劑。在另外的實(shí)施方案中，提供編碼本發(fā)明的多肽的分離的核酸，以及包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸的載體。在另一個(gè)方面中，提供包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸的宿主細(xì)胞以及用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括在適于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明的多肽的核酸的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供治療患有神經(jīng)疾病或病癥的個(gè)體的方法，所述方法包括給所述個(gè)體施用有效量的本發(fā)明的多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供減少患有或有風(fēng)險(xiǎn)患上神經(jīng)疾病或病癥的患者中的淀粉狀蛋白斑或抑制淀粉狀蛋白斑形成的方法，所述方法包括給個(gè)體施用有效量的本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供減少患者中的aβ的方法，所述方法包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述患者患有或有風(fēng)險(xiǎn)患上神經(jīng)疾病或病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供抑制患者中的軸突變性的方法，所述方法包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的多肽。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述患者是哺乳動(dòng)物。在另一個(gè)方面中，所述患者是人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)疾病或病癥選自由下列各項(xiàng)組成的組：阿爾茨海默病(ad)，外傷性腦損傷(traumaticbraininjury)，卒中(stroke)，青光眼(glaucoma)，癡呆(dementia)，肌營(yíng)養(yǎng)不良(musculardystrophy，md)，多發(fā)性硬化(ms)，肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，als)，囊性纖維化(cysticfibrosis)，安吉爾曼綜合征(angelman’ssyndrome)，利德?tīng)柧C合征(liddlesyndrome)，佩吉特病(paget’sdisease)，外傷性腦損傷，雷維小體病(lewybodydisease)，脊髓灰質(zhì)炎后綜合征(postpoliomyelitissyndrome)，夏伊-德雷格綜合征(shy-draegersyndrome)，橄欖體腦橋小腦萎縮(olivopontocerebellaratrophy)，帕金森病，多系統(tǒng)萎縮(multiplesystematrophy)，紋狀體黑質(zhì)變性(striatonigraldegeneration)，核上性麻痹(supranuclearpalsy)，牛海綿狀腦病(bovinespongiformencephalopathy)，癢病(scrapie)，克-雅綜合征(creutzfeldt-jakobsyndrome)，庫(kù)魯病(kuru)，格-施-沙綜合征(gerstmann-straussler-scheinkerdisease)，慢性消耗性疾病(chronicwastingdisease)，家族致命性失眠癥(fatalfamilialinsomnia)，延髓性麻痹(bulbarpalsy)，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(motorneurondisease)，卡納范病(canavandisease)，亨廷頓病(huntington′sdisease)，神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病(neuronalceroid-lipofuscinosis，亞歷山大病(alexander′sdisease)，圖雷特綜合征(tourette′ssyndrome)，門(mén)克斯扭結(jié)發(fā)綜合征(menkeskinkyhairsyndrome)，科凱恩綜合征(cockaynesyndrome)，哈勒沃登-施帕茨綜合征(halervorden-spatzsyndrome)，拉福拉病(laforadisease)，雷特綜合征(rettsyndrome)，肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticulardegeneration)，萊施-奈恩綜合征(lesch-nyhansyndrome)，和翁-隆綜合征(unverricht-lundborgsyndrome)，癡呆(dementia)(包括，但不限于，皮克病(pick′sdisease)和脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellarataxia))。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)疾病或病癥是阿爾茨海默病。附圖簡(jiǎn)述本專利文件包含至少一幅彩色繪制的附圖。請(qǐng)求并繳納需要的費(fèi)用后，局方將提供帶有彩色附圖的本專利或?qū)＠嫉母北尽D1a顯示來(lái)源于噬菌體展示的線性肽和環(huán)肽文庫(kù)的平板分選的針對(duì)bace1的肽配體(按出現(xiàn)的順序分別為seqidnos21，56-61，21，62，56，63-68和22-24)的序列比對(duì)。bms1、bms2和bms4分別與之前所述的肽標(biāo)識(shí)符1、2和4相同(kornacker，m.g等(2005)biochemistry(生物化學(xué))44：11567-73)。圖1b顯示與已知的bace1抑制劑om99-2(標(biāo)識(shí)為“om99”)和抑制素相比，關(guān)于bace010和bace011(在該圖中分別標(biāo)識(shí)為“bace10”和“bace11”)的htrf酶活性測(cè)定的結(jié)果。圖1c顯示與bace1結(jié)合的肽-展示噬菌體與合成肽bms1的競(jìng)爭(zhēng)。柱表示在不存在(灰色)或存在(黑色)70nmbms1肽時(shí)的噬菌體elisa信號(hào)。噬菌體肽id如圖1a中所示。圖2顯示在存在bace010作為競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)來(lái)源于噬菌體展示的肽文庫(kù)的溶液分選的針對(duì)bace1的肽配體(按出現(xiàn)的順序分別為seqidnos26，14，69-73，15，74-78，16，79-86，17和87-95)的序列。bace017是在存在100μmbace010時(shí)由針對(duì)首次用于實(shí)驗(yàn)的肽文庫(kù)的bace1溶液淘選(solutionpanning)獲得的bace1結(jié)合肽配體。bace018-bace021是來(lái)源于bace017的親和力成熟的針對(duì)bace1結(jié)合肽的肽序列。列出噬菌體點(diǎn)elisa數(shù)據(jù)表示針對(duì)單個(gè)克隆的相對(duì)結(jié)合親和力。用elisa標(biāo)記的柱是針對(duì)bace1的噬菌體結(jié)合信號(hào)，s/n比率表示信號(hào)/噪聲比率，其中“信號(hào)”是在柱“elisa”中所示的數(shù)據(jù)，并且噪聲是作為背景非特異性結(jié)合的針對(duì)bsa的噬菌體結(jié)合信號(hào)。序列比對(duì)總結(jié)為logo表示(crooks等，genomeresearch(基因組研究)，14：1188-1190，(2004)；schneider和stephensrm.1990.nucleicacidsres.(核酸研究)18：6097-6100(1990))。選擇用pepid表示的肽進(jìn)行肽合成。圖3a顯示合成的bace1肽配體在htrf酶測(cè)定中的抑制性活性。bace1結(jié)合肽bace018-bace021在針對(duì)bace1的27-merhtrf底物的分解中表現(xiàn)出濃度依賴性抑制作用。與bace018-bace021對(duì)應(yīng)的肽，其中半胱氨酸殘基被絲氨酸置換(bace025-bace028)，其抑制bace1酶活性的能力有效性少得多。在該圖中，bace018-bac021和bace025-bace028分別標(biāo)識(shí)為bace-18-bace-21和bace25-bace-28。圖3b是顯示分別使用bace020、和小分子和肽抑制劑om99-2或bms1的生物素?；腷ace020競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合elisa的結(jié)果的圖表。圖4是顯示在細(xì)胞測(cè)定中bace1結(jié)合肽抑制aβ產(chǎn)生的圖表。與bace1抑制性抗體(抗-bace1)、bace1的小分子抑制劑(om99-2)、bace1的肽抑制劑(bms1)和bace1的小分子抑制劑(gsk-8e，charrier，等，j.med.chem.(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志)51：3313-3317(2008))相比，bace1結(jié)合肽bace017-bace021在293-happ細(xì)胞中表現(xiàn)出aβ產(chǎn)生的濃度依賴性的減少。使用4-參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序確定ic50值。圖5a顯示通過(guò)同核nmr光譜確定的溶液中bace020的結(jié)構(gòu)。圖5b顯示同與bace020復(fù)合的bace1(紅色)相比，未結(jié)合的bace1(藍(lán)色)的trosy光譜的比較。右圖突出顯示包括活性位點(diǎn)殘基asp32和asp228的特定的殘基的光譜的變化。圖5c顯示在bace1的活性位點(diǎn)溝(groove)和蓋(flap)中的bace1的結(jié)構(gòu)；當(dāng)結(jié)合bace020時(shí)具有受擾共振的那些bace1殘基顯示為紅色。圖6顯示與bace030復(fù)合的bace1的解析度的晶體結(jié)構(gòu)。圖6a顯示繪出在1σ(棕色網(wǎng)狀物)、與bace的活性位點(diǎn)結(jié)合的bace030肽的輪廓的電子密度圖譜。圖6b顯示游離的bace1(灰色)、與bace1(藍(lán)色)結(jié)合的bace030(綠色)和與bace1(粉色)結(jié)合的om99-2(小麥色)的晶體結(jié)構(gòu)?；钚晕稽c(diǎn)天冬氨酸殘基顯示為棒狀并且涂色為紅色。圖6c顯示具有bace030(綠色)和om99-2(洋紅色)的bace1復(fù)合物的重疊。在催化位點(diǎn)的天冬氨酸殘基顯示為紅色。圖6d顯示bace030(綠色)與bace1(橙色)的殘基的結(jié)合相互作用。水分子顯示為紅色球體。氫鍵顯示為紅色虛線。圖6e顯示具有棒狀的om99-2(洋紅色)和om03-4(青色)的bace1復(fù)合物的重疊。在不再與bace020結(jié)合的bace1突變體的情形中，bace1表面具有紅色表面，并且對(duì)bace030結(jié)合沒(méi)有作用的bace1突變體具有綠色表面。圖7a顯示與bace的活性位點(diǎn)結(jié)合的bace030肽的解析度的晶體結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)視圖。bace030顯示為黃色，bace1包含催化的天冬氨酸殘基的區(qū)域顯示為紅色，并且bace1的蓋區(qū)顯示為骨架蹤跡。圖7b顯示bace030的“精氨酸指”(arg6)與bace1的催化天冬氨酸殘基的相互作用。圖7c顯示bace030的tyr4與bace1的y-環(huán)的相互作用。圖7c公開(kāi)″leu8gly9leu10gly11″作為seqidno：96。發(fā)明實(shí)施方案詳述定義“分離的”當(dāng)指分子時(shí)是指已經(jīng)鑒定并且與其天然環(huán)境的成分分離和/或從中回收的分子。其天然環(huán)境的污染成分是干擾診斷或治療應(yīng)用的物質(zhì)?！盎钚浴倍嚯幕蚱淦伪Ａ羲龌钚远嚯牡奶烊换蛱烊淮嬖诘母北镜纳锘钚?。生物活性是指由所述活性多肽的天然或天然存在的副本介導(dǎo)的功能。例如，結(jié)合或蛋白-蛋白相互作用組成生物活性。術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”在最廣泛意義上可以互換使用，并且包括單克隆抗體(例如，全長(zhǎng)或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多價(jià)抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體，只要其展現(xiàn)出需要的生物活性)，并且還可以包括特定的抗體片段(如本文中更詳細(xì)所述)。抗體可以是嵌合的、人的、人源化的和/或親和力成熟的?！翱贵w片段”僅包含完整抗體的一部分，其中該部分優(yōu)選地保留當(dāng)該部分存在于完成抗體時(shí)通常與其相關(guān)的功能中的至少一種、優(yōu)選大部分或全部。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”用在本文中是指從一群基本上同質(zhì)的抗體中獲得的抗體，即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突變之外，構(gòu)成群體的各個(gè)抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，針對(duì)單一的抗原。此外，與典型地包括針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單個(gè)決定簇。本文的單克隆抗體具體包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來(lái)源于特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體中相應(yīng)的序列相同或同源，而該鏈的其余部分與來(lái)源于另一種物種或?qū)儆诹硪环N抗體種類或亞類的抗體中相應(yīng)的序列相同或同源，只要其表現(xiàn)出需要的生物活性(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；和morrison等，proc.natl.acad.sci.usa(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))81：6851-6855(1984))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式是最低限度包含來(lái)源于非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(接受體抗體)，其中所述接受體的高變區(qū)的殘基被具有需要的特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替換。在一些情況中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(fr)殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在接受體抗體或供體抗體中不存在的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上全部或至少一個(gè)、通常兩個(gè)這樣的可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或基本上所有的高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有的frs是人免疫球蛋白序列的frs。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)jones等，nature(自然)321：522-525(1986)；riechmann等，nature(自然)332：323-329(1988)；和presta，curr.op.struct.biol.(結(jié)構(gòu)生物學(xué)新觀點(diǎn))2：593-596(1992)。還參見(jiàn)下述綜述論文及其中引用的參考文獻(xiàn)：vaswani和hamilton，ann.allergy，asthma&immunol.(過(guò)敏、哮喘和免疫學(xué))1：105-115(1998)；harris，biochem.soc.transactions(生物化學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)報(bào))23：1035-1038(1995)；hurle和gross，curr.op.biotech.(現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn))5：428-433(1994)?！叭丝贵w”是具有與由人產(chǎn)生的抗體的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的抗體和/或使用本文公開(kāi)的任一種制備人抗體的技術(shù)制備的抗體。人抗體的這一定義特異性排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化的抗體?！坝H和力成熟的”抗體指這樣的抗體，在該抗體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdrs)中具有一處或多處改變，導(dǎo)致該抗體對(duì)抗原的親和力與沒(méi)有這些改變的親本抗體相比有提高。優(yōu)選的親和力成熟的抗體具有針對(duì)靶抗原的納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體由本領(lǐng)域已知的方法制備。marks等，bio/technology(生物技術(shù))10：779-783(1992)記述了通過(guò)vh和vl結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。cdr和/或構(gòu)架殘基的隨機(jī)誘變記述在：barbas等，procnat.acad.sciusa(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))91：3809-3813(1994)；schier等，gene(基因)169：147-155(1995)；yelton等j.immunol.(免疫學(xué)雜志)155：1994-2004(1995)；jackson等，j.immunol.(免疫學(xué)雜志)154(7)：3310-9(1995)；和hawkins等j.mol.biol.(分子生物學(xué)雜志)226：889-896(1992)?！皫П砦粯?biāo)簽的”多肽是指與“標(biāo)簽多肽”融合的嵌合多肽。所述標(biāo)簽提供這樣的表位，可以制備針對(duì)所述表位的抗體或針對(duì)所述表位的抗體是可獲得的，但是所述表位基本上不干擾多肽活性。為了減少抗-標(biāo)簽抗體與內(nèi)源性表位的反應(yīng)性，所述標(biāo)簽多肽通常是獨(dú)特的。適宜的標(biāo)簽多肽通常具有至少六個(gè)氨基酸殘基，通常約8-50個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選8-20個(gè)氨基酸殘基。表位標(biāo)簽序列的實(shí)例包括來(lái)自甲型流感病毒(influenzaavirus)的ha，gd，和c-myc，聚-his和flag?！岸嗪塑账帷被颉昂怂帷痹诒疚闹锌苫Q使用，是指任意長(zhǎng)度的核苷酸的聚合物，并且包括，但不限于，dna和rna。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或堿基和/或其類似物、或可以通過(guò)dna或rna聚合酶或通過(guò)合成反應(yīng)結(jié)合成聚合物的任意底物。多核苷酸可以包含修飾的核苷酸，諸如甲基化的核苷酸及其類似物。如果存在，可以在組裝聚合物之前或之后進(jìn)行核苷酸的修飾。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可以在合成后進(jìn)行進(jìn)一步修飾，諸如通過(guò)綴合標(biāo)記進(jìn)行修飾。其他類型的修飾包括，例如，“帽”，用類似物置換一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸，中間核苷酸修飾，諸如例如具有不帶電荷的鍵的那些(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺(phosphoamidates)、氨基甲酸酯(cabamates)等)和具有帶電荷的鍵的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，含有懸垂結(jié)構(gòu)部分的那些，所述懸垂結(jié)構(gòu)部分諸如例如，蛋白(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚-l-賴氨酸等)，具有嵌入劑(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的那些，含有螯合劑(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的那些，含有烷化劑的那些，具有修飾的鍵的那些(例如，α異頭核酸等)以及未修飾形式的多核苷酸。此外，在糖中通常存在的任一羥基可以被替換，例如，被磷酸酯基(phosphonategroups)、磷酸鹽基(phosphategroups)替換，被標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基保護(hù)，或被活化以產(chǎn)生針對(duì)另外的核苷酸的另外的鍵，或可以綴合到固體或半固體支持物上。5′和3′末端oh可以被磷酸化或被取代為1-20個(gè)碳原子的胺或有機(jī)加帽基團(tuán)結(jié)構(gòu)部分。其他羥基也可以被衍生為標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基。多核苷酸還可以包含本領(lǐng)域通常已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，包括，例如，2′-o-甲基-，2′-o-烯丙基，2’-氟-或2′-疊氮基-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-異頭糖，差向異構(gòu)體糖諸如阿拉伯糖、木糖或來(lái)蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無(wú)環(huán)類似物和無(wú)堿基核苷類似物諸如甲基核苷。一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯鍵可以被替換為備選的連接基團(tuán)。這些備選的連接基團(tuán)包括，但不限于，下述實(shí)施方案，其中磷酸酯被替換為p(o)s(″硫代酯″)，p(s)s(″二硫代酯″)，″(o)nr2(″酰胺化物″)，p(o)r，p(o)or′，co或ch2(″甲?；?formacetal)″)，其中每個(gè)r或r′獨(dú)立地是h或是任選地含有醚(--o--)鍵的取代的或未取代的烷基(1-20個(gè)c)，芳基，烯基，環(huán)烷基，環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。多核苷酸中的所有的鍵不需要是相同的。之前的描述適用于本文引用的所有多核苷酸，包括rna和dna?！肮押塑账帷庇迷诒疚闹型ǔＪ侵付痰?、一般是單鏈的、一般是合成的多核苷酸，其長(zhǎng)度通常但不是必須地少于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”和“多核苷酸”不互相排除。上文關(guān)于多核苷酸的描述同等且完全適用于寡核苷酸。“控制序列”用在本文中是允許可操作連接的編碼序列在特定宿主生物體中表達(dá)的dna序列。原核控制序列包括啟動(dòng)子、操縱子序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。真核孔子和序列包括啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。若核酸與另一核酸序列處于功能性關(guān)系中，則該核酸是“可操作連接”的。例如，若啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則其與該編碼序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點(diǎn)的位置促進(jìn)翻譯，則其與編碼序列可操作連接。通常，“可操作連接″指被連接的dna序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)序列的情況中指相鄰且處于相同閱讀框中。然而，增強(qiáng)子不必相鄰。術(shù)語(yǔ)“載體”當(dāng)在本文中使用時(shí)是指能夠增殖與其相連的另一個(gè)核酸的核酸分子。該術(shù)語(yǔ)包括作為自我復(fù)制核酸結(jié)構(gòu)的載體以及結(jié)合到已經(jīng)引入其的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作相連的核酸的表達(dá)。這樣的載體在本文中被稱為″表達(dá)載體″。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞系”和“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換地使用并且是指其中引入外源核酸的細(xì)胞，包括所述細(xì)胞的后代。宿主細(xì)胞包括“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”，其包括原代轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和來(lái)源于其的后代，而不考慮傳代的次數(shù)。后代在核酸含量上可能與親本細(xì)胞不完全相同，而是可以包含突變。本文中包括與在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物活性的突變體后代。除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“bace1”當(dāng)在本文中使用時(shí)是指來(lái)自任何脊椎動(dòng)物來(lái)源(包括哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如人)和嚙齒類動(dòng)物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然β-分泌酶1(也被稱為β-位淀粉狀蛋白前體蛋白切割酶1，膜相關(guān)天冬氨酸蛋白酶2，memapsin2，天冬氨酰蛋白酶2或asp2)。該術(shù)語(yǔ)包括“全長(zhǎng)”未加工的bace1以及由細(xì)胞內(nèi)加工產(chǎn)生的任何形式的bace1。該術(shù)語(yǔ)還包括天然存在的bace1的變體，例如，剪接變體或等位變體。示例性bace1多肽的氨基酸序列顯示在以下seqidno：1中，并且有人bace1、同種型a的序列，如在vassar等，science(科學(xué))286：735-741(1999)中報(bào)道的，該文獻(xiàn)通過(guò)引用完整地結(jié)合于本文中。maqalpwlllwmgagvlpahgtqhgirlplrsglggaplglrlpretdeepeepgrrgsfvemvdnlrgksgqgyyvemtvgsppqtlnilvdtgssnfavgaaphpflhryyqrqlsstyrdlrkgvyvpytqgkwegelgtdlvsiphgpnvtvraniaaitesdkffingsnwegilglayaeiarpddslepffdslvkqthvpnlfslqlcgagfplnqsevlasvggsmiiggidhslytgslwytpirrewyyeviivrveingqdlkmdckeynydksivdsgttnlrlpkkvfeaavksikaasstekfpdgfwlgeqlvcwqagttpwnifpvislylmgevtnqsfritilpqqylrpvedvatsqddcykfaisqsstgtvmgavimegfyvvfdrarkrigfavsachvhdefrtaavegpfvtldmedcgynipqtdestlmtiayvmaaicalfmlplclmvcqwcclrclrqqhddfaddisllk(seqidno：1)存在人bace1的一些其他的同種型，包括同種型b，c和d，以下分別顯示為seqidno：2，seqidno：3和seqidno：4。參見(jiàn)uniprotkb/swiss-protentryp56817，其通過(guò)引用完整地結(jié)合于本文中。maqalpwlllwmgagvlpahgtqhgirlplrsglggaplglrlpretdeepeepgrrgsfvemvdnlrgksgqgyyvemtvgsppqtlnilvdtgssnfavgaaphpflhryyqrqlsstyrdlrkgvyvpytqgkwegelgtdlvsiphgpnvtvraniaaitesdkffingsnwegilglayaeiarlcgagfplnqsevlasvggsmiiggidhslytgslwytpirrewyyeviivrveingqdlkmdckeynydksivdsgttnlrlpkkvfeaavksikaasstekfpdgfwlgeqlvcwqagttpwnifpvislylmgevtnqsfritilpqqylrpvedvatsqddcykfaisqsstgtvmgavimegfyvvfdrarkrigfavsachvhdefrtaavegpfvtldmedcgynipqtdestlmtiayvmaaicalfmlplclmvcqwcclrclrqqhddfaddisllk(seqidno：2)maqalpwlllwmgagvlpahgtqhgirlplrsglggaplglrlpretdeepeepgrrgsfvemvdnlrgksgqgyyvemtvgsppqtlnilvdtgssnfavgaaphpflhryyqrqlsstyrdlrkgvyvpytqgkwegelgtdlpddslepffdslvkqthvpnlfslqlcgagfplnqsevlasvggsmiiggidhslytgslwytpirrewyyeviivrveingqdlkmdckeynydksivdsgttnlrlpkkvfeaavksikaasstekfpdgfwlgeqlvcwqagttpwnifpvislylmgevtnqsfritilpqqylrpvedvatsqddcykfaisqsstgtvmgavimegfyvvfdrarkrigfavsachvhdefrtaavegpfvtldmedcgynipqtdestlmtiayvmaaicalfmlplclmvcqwcclrclrqqhddfaddisllk(seqidno：3)maqalpwlllwmgagvlpahgtqhgirlplrsglggaplglrlpretdeepeepgrrgsfvemvdnlrgksgqgyyvemtvgsppqtlnilvdtgssnfavgaaphpflhryyqrqlsstyrdlrkgvyvpytqgkwegelgtdllcgagfplnqsevlasvggsmiiggidhslytgslwytpirrewyyeviivrveingqdlkmdckeynydksivdsgttnlrlpkkvfeaavksikaasstekfpdgfwlgeqlvcwqagttpwnifpvislylmgevtnqsfritilpqqylrpvedvatsqddcykfaisqsstgtvmgavimegfyvvfdrarkrigfavsachvhdefrtaavegpfvtldmedcgynipqtdestlmtiayvmaaicalfmlplclmvcqwcclrclrqqhddfaddisllk(seqidno：4)同種型b顯示在seqidno：2中，并且與同種型a(seqidno：1)不同之處在于缺少氨基酸190-214(即，缺失seqidno：1的氨基酸190-214)。同種型c顯示在seqidno：3中，并且與同種型a(seqidno：1)不同之處在于缺少氨基酸146-189(即，缺失seqidno：1的氨基酸146-189)。同種型d顯示在seqidno：4中，并且與同種型a(seqidno：1)不同之處在于缺少氨基酸146-189和190-214(即，缺失seqidno：1的氨基酸146-189和190-214)。術(shù)語(yǔ)“肽”通常是指通過(guò)肽鍵連接的相鄰的且相對(duì)短的氨基酸序列。典型地，但是不是必需的，肽具有約2-50個(gè)氨基酸、4-40個(gè)氨基酸或10-30個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。盡管術(shù)語(yǔ)“多肽”通常是指較長(zhǎng)形式的肽，但是這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)在本發(fā)明的一些情形中可以互換使用并且已經(jīng)互換使用。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”和“殘基”在本文中互換使用。多肽的“區(qū)域”是2個(gè)以上氨基酸的相鄰序列。在其他實(shí)施方案中，區(qū)域是至少約任意3，5，10，15個(gè)相鄰的氨基酸。“c端區(qū)”、“c端序列”及其變化形式用在本文中是指位于或緊鄰多肽的c端末端的氨基酸序列。通常，該序列包含具有游離羧基的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，c端區(qū)或序列是指包含位于最接近多肽的c端的約1-15個(gè)殘基的多肽區(qū)域?！皀端區(qū)”、“n端序列”及其變化形式用在本文中是指位于或緊鄰多肽的n端末端的氨基酸序列。通常，該序列包含具有游離氨基的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，n端區(qū)或序列是指包含位于最接近多肽的n端的約1-15個(gè)殘基的多肽區(qū)域?！爸虚g區(qū)”、“中間序列”及其變化形式用在本文中是指位于多肽內(nèi)并且在其n端和c端兩端側(cè)連不是該序列的一部分的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列。通常，該序列不包含具有游離的羧基或氨基的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，中間區(qū)或序列是指包含位于多肽內(nèi)的約1-15個(gè)殘基的多肽區(qū)域，其中所述區(qū)域不包含c端或n端氨基酸?！坝H和力”指分子的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說(shuō)明，在用于本文時(shí)，“結(jié)合親和力”指反映結(jié)合對(duì)的成員之間1∶1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子x對(duì)其配偶體y的親和力通?？捎媒怆x常數(shù)(kd)來(lái)表述。親和力可通過(guò)本領(lǐng)域已知的常用方法來(lái)測(cè)量，包括本文中所描述的那些方法。下文記述了用于測(cè)量結(jié)合親和力的具體舉例說(shuō)明的和示例性的實(shí)施方案?！叭诤系鞍住笔侵妇哂泄矁r(jià)連接在一起的兩部分的多肽，其中每個(gè)部分來(lái)源于不同的蛋白。這兩個(gè)部分可以通過(guò)單一肽鍵直接連接或通過(guò)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的肽接頭連接。通常，這兩個(gè)部分和接頭彼此處在一個(gè)閱讀框中，并且使用重組技術(shù)產(chǎn)生?！安“Y”或“病理病況”是能夠受益于本發(fā)明的物質(zhì)/分子或方法的任意病況。這包括慢性和急性病癥或疾病，包括使哺乳動(dòng)物易受討論病癥的影響的病理病況。本文中待治療的病癥的非限制性的實(shí)例包括神經(jīng)病癥。術(shù)語(yǔ)“神經(jīng)病癥”或“神經(jīng)疾病”是指或描述哺乳動(dòng)物的中樞和/或周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的疾病或病癥。神經(jīng)病癥的實(shí)例包括但不限于下述列表的疾病和病癥。神經(jīng)病病癥是特征在于不適當(dāng)?shù)幕虿皇芸刂频纳窠?jīng)信號(hào)傳導(dǎo)或缺乏神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病或異常，并且包括但不限于，慢性疼痛，包括感受傷害的疼痛(由對(duì)身體組織的損傷引起的疼痛，包括癌相關(guān)的疼痛)，神經(jīng)性疼痛(由神經(jīng)、脊髓或腦中的異常引起的疼痛)，和精神性疼痛(完全或大部分相關(guān)于心理障礙)，頭痛，偏頭痛(migraine)，神經(jīng)病，以及常常伴隨這樣的神經(jīng)病病癥的癥狀和綜合征如眩暈或惡心。淀粉狀變性是一組與在cns中的細(xì)胞外蛋白質(zhì)沉積相關(guān)的疾病和病癥，其包括但不限于，繼發(fā)性淀粉狀變性，年齡相關(guān)性淀粉狀變性，阿爾茨海默病(ad)，輕度認(rèn)知損傷(mildcognitiveimpairment，mci)，雷維小體癡呆，唐氏綜合征，遺傳性腦出血伴淀粉狀變性(荷蘭型)；關(guān)島帕金森-癡呆并發(fā)癥，腦淀粉狀血管病，亨廷頓病，進(jìn)行性核上性麻痹，多發(fā)性硬化；克-雅病，帕金森病，傳染性海綿狀腦病，hiv相關(guān)癡呆，肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(als)，包涵體肌炎(inclusion-bodymyositis，ibm)，和涉及β-淀粉狀蛋白沉積的眼病(即，黃斑變性，玻璃疣相關(guān)視神經(jīng)病變和白內(nèi)障(cataract))。cns的癌癥特征在于一個(gè)或多個(gè)cns細(xì)胞(即，神經(jīng)細(xì)胞)的異常增殖，并且包括但不限于，膠質(zhì)瘤(glioma)，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme)，腦膜瘤(meningioma)，星細(xì)胞瘤(astrocytoma)，聽(tīng)神經(jīng)瘤(acousticneuroma)，軟骨瘤(chondroma)，少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(oligodendroglioma)，成神經(jīng)管細(xì)胞瘤(medulloblastomas)，神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤(ganglioglioma)，神經(jīng)鞘瘤(schwannoma)，神經(jīng)纖維瘤(neurofibroma)，成神經(jīng)細(xì)胞瘤(neuroblastoma)和硬膜外、髓內(nèi)或硬膜內(nèi)腫瘤。眼疾病或病癥是眼睛的疾病或病癥，為本文的目的，眼睛被視為受制于bbb的cns器官。眼病或病癥包括但不限于，鞏膜、角膜、虹膜和睫狀體的病癥(即，鞏膜炎(scleritis)、角膜炎(keratitis)、角膜潰瘍(cornealulcer)，角膜擦傷(cornealabrasion)，雪盲(snowblindness)，電光性眼炎(arceye)，thygeson淺層點(diǎn)狀角膜病變(thygeson’ssuperficialpunctatekeratopathy)，角膜新生血管化(cornealneovascularisation)，富克斯?fàn)I養(yǎng)不良(fuchs’dystrophy)，圓錐形角膜(keratoconus)，干燥性角膜結(jié)膜炎(keratoconjunctivitissicca)，虹膜炎(iritis)和葡萄膜炎(uveitis))，晶狀體的病癥(即，白內(nèi)障(cataract))，脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜的病癥(即，視網(wǎng)膜脫離(retinaldetachment)，視網(wǎng)膜劈裂癥(retinoschisis)，高血壓性視網(wǎng)膜病變(hypertensiveretinopathy)，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy)，視網(wǎng)膜病(retinopathy)，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，老年性黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration)，黃斑變性(maculardegeneration)(濕性或干性)，視網(wǎng)膜外膜(epiretinalmembrane)，色素性視網(wǎng)膜炎(retinitispigmentosa)和黃斑水腫(macularedema))，青光眼(glaucoma)，懸浮物(floaters)，視神經(jīng)和視覺(jué)通路的病癥(即，萊伯遺傳性視神經(jīng)病(leber’shereditaryopticneuropathy)和視覺(jué)盤(pán)玻璃疣(opticdiscdrusen))，眼肌/雙眼移動(dòng)調(diào)節(jié)/折射的病癥(即，斜視(strabismus)，眼肌癱瘓(ophthalmoparesis)，進(jìn)行性外部眼肌麻痹(progressiveexternalopthalmoplegia)，內(nèi)斜視(esotropia)，外斜視(exotropia)，遠(yuǎn)視(hypermetropia)，近視(myopia)，散光(astigmatism)，屈光不正(anisometropia)，老花眼(presbyopia)和眼肌麻痹(ophthalmoplegia))，視覺(jué)障礙和失明(即，弱視(amblyopia)，萊伯先天性黑矇(lever’scongenitalamaurosis)，暗點(diǎn)(scotoma)，色盲(colorblindness)，全色盲(achromatopsia)，夜盲癥(nyctalopia)，失明(blindness)，河盲(riverblindness)和微眼炎/缺損(micro-opthalmia/coloboma))，紅眼，阿蓋耳羅伯遜瞳孔(argyllrobertsonpupil)，角膜真菌病(keratomycosis)，干眼病(xerophthalmia)和無(wú)虹膜(aniridia)。cns的病毒或微生物感染包括但不限于由以下引起的感染，病毒(即，流感，hiv，脊髓灰質(zhì)炎病毒，風(fēng)疹)，細(xì)菌(即，奈瑟氏球菌屬物種(neisseriasp.)，鏈球菌屬物種(streptococcussp.)，假單胞菌屬物種(pseudomonassp.)，變形菌屬物種(proteussp.)，大腸桿菌(e.coli)，金黃色葡萄球菌(s.aureus)，肺炎球菌屬物種(pneumococcussp.)，腦膜炎球菌屬物種(meningococcussp.)，嗜血桿菌屬物種(haemophilussp.)和結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis))和其他微生物如真菌(即，酵母，新型隱球菌(cryptococcusneoformans))，寄生蟲(chóng)(即，弓形蟲(chóng)(toxoplasmagondii))或變形蟲(chóng)(amoebas)，其導(dǎo)致cns病理生理學(xué)，包括但不限于，腦膜炎，腦炎，脊髓炎，血管炎和膿腫(abscess)，其可以是急性的或慢性的。cns的炎癥是這樣的炎癥，其由對(duì)cns的損傷導(dǎo)致，所述損傷可以是物理?yè)p傷(即，由于事故，手術(shù)，腦創(chuàng)傷，脊髓損傷，腦震蕩(concussion)所致的)或由于或相關(guān)于一種或多種cns的其他疾病或病癥(即，膿腫，癌癥，病毒或微生物感染)的損傷。當(dāng)用于本文中時(shí)，cns的缺血是指一組這樣的病癥，其相關(guān)于腦部的異常血流或血管行為或其病因，并且包括但不限于，局部腦缺血(focalbrainischemia)，全局腦缺血(globalbrainischemia)，卒中(即，蛛網(wǎng)膜下出血(subarachnoidhemorrhage)和腦內(nèi)出血(intracerebralhemorrhage))，和動(dòng)脈瘤(aneurysm)。神經(jīng)退行性疾病是一組這樣的疾病和病癥，其與cns中神經(jīng)細(xì)胞喪失功能或死亡相關(guān)，并且包括但不限于，腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(adrenoleukodystrophy)，亞歷山大病，阿爾珀斯病(alper’sdisease)，肌萎縮性側(cè)索硬化，運(yùn)動(dòng)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxiatelangiectasia)，batten病(battendisease)，科凱恩綜合征，基層皮質(zhì)變性(corticobasaldegeneration)，由淀粉狀變性引起或與其相關(guān)的變性，弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥(friedreich’sataxia)，額顳葉變性(frontotemporallobardegeneration)，肯尼迪病(kennedy’sdisease)，多系統(tǒng)萎縮，多發(fā)性硬化，原發(fā)性側(cè)索硬化，進(jìn)行性核上性麻痹，脊髓性肌萎縮，橫貫性脊髓炎，雷夫敘姆病(refsum’sdisease)和脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)。cns的發(fā)作疾病和病癥涉及cns中的不適當(dāng)和/或異常電導(dǎo)，并且包括但不限于，癲癇(epilepsy)(即，失神發(fā)作(absenceseizures)，失張力發(fā)作(atonicseizures)，良性運(yùn)動(dòng)性癲癇(benignrolandicepilepsy)，兒童期失神(childhoodabsence)，陣攣發(fā)作(clonicseizures)，復(fù)雜部分發(fā)作(complexpartialseizures)，額葉性癲癇(frontallobeepilepsy)，發(fā)熱性癲癇發(fā)作(febrileseizures)，嬰兒痙攣(infantilespasms)，少年肌陣攣性癲癇(juvenilemyoclonicepilepsy)，青少年期失神癲癎(juvenileabsenceepilepsy)，倫-格綜合征(lennox-gastautsyndrome)，蘭-克綜合征(landau-kleffnersyndrome)，dravet綜合征(dravet’ssyndrome)，otahara綜合征(otaharasyndrome)，west綜合征(westsyndrome)，肌肉陣攣性發(fā)作(myoclonicseizures)，線粒體病(mitochondrialdisorders)，進(jìn)行性肌陣攣性癲癇(progressivemyoclonicepilepsies)，精神性發(fā)作(psychogenicseizures)，反射性癲癇(reflexepilepsy)，rasmussen綜合征(rasmussen′ssyndrome)，簡(jiǎn)單部分發(fā)作(simplepartialseizures)，繼發(fā)性全身性癲癇發(fā)作(secondarilygeneralizedseizures)，顳葉癲癇(temporallobeepilepsy)，陣攣性發(fā)作(toniclonicseizures)，強(qiáng)直發(fā)作(tonicseizures)，精神運(yùn)動(dòng)發(fā)作(psychomotorseizures)，邊緣葉癲癇(limbicepilepsy)，部分性癲癇發(fā)作(partial-onsetseizures)，全身發(fā)作性癲癇發(fā)作(generalized-onsetseizures)，癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus)，腹型癲癇(abdominalepilepsy)，失神型發(fā)作(akineticseizures)，植物神經(jīng)性發(fā)作(autonomicseizures)，大量雙側(cè)肌陣攣(massivebilateralmyoclonus)，月經(jīng)性癲癇(catamenialepilepsy)，跌倒發(fā)作(dropseizures)，情緒性發(fā)作(emotionalseizures)，病灶性發(fā)作(focalseizures)，發(fā)笑發(fā)作(gelasticseizures)，賈克森擴(kuò)布(jacksonianmarch)，拉福拉病(laforadisease)，運(yùn)動(dòng)性發(fā)作(motorseizures)，多病灶性發(fā)作(multifocalseizures)，夜發(fā)作(nocturnalseizures)，光敏性發(fā)作(photosensitiveseizure)，假性發(fā)作(pseudoseizures)，感覺(jué)性發(fā)作(sensoryseizures)，微小發(fā)作(subtleseizures)，sylvan發(fā)作(sylvanseizures)，戒斷發(fā)作(withdrawalseizures)和視反射發(fā)作(visualreflexseizures))。行為障礙是這樣的cns病癥，其特征為就受折磨的受試者而言的異常行為，并且包括但不限于，睡眠障礙(sleepdisorders)(即，失眠(insomnia)，深眠狀態(tài)(parasomnias)，夜驚(nightterrors)，晝夜節(jié)律睡眠障礙(circadianrhythmsleepdisorders)，和發(fā)作性睡病(narcolepsy))，心境障礙(mooddisorders)(即，抑郁(depression)，自殺性抑郁(suicidaldepression)，焦慮(anxiety)，慢性情感障礙(chronicaffectivedisorders)，恐怖病(phobias)，驚恐發(fā)作(panicattacks)，強(qiáng)迫性障礙(obsessive-compulsivedisorder)，注意力缺陷伴多動(dòng)障礙(attentiondeficithyperactivitydisorder，adhd)，注意缺陷障礙(attentiondeficitdisorder，add)，慢性疲勞綜合征(chronicfatiguesyndrome)，廣場(chǎng)恐怖癥(agoraphobia)，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumaticstressdisorder)，雙相性精神障礙(bipolardisorder))，進(jìn)食障礙(即，厭食癥(anorexia)或貪食癥(bulimia))，精神病(psychoses)，發(fā)育行為障礙(developmentalbehavioraldisorders)(即，自閉癥(autism)，雷特綜合征(rett’ssyndrome)，aspberger綜合征(aspberger’ssyndrome))，人格障礙和精神障礙(即，精神分裂癥(schizophrenia)，妄想障礙(delusionaldisorder)等)。溶酶體貯積癥(lysosomalstoragedisorders)是代謝病癥，在一些情況中其與cns相關(guān)或具有cns特異性癥狀；這樣的病癥包括但不限于泰-薩克斯病(tay-sachsdisease)，戈謝病(gaucher’sdisease)，法布里病(fabrydisease)，粘多糖貯積癥(i，ii，iii，iv，v，vi和vii型)，糖原貯積病(glycogenstoragedisease)，gm1神經(jīng)節(jié)苷脂貯積癥(gm1-gangliosidosis)，異染性腦白質(zhì)病變(metachromaticleukodystrophy)，farber病(farber’sdisease)，卡納范腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(canavan’sleukodystrophy)和1型和2型神經(jīng)元蠟樣脂褐素沉積癥(neuronalceroidlipofuscinoses)，尼曼-皮克病(niemann-pickdisease)，pompe病(pompedisease)和克拉伯病(krabbe’sdisease)。用于本文時(shí)，“治療”指在嘗試改變待治療的個(gè)體或細(xì)胞的天然進(jìn)程中的臨床干預(yù)，并且可以為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的理想效果包括但不限于防止疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)，緩和癥狀，消除疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果，防止轉(zhuǎn)移，減少疾病進(jìn)展速率，改善或減輕疾病狀態(tài)，和癥狀緩解或改善的預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，將本發(fā)明的調(diào)節(jié)性化合物用于延緩疾病或病癥的發(fā)展?！皞€(gè)體”或“受試者”是哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物包括但不限于，家養(yǎng)動(dòng)物(例如，牛，羊，貓，狗和馬)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，人和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物如猴)，兔以及嚙齒類動(dòng)物(例如，小鼠和大鼠)。在某些實(shí)施方案中，個(gè)體或受試者是人?！逵行Я俊迨侵冈谛枰膭┝亢蜁r(shí)間階段有效獲得所需的治療或預(yù)防結(jié)果的量。本發(fā)明的物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拈抗劑的“治療有效量”可以按照諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重、以及所述物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拈抗劑在所述個(gè)體中激發(fā)需要的反應(yīng)的能力而變化。治療有效量也是這樣的量：其中治療有益效果超過(guò)了所述物質(zhì)/分子、激動(dòng)劑或拈抗劑的任意毒性或有害的作用?！邦A(yù)防有效量”是指在需要的劑量和時(shí)間階段有效獲得需要的預(yù)防結(jié)果的量。典型地，但不是必需地，由于預(yù)防劑量是在疾病之前或在疾病的早期階段用于受試者，因此，所述預(yù)防有效量將少于治療有效量。術(shù)語(yǔ)“藥物制劑”指這樣的制劑，其以允許包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式存在，并且不包含對(duì)施用所述制劑的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分?！八幱幂d體”是指藥物制劑中除活性成分之外的成分，其對(duì)受試者是無(wú)毒的。藥用載體包括但不限于緩沖劑、賦形劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。術(shù)語(yǔ)“包裝說(shuō)明書(shū)”用于指通常包括在治療產(chǎn)品的商品包裝中的使用說(shuō)明，其包含關(guān)于適應(yīng)證、用法、劑量、給藥、組合療法、禁忌癥的信息和/或關(guān)于使用這樣的治療產(chǎn)品的警告。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性劑”用在本發(fā)明中指抑制或防止細(xì)胞功能和/或引起細(xì)胞死亡或破壞的物質(zhì)。細(xì)胞毒性劑包括但不限于：放射性同位素(例如，at211，i131，i125，y90，re186，re188，sm153，bi212，p32，pb212和lu的放射性同位素)；化療劑或藥物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，長(zhǎng)春花生物堿(vincaalkaloids)(長(zhǎng)春新堿(vincristine)，長(zhǎng)春堿(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法侖(melphalan)，絲裂霉素c(mitomycinc)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔紅霉素(daunorubicin)或其它嵌入劑)；生長(zhǎng)抑制劑；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶促活性毒素，包括其片段和/或變體；和下面公開(kāi)的各種抗腫瘤或抗癌劑。發(fā)明的組合物和方法a.本發(fā)明的肽和多肽在一方面中，本發(fā)明部分基于結(jié)合bace1并且降低和/或抑制bace1活性的肽/多肽。在某些實(shí)施方案中，提供結(jié)合到bace1的活性位點(diǎn)或外結(jié)合位點(diǎn)的抗體。本發(fā)明的bace1結(jié)合肽包括表2和圖2中所述的那些。本發(fā)明還提供突變體或變體肽，其殘基的任一個(gè)可以由這些肽的相對(duì)應(yīng)的殘基改變，同時(shí)仍然編碼保留抑制活性的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合肽/多肽的變體與參比結(jié)合肽/多肽具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％，99％的氨基酸序列同一性。通常，所述變體表現(xiàn)出與參比結(jié)合肽/多肽基本上相同的或更大的結(jié)合親和力，例如，基于本領(lǐng)域接受的結(jié)合測(cè)定定量單位/計(jì)量，是參比結(jié)合肽/多肽的結(jié)合親和力的至少0.75x，0.8x，0.9x，1.0x，1.25x或1.5x。通常，本發(fā)明的變體包括這樣的變體，其中序列中特定位置的殘基被其他氨基酸置換，并且還包括在親本肽/多肽的兩個(gè)殘基之間插入另外一個(gè)或多個(gè)殘基的可能性以及從親本序列刪除一個(gè)或多個(gè)殘基或向親本序列中添加一個(gè)或多個(gè)殘基的可能性。本發(fā)明包括任意的氨基酸置換、插入或缺失。在特定的情形中，所述置換是如本文所述的保守置換。“百分比(％)氨基酸序列同一性”定義為比對(duì)兩條序列時(shí)與參比(親本)多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。為了確定％氨基酸同一性，比對(duì)序列，并且，如果需要，導(dǎo)入空位以獲取最大％序列同一性；不將保守置換視為序列同一性的部分。確定百分比同一性的氨基酸序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通常使用公眾可得到的計(jì)算機(jī)軟件如blast、blast2、align2或megalign(dnastar)軟件來(lái)比對(duì)肽序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定測(cè)量比對(duì)的適宜參數(shù)，包括對(duì)所比較的序列全長(zhǎng)獲得最大比對(duì)所需的任何算法。當(dāng)比對(duì)氨基酸序列時(shí)，給定的氨基酸序列a相對(duì)于、與或針對(duì)給定的氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者可以這樣說(shuō)：給定氨基酸序列a具有或含有相對(duì)于、與或針對(duì)給定氨基酸序列b的特定的％氨基酸序列同一性)可以如下計(jì)算：％氨基酸序列同一性＝x/y′100其中x是用a和b的序列比對(duì)程序或算法比對(duì)中評(píng)分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，并且y是b中的氨基酸殘基總數(shù)。如果當(dāng)氨基酸序列a的長(zhǎng)度與氨基酸序列b的長(zhǎng)度不相等，則a相對(duì)于b的％氨基酸序列同一性將不等于b相對(duì)于a的％氮基酸序列同一性。“分離的”或“純化的”肽、多肽、蛋白或生物活性片段與其天然環(huán)境的成分分開(kāi)和/或回收。污染成分包括通常會(huì)干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可能包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的物質(zhì)。具有優(yōu)選少于30干重％的不需要的污染物質(zhì)(污染物)、優(yōu)選少于20％、10％且優(yōu)選少于5％的污染物的制劑認(rèn)為是基本上分離的。分離的、重組產(chǎn)生的肽/多肽或其生物活性部分優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占優(yōu)選少于20％、優(yōu)選少于約10％且優(yōu)選少于約5％的肽/多肽制劑的體積。污染物的實(shí)例包括細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基和在體外合成所述肽/多肽過(guò)程中所用的和產(chǎn)生的物質(zhì)。肽/多肽的保守置換在表a中以“優(yōu)選的置換”的標(biāo)題顯示。如果這樣的置換導(dǎo)致生物活性改變，那么可以引入表a中命名為“示例性置換”的更多實(shí)質(zhì)性變化，且如下文關(guān)于氨基酸種類進(jìn)一步描述，并篩選產(chǎn)物。表1原始?xì)埢纠灾脫Q優(yōu)選的置換ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；hislysasn(n)gln；his；asp，lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；phe；正亮氨酸leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)trp；leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)val；sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；正亮氨酸leu可根據(jù)常見(jiàn)側(cè)鏈特性將氨基酸分組：(1)疏水性：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水性：cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性：asp，glu；(4)堿性：his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly，pro；(6)芳香性：trp，tyr，phe。氨基酸還可以根據(jù)常見(jiàn)的測(cè)量尺寸進(jìn)行分組，例如，分成小氨基酸(glyala，ser，pro，thr，asp，asn)或大體積疏水氨基酸(met，ile，leu)。肽/多肽的生物特性的實(shí)質(zhì)性修飾通過(guò)選擇這樣的置換而實(shí)現(xiàn)，所述置換在其對(duì)維持下列各項(xiàng)的作用方面顯著不同：(a)在所述置換區(qū)的多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，作為折疊或螺旋構(gòu)象，(b)在靶位點(diǎn)處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的大小。非保守性置換將需要將這些種類中的一類的成員與另一種類交換。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽或多肽可以包含一個(gè)或多個(gè)非天然存在的或修飾的氨基酸?！胺翘烊淮嬖诘陌被釟埢笔侵覆煌谏衔牧谐龅哪切┨烊淮嬖诘陌被釟埢臍埢?，其能夠共價(jià)結(jié)合多肽鏈中的相鄰的氨基酸殘基。非天然氨基酸包括但不限于，高賴氨酸，高精氨酸，高絲氨酸，鈴蘭氨酸，2-氨基己二酸，3-氨基己二酸，β-丙氨酸，氨基丙酸，2-氨基丁酸，4-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基庚酸，2氨基異丁酸，3-氨基異丁酸，2-氨基庚二酸，叔丁基甘氨酸，2，4-二氨基異丁酸，鎖鏈素，2，2’-二氨基庚二酸，2，3-二氨基丙酸，n-乙基甘氨酸，n-乙基天冬酰胺，高脯氨酸，羥基賴氨酸，別-羥基賴氨酸，3-羥基脯氨酸，4-羥基脯氨酸，異鎖鏈素，別-異亮氨酸，n-甲基丙氨酸，n-甲基甘氨酸，n-甲基異亮氨酸，n-甲基戊基甘氨酸，n-甲基纈氨酸，naphthalanine，正纈氨酸，正亮氨酸，鳥(niǎo)氨酸，瓜氨酸，戊基甘氨酸，哌可酸和硫代脯氨酸。修飾的氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，在在其n端氨基基團(tuán)或其側(cè)鏈基團(tuán)被可逆地或不可逆地化學(xué)封閉或修飾，諸如例如，n甲基化的d和l氨基酸，其側(cè)鏈官能團(tuán)被化學(xué)修飾為另一種官能團(tuán)。例如，修飾的氨基酸包括甲硫氨酸亞砜；甲硫氨酸砜；天冬氨酸-(β-甲酯)，天冬氨酸的修飾的氨基酸；n-乙基甘氨酸，甘氨酸的修飾的氨基酸；或丙氨酸羧酰胺(alaninecarboxamide)和丙氨酸的修飾的氨基酸。另外的非天然和修飾的氨基酸，以及將其結(jié)合到蛋白和肽中的方法在本領(lǐng)域中是已知的(參見(jiàn)，例如，sandberg等，(1998)j.med.chem.(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志)41：2481-91；xie和schultz(2005)curr.opin.chem.biol.(現(xiàn)代化學(xué)生物學(xué)觀點(diǎn))9：548-554；hodgson和sanderson(2004)chem.soc.rev.(化學(xué)學(xué)會(huì)綜述)33：422-430)。b.載體構(gòu)建編碼本文所述的肽和多肽的多核苷酸序列可以使用標(biāo)準(zhǔn)的合成和/或重組技術(shù)獲得?？梢詮倪m當(dāng)來(lái)源的細(xì)胞分離需要的多核苷酸序列并且測(cè)序。用于抗體的來(lái)源細(xì)胞包括產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞。備選地，可以使用核苷酸合成儀或pcr技術(shù)合成多核苷酸。一旦獲得，將編碼所述肽或多肽的序列插入到能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并表達(dá)異源多核苷酸的重組載體中。本領(lǐng)域可用的和已知的多種載體可以用于本發(fā)明目的。選擇適當(dāng)?shù)妮d體主要取決于要插入到載體中的核酸的尺寸和要轉(zhuǎn)化所述載體的特定的宿主細(xì)胞。取決于其功能(擴(kuò)增或表達(dá)異源多核苷酸，或二者)及其與其停留在其中的特定宿主細(xì)胞的互補(bǔ)性，每個(gè)載體包含多種成分。載體成分通常包括但不限于：復(fù)制起點(diǎn)(特別是當(dāng)載體插入到原核細(xì)胞中時(shí))、選擇標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs)、信號(hào)序列、異源核酸插入物和轉(zhuǎn)錄終止序列。通常，包含來(lái)源于物種的與宿主細(xì)胞相容的復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體與這些宿主聯(lián)合使用。載體通常攜帶復(fù)制位點(diǎn)，以及能夠在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，大腸桿菌(e.coli)通常用來(lái)源于大腸桿菌物種的質(zhì)粒pbr322轉(zhuǎn)化。pbr322包含編碼氨芐青霉素(amp)和四環(huán)素(amp)抗性的基因，并且因此提供鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的容易的方法。pbr322、其衍生物或其他微生物質(zhì)粒或噬菌體還可以包含或者被修飾從而包含可以被所述微生物生物體用來(lái)表達(dá)內(nèi)源性蛋白的啟動(dòng)子。另外，包含與宿主微生物相容的復(fù)制子和控制序列的噬菌體載體可以用作與這些宿主聯(lián)系使用的轉(zhuǎn)化載體。例如，諸如.λ.gfmtm-11的噬菌體可以用于制備能夠用于轉(zhuǎn)化敏感宿主細(xì)胞諸如大腸桿菌le392的重組載體。組成型或誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子可用于本發(fā)明，按照具體情形的需要，這可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)確定。由多種潛在的宿主細(xì)胞識(shí)別的大量的啟動(dòng)子是公知的。通過(guò)限制性酶消化去除源dna的啟動(dòng)子，并且將分離的啟動(dòng)子序列插入到選擇的載體中，可以將所選擇的啟動(dòng)子可操作地與編碼本文所述的多肽的順?lè)醋觗na連接。天然啟動(dòng)子序列和多種異源啟動(dòng)子序列都可以用來(lái)引導(dǎo)靶基因的擴(kuò)增和/或表達(dá)。然而，優(yōu)選異源啟動(dòng)子，原因在于，與天然的靶多肽啟動(dòng)子相比，其通常允許更多的轉(zhuǎn)錄和所表達(dá)的靶基因的更高的產(chǎn)率。適合與原核宿主一起使用的啟動(dòng)子包括phoa啟動(dòng)子，.β.-半乳糖苷酶(β-galactamase)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)和雜化的啟動(dòng)子諸如tac或trc啟動(dòng)子。然而，在細(xì)菌中起作用的其他啟動(dòng)子(諸如其他已知的細(xì)菌或噬菌體啟動(dòng)子)也是適合的。其核苷酸序列已經(jīng)公布，由此允許技術(shù)人員使用提供任意需要的限制性位點(diǎn)的接頭或銜接子將其可操作性地連接到編碼靶標(biāo)輕鏈和重鏈的順?lè)醋由?siebenlist等(1980)cell(細(xì)胞)20：269)。在一些實(shí)施方案中，重組載體中的每個(gè)順?lè)醋影笇?dǎo)所表達(dá)的多肽穿過(guò)膜易位的分泌信號(hào)序列元件。一般地，信號(hào)序列可以是載體的元件，或者其可以是插入到載體中的靶多肽dna的一部分。為本發(fā)明的目的選擇的信號(hào)序列熒光是由宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即，通過(guò)信號(hào)肽切割)的一種信號(hào)序列。對(duì)于原核宿主細(xì)胞，其不識(shí)別和加工異源多肽本身所有的信號(hào)序列，該信號(hào)序列替換為原核信號(hào)序列，例如，其選自由下列組成的組：堿性磷酸酶，青霉素酶，ipp，或熱穩(wěn)定性腸毒素ii(stii)前導(dǎo)物，lamb，phoe，pelb，ompa和mbp。適于表達(dá)多肽的原核宿主細(xì)胞包括古細(xì)菌(archaebacteria)和真細(xì)菌(eubacteria)，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性微生物?？捎玫募?xì)菌的實(shí)例包括埃希氏菌屬(escherichia)(例如，大腸桿菌)，桿菌(例如，枯草芽孢桿菌(b.subtilis))，腸細(xì)菌(enterobacteria)，假單胞菌屬(pseudomonas)物種(例如，銅綠假單胞菌(p.aeruginosa))，鼠傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphimurium)，粘質(zhì)沙雷氏菌(serratiamarcescans)，克雷伯氏菌屬(klebsiella)，變形菌屬(proteus)，志賀菌屬(shigella)，根瘤菌屬(rhizobia)，透明顫菌屬(vitreoscilla)或副球菌屬(paracoccus)。優(yōu)選地，使用革蘭氏陰性細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞應(yīng)該分泌少量蛋白水解酶，并且可能需要在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入另外的蛋白酶抑制劑。c.肽或多肽產(chǎn)生將宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染上述表達(dá)載體并且在已被改進(jìn)適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼需要的序列的基因的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染是指由宿主細(xì)胞攝取表達(dá)載體，不管實(shí)際上是否表達(dá)任意的編碼序列。多種轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如，capo4沉淀法和電穿孔法。通常在宿主細(xì)胞中發(fā)生操作該載體的任意指示時(shí)認(rèn)識(shí)到轉(zhuǎn)染的成功。轉(zhuǎn)化意指將dna引入到原核宿主中，從而是dna作為染色體外元件或染色體成分而復(fù)制。取決于所用的宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化使用適于所述細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。使用氯化鈣的鈣處理通常用于含有大量細(xì)胞壁屏障的細(xì)菌細(xì)胞。另一種轉(zhuǎn)化方法利用聚乙二醇/dmso。所用的另一種技術(shù)是電穿孔。用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的原核細(xì)胞在本領(lǐng)域已知的且適于培養(yǎng)所選擇的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。適宜的培養(yǎng)基的實(shí)例包括luria肉湯(lb)加必需的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基還包含基于表達(dá)載體的構(gòu)建而選擇的選擇試劑，以選擇性允許含有表達(dá)載體的原核細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素用于表達(dá)氨芐青霉素抗性基因的細(xì)胞的生長(zhǎng)。除了碳、氮和無(wú)機(jī)磷酸來(lái)源之外，還可以包括適當(dāng)濃度的任意需要的補(bǔ)充物，單獨(dú)引入或作為與另一只補(bǔ)充物或培養(yǎng)基的混合物引入，諸如符合氮源。任選地，培養(yǎng)基可以包含一種或多種選自由下述組成的組的還原劑：谷胱甘肽，半胱氨酸，胱胺，硫膠質(zhì)，二硫丁四醇和二硫蘇糖醇。原核宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臏囟扰囵B(yǎng)。對(duì)于大腸桿菌生長(zhǎng)，例如，優(yōu)選的溫度是在約20℃-約39℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約25℃-約37℃，甚至更優(yōu)選約30℃。培養(yǎng)基的ph可以是約5-約9范圍內(nèi)的任意ph，這主要取決于宿主生物體。對(duì)于大腸桿菌，ph優(yōu)選為約6.8-約7.4，并且更優(yōu)選為約7.0。如果在表達(dá)載體中使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則在適于激活所述啟動(dòng)子的條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。例如，如果使用phoa啟動(dòng)子來(lái)控制轉(zhuǎn)錄，則轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在磷酸鹽限制性培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于誘導(dǎo)。根據(jù)所用的載體構(gòu)建體，可以使用多種其他的誘導(dǎo)劑，這是本領(lǐng)域已知的。在微生物中表達(dá)的本文所述的多肽可以分泌到宿主細(xì)胞的周質(zhì)中并且從中回收。蛋白回收典型地包括分解微生物，通常通過(guò)諸如滲壓休克(osmoticshock)、超聲或裂解的方式進(jìn)行。一旦細(xì)胞被分解，則可以通過(guò)離心或過(guò)濾除去細(xì)胞碎片或全細(xì)胞。蛋白可以進(jìn)一步純化，例如，通過(guò)親和樹(shù)脂層析純化。備選地，蛋白可以被轉(zhuǎn)運(yùn)到培養(yǎng)基中并且從中分離?？梢詮呐囵B(yǎng)物中去除細(xì)胞，并且過(guò)濾并濃縮培養(yǎng)物上清液，以進(jìn)一步純化所產(chǎn)生的蛋白。表達(dá)的多肽可以使用常規(guī)已知的方法諸如在免疫親和或離子交換柱上分級(jí)分離；乙醇沉淀；反相hplc；在二氧化硅上或在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂如deae上層析；色譜聚焦；sds-page；硫酸銨沉淀；例如使用sephadexg-75的凝膠過(guò)濾；疏水親和樹(shù)脂，使用固定在基質(zhì)上的適當(dāng)?shù)目乖呐潴w親和和蛋白質(zhì)印跡測(cè)定進(jìn)一步分離和鑒定。除了原核宿主細(xì)胞之外，本領(lǐng)域中也充分建立了真核宿主細(xì)胞系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)乃拗靼ú溉閯?dòng)物細(xì)胞系，諸如cho，和昆蟲(chóng)細(xì)胞，諸如下文描述的那些。d.多肽/肽純化產(chǎn)生的多肽/肽可以進(jìn)行純化以獲得對(duì)于進(jìn)一步的測(cè)定和應(yīng)用基本上是均質(zhì)的制劑。可以使用本領(lǐng)域中已知的的標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化方法。下述方法是適宜的純化方法的示例：在免疫親和或離子交換柱上分級(jí)分離，乙醇沉淀，反相hplc，在二氧化硅上或在陽(yáng)離子交換樹(shù)脂如deae上層析，色譜聚焦，sds-page，硫酸銨沉淀，以及例如使用sephadexg-75的凝膠過(guò)濾。e.bace1調(diào)節(jié)劑的鑒定和表征-一般方法可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法中的任一種鑒定候選bace1調(diào)節(jié)劑，例如，結(jié)合肽。調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)特征可以通過(guò)確定所述調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)bace1與其結(jié)合配偶體(諸如底物app、或本發(fā)明的結(jié)合多肽)之間的相互作用的能力來(lái)評(píng)估。一種重要的特征是結(jié)合親和力。目的候選調(diào)節(jié)劑(例如肽)的結(jié)合特征可以以本領(lǐng)域已知的多種方法中的任一種進(jìn)行評(píng)估。所述調(diào)節(jié)劑的抑制特征可以通過(guò)確定所述調(diào)節(jié)劑抑制bace1的生物活性(例如，蛋白水解活性)的能力來(lái)評(píng)估。方法中的起始步驟可以包括產(chǎn)生一種或多種包含目的序列的候選肽，然后在適于確定其bace1結(jié)合特征的條件下進(jìn)行展示。例如，候選肽可以作為肽的羧基端(c端)展示文庫(kù)展示在噬菌體或噬菌粒表面上，例如，使用與外殼蛋白如p3或p8的蛋白融合體展示在絲狀噬菌體(噬菌粒)表面上。c端展示在本領(lǐng)域中是已知的。例如，參見(jiàn)jespers等，biotechnology(生物技術(shù))(ny).13：378-82和wo00/06717。這些方法可以用于制備本發(fā)明的融合基因、融合蛋白、載體、重組噬菌體文庫(kù)、宿主細(xì)胞及其文庫(kù)。如本文所述，在一些實(shí)施方案中，將候選肽作為肽的氨基端(n端)展示文庫(kù)展示在噬菌體或噬菌粒表面上也可以是可行的。n端噬菌體(噬菌粒)展示的方法包括本文所述的那些，和本領(lǐng)域公知的那些，例如，如在美國(guó)專利號(hào)5,750,373(及其中引用的參考文獻(xiàn))中所述。肽文庫(kù)在本領(lǐng)域中是公知的，并且也可以按照本領(lǐng)域方法制備。例如，參見(jiàn)clark等，美國(guó)專利號(hào)6,121,416。與異源蛋白成分如噬菌體外殼蛋白融合的肽的文庫(kù)在本領(lǐng)域中是公知的，例如，如clark等，同前所述中所述。表征通過(guò)這些方法獲得的結(jié)合劑分子的方法也是本領(lǐng)域中已知的，包括上文引用的參考文獻(xiàn)中公開(kāi)的那些(jespers等，wo00/06717&美國(guó)專利號(hào)5,750,373)和本文所述的那些。第一肽結(jié)合劑的變體可以通過(guò)篩選所述肽的突變體以獲得目的特征(例如，增強(qiáng)的靶標(biāo)結(jié)合親和力、增強(qiáng)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)、減少的毒性、改善的治療指數(shù)等)而產(chǎn)生。誘變技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。此外，掃描誘變技術(shù)(諸如基于丙氨酸掃描的那些)可以特別有助于評(píng)估肽內(nèi)單個(gè)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)和/或功能重要性。1.分離針對(duì)bace1的結(jié)合噬菌體將具有展示的候選bace1結(jié)合肽的噬菌體展示文庫(kù)在體外與bace1蛋白或融合蛋白接觸，以確定該文庫(kù)中與bace1靶標(biāo)結(jié)合的那些成員。可以使用技術(shù)人員已知的任何方法來(lái)評(píng)估體外蛋白結(jié)合。例如，可以進(jìn)行1、2、3或4輪或更多輪結(jié)合選擇，之后分離單個(gè)噬菌體，并且任選地，在噬菌體elisa中分析?？梢允褂檬删welisa確定肽-展示噬菌體顆粒與固定的bace1靶蛋白的結(jié)合親和力(barrett等，(1992)analbiochem.(年度生物化學(xué))204：357-64)。在評(píng)估候選子與已知的bace1結(jié)合劑競(jìng)爭(zhēng)與bace1結(jié)合的能力的情形中，提供適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合競(jìng)爭(zhēng)條件。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在一種或多種濃度的已知的bace1結(jié)合劑的條件下進(jìn)行篩選/選擇/生物淘選。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以隨后在存在已知的bace1結(jié)合劑的條件下在競(jìng)爭(zhēng)性elisa測(cè)定中評(píng)估從所述文庫(kù)分離的候選結(jié)合劑。2.bace1的制備bace1可以利用常規(guī)合成或重組技術(shù)便利地作為純化的蛋白或蛋白片段(例如，bace1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，殘基22-457，殘基43-453或殘基57-453)或作為融合多肽產(chǎn)生。融合多肽可用在噬菌體(噬菌粒)展示中(其中bace1是結(jié)合的靶標(biāo))，用在表達(dá)研究、細(xì)胞定位、生物測(cè)定、elisas(包括結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定)等中。bace1“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含與不相關(guān)的多肽融合的bace1。bace1融合蛋白可以包含bace1的任一部分至完整序列，包括任意多的生物活性部分。然后，可以按照已知的方法使用親和層析和與非-bace1多肽結(jié)合的捕獲試劑純化該融合蛋白。bace1可以與親和序列融合，例如，與gst(谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶)序列的c端融合。所述融合蛋白促進(jìn)重組bace1的純化，例如，使用與固體支持物結(jié)合的和/或連接在固體支持物(例如，用于肽篩選/選擇/生物淘選的基質(zhì))上的谷胱甘肽的純化。利用重組方法可以容易地產(chǎn)生融合蛋白。編碼bace1(或其部分)的核酸可以在bace1n端、c端或中間與非-bace1編碼核酸符合閱讀框融合。也可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)，包括自動(dòng)化dna合成儀，來(lái)合成融合基因。還可以利用使用錨定引物的pcr擴(kuò)增，所述錨定引物產(chǎn)生兩個(gè)連續(xù)的基因片段之間的互補(bǔ)突出端，其隨后可以退火并且重新擴(kuò)增而產(chǎn)生嵌合的基因序列(ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)方法).johnwiley&sons，紐約1987)。許多促進(jìn)符合閱讀框地亞克隆bace1或其部分成為融合蛋白的載體是可商購(gòu)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，多種變異可以實(shí)現(xiàn)分離的bace1蛋白的目的并且可以用于本發(fā)明。例如，可以按上文所述構(gòu)建bace1和表位標(biāo)簽的融合體，并且該標(biāo)簽用于親和純化bace1。還可以不用任何融合體而制備bace1蛋白或其部分；另外，不使用微生物載體來(lái)產(chǎn)生蛋白，可以另外使用體外化學(xué)合成。其他細(xì)胞可以用來(lái)產(chǎn)生bace1蛋白或其部分，諸如其他細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如cos)或桿狀病毒系統(tǒng)。產(chǎn)生多種融合體的寬泛種類的多核苷酸載體也是可用的。bace1融合蛋白的最終純化通常取決于融合配偶體；例如，多組氨酸標(biāo)簽融合體可以在鎳柱上純化。3.確定所展示的肽的序列以需要的特征結(jié)合bace1(并且任選地，不結(jié)合不相關(guān)的序列)的噬菌體(噬菌粒)可以進(jìn)行序列分析。在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增展示候選結(jié)合肽的噬菌體(噬菌粒)顆粒，分離dna，并且使用任何適當(dāng)?shù)囊阎臏y(cè)序技術(shù)對(duì)基因組的適當(dāng)部分(編碼該候選肽)測(cè)序。4.確定bace1結(jié)合多肽中的關(guān)鍵殘基丙氨酸掃描bace1結(jié)合肽序列的丙氨酸掃描可以用來(lái)確定肽中每個(gè)殘基對(duì)bace1結(jié)合和/或抑制的相對(duì)貢獻(xiàn)。為了確定bace1配體中的關(guān)鍵殘基，將殘基替換為單個(gè)氨基酸，典型地替換為丙氨酸殘基，并且評(píng)估對(duì)bace1結(jié)合和活性的作用。參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,580,723；美國(guó)專利號(hào)5,834,250；以及實(shí)施例。剪截體(缺失系列)bace1結(jié)合肽的剪截體不但可以闡明結(jié)合的關(guān)鍵殘基，而且確定實(shí)現(xiàn)結(jié)合的最短的肽長(zhǎng)度。在一些情形中，剪截體將揭示比天然配體更緊密結(jié)合的配體；這樣的肽可用于調(diào)節(jié)bace1：配體相互作用。優(yōu)選地，制備一系列的bace1結(jié)合肽剪截體。一個(gè)系列將順序地剪截氨基端氨基酸；在另一個(gè)系列中，剪截將在羧基端開(kāi)始。當(dāng)在用于丙氨酸掃描的情形中，肽可以在體外合成或通過(guò)重組方法制備。合理的調(diào)節(jié)劑設(shè)計(jì)基于由丙氨酸掃描和剪截體分析獲得的信息，技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)并且合成小分子，或者選擇富含可能調(diào)節(jié)結(jié)合的化合物的小分子文庫(kù)。例如，基于實(shí)施例中所述的信息，可以設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)劑肽使其包含2個(gè)適當(dāng)間隔的半胱氨酸殘基和“精氨酸指”。5.結(jié)合測(cè)定形成bace1結(jié)合肽與bace1的復(fù)合物促進(jìn)該復(fù)合的形式與其未復(fù)合的形式和與雜質(zhì)的分離。bace1：結(jié)合配體復(fù)合物可以在溶液中形成，或者其中一個(gè)結(jié)合配偶體結(jié)合在不溶性支持物上。復(fù)合物可以從溶液中分離，例如，使用柱層析分離，并且可以使用公知技術(shù)通過(guò)過(guò)濾、離心等分離而結(jié)合在固體支持物上。bace1多肽或其配體與固體支持物的結(jié)合促進(jìn)高通量測(cè)定?？梢栽诖嬖诤筒淮嬖诤蜻x結(jié)合化合物的條件下篩選測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(例如，抑制)結(jié)合劑多肽與bace1的相互作用的能力，并且篩選可以在任意適當(dāng)?shù)娜萜髦?，如微量滴定板、試管和微量離心管中完成。還可以制備融合蛋白以促進(jìn)檢測(cè)或分離，其中所述融合蛋白包含允許該蛋白中的一個(gè)或兩個(gè)都結(jié)合到基質(zhì)上的另外的結(jié)構(gòu)域。例如，gst-bace1-結(jié)合肽融合蛋白或gst-bace1蛋白可以吸附到谷胱甘肽瓊脂糖珠(sigmachemical，st.louis，mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后將其與測(cè)試化合物組合，并且將混合物在允許復(fù)合物形成的條件下(例如，在鹽和ph的生理?xiàng)l件下)溫育。溫育后，洗滌珠子或微量滴定板孔以去除任何未結(jié)合的成分，在珠子的情形中基質(zhì)是固定的，并且直接或間接確定所述復(fù)合物。備選地，所述復(fù)合物可以與基質(zhì)解離，并且結(jié)合或活性水平利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)確定。在篩選測(cè)定中還可以使用其他用于將蛋白固定到基質(zhì)上的融合多肽技術(shù)。bace1結(jié)合肽或bace1可以使用生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生物素蛋白系統(tǒng)固定。生物素?；梢允褂枚喾N試劑實(shí)現(xiàn)，諸如生物素-n-羥基-琥珀酰亞胺(nhs；piercechemicals，rockford，ill.)，并且固定在鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔平板(piercechemical)的孔中。備選地，與bace1結(jié)合肽或bace1反應(yīng)但是不干擾結(jié)合肽與其靶分子的結(jié)合的抗體可以衍生在該平板的孔上，并且未結(jié)合的bace1或結(jié)合肽通過(guò)抗體綴合截留在孔中。除了關(guān)于gst-固定的復(fù)合物所述的那些之外，檢測(cè)所述復(fù)合物的方法包括使用與結(jié)合劑肽或bace1反應(yīng)的抗體進(jìn)行的復(fù)合物免疫檢測(cè)。結(jié)合測(cè)定：競(jìng)爭(zhēng)性elisa為了評(píng)估肽、蛋白或其他bace1配體的結(jié)合親和力，可以使用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定，其中評(píng)估配體結(jié)合bace1的能力(以及結(jié)合親和力，如果需要的話)，并且與已知與bace1結(jié)合的化合物(例如，bace1的擬肽抑制劑，如om99-2，bace1抗體或通過(guò)如本文所述的噬菌體展示確定的高親和力結(jié)合肽)的能力相比較。多種方法是已知的，并且可以用于鑒定結(jié)合分子(例如，肽、蛋白、小分子等)的結(jié)合親和力；例如，結(jié)合親和力可以使用競(jìng)爭(zhēng)性elisas確定為ic50值。ic50值定義為結(jié)合劑阻斷50％的bace1與配體的結(jié)合的濃度。例如，在固相測(cè)定中，測(cè)定平板可以通過(guò)用neutravidin、抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白包被微孔板(優(yōu)選地處理以有效吸附蛋白)而制備。然后，通過(guò)加入牛血清白蛋白(bsa)或其他蛋白(例如，非脂奶)的溶液而進(jìn)行封閉，然后洗滌，優(yōu)選用含有去污劑如吐溫-20的緩沖液洗滌。制備生物素?；囊阎腷ace1結(jié)合劑(例如，作為與gst或其他此類促進(jìn)純化和檢測(cè)的分子的融合體的噬菌體肽)并且結(jié)合在平板上。制備要用bace1檢測(cè)的分子的系列稀釋液并且與結(jié)合的結(jié)合劑接觸。洗滌用固定的結(jié)合劑包被的平板，然后向孔中加入每種結(jié)合反應(yīng)液，并且短暫溫育。進(jìn)一步洗滌后，檢測(cè)結(jié)合反應(yīng)，通常使用識(shí)別非-bace1融合配偶體的抗體和識(shí)別一級(jí)抗體的標(biāo)記的(諸如辣根過(guò)氧化物酶(hrp)、堿性磷酸酶(ap)或熒光標(biāo)記諸如熒光素)二級(jí)抗體進(jìn)行檢測(cè)。然后，將該平板用適當(dāng)?shù)牡孜?取決于標(biāo)記)顯色，并且定量信號(hào)，諸如使用分光光度計(jì)平板讀數(shù)儀定量?？梢允褂米钚《朔〝M合將吸光度信號(hào)擬合為結(jié)合曲線。因此，可以測(cè)量多種分子抑制bace1與已知的bace1結(jié)合劑結(jié)合的能力。技術(shù)人員清楚上述測(cè)定的多種變化形式。例如，除了基于鏈霉抗生物素蛋白的系統(tǒng)之外，bace1結(jié)合劑可以化學(xué)連接到基底上，或者簡(jiǎn)單地吸附在基底上。f.活性測(cè)定可以通過(guò)在體外或在體內(nèi)測(cè)定中檢測(cè)物質(zhì)/分子的調(diào)節(jié)能力而進(jìn)行對(duì)本發(fā)明的候選肽或多肽(諸如包含本文公開(kāi)的結(jié)合劑肽的氨基酸序列的肽)調(diào)節(jié)bace1活性的能力的確定。調(diào)節(jié)能力可以包括，例如，抑制或減少bace1天冬氨酰蛋白酶活性；或者抑制或減少bace1對(duì)app的切割；或者抑制或減少aβ產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，檢測(cè)本發(fā)明的肽/多肽(諸如包含本文公開(kāi)的結(jié)合劑肽的氨基酸序列的肽)的這種生物活性。例如，可以在均相時(shí)間分辨熒光htrf測(cè)定或微流體毛細(xì)管電泳(mce)測(cè)定中，如實(shí)施例1詳細(xì)所述，使用合成的底物肽檢測(cè)bace1蛋白酶活性。簡(jiǎn)言之，均相時(shí)間分辨熒光(htrf)測(cè)定可以用來(lái)利用淀粉狀蛋白前體蛋白bace1切割位點(diǎn)肽測(cè)量bace1天冬氨酰蛋白酶活性。例如，bi27肽(生物素-kteeisevnldaefrhdsgyevhhqkl(seqidno：5)，americanpeptidecompany))與用抗-bace抗體預(yù)先溫育的bace1組合在384-孔平板(proxiplatetm，perkin-elmer)的bace反應(yīng)緩沖液(50mm乙酸鈉，ph4.4和0.1％chaps)中。將蛋白水解反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度溫育75分鐘，并且通過(guò)在檢測(cè)緩沖液(200mmtrisph8.0，20mmedta，0.1％bsa和0.8mkf)中加入5μl含有2nm鏈霉抗生物素蛋白-d2和150nm用銪穴狀化合物(europiumcryptate)標(biāo)記的抗-淀粉狀蛋白β抗體的htrf檢測(cè)混合物而猝滅。最終反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度溫育60分鐘，并且使用envision多標(biāo)記平板讀數(shù)儀tm(envisionmultilabelplatereadertm，perkin-elmer)以320nm的激發(fā)波長(zhǎng)和615與665nm的發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)量tr-fret信號(hào)。mce測(cè)定反應(yīng)可以在標(biāo)準(zhǔn)酶反應(yīng)中進(jìn)行，通過(guò)加入酶的底物和4x化合物(包含人bace1(細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)、淀粉狀蛋白前體蛋白β分泌酶活性位點(diǎn)肽(fam-kteeisevnldaefrwkk-conh2(seqidno：20))、50mmnaoacph4.4和0.1％chaps)而起始。在環(huán)境溫度溫育60分鐘后，使用在上分析的12-sipper微流體芯片(二者均購(gòu)自caliperlifesciences)分離每個(gè)反應(yīng)中的產(chǎn)物和底物。通過(guò)使用供應(yīng)商優(yōu)化軟件選擇電壓和壓力而優(yōu)化產(chǎn)物和底物的分離。使用htswell分析儀軟件(htswellanalyzersoftware，caliperlifesciences)由電泳圖計(jì)算底物轉(zhuǎn)換率。另外，bace1蛋白酶活性可以在表達(dá)bace1底物如app的細(xì)胞系或在表達(dá)bace1底物如人app的轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)。另外，可以在動(dòng)物模型中檢測(cè)bace1蛋白酶活性。例如，多種神經(jīng)疾病和病癥的動(dòng)物模型以及檢驗(yàn)與這些模型相關(guān)的病理過(guò)程的相關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域中是容易獲得的。多種生物學(xué)病癥的動(dòng)物模型包括非重組的和重組的(轉(zhuǎn)基因)動(dòng)物。非重組的動(dòng)物模型包括，例如，嚙齒類動(dòng)物，例如，鼠模型。這些模型可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如，皮下注射、尾靜脈注射、脾移植、腹膜內(nèi)移植和在腎囊下移植向同系小鼠中引入細(xì)胞而產(chǎn)生。體內(nèi)模型包括卒中/腦缺血模型，神經(jīng)變性病的體內(nèi)模型，諸如帕金斯病的小鼠模型；阿爾茨海默病的小鼠模型；肌萎縮側(cè)索硬化的小鼠模型；脊髓性肌萎縮的小鼠模型；局部和全腦缺血的小鼠/大鼠模型，例如，常見(jiàn)的頸總動(dòng)脈閉塞或大腦中動(dòng)脈閉塞模型；或離體全胚胎培養(yǎng)物。作為一個(gè)非限制性的實(shí)例，存在多種本領(lǐng)域已知的阿爾茨海默病小鼠模型(例如，參見(jiàn)rakover等，neurodegener.dis.(神經(jīng)變性病)(2007)；4(5)：392-402；mouri等，fasebj.(2007)jul；21(9)：2135-48；minkeviciene等，j.pharmacol.exp.ther.(2004)nov；311(2)：677-82andyuede等，behavpharmacol.(2007)sep；18(5-6)：347-63)。多種測(cè)定可以以已知的體外或體內(nèi)測(cè)定形式進(jìn)行，如本領(lǐng)域已知的并且參考文獻(xiàn)中所述的。多種這樣的動(dòng)物模型也可以從商業(yè)供應(yīng)商諸如jackson實(shí)驗(yàn)室(jacksonlaboratory)獲得。g.bace1結(jié)合劑的用途的實(shí)例本文所述的bace1肽結(jié)合劑的鑒定和表征提供了用于調(diào)節(jié)bace1及其底物(例如app)之間的體內(nèi)相互作用的組合物和方法。本文所述的bace1肽結(jié)合劑可以用于治療諸如神經(jīng)病癥的疾病和病癥，如下文所討論。本文所述的充分表征的bace1的中等至高等親和力肽結(jié)合劑可以進(jìn)一步用于闡明bace1本身的重要的結(jié)構(gòu)特征。這樣的知識(shí)提供了基于bace1序列本身的修飾開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)性試劑。bace1調(diào)節(jié)及的其他應(yīng)用包括與bace1及其相關(guān)的配偶體相關(guān)的疾病的診斷測(cè)定，融合蛋白形式的bace1和配體作為純化工具和底物錨定子的應(yīng)用。本文所述的bace1結(jié)合肽還可以用于篩選另外的化合物，以鑒定調(diào)節(jié)bace1-配體相互作用的那些化合物。設(shè)計(jì)篩選測(cè)定，以鑒定與bace1結(jié)合或復(fù)合或另外干擾bace1與細(xì)胞因子的相互作用的化合物。確定候選化合物作為調(diào)節(jié)劑的能力的一種方法是在存在已知的bace1結(jié)合劑(如本文公開(kāi)的結(jié)合肽(例如，實(shí)施例中描述的高親和性結(jié)合劑))的條件下在競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定中評(píng)估候選化合物的活性。這樣的篩選測(cè)定將包括允許化學(xué)文庫(kù)的高通量篩選的測(cè)定，使得其特別適合鑒定小分子藥物候選物。測(cè)定可以以多種形式進(jìn)行，包括蛋白-蛋白結(jié)合測(cè)定，生物化學(xué)篩選測(cè)定，免疫測(cè)定和基于細(xì)胞的測(cè)定，這些在本領(lǐng)域中是充分表征的。用于調(diào)節(jié)劑的所有測(cè)定是常見(jiàn)的，其中需要將候選調(diào)節(jié)劑與bace1(或其等價(jià)物)和/或參與bace1和結(jié)合配體的結(jié)合相互作用的結(jié)合配體在一定條件下接觸充分的時(shí)間，以足以允許這兩種化合物相互作用。在結(jié)合測(cè)定中，所述相互作用是結(jié)合，所形成的復(fù)合物可以分離或在反應(yīng)混合物中進(jìn)行檢測(cè)。在具體的實(shí)施方案中，候選物質(zhì)或分子通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)連接固定在固相上，例如，在微量滴定板上。非共價(jià)連接通常通過(guò)用所述物質(zhì)/分子的溶液包被固體表面并且干燥而實(shí)現(xiàn)。備選地，固定的對(duì)要固定的物質(zhì)/分子特異性的親和分子，諸如抗體，例如，單克隆抗體，可以用于將其錨定在固體表面上。測(cè)定通過(guò)向固定的成分(例如，含有被錨定的成分的包被的表面)中加入未固定的成分而進(jìn)行，所述未固定的成分可以由可檢測(cè)的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時(shí)，去除未反應(yīng)的成分，例如，通過(guò)洗滌去除，并且檢測(cè)錨定在固體表面上的復(fù)合物。當(dāng)初始未固定的成分?jǐn)y帶可檢測(cè)的標(biāo)記時(shí)，固定在表面上的標(biāo)記的檢測(cè)指示復(fù)合的發(fā)生。在初始未固定的成分不攜帶標(biāo)記的情形中，例如，可以通過(guò)使用特異性結(jié)合被固定的復(fù)合物的標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)復(fù)合。候選化合物可以通過(guò)組合文庫(kù)和/或基于本文所述的信息(特別是涉及配體或bace1序列本身中單個(gè)殘基和結(jié)構(gòu)部分對(duì)bace1-配體結(jié)合相互作用的貢獻(xiàn)和重要性的信息)的已知的結(jié)合劑的突變而產(chǎn)生。干擾bace1和結(jié)合配體的相和作用的化合物可以按下述檢測(cè)：通常在一定條件下制備含有bace1和配體的反應(yīng)混合物，反應(yīng)一定的時(shí)間，以允許這兩種分子的相互作用和結(jié)合。為了檢測(cè)候選化合物抑制結(jié)合相互作用的能力，在不存在或存在測(cè)試化合物的條件下運(yùn)行反應(yīng)。另外，可以向第三反應(yīng)混合物中加入對(duì)照化合物，以作為陽(yáng)性對(duì)照。監(jiān)測(cè)測(cè)試化合物與混合物中存在的bace1和/或結(jié)合配體之間的結(jié)合(復(fù)合物形成)，如本文上文所述。在對(duì)照反應(yīng)中形成復(fù)合物而在含有測(cè)試化合物的反應(yīng)混合物中不形成復(fù)合物表示所述測(cè)試化合物干擾bace1與結(jié)合配體的相互作用。h.肽綴合物本發(fā)明也提供包含本文中公開(kāi)的bace1結(jié)合肽與一或多種細(xì)胞毒性劑，如化療劑或藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如蛋白質(zhì)毒素、細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來(lái)源的酶促活性毒素，或其片段))或放射性同位素綴合的肽綴合物。在一實(shí)施方案中，肽綴合物包含與一種或多種藥物綴合的本文所述的bace1結(jié)合肽，所述一種或多種藥物包括但不限于，美坦生類化合物(maytansinoid，參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,208,020、5,416,064及歐洲專利ep0425235b1)；奧利司他汀(auristatin)，如單甲基奧利司他汀藥物(monomethylauristatin)結(jié)構(gòu)部分de及df(mmae及mmaf)(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,635,483及5,780,588，及7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利車(chē)霉素(calicheamicin)或其衍生物(參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001及5,877,296；hinman等人，cancerres.(癌癥研究)53：3336-3342(1993)；及l(fā)ode等人，cancerres.(癌癥研究)58：2925-2928(1998))；蒽環(huán)類抗生素(anthracycline)如道諾霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(參見(jiàn)kratz等人，currentmed.chem.(現(xiàn)代藥物化學(xué))13：477-523(2006)；jeffrey等人，bioorganic&med.chem.letters(生物有機(jī)和藥物化學(xué)通信)16：358-362(2006)；torgov等人，bioconj.chem.16：717-721(2005)；nagy等入，proc.natl.acad.sci.usa(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))97：829-834(2000)；dubowchik等人，bioorg.&med.chem.letters(生物有機(jī)和藥物化學(xué)通信)12：1529-1532(2002)；king等人，j.med.chem.(藥物化學(xué)雜志)45：4336-4343(2002)；及美國(guó)專利號(hào)6,630,579)；甲氨喋呤(methotrexate)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)如多西他賽(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特賽紫杉醇(tesetaxel)及奧他紫杉醇(ortataxel)；單端孢霉烯族化合物(trichothecene)；及cc1065。在另一實(shí)施方案中，肽綴合物包含與酶促活性毒素或其片段綴合的本文中所述的bace1結(jié)合肽，所述酶促活性毒素或其片段包括，但不限于，白喉(diphtheria)a鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素a鏈(來(lái)自銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)a鏈、相思豆毒蛋白(abrin)a鏈、蒴蓮根毒蛋白(modeccin)a鏈、α-帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(aleutitesfordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陸(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制劑、麻瘋樹(shù)毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑、白樹(shù)毒蛋白(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(enomycin)和單端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。在另一實(shí)施方案中，肽綴合物包含與放射性原子綴合形成放射性綴合物的本文中所述的bace1結(jié)合肽。多種放射性同位素可用于制備放射性綴合物。實(shí)例包括at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212、p32、pb212及l(fā)u的放射性同位素。當(dāng)使用放射性綴合物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，其可包含用于閃爍攝影研究的放射性原子，例如tc99m或i123，或用于核磁共振(nmr)成像(也稱為磁共振成像，mri)的自旋標(biāo)記物，同樣如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。肽與細(xì)胞毒性劑的綴合物可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶合劑制得，例如n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)，琥珀酰亞胺基-4-(n-馬來(lái)酰亞氨甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(smcc)，亞氨基硫烷(it)，亞氨酸酯(諸如鹽酸二甲基己二亞酰胺化物)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對(duì)-疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對(duì)-重氮苯甲?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。舉例來(lái)說(shuō)，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如vitetta等人，science(科學(xué))238：1098(1987)中所述來(lái)制備。接頭可以是促進(jìn)細(xì)胞毒性藥物在細(xì)胞中釋放的“可切割接頭”。舉例來(lái)說(shuō)，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感性接頭、光不穩(wěn)定接頭、二甲基接頭或含二硫化物的接頭(chari等人，cancerres.(癌癥研究)52：127-131(1992)；美國(guó)專利號(hào)5,208,020)。本文中的肽綴合物明確涵蓋，但不限于，用交聯(lián)劑試劑制備的這些綴合物，該等交聯(lián)劑試劑包括，但不限于：bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、硫代-emcs、硫代-gmbs、硫代-kmus、硫代-mbs、硫代-siab、硫代-smcc及硫代-smpb及svsb(琥珀酰亞胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，交聯(lián)劑試劑可商購(gòu)獲得(例如購(gòu)自piercebiotechnology，inc.，rockford，il.，美國(guó))。在其他實(shí)施方案中，肽綴合物包括包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的本文所公開(kāi)的bace1結(jié)合肽的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含所述bace1結(jié)合肽與酶促活性毒素(如上文公開(kāi)的那些中的任一種)的融合體。在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含所述bace1結(jié)合肽與增強(qiáng)多肽細(xì)胞進(jìn)入的氨基酸序列的融合體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氨基酸序列式細(xì)胞穿透肽(ccp)，例如，tat肽，penetratin，皰疹病毒被膜蛋白vp22，transportan，模式兩親性肽(map)，精氨酸寡聚物，或其他本領(lǐng)域已知的ccp。例如，參見(jiàn)sebbage，(2009)biosciencehorizons2：64-72；和delcroix與riley，(2010)pharmaceuticals3：448-470。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含所述bace1結(jié)合肽與通常進(jìn)行通過(guò)血腦屏障的吸附介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)作用或受體介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)作用的蛋白的氨基酸序列的融合體。這些蛋白包括但不限于，針對(duì)腦毛細(xì)管內(nèi)皮受體的配體，諸如針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或針對(duì)胰島素受體的單克隆抗體，組蛋白，生物素，葉酸，尼克酸，泛酸或糖肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述bace1結(jié)合肽連接在高度帶正電荷的化合物上，所述高度帶正電荷的化合物諸如賴氨酸、聚賴氨酸、精氨酸、聚精氨酸、賴氨酸-精氨酸肽、腐胺、精脒、精胺等，已知所有這些可能通過(guò)與受體結(jié)合而促進(jìn)穿過(guò)血腦屏障。在備選的實(shí)施方案中，所述融合蛋白可以包含bace1結(jié)合肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區(qū)域(例如，igg分子的fc區(qū))的融合體。對(duì)于免疫球蛋白融合體的產(chǎn)生，參見(jiàn)，例如，1995年6月27日出版的美國(guó)專利號(hào)5,428,130。在備選的實(shí)施方案中，所述bace1結(jié)合肽與導(dǎo)致肽的提高的pk和/或藥效學(xué)的試劑融合。在一些實(shí)施方案中，所述肽是白蛋白融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述融合蛋白是聚乙二醇化的融合蛋白。i.藥物組合物本發(fā)明的bace1結(jié)合肽或多肽可以結(jié)合在組合物中，所述組合物在一些實(shí)施方案中適于制藥應(yīng)用。所述組合物典型地包含所述肽或多肽以及可接受的載體，例如，藥用載體。“藥用載體”包括任一種和所有的與藥物給藥相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸附延遲劑等(gennaro，remington：thescienceandpracticeofpharmacy(雷明頓：制藥科學(xué)與實(shí)踐).lippincott，williams&wilkins，philadelphia，pa.(2000))。所述載體或稀釋劑的實(shí)例包括但不限于，水、鹽水、finger′s溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂質(zhì)體和非水性賦形劑如不揮發(fā)性油。除了當(dāng)常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容時(shí)，都考慮這些組合物的使用。補(bǔ)充性活性化合物也可以結(jié)合在組合物中。1.一般考慮配制藥物組合物使其與其意欲的給藥途徑相容，所述給藥途徑包括靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服(例如，吸入)、經(jīng)皮(例如，局部)、經(jīng)黏膜和直腸給藥。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可以包括：無(wú)菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸(edta)；緩沖液，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，和用于調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。ph可以用酸或堿調(diào)節(jié)，諸如用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。腸胃外制劑可以包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。2.可注射的制劑適于注射的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(在水溶性的情形中)或分散液或用于即時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散液的無(wú)菌粉劑。對(duì)于靜脈內(nèi)給藥，適當(dāng)?shù)妮d體包括生理鹽水、抑菌水、cremophoreltm(basf，parsippany，n.j.)或磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)。在所有情形中，所述組合物必須是無(wú)菌的，并且應(yīng)該是流體，以用注射器給藥。所述組合物應(yīng)該在制備和儲(chǔ)存過(guò)程中是穩(wěn)定的，并且必須保持不受諸如細(xì)菌和真菌的微生物的污染。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，例如，包含水、乙醇、多元醇(如甘油、聚乙二醇和液體聚乙二醇)和適當(dāng)?shù)幕旌衔??？梢员３诌m當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如，通過(guò)使用諸如磷脂酰膽堿的包衣，在分散液的情形中通過(guò)保持需要的粒度，以及通過(guò)使用表面活性劑。多種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑；例如，對(duì)羥苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，抗壞血酸和硫柳汞，可以包含微生物污染。等滲劑；例如，糖，多元醇，諸如甘露醇，山梨醇，和氯化鈉可以包含在組合物中?？梢匝舆t吸收的組合物包括諸如單硬脂酸鋁和明膠的試劑。無(wú)菌注射溶液可以通過(guò)將需要量的活性化合物(例如，本發(fā)明任意的調(diào)節(jié)物質(zhì)/分子)結(jié)合在適當(dāng)?shù)娜軇?具有一種需要的成分或需要的成分的組合)中，然后除菌而制備。一般地，分散液通過(guò)將活性化合物結(jié)合在包含基本的分散介質(zhì)和其他需要的成分的無(wú)菌賦形劑中而制備。用于制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉劑、制備方法包括真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生包含活性成分和來(lái)自無(wú)菌溶液的任意需要的成分的粉劑。3.口服組合物口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用的載體。其可以包封在明膠膠囊中或壓縮成片劑。為了口服治療給藥的目的，活性化合物可以與賦形劑結(jié)合并且以片劑、藥片或膠囊的形式使用?？诜M合物還可以使用流體載體制備，用作漱口水，其中在流體載體中的化合物口服應(yīng)用?？梢园ㄋ幬锵嗳莸慕Y(jié)合劑和/或輔藥物質(zhì)。片劑、丸劑、膠囊、藥片等可以包含下述成分或相似性質(zhì)的化合物中的任一種：結(jié)合劑，如微晶纖維素，黃蓍膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖，崩解劑，如海藻酸，primogel或玉米淀粉；滑潤(rùn)劑，如硬脂酸鎂或sterotes；助流劑，諸如膠狀二氧化硅；增甜劑，如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，如薄荷，水楊酸甲酯或橙味調(diào)味劑。4.用于吸入的組合物對(duì)于通過(guò)吸入給藥，化合物作為氣霧噴霧劑由噴霧器或含有適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑(例如，氣體，如二氧化碳)的壓縮容器遞送。5.系統(tǒng)給藥系統(tǒng)給藥也可以是經(jīng)黏膜的或經(jīng)皮的。對(duì)于經(jīng)黏膜或經(jīng)皮給藥，選擇可以透過(guò)靶屏障的滲透劑。經(jīng)黏膜滲透劑包括去污劑，膽汁鹽和夫西地酸衍生物。鼻噴霧劑或栓劑可以用于經(jīng)黏膜給藥。對(duì)于經(jīng)皮給藥，活性化合物配制成軟膏、油膏、凝膠或乳膏?；衔镞€可以以用于直腸遞送的栓劑(例如，用基質(zhì)如可可油和其他甘油酯)或保留灌腸劑的形式制備。6.載體在一個(gè)實(shí)施方案中，活性化合物用保護(hù)該化合物免于從機(jī)體中快速清除的載體制備，諸如可控釋放的制劑，包括植入物和微膠囊化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到獾幕钌锵嗳莸木酆衔?，諸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。此類物質(zhì)可以從alza公司(mountainview，calif.)和諾華制藥公司(novapharmaceuticals，inc.)(lakeelsinore，calif.)商購(gòu)獲得，或者由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。脂質(zhì)體混懸液也可以用作藥用載體。這些可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，諸如在(eppstein等，美國(guó)專利號(hào)4,522,811,1985)中的方法。7.單位劑量可以產(chǎn)生單位劑型的口服制劑或腸胃外組合物，以促進(jìn)給藥和劑量均一性。單位劑型是指適用作待治療的受試者的單次劑量的物理上分離的單位，其包含與需要的藥物載體聯(lián)合的治療有效量的活性活性化合物。關(guān)于單位劑型的說(shuō)明由活性化合物特有的特征和特別需要的治療效果以及配制所述活性化合物的固有限制所指示，并且直接取決于上述。8.基因治療組合物編碼本發(fā)明的肽或多肽的核酸可以插入到載體中并且用作基因治療載體。基因治療載體可以通過(guò)例如靜脈內(nèi)注射、局部給藥(nabel和nabel，美國(guó)專利號(hào)5,328,470,1994)或通過(guò)立體定向注射(chen等，procnatlacadsciusa(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)).91；3054-7(1994))而遞送至受試者。基因治療載體的藥物制劑可以包括可接受的稀釋劑，或可以包含緩慢釋放的基質(zhì)，其中包埋有所述基因遞送賦形劑。備選地，在可以由重組細(xì)胞完整地產(chǎn)生完整基因遞送載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒載體)的情形中，藥物制劑可以包括一種或多種產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。j.治療方法本文中提供的任何bace1結(jié)合肽或多肽可以用于治療方法。在一方面中，提供用作藥物的bace1結(jié)合肽或多肽。在另外的方面中，提供用于治療神經(jīng)疾病或病癥(例如，ad)的抗-bace1抗體。在某些實(shí)施方案中，提供用于治療方法中的bace1結(jié)合肽或多肽。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供bace1結(jié)合肽或多肽，其用于治療患有神經(jīng)疾病或病癥的個(gè)體的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給藥有效量的所述bace1結(jié)合肽或多肽。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述方法還包括向所述個(gè)體給藥有效量的至少一種另外的治療劑。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供bace1結(jié)合肽或多肽，其用于減少或抑制有風(fēng)險(xiǎn)患有或患有神經(jīng)疾病或病癥(例如，ad)的患者中的淀粉狀蛋白斑形成。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供bace1結(jié)合肽或多肽，其用于減少或抑制個(gè)體中aβ產(chǎn)生的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給藥有效量的bace1結(jié)合肽或多肽。根據(jù)任何以上實(shí)施方案的“個(gè)體”優(yōu)選是人。在某些方面中，用于本發(fā)明的方法的bace1結(jié)合肽或多肽降低或抑制bace1活性。例如，所述bace1結(jié)合肽或多肽降低或抑制bace1切割app的能力。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供bace1結(jié)合肽或多肽在生產(chǎn)或制備藥物中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物用于治療神經(jīng)疾病或病癥。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物用于治療神經(jīng)疾病或病癥的方法，所述方法包括向患有神經(jīng)疾病或病癥的個(gè)體給藥有效量的所述藥物。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述方法還包括向所述個(gè)體給藥有效量的至少一種另外的治療劑，例如，如以下所述的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物用于抑制bace1活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物用于抑制個(gè)體中aβ產(chǎn)生或斑塊形成的方法，所述方法包括向所述個(gè)體給藥有效量的所述藥物以抑制aβ產(chǎn)生或斑塊形成。根據(jù)任何以上實(shí)施方案的“個(gè)體”可以是人。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療阿爾茨海默病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括向患有ad的個(gè)體給藥有效量的bace1結(jié)合肽或多肽。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述方法還包括向所述個(gè)體給藥有效量的至少一種另外的治療劑。根據(jù)任何以上實(shí)施方案的“個(gè)體”可以是人。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供藥物制劑，所述藥物制劑包含本文提供的任一種bace1結(jié)合肽或多肽，例如，用于任何以上治療方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑包含本文提供的任一種bace1結(jié)合肽或多肽和藥用載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物制劑包含本文提供的任一種bace1結(jié)合肽或多肽和至少一種另外的治療劑，例如，如以下所述的。在治療中，本發(fā)明的bace1結(jié)合肽或多肽可以單獨(dú)使用或與其他藥劑組合使用。例如，本發(fā)明的肽或多肽可以與至少一種另外的治療劑共同給藥。這樣的以上所述的組合療法包括組合給藥(其中兩種以上治療劑被包含在相同或分開(kāi)的制劑中)，和分別給藥，其中，本發(fā)明抗體的給藥可以發(fā)生在另外的治療劑和/或佐劑的給藥前、同時(shí)和/或之后。本發(fā)明的肽或多肽還可以與放射療法一起使用。本發(fā)明的肽或多肽(以及任何另外的治療劑)可以通過(guò)任何合適的方法給藥，包括腸胃外給藥，肺內(nèi)給藥、鞘內(nèi)和鼻內(nèi)給藥，并且，如果局部治療需要，病變內(nèi)給藥。腸胃外輸注包括肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥。在一定程度上根據(jù)用藥是短期或長(zhǎng)期性而定，可通過(guò)任何適合的途徑，例如通過(guò)注射，例如靜脈內(nèi)或皮下注射用藥。本文中涵蓋各種用藥時(shí)間方案，包括，但不限于，單次給藥或在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)多次給藥、推注給藥及脈沖輸注。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供穿過(guò)血腦屏障的肽或多肽。某些神經(jīng)退行性疾病與血腦屏障的滲透性提高相關(guān)，以致肽或多肽可以容易地被引入到腦中。當(dāng)血腦屏障保持完整時(shí)，存在數(shù)種已知方法用于穿過(guò)血腦屏障運(yùn)輸分子，所述方法包括但不限于，物理方法，基于脂質(zhì)的方法，以及基于受體和通道的方法。運(yùn)輸肽或多肽穿過(guò)血腦屏障的物理方法包括但不限于，完全繞開(kāi)血腦屏障，或通過(guò)在血腦屏障中產(chǎn)生開(kāi)口。繞行法包括但不限于，向腦中直接注射(見(jiàn)例如，papanastassiou等，genetherapy(基因治療)9：398-406(2002))和將遞送裝置植入腦中(見(jiàn)例如，gill等，naturemed.(自然醫(yī)學(xué))9：589-595(2003)；和gliadelwaferstm，guildfordpharmaceutical)。在屏障中產(chǎn)生開(kāi)口的方法包括但不限于，超聲(見(jiàn)例如，美國(guó)專利公布號(hào)2002/0038086)，滲透壓(例如，通過(guò)施用高滲甘露醇(neuwelt，e.a.，implicationoftheblood-brainbarrieranditsmanipulation(血腦屏障及其操作的意義)，卷1&2，plenumpress，n.y.(1989)))，通過(guò)例如緩激肽或滲透劑(permeabilizer)a-7的滲透化(見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5,112,596，5,268,164，5,506,206，和5,686,416)，以及用包含編碼抗體或其片段的基因的載體轉(zhuǎn)染橫跨血腦屏障的神經(jīng)元(見(jiàn)例如，美國(guó)專利公布號(hào)2003/0083299)?；谥|(zhì)的運(yùn)輸肽或多肽穿過(guò)血腦屏障的方法包括但不限于，將肽或多肽包封在脂質(zhì)體中，所述脂質(zhì)體與抗體結(jié)合片段偶聯(lián)，所述抗體結(jié)合片段結(jié)合血腦屏障的血管內(nèi)皮上的受體(見(jiàn)例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)20020025313)，以及將肽或多肽包被在低密度脂蛋白顆粒(見(jiàn)例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)20040204354)或脫脂載酯蛋白e(見(jiàn)例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)20040131692)中?；谑荏w的運(yùn)輸肽或多肽穿過(guò)血腦屏障的方法包括但不限于，將所述肽或多肽與識(shí)別在血腦屏障上表達(dá)的受體的配體綴合，導(dǎo)致在受體-介導(dǎo)的胞轉(zhuǎn)作用后其被攜帶穿過(guò)血腦屏障(gabathuler(2010)neurobiologyofdisease(疾病的神經(jīng)生物學(xué))37；48-57)。這些配體包括但不限于，針對(duì)腦毛細(xì)管內(nèi)皮受體的配體，如針對(duì)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或針對(duì)胰島素受體的單克隆抗體，組蛋白，生物素，葉酸，尼克酸，泛酸或糖肽。本發(fā)明的肽或多肽將以與良好醫(yī)療實(shí)踐相一致的方式配制、給藥和施用。在該背景下考慮的因素包括待治療的具體病癥、待治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀態(tài)、病癥的原因、遞送試劑的位點(diǎn)、施藥方法、施藥時(shí)間安排和醫(yī)療從業(yè)者已知的其他因素。所述肽或多肽不需要，但任選地，與目前用于預(yù)防或治療待討論病癥的一種或多種試劑一起配制。所述其他試劑的有效量取決于制劑中存在的抗體的量、病癥或治療的類型以及以上討論的其他因素。這些一般以相同劑量，并使用如本文中所述的施藥途徑，或以本文中所述的劑量的約1-99％，或以通過(guò)經(jīng)驗(yàn)/臨床確定合適的任意劑量和任何途徑來(lái)使用。為了預(yù)防或治療疾病，本發(fā)明的肽或多肽的合適劑量(當(dāng)單獨(dú)或與一種或多種其他另外的治療劑組合使用時(shí))將取決于待治療疾病的類型、疾病的嚴(yán)重性和進(jìn)程、所述肽或多肽是以預(yù)防目的施用還是以治療目的施用、以前的治療、患者的臨床病史和對(duì)所述肽或多肽的應(yīng)答和主治醫(yī)師的判斷力。所述肽或多肽以一次治療或經(jīng)過(guò)一系列治療合適地施用于患者。根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重性，合適的劑量水平一般為約0.01-500mg/kg患者體重/天，其可以以單次或多次劑量給藥。優(yōu)選地，劑量水平為約0.1-約250mg/kg/天；更優(yōu)選地，約0.5-約100mg/kg/天。適當(dāng)?shù)膭┝克娇梢允羌s0.01-250mg/kg/天，約0.05-100mg/kg/天，或約0.1-50mg/kg/天。在該范圍內(nèi)，劑量可以是0.05-0.5，0.5-5或5-50mg/kg/天。對(duì)于口服給藥，組合物優(yōu)選以含有1.0-1000毫克活性成分、特別是1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，50.0，75.0，100.0，150.0，200.0，250.0，300.0，400.0，500.0，600.0，750.0，800.0，900.0和1000.0毫克活性成分(用于針對(duì)癥狀調(diào)節(jié)用于待治療的患者的劑量)的片劑的形式提供。化合物可以以每天1-4次、優(yōu)選每天一次或兩次的方案給藥。然而，用于任意特定患者的具體的劑量水平和給藥頻率可能不同并且取決于多種因素，包括所用的具體化合物的活性，該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)長(zhǎng)，年齡，體重，一般健康，性別，飲食，給藥方式和時(shí)間，排泄速率，藥物組合，具體病癥的嚴(yán)重性以及主要正在進(jìn)行的治療(hostundergoingtherapy)。通過(guò)常規(guī)技術(shù)和測(cè)定容易地監(jiān)測(cè)該治療的進(jìn)展。k.制品在本發(fā)明的另一方面中，提供一種制品，所述制品包含可用于治療、預(yù)防和/或診斷上述病癥的物質(zhì)。該制品包括容器和在容器上或與容器一起的標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)。適合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、iv溶液袋等。所述容器可以由各種材料諸如玻璃或塑料制成。容器裝有組合物，所述組合物是單獨(dú)地或與可有效用于治療、預(yù)防和/或診斷所述病癥的另一種組合物結(jié)合，并且可以具有無(wú)菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或小瓶)。組合物中至少一種活性試劑是本發(fā)明的肽或多肽。標(biāo)簽或包裝說(shuō)明書(shū)標(biāo)明該組合物是用于治療所選的病癥。此外，所述制品可以包含(a)其中包含組合物的第一容器，其中所述組合物包含本發(fā)明的肽或多肽；和(b)其中包含組合物的第二容器，其中所述組合物包含另一種細(xì)胞毒性劑或其他的治療劑。本發(fā)明的該實(shí)施方案中的制品還可以包括包裝說(shuō)明書(shū)，所述包裝說(shuō)明書(shū)指明所述組合物可以用于治療特定病癥。備選地，或另外地，所述制品還可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含藥用緩沖劑，如抑菌注射用水(bwfi)，磷酸鹽緩沖鹽水，ringer溶液和葡萄糖溶液。從商業(yè)和用戶立場(chǎng)，它還可以包括所需的其他物質(zhì)，包括其他緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭和注射器。包括下述實(shí)施例，以證明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明的實(shí)踐中作用良好的技術(shù)，并且因此可以被認(rèn)為組成用于其實(shí)踐的優(yōu)選模式。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)該理解在所公開(kāi)的具體的實(shí)施方案中可以進(jìn)行多種改變并且仍然獲得類似的或相似的結(jié)果，而并不背離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例實(shí)施例1：bace1的肽抑制劑的選擇和表征材料和方法材料。酶和m13-ko7輔助噬菌體獲自newenglandbiolabs。maxisorp免疫平板獲自nalgenenuncinternational(naperville，il)。myone鏈霉抗生物素蛋白獲自invitrogen(carlsbad，ca)。3，3’，5，5’-四甲基-聯(lián)苯胺/h2o2(tmb)過(guò)氧化物酶底物獲自kirkegaard&perrylaboratories，inc(gaithersburg，md)。neutravidin和鏈霉抗生物素蛋白獲自thermoscientific(rockford，il)。om99-2(cat.no.496000)獲自emdbiosciences(sandiego，ca)。文庫(kù)構(gòu)建。利用標(biāo)準(zhǔn)kunkel誘變構(gòu)建噬菌體展示的肽文庫(kù)(kunkel，t.a.等(1987)methodsenzymol(酶學(xué)方法)154：367-82)。通過(guò)按照制備噬菌體展示文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)方法(sidhu，s.s.等(2000)methodsenzymol(酶學(xué)方法)328：333-63)將隨機(jī)化的肽融合在m13主要衣殼蛋白的n端而構(gòu)建兩組噬菌體展示的肽文庫(kù)，線性-lib和環(huán)形-lib(含有半胱氨酸二硫化物)。線性-lib由連續(xù)的簡(jiǎn)并密碼子(nnk，其中n＝a/c/g/t并且k＝g/t)編碼的長(zhǎng)度為8，10，12，14，16個(gè)氨基酸的隨機(jī)的肽組成。單獨(dú)構(gòu)建具有不同長(zhǎng)度的文庫(kù)并且匯集在一起，每個(gè)具有相同的濃度。環(huán)形-lib由在兩個(gè)固定的半胱氨酸之間具有不同長(zhǎng)度的14-mer隨機(jī)的肽組成。其命名為x6cx3cx5，x5cx4cx5，x5cx5cx4，x4cx6cx4，x4cx7cx3，x3cx8cx3，x3cx9cx2，x2cx10cx2，其中x表示由nnk密碼子編碼的殘基，數(shù)字表示殘基數(shù)目，并且c表示固定的半胱氨酸。單獨(dú)構(gòu)建這些文庫(kù)并且匯集在一起，每個(gè)的濃度相同。線性-lib和環(huán)形-lib的最終多樣性分別為1.8×1011和7.8×1011。使用簡(jiǎn)并寡核苷酸構(gòu)建軟隨機(jī)文庫(kù)(softrandomizedlibrary)，所述簡(jiǎn)并寡核苷酸用核苷酸堿基的70-10-10-10混合物合成，其中野生型堿基是過(guò)量的。該結(jié)果是在靶位置以約50％的頻率存在野生型氨基酸。選擇針對(duì)人bace1(bace1)的肽配體。將線性-lib和環(huán)形-lib的噬菌體庫(kù)用平板-包被的bace1使用標(biāo)準(zhǔn)噬菌體淘選流程(sidhu，s.s.等(2000)methodsenzymol(酶學(xué)方法)328：333-63)或用在溶液中的生物素?；腷ace1循環(huán)經(jīng)過(guò)數(shù)輪的結(jié)合選擇。bace1在體外用購(gòu)自thermoscientific(rockford，il)的ez-link硫代-nhs-lc-生物素酰化試劑盒(cat.no.21435)按照供應(yīng)商的使用說(shuō)明進(jìn)行生物素?；?。對(duì)于第1輪，將20μg生物素酰化的bace1與1ml的噬菌體文庫(kù)(～1×1013pfu/ml)在4℃溫育2h，在室溫由200μl預(yù)先用封閉緩沖液(pbs，1％bsa和0.1％吐溫20)封閉的myone鏈霉抗生物素蛋白捕獲15分鐘。棄去上清液，并且將珠子用洗滌緩沖液(具有0.1％吐溫20的pbs)洗滌三次。結(jié)合的噬菌體用400μl0.1mhcl洗滌7分鐘，并立即用60μl1mtris，ph13中和。洗脫的噬菌體按先前所述進(jìn)行擴(kuò)增(sidhu，s.s.等(2000)methodsenzymol(酶學(xué)方法)328：333-63)。對(duì)于第2輪，除了使用10μg生物素?；腷ace1和100μl之外，流程與第一輪相同。對(duì)于第3輪，2μg生物素?；腷ace1與前一輪擴(kuò)增的噬菌體溫育，并且通過(guò)預(yù)先用封閉緩沖液包被的neutravidin-包被的平板捕獲噬菌體-bace1復(fù)合物。處理使用鏈霉抗生物素蛋白-包被的平板來(lái)捕獲生物素-bace1-噬菌體復(fù)合物之外，第4輪與第3輪相同。4輪結(jié)合選擇后，在高通量斑點(diǎn)噬菌體elisa(sidhu，s.s.等(2000)methodsenzymol(酶學(xué)方法)328：333-63)中使用平板-固定的bace1作為靶標(biāo)分析單個(gè)噬菌體克隆。檢測(cè)相同噬菌體顆粒與bsa的結(jié)合信號(hào)作為非特異性結(jié)合噪聲。認(rèn)為具有大于0.5的噬菌體與靶標(biāo)結(jié)合信號(hào)和＞3的信號(hào)/噪聲比率的克隆是陽(yáng)性克隆，并且進(jìn)行dna序列分析。通過(guò)人工或自動(dòng)化(proteintechnologies，inc.symphony肽合成儀(symphonypeptidesynthesizer))基于fmoc的固相合成以0.25mmol規(guī)格使用聚苯乙烯樹(shù)脂合成肽(參見(jiàn)bodanszky，m.，和bodanszky，a.(1984)，thepracticeofpeptidesynthesis(肽合成實(shí)踐)，springer-verlag，紐約)。合成結(jié)束時(shí)，去除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，并且用95％三氟乙酸(tfa)，2.5％三異丙基硅烷和2.5％水將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)。通過(guò)加入在乙酸中的飽和的碘溶液進(jìn)行半胱氨酸到二硫鍵的氧化。通過(guò)使用含有0.1％tfa的水/乙腈梯度的反相hplc進(jìn)行肽的純化。每種肽的純度通過(guò)分析型hplc確定為大于95％均質(zhì)性，并且其性質(zhì)通過(guò)質(zhì)譜來(lái)驗(yàn)證。肽bms1、bms2和bms4分別與kornacker等biochemistry(生物化學(xué))44：11567-11573(2005)中所述的肽1、肽2和肽4相同。bace1htrf活性測(cè)定。通過(guò)向384-孔proxiplate(perkinelmer)中的在bace1反應(yīng)緩沖液(50mmnaoacph4.4和0.1％chaps)中的用肽或小分子抑制劑預(yù)先溫育的6μl2.7nmrhbace1中加入2μl600nmbi27(生物素-kteeisevnldaefrhdsgyevhhqkl(seqidno：5)，americanpeptidecompany)起始bace1htrf反應(yīng)。將8μl蛋白水解反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度溫育24小時(shí)，并且通過(guò)加入在檢測(cè)緩沖液(200mmtrisph8.0，20mmedta，0.1％bsa，和0.8mkf)中含有150nm鏈霉抗生物素蛋白-d2和5nm用銪穴狀化合物標(biāo)記的6e10的8μlhtrf檢測(cè)混合物而猝滅。最終反應(yīng)混合物在室溫溫育60分鐘，并且使用envision多標(biāo)記平板讀數(shù)儀(envisionmultilabelplatereader，perkin-elmer)(320nm激發(fā)，615與665nm發(fā)射)測(cè)量tr-fret信號(hào)。使用graphpadprism5(lajolla，ca)分析數(shù)據(jù)。使用微流體毛細(xì)管電泳(mce)進(jìn)行的bace1、bace2和組織蛋白酶d活性測(cè)定。在384-孔微量平板中以每孔20μl的終體積使用caliperlabchip3000(hopkinton，ma)進(jìn)行bace1，bace2和組織蛋白酶d反應(yīng)。通過(guò)向5μl4x酶和5μl4x肽或小分子抑制劑中加入10μl2x底物起始的標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)含有12nmrhbace1，1μmfam-kteeisevnldaefrwkk-酰胺(seqidno：20)，50mmnaoac，ph4.4，0.1％chaps。對(duì)于rhbace2(5nm)和組織蛋白酶d(6nm)(cat.no.219394；emdbiosciences，sandiego，ca)使用相同的反應(yīng)條件。在室溫溫育60min后，使用12-sipper微流體芯片分離每份反應(yīng)物中的產(chǎn)物和底物。通過(guò)使用caliperoptimizer軟件選擇電壓和壓力而優(yōu)化產(chǎn)物和底物的分離。分離緩沖液包含100mmhepes，ph7.2，0.015％brij-35，0.1％包被試劑#3，10mmedta和5％dmso。分離條件使用-500v的下游電壓，-2250v的上游電壓和-1.2psi的篩選壓力。產(chǎn)物和底物熒光在488nm處激發(fā)并且在530nm處檢測(cè)。使用htswell分析儀軟件(htswellanalyzersoftware)由電泳圖計(jì)算底物轉(zhuǎn)換率。bace1熒光偏振競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。在黑色384-孔微量平板(proxiplate-plus；perkinelmer，waltham，ma)中以每孔10μl的終體積進(jìn)行bace1結(jié)合測(cè)定。通過(guò)向2.5μl4x結(jié)合探針和2.5ml4x抑制劑中加入5μl2x酶起始的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合反應(yīng)含有12nmrhbace1，3nm5-tamra-neesmycrllgigcg(seqidno：16)(5-tamra-bace020)，具有0.1％chaps的50mmnaoac，ph4.4。允許反應(yīng)在環(huán)境溫度繼續(xù)2小時(shí)至平衡，然后使用envision(perkinelmer)測(cè)量熒光偏振。在每孔中在595nm處(激發(fā)531nm的偏振光)測(cè)量的平行和垂直的熒光發(fā)射用于使用下式確定毫偏振水平(mp)：mp＝1000*(s-g*p)/(s+g*p)，其中s＝平行發(fā)射，p＝垂直發(fā)射，g＝0.65。每孔中的mp值作為抑制劑濃度的函數(shù)繪圖，并且利用prism5.0軟件(graphpadsoftware，sandiego，ca)使用數(shù)據(jù)的非線性最小二乘擬合為四參數(shù)等式來(lái)確定50％抑制(ic50)值。5-tamra-標(biāo)記的bace020購(gòu)自americanpeptidecompany，inc(sunnyvale，ca)并且以100mm溶解在dmso中用于存儲(chǔ)。在293-happ細(xì)胞中的aβ1-40測(cè)定。在穩(wěn)定表達(dá)野生型人app(695)互補(bǔ)dna(cdna)的293-hek細(xì)胞(293-happ)中測(cè)量aβ1-40產(chǎn)生。細(xì)胞以每孔3x104個(gè)細(xì)胞接種在96孔平板中過(guò)夜。將含有多種抑制劑的新鮮培養(yǎng)基[dulbecco’s改良的eagle’s培養(yǎng)基(dmem)+10％胎牛血清(fbs)]與293-happ細(xì)胞溫育24小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)基并且用aβ1-40htrf測(cè)定(cisbio)按照供應(yīng)商的使用說(shuō)明測(cè)定aβ1-40的存在。將aβ1-40值針對(duì)細(xì)胞存活性標(biāo)準(zhǔn)化，細(xì)胞存活性用celltiter-glo發(fā)光細(xì)胞存活性測(cè)定(celltiter-gloluminescentcellviabilityassay，promega)確定。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少3次，并且每次實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)點(diǎn)一式兩份重復(fù)。數(shù)據(jù)用4-參數(shù)非線性回歸曲線-擬合程序(kaleidagraph，synergysoftware)繪圖。結(jié)果選擇在外部位點(diǎn)結(jié)合bace1的肽兩種類型的噬菌體展示的首次用于實(shí)驗(yàn)的肽文庫(kù)，線性-lib和環(huán)形-lib用來(lái)選擇bace1配體，最初使用平板分選形式進(jìn)行。初始淘選鑒定一組具有保守的φpyfφ基序的肽，其與之前報(bào)道的來(lái)源于噬菌體展示的肽相似(圖1a)(kornacker，m.g.等(2005)biochemistry(生物化學(xué))44：11567-73)。合成選擇的肽，bace010和bace11，并且在bace1htrf活性測(cè)定中檢測(cè)。bace010是非常弱的bace1抑制劑，而bace011是bace1的激活劑(圖1b)。噬菌體展示的肽bace010和bace011與bace1的結(jié)合與肽bms1競(jìng)爭(zhēng)(圖1c)，其之前描述為外部位點(diǎn)-結(jié)合肽(komacker，m.g.等(2005)biochemistry(生物化學(xué))44：11567-73)。競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合以及相似的序列基序表明這些肽結(jié)合bace1上相同的外部位點(diǎn)(exosite)。選擇不與bace1外部位點(diǎn)結(jié)合的肽為了獲得不與bace1的外部位點(diǎn)結(jié)合的肽，我們使用首次用于實(shí)驗(yàn)的文庫(kù)在存在100μm外部位點(diǎn)-結(jié)合肽bace010(ac-sgpyfieymsav-nh2)(seqidno：21)的條件下進(jìn)行bace1的溶液分選。在使用該競(jìng)爭(zhēng)選擇策略進(jìn)行四輪溶液淘選后，環(huán)形肽文庫(kù)中有一種肽，命名為bace017，被鑒定為也與bace1結(jié)合的具有不同序列的肽(圖2)。為了提高bace017的親和性，使用bace017序列作為母本構(gòu)建軟隨機(jī)文庫(kù)。以增加嚴(yán)謹(jǐn)性的四輪淘選后，鑒定了31種肽，其以比母本更強(qiáng)的斑點(diǎn)噬菌體elisa信號(hào)結(jié)合bace1，表現(xiàn)為超過(guò)5倍的顯著的信號(hào)/噪聲比提高。這些肽的序列比對(duì)和序列標(biāo)識(shí)表明與母本的主要需要差異為his4變?yōu)閟er4，這可能解釋親和力增加(圖2)。肽選擇性抑制bace1酶活性并且與活性位點(diǎn)結(jié)合配體競(jìng)爭(zhēng)選擇四種信號(hào)/噪聲比超過(guò)20的環(huán)形肽用于肽合成，命名為bace018-021，并且進(jìn)行兩種類型的酶活性測(cè)定。bace025-028分別是bace018-021的肽，其中cys被ser置換，以研究二硫鍵對(duì)其抑制活性的重要性。在htrf酶活性測(cè)定(圖3a)中，bace018-021肽以10-70nm的ic50值抑制酶活性，與bace017相比，具有多至100倍的效力提高。這些肽的線性版本，bace025-028，不再抑制bace1活性，這表明二硫鍵對(duì)于抑制作用是必需的(表2)。bace020是通過(guò)htrf酶活性測(cè)定所示具有最佳抑制活性的肽，并且選擇其用于進(jìn)一步的研究。使用生物素?；腷ace020和濃度依賴性的加入bace020、om99-2或bms1肽進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合elisa實(shí)驗(yàn)。如預(yù)測(cè)的，生物素?；腷ace020與外部位點(diǎn)-結(jié)合肽配體bms1沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)(圖3b)。然而，在活性位點(diǎn)結(jié)合的肽抑制劑om99-2不競(jìng)爭(zhēng)生物素酰化的bace020的結(jié)合，這表明bace020也在所述活性位點(diǎn)結(jié)合。使用上文提及的用于確定ic50值的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合fp測(cè)定用系列稀釋的肽測(cè)量bace1肽配體的親和力。caliper測(cè)定用來(lái)測(cè)量肽配體對(duì)bace1酶活性的抑制。如表2所示，通過(guò)fp測(cè)定測(cè)量的親和力與通過(guò)caliper測(cè)定測(cè)量的抑制活性相關(guān)。此外，對(duì)于肽bace017-021和bace025-028，通過(guò)caliper測(cè)定測(cè)量的ic50值與通過(guò)htrf測(cè)定測(cè)量的那些相一致。為了研究結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，我們合成了一組在每個(gè)位置具有丙氨酸置換的肽以及從bace020的n端截短的肽。fp結(jié)合和caliper活性測(cè)定都用來(lái)評(píng)估對(duì)這些肽的親和力和抑制活性(表2)。用a1a替換asp1，glu2，gly11，ile12，gly13和gly15，以及剪截asp1和gly2不影響bace020的親和力和抑制活性，這表明這些殘基如果有任何相互作用能的話沒(méi)有貢獻(xiàn)太多。glu3突變?yōu)閍la，以及截短至位置4(bace031)減弱所述親和力和抑制活性3-4倍，并且用ala置換tyr6和leu10具有相似的親和力損失，這表明這些殘基對(duì)結(jié)合能有中等貢獻(xiàn)。當(dāng)用丙氨酸置換arg8，leu9，ser4和met5時(shí)，觀察到肽活性的最顯著的減少。特別地，arg8突變?yōu)閍la的突變體在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和酶測(cè)定中完全沒(méi)有活性。用精氨酸類似物賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸和瓜氨酸置換arg8(分別為bace058-060)在某種程度上拯救肽活性，但是不能恢復(fù)全部活性。bace030是具有全部活性的抑制性肽配體的最小版本，并且用來(lái)獲得肽-bace1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)實(shí)施例4)。由于沒(méi)有緊密相關(guān)的天冬氨酸蛋白水解酶bace2或組織蛋白酶d的抑制，因此，bace030對(duì)bace1的抑制是特異性的。表2.通過(guò)fp競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、caliperbace1活性測(cè)定和htrfbace1活性測(cè)定確定人bace1的肽配體(按出現(xiàn)的順序分別為seqidnos22-24，21，25-26，14-17，27-31，19，18和32-53)的抑制活性和結(jié)合親和力*速率增加的，數(shù)據(jù)是ec50而不是ic50#x＝l-鳥(niǎo)氨酸&x＝l-瓜氨酸在基于細(xì)胞的測(cè)定中，bace1肽抑制劑減少aβ由于肽是體外bace1酶活性的有力的抑制劑，接著在更代表生理狀態(tài)的細(xì)胞環(huán)境的情形中確定其是否是bace1的抑制劑。使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染app的293-hek細(xì)胞進(jìn)行濃度依賴性抑制測(cè)定。bace020確實(shí)是aβ產(chǎn)生形成的有力的抑制劑(圖4)。bace030，其在n端截短兩個(gè)殘基，也表現(xiàn)出有力的抑制(圖4)。bace027，bace020的cys突變?yōu)閟er的線性類似物，以及外部位點(diǎn)結(jié)合肽bms1，沒(méi)有表現(xiàn)出抑制，這與酶結(jié)果一致。然而，不是所有的酶促抑制劑都表現(xiàn)出有力的活性位點(diǎn)結(jié)合擬肽bace1抑制劑om99-2所顯示的細(xì)胞活性(圖4)。為了完整性和比較，對(duì)于有力的活性位點(diǎn)結(jié)合小分子抑制劑gsk-8e(charrier，等，j.med.chem.(醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志)51：3313-3317(2008))和外部位點(diǎn)結(jié)合抗-bace1抗體也顯示細(xì)胞抑制作用(圖4)(atwal，j.k.等(2011)scitranslmed3：84ra43)。實(shí)施例2：bace020溶液結(jié)構(gòu)和與bace1結(jié)合的nmr譜nmr譜bace020溶解在含有50mm磷酸鈉ph6.5和150mm氯化鈉的緩沖液中至終濃度為2mm。為了在d2o中的測(cè)量，將樣品凍干并且重新溶解在100％d2o中。在裝配有室溫三聯(lián)共振探針的brukerdrx800光譜儀上以280k捕獲nmr譜(1h1d譜，2d-2qfcosy，2d-tocsy和2d-noesy譜)。用topspin(bruker)處理譜圖，并且使用ccpn分析軟件(vranken，w.f.等(2005)proteins(蛋白質(zhì))59：687-96)進(jìn)行光譜分析。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法分配1h化學(xué)位移(wüthrich，k.(1986)nmrofproteinsandnucleicacids(蛋白質(zhì)和核酸的nmr).newyork，wiley)。距離抑制(distancerestraints)來(lái)源于在h2o和d2o中記錄的具有300ms混合時(shí)間的1h同核二維noesy譜圖(1hhomonucleartwo-dimensionalnoesyspectra)。骨架角的抑制來(lái)源于由高分辨率2qf-cosy譜確定的3j(hn，hα)偶聯(lián)常數(shù)，ω2橫截面通過(guò)hn-hα(kim，y.m.等(1989)jmagres(磁共振雜志)84：9-13)。由在d2o中測(cè)量的cosy-35譜獲得關(guān)于χ1角的3j(hα，hβ)偶聯(lián)常數(shù)(cavanagh，j.(2007)proteinnmrspectroscopy：principlesandpractice(蛋白質(zhì)nmr譜：原理和實(shí)踐).amsterdam；boston，academicpress)。為了確定bace020在bace1蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)，用增加量的bace020滴定30μm完全2h/15n-標(biāo)記的bace1的樣品，直至達(dá)到1∶1.5的摩爾化學(xué)計(jì)量。超過(guò)1∶1的摩爾化學(xué)計(jì)量在記錄的trosy1h，15n相關(guān)性譜圖中沒(méi)有觀察到進(jìn)一步的改變。對(duì)于在滴定過(guò)程中容易控制的共振，使用每個(gè)殘基的加權(quán)化學(xué)位移變化定量化學(xué)位移微擾(chemicalshiftperturbations)：其中ddhn和ddn分別是1hn和15n的化學(xué)位移的變化。nmr結(jié)構(gòu)計(jì)算對(duì)于bace020的實(shí)驗(yàn)確定的距離和二面角抑制(dihedralrestraints)(見(jiàn)表3)使用aria2.2(rieping，w.等(2007)bioinformatics(生物信息學(xué))23：381-2)和cns(brunger，a.t.等(1998)actacrystallogrdbiolcrystallogr54：905-21)用于模擬的退火流程中。在計(jì)算過(guò)程中不用氫抑制。使用procheck分析結(jié)構(gòu)性質(zhì)(laskowski，r.a.等(1996)jbiomolnmr(生物分子nmr雜志)8：477-86)。用molmol(koradi，r.等(1996)jmolgraph14：51-5，29-32)和pymol(thepymolmoleculargraphicssystem，version1.3，llc)制作繪圖顯示。表3.關(guān)于bace020肽的溶液結(jié)構(gòu)的nmr結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)基于bace020的十個(gè)(在100個(gè)計(jì)算的中)最低能量溶液結(jié)構(gòu)的全體而報(bào)道。cnserepel函數(shù)用來(lái)模擬范德華相互作用，使用‘prolsq′范德華半徑，能量常數(shù)為25.0kcal1kcal＝4.18kj。坐標(biāo)精確性作為關(guān)于其平均結(jié)構(gòu)的nmr全體中的十個(gè)最低能量結(jié)構(gòu)的cartesian坐標(biāo)r.m.s.d.給出。#結(jié)構(gòu)性質(zhì)使用procheck進(jìn)行分析(laskowski，r.a.等(1996)jbiomolnmr(生物分子nmr雜志)8：477-86)。noesy來(lái)源的距離抑制與使用50kcalmol-1的能量常數(shù)的軟方阱勢(shì)(softsquare-wellpotential)一起使用。二面角抑制使用200kcalmol-1rad-2的能量常數(shù)應(yīng)用。關(guān)于鍵長(zhǎng)的力常數(shù)為1000kcalmol-1關(guān)于角度和假二面角(improperdihedrals)的力常數(shù)為500kcalmol-1rad-2。bace020的nmr分析揭示其溶液結(jié)構(gòu)bace020的1hnmr譜圖分析表明bace020在溶液中具有確定的結(jié)構(gòu)?；谠摮跏荚u(píng)估，通過(guò)同核nmr譜解析bace020的結(jié)構(gòu)(圖5a)。多肽充分限定在glu3與cys14之間。殘基glu3至leu10形成n端螺旋，其通過(guò)cys7與cys14之間的二硫鍵與c端連接。tyr6，leu9，leu10和ile12的側(cè)鏈在結(jié)構(gòu)的一側(cè)形成疏水簇。由于用絲氨酸殘基置換半胱氨酸(bace027)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和活性二者的喪失，因此，二硫鍵是至關(guān)重要的。bace020在bace1上的結(jié)合位點(diǎn)的圖譜為了確定bace020在bace1上的結(jié)合位點(diǎn)的位置，使用完全2h/15n標(biāo)記的bace1通過(guò)nmr譜進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)。用于此的bace1構(gòu)建體(殘基43-453)與公布化學(xué)位移指定的構(gòu)建體非常相似，這允許轉(zhuǎn)化幾乎所有的指定并且在每個(gè)殘基的水平上追蹤化學(xué)位移微擾(liu，d.等(2004)jbiomolnmr(生物分子nmr雜志)29：425-6)。當(dāng)向bace1中加入bace020時(shí)，未結(jié)合的bace1的大量共振逐漸消失，并且在譜圖的不同位置出現(xiàn)新信號(hào)。因此，結(jié)合處于nmr時(shí)間范圍的緩慢交換方案中，如關(guān)于高親和性相互作用所預(yù)測(cè)的。將未結(jié)合的bace1的trosy譜與同bace020復(fù)合的bace1的譜進(jìn)行比較(參見(jiàn)圖5b)。對(duì)于多種共振，基于鄰近性處于結(jié)合狀態(tài)的哪種與處于游離狀態(tài)的那種相對(duì)應(yīng)是明顯的。認(rèn)為明顯受bace020結(jié)合的影響但是具有未知的新位置的bace1共振是獨(dú)立的一類，原因在于化學(xué)位移微擾不能進(jìn)行量化。bace020誘導(dǎo)的變化位于圍繞底物-結(jié)合溝的n和c端片狀物(lobes)的界面上。(參見(jiàn)圖5c)。兩個(gè)催化天冬氨酸殘基進(jìn)行化學(xué)位移微擾(圖5b)，這表明結(jié)合位點(diǎn)與活性位點(diǎn)緊密相鄰。另外，添加bace020影響蓋(flap)中的多種共振，這進(jìn)一步表明所述肽結(jié)合在底物-結(jié)合溝中。已知該蓋對(duì)不同分子在活性位點(diǎn)的結(jié)合非常敏感，并且可以采取多種構(gòu)象來(lái)容納不同的配體。實(shí)施例3：通過(guò)bace1的定點(diǎn)誘變繪制肽結(jié)合位點(diǎn)人bace1ecd突變體的構(gòu)建、表達(dá)和純化在prk載體中制備人bace1突變體，所述載體包含bace1信號(hào)肽，接著是其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ecd)(殘基22-457)和c端his8標(biāo)簽(seqidno：54)。使用iixl定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?agilenttechnologiesstratageneproducts，lajolla，ca)使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嶂苽渫蛔?，并且通過(guò)dna測(cè)序證實(shí)。使用在1升發(fā)酵器中生長(zhǎng)的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)蛋白，并且2周后收集培養(yǎng)物。離心后，通過(guò)在ni-nta瓊脂糖(qiagen，valencia，ca)將來(lái)自培養(yǎng)液的突變蛋白純化至均質(zhì)性(純度＞95％)。用含有10mm咪唑的pbs洗滌后，用含有200mm咪唑的pbs洗脫蛋白，并且匯集洗脫物，使用vivaspin20(sartorius-stedim，goettingen，德國(guó))濃縮，并且應(yīng)用到用20mmhepesph7.2，150mmnacl平衡的superdex20010/300gl柱(gehealthcarebio-sciencesab，uppsala，瑞典)上。收集蛋白峰，濃縮，并且通過(guò)a280確定蛋白濃度。純化的蛋白通過(guò)sds-page顯示正確的分子量；觀察到的粗條帶可能是由于異源糖基化所致。生物素?；腷ace020肽結(jié)合測(cè)定通過(guò)96孔平板測(cè)定確定生物素酰化的bace020與重組蛋白的結(jié)合。將maxisorp微量滴定平板(nalgenuncinternational，rochester，ny)用在50mm碳酸鹽，ph9.6中的2μg/mlbace1突變體在4℃包被過(guò)夜。包被的孔用緩沖液(pbs，0.05％聚山梨醇酯20)洗滌，并用測(cè)定緩沖液(pbs，ph7.4，0.5％bsa，0.05％吐溫20，15ppmproclin)在室溫輕輕搖動(dòng)下封閉1小時(shí)。封閉后，加入稀釋在測(cè)定緩沖液中的不同濃度的具有聚乙二醇(peg)間隔體的c端生物素標(biāo)記的bace020肽(ac-neesmycrllgigcg-(peg)3-生物素(seqidno：16)；ac-neesmycrllgigcg-conh-ch2-(ch2-ch2-o-)3-(ch2)3-nh-生物素(seqidno：16))，并且將平板在室溫輕輕搖動(dòng)溫育1小時(shí)。洗滌后，通過(guò)加入鏈霉抗生物素蛋白-辣根過(guò)氧化物酶綴合物(gehealthcare，piscataway，nj)、然后加入tmb/h2o2底物(kpl，gaithersburg，md)檢測(cè)與平板結(jié)合的肽的量。反應(yīng)用1m磷酸猝滅，并且在moleculardevicesspectramaxplus384微量平板讀數(shù)儀上測(cè)量a450。利用kaleidagraph使用4參數(shù)非線性回歸曲線-擬合程序(synergysoftware，reading，pa)確定給出半最大有效濃度的濃度(ec50)。使用固定量的生物素?；腷ace020和濃度依賴性加入的肽(例如bace020，om99-2或bms1)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。利用kaleidagraph使用4參數(shù)非線性回歸曲線-擬合程序確定給出半最大有效濃度的濃度(ec50)。結(jié)果為了確定作為肽結(jié)合區(qū)域的活性位點(diǎn)，在由om99-2結(jié)合確定的底物-結(jié)合溝中制備bace1的突變體(hong，l.等(2000)science(科學(xué))290：150-3)。使用elisa測(cè)定確定生物素?；腷ace020結(jié)合bace1和突變體的能力。以ec50(mut)/ec50(wt)的相對(duì)ec50值確定結(jié)合親和力減少的倍數(shù)，其在表3中列出。表4.與bace1突變體的相對(duì)生物素?；腷ace020結(jié)合*(表示基于結(jié)構(gòu)編號(hào)方式的殘基號(hào))實(shí)施例4：通過(guò)與bace1復(fù)合的bace030的x-射線晶體學(xué)確定結(jié)構(gòu)bace1蛋白表達(dá)和純化通過(guò)blueheron核查具有c端his6標(biāo)簽(seqidno：55)的人bace157-453或bace143-453dna，克隆到pet29a(+)載體中，并且轉(zhuǎn)化到bl21(de3)細(xì)胞中。表達(dá)用1mm異丙基β-d-1-硫代吡喃型半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)在37℃進(jìn)行4小時(shí)。細(xì)胞用微射流機(jī)(microfluidizer)裂解，并且分離包含bace1的包涵體，用te(10mmtris·hclph8.0和1mm乙二胺四乙酸(edta))緩沖液洗滌兩次。包涵體用7.5m尿素，100mmampsoph10.8和100mmβ-巰基乙醇(bme)在室溫溶解2小時(shí)，然后以12,000rpm離心30分鐘。然后，用7.5m尿素，100mmampsoph10.8稀釋上清液，以獲得od280～1.5-2.0。通過(guò)先將溶解的bace11∶20倍稀釋在冷水中，然后在4℃輕輕攪拌樣品3周以允許重折疊反應(yīng)發(fā)生而進(jìn)行重折疊。重折疊的bace1的純化包括3個(gè)柱步驟。首先將蛋白上樣到50ml用具有0.4m尿素的20mmtrisph8.0預(yù)先平衡的q瓊脂糖快速流動(dòng)(qsepharosefastflow，gehealthcare)柱上，并用0-0.5mnacl的鹽梯度洗脫。匯集峰級(jí)分，用20mmtrisph8.0緩沖液稀釋5倍，并且上樣到sourcetm15q柱(gehealthcare)上。使用0-0.3mnacl的梯度洗脫bace1。匯集含有bace1蛋白的級(jí)分，濃縮，用在superdexs75柱上進(jìn)一步純化在25mmhepesph7.5，150mmnacl中。與bace1復(fù)合的bace030的結(jié)晶將純化的bace157-453在如上述相同的緩沖液中濃縮至11mg/ml，并且用1mm肽bace030(初始以100mm溶解在100％dmso中)在4℃溫育1小時(shí)。然后，通過(guò)將0.2μlbace1蛋白儲(chǔ)液與0.2μl含有20％peg3350和0.1mbis-trisph5.5的儲(chǔ)庫(kù)溶液(reservoirsolution)在環(huán)境溫度混合通過(guò)坐滴蒸汽擴(kuò)散法(settingdropvapordiffusionmethod)進(jìn)行結(jié)晶。晶體出現(xiàn)并且在3天內(nèi)生長(zhǎng)至完全的尺寸。晶體從結(jié)晶液滴中成環(huán)析出并且迅速轉(zhuǎn)移到冷凍保護(hù)劑溶液(母液加20％甘油)中少于1分鐘，然后在液氮中驟冷而成環(huán)析出所述冷凍保護(hù)劑液滴。數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)確定使用單一x射線束在鉆石光源(diamondlightsource，dls)光束線i02確定衍射數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)收集的整個(gè)過(guò)程中保持晶體處于低溫溫度。x射線檢測(cè)裝置是放置在距離晶體170mm處的adsc量子-315ccd檢測(cè)器。對(duì)于單一晶體應(yīng)用旋轉(zhuǎn)法，以收集完整的數(shù)據(jù)組，其中每幀擺動(dòng)0.5°并且總的楔(wedge)大小為140°。然后將數(shù)據(jù)指標(biāo)化，積分，并使用程序hkl2000(otwinowski，z.等(1997)methodsenzymol.(酶學(xué)方法)276：307-325)換算(scaled)。數(shù)據(jù)處理的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示在表5中。使用分子置換(mr)法利用程序phaser(mccoy，a.j.等(2007)japplcrystallogr40：658-674)解析結(jié)構(gòu)。matthews系數(shù)計(jì)算結(jié)果指示每個(gè)不對(duì)稱單位由一種bace1/肽復(fù)合物和50％溶劑組成。因此，進(jìn)行mr計(jì)算以搜尋bace1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的三個(gè)亞基的一個(gè)組。bace1的搜尋模型來(lái)自bace1結(jié)構(gòu)1fkn(hong，l.等(2000)science(科學(xué))290：150-3)。在bace1活性位點(diǎn)中，在由于肽結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的不同的電子密度譜圖中觀察到大的陽(yáng)性峰。顯著的構(gòu)象變化發(fā)生在bace1中，特別是在蓋區(qū)域中。利用程序coot(emsley，2004)進(jìn)行手工重建。反復(fù)利用程序refmac5(murshudov，g.n.等(1997)actacrystallogrdbiolcrystallogr53：240-55)和phenix(adams，2010)使用最大相似度靶標(biāo)函數(shù)、各向異性個(gè)體b-因子精修法和tls精修法進(jìn)行結(jié)構(gòu)精修以獲得0.164的最終r因子和0.194的rfree。結(jié)構(gòu)精修的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示在表5中。表5.晶體學(xué)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)1rsym＝∑|ihi-ih|/∑ihi，其中ihi是經(jīng)換算的第i次對(duì)反射h的對(duì)稱相關(guān)觀察的強(qiáng)度，并且ih是平均值。2括號(hào)中的值是最高分辨率殼層的值。3rcryst＝∑h|foh-fch|/∑hfoh，其中foh和fch是反射h的觀察的和計(jì)算的結(jié)構(gòu)因子振幅。4對(duì)不包括在精修中的5％隨機(jī)選擇的反射計(jì)算rfree的值。靶向環(huán)形肽抑制劑的活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為了表征bace030肽與bace1催化結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，以的分辨率確定二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。在使肽滲透成幾種已知的晶體形式的無(wú)用的試驗(yàn)后，通過(guò)共同結(jié)晶結(jié)合所述肽。如圖7a所示，bace030結(jié)合在催化溝上，所述催化溝位于bace1通常稱為蓋區(qū)的柔性環(huán)片段下。所述蓋區(qū)可以采用如在與bace1結(jié)合的om99-2和小分子抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)中觀察到的多種構(gòu)象(hong，l.等(2000)science(科學(xué))290：150-3；cole等，(2008)bioinorganicmed.chem.lett.18：1063-1066；pael等，(2004)j.mol.biol.(分子生物學(xué)雜志)343：407-416)。當(dāng)bace030結(jié)合時(shí)，與用典型的線性底物樣抑制劑om99-2觀察到的底物結(jié)合構(gòu)象中的其閉合的位置(pdb登記編號(hào)1fkn)(hong，l.等(2000)science(科學(xué))290：150-3)相比較，蓋打開(kāi)約(基于thr72的cα)，并且容納更大的螺旋肽。結(jié)合狀態(tài)的bace030保持在溶液中通過(guò)nmr觀察到的α-螺旋結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)實(shí)施例2)。cys5與cys12之間的二硫鍵保持這樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這強(qiáng)調(diào)對(duì)在這兩個(gè)位置的半胱氨酸殘基的絕對(duì)需要。其支持使用首次用于實(shí)驗(yàn)的環(huán)形噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選的觀點(diǎn)，盡管天然bace1底物是線性的并且與bace1活性位點(diǎn)的結(jié)合的α-螺旋肽似乎是違反直覺(jué)的。復(fù)合物的結(jié)構(gòu)揭示與噬菌體展示結(jié)果緊密相關(guān)的特征。大部分肽殘基參與結(jié)合相互作用。不變的arg6，稱為“精氨酸指”，其側(cè)鏈伸入到催化中心并且與兩個(gè)催化半胱氨酸形成雙配位的鹽橋(圖7b)。這樣的官能性非常類似于通常在小分子bace1抑制劑中觀察到的“彈頭”基團(tuán)的官能性。bace030的met3和leu7分別背離bace1表面上的疏水口袋s1和s3位點(diǎn)。s1位點(diǎn)似乎是混雜的，并且可以耐受相似尺寸的不同的疏水殘基(例如，ile，leu，met，與肽噬菌體數(shù)據(jù)一致)，而s3位點(diǎn)需要leu。tyr4，肽中的另一個(gè)高度保守的殘基，與bace1上包含殘基107-111(y-環(huán))的小溝(之前未認(rèn)識(shí)到的用于抑制劑結(jié)合的位點(diǎn))結(jié)合。鑒于其與催化中心的鄰近性，該位點(diǎn)可能被潛在地靶向用于小分子抑制劑設(shè)計(jì)。y-環(huán)相互作用由于存在leu8而增強(qiáng)，并且又由于存在疏水性但較不保守的殘基leu10而增強(qiáng)(圖7c)。gly9和gly11為leu10提供柔性，以包裝在疏水核心上。在肽的n端，高度保守的glu1側(cè)鏈與bace1的arg235形成鹽橋。ser2在螺旋的n端放置帽。與om99-2和om03-4非水解的底物模擬物(hong，l.等(2000)science(科學(xué))290：150-3；turner，r.t.，3rd等(2005)biochemistry(生物化學(xué))44：105-12)相比，bace030占據(jù)p側(cè)(p1-p4)的底物溝，其中肽鍵朝向底物方向相反的方向。bace030利用“精氨酸指”在其催化天冬氨酸殘基處與bace1結(jié)合，因此防止呈現(xiàn)易切斷的肽鍵的任何機(jī)會(huì)。序列表<110>健泰科生物技術(shù)公司<120>bace1的肽抑制劑<130>gne-0394pct<140><141><150>61/627,573<151>2011-10-14<160>96<170>patentinversion3.5<210>1<211>501<212>prt<213>智人（homosapiens）<400>1metalaglnalaleuprotrpleuleuleutrpmetglyalaglyval151015leuproalahisglythrglnhisglyileargleuproleuargser202530glyleuglyglyalaproleuglyleuargleuproarggluthrasp354045glugluproglugluproglyargargglyserphevalglumetval505560aspasnleuargglylysserglyglnglytyrtyrvalglumetthr65707580valglyserproproglnthrleuasnileleuvalaspthrglyser859095serasnphealavalglyalaalaprohispropheleuhisargtyr100105110tyrglnargglnleuserserthrtyrargaspleuarglysglyval115120125tyrvalprotyrthrglnglylystrpgluglygluleuglythrasp130135140leuvalserileprohisglyproasnvalthrvalargalaasnile145150155160alaalailethrgluserasplysphepheileasnglyserasntrp165170175gluglyileleuglyleualatyralagluilealaargproaspasp180185190serleugluprophepheaspserleuvallysglnthrhisvalpro195200205asnleupheserleuglnleucysglyalaglypheproleuasngln210215220sergluvalleualaservalglyglysermetileileglyglyile225230235240asphisserleutyrthrglyserleutrptyrthrproileargarg245250255glutrptyrtyrgluvalileilevalargvalgluileasnglygln260265270aspleulysmetaspcyslysglutyrasntyrasplysserileval275280285aspserglythrthrasnleuargleuprolyslysvalphegluala290295300alavallysserilelysalaalaserserthrglulyspheproasp305310315320glyphetrpleuglygluglnleuvalcystrpglnalaglythrthr325330335protrpasnilepheprovalileserleutyrleumetglygluval340345350thrasnglnserpheargilethrileleuproglnglntyrleuarg355360365provalgluaspvalalathrserglnaspaspcystyrlyspheala370375380ileserglnserserthrglythrvalmetglyalavalilemetglu385390395400glyphetyrvalvalpheaspargalaarglysargileglypheala405410415valseralacyshisvalhisaspglupheargthralaalavalglu420425430glyprophevalthrleuaspmetgluaspcysglytyrasnilepro435440445glnthraspgluserthrleumetthrilealatyrvalmetalaala450455460ilecysalaleuphemetleuproleucysleumetvalcysglntrp465470475480cyscysleuargcysleuargglnglnhisaspaspphealaaspasp485490495ileserleuleulys500<210>2<211>476<212>prt<213>智人<400>2metalaglnalaleuprotrpleuleuleutrpmetglyalaglyval151015leuproalahisglythrglnhisglyileargleuproleuargser202530glyleuglyglyalaproleuglyleuargleuproarggluthrasp354045glugluproglugluproglyargargglyserphevalglumetval505560aspasnleuargglylysserglyglnglytyrtyrvalglumetthr65707580valglyserproproglnthrleuasnileleuvalaspthrglyser859095serasnphealavalglyalaalaprohispropheleuhisargtyr100105110tyrglnargglnleuserserthrtyrargaspleuarglysglyval115120125tyrvalprotyrthrglnglylystrpgluglygluleuglythrasp130135140leuvalserileprohisglyproasnvalthrvalargalaasnile145150155160alaalailethrgluserasplysphepheileasnglyserasntrp165170175gluglyileleuglyleualatyralagluilealaargleucysgly180185190alaglypheproleuasnglnsergluvalleualaservalglygly195200205sermetileileglyglyileasphisserleutyrthrglyserleu210215220trptyrthrproileargargglutrptyrtyrgluvalileileval225230235240argvalgluileasnglyglnaspleulysmetaspcyslysglutyr245250255asntyrasplysserilevalaspserglythrthrasnleuargleu260265270prolyslysvalpheglualaalavallysserilelysalaalaser275280285serthrglulyspheproaspglyphetrpleuglygluglnleuval290295300cystrpglnalaglythrthrprotrpasnilepheprovalileser305310315320leutyrleumetglygluvalthrasnglnserpheargilethrile325330335leuproglnglntyrleuargprovalgluaspvalalathrsergln340345350aspaspcystyrlysphealaileserglnserserthrglythrval355360365metglyalavalilemetgluglyphetyrvalvalpheaspargala370375380arglysargileglyphealavalseralacyshisvalhisaspglu385390395400pheargthralaalavalgluglyprophevalthrleuaspmetglu405410415aspcysglytyrasnileproglnthraspgluserthrleumetthr420425430ilealatyrvalmetalaalailecysalaleuphemetleuproleu435440445cysleumetvalcysglntrpcyscysleuargcysleuargglngln450455460hisaspaspphealaaspaspileserleuleulys465470475<210>3<211>457<212>prt<213>智人<400>3metalaglnalaleuprotrpleuleuleutrpmetglyalaglyval151015leuproalahisglythrglnhisglyileargleuproleuargser202530glyleuglyglyalaproleuglyleuargleuproarggluthrasp354045glugluproglugluproglyargargglyserphevalglumetval505560aspasnleuargglylysserglyglnglytyrtyrvalglumetthr65707580valglyserproproglnthrleuasnileleuvalaspthrglyser859095serasnphealavalglyalaalaprohispropheleuhisargtyr100105110tyrglnargglnleuserserthrtyrargaspleuarglysglyval115120125tyrvalprotyrthrglnglylystrpgluglygluleuglythrasp130135140leuproaspaspserleugluprophepheaspserleuvallysgln145150155160thrhisvalproasnleupheserleuglnleucysglyalaglyphe165170175proleuasnglnsergluvalleualaservalglyglysermetile180185190ileglyglyileasphisserleutyrthrglyserleutrptyrthr195200205proileargargglutrptyrtyrgluvalileilevalargvalglu210215220ileasnglyglnaspleulysmetaspcyslysglutyrasntyrasp225230235240lysserilevalaspserglythrthrasnleuargleuprolyslys245250255valpheglualaalavallysserilelysalaalaserserthrglu260265270lyspheproaspglyphetrpleuglygluglnleuvalcystrpgln275280285alaglythrthrprotrpasnilepheprovalileserleutyrleu290295300metglygluvalthrasnglnserpheargilethrileleuprogln305310315320glntyrleuargprovalgluaspvalalathrserglnaspaspcys325330335tyrlysphealaileserglnserserthrglythrvalmetglyala340345350valilemetgluglyphetyrvalvalpheaspargalaarglysarg355360365ileglyphealavalseralacyshisvalhisaspglupheargthr370375380alaalavalgluglyprophevalthrleuaspmetgluaspcysgly385390395400tyrasnileproglnthraspgluserthrleumetthrilealatyr405410415valmetalaalailecysalaleuphemetleuproleucysleumet420425430valcysglntrpcyscysleuargcysleuargglnglnhisaspasp435440445phealaaspaspileserleuleulys450455<210>4<211>432<212>prt<213>智人<400>4metalaglnalaleuprotrpleuleuleutrpmetglyalaglyval151015leuproalahisglythrglnhisglyileargleuproleuargser202530glyleuglyglyalaproleuglyleuargleuproarggluthrasp354045glugluproglugluproglyargargglyserphevalglumetval505560aspasnleuargglylysserglyglnglytyrtyrvalglumetthr65707580valglyserproproglnthrleuasnileleuvalaspthrglyser859095serasnphealavalglyalaalaprohispropheleuhisargtyr100105110tyrglnargglnleuserserthrtyrargaspleuarglysglyval115120125tyrvalprotyrthrglnglylystrpgluglygluleuglythrasp130135140leuleucysglyalaglypheproleuasnglnsergluvalleuala145150155160servalglyglysermetileileglyglyileasphisserleutyr165170175thrglyserleutrptyrthrproileargargglutrptyrtyrglu180185190valileilevalargvalgluileasnglyglnaspleulysmetasp195200205cyslysglutyrasntyrasplysserilevalaspserglythrthr210215220asnleuargleuprolyslysvalpheglualaalavallysserile225230235240lysalaalaserserthrglulyspheproaspglyphetrpleugly245250255gluglnleuvalcystrpglnalaglythrthrprotrpasnilephe260265270provalileserleutyrleumetglygluvalthrasnglnserphe275280285argilethrileleuproglnglntyrleuargprovalgluaspval290295300alathrserglnaspaspcystyrlysphealaileserglnserser305310315320thrglythrvalmetglyalavalilemetgluglyphetyrvalval325330335pheaspargalaarglysargileglyphealavalseralacyshis340345350valhisaspglupheargthralaalavalgluglyprophevalthr355360365leuaspmetgluaspcysglytyrasnileprogl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