本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA6及其制備方法。

背景技術(shù)：

抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質(zhì)，它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對(duì)人體損害的一類物質(zhì)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的抗氧化劑，這些抗氧化劑可以被分為以下兩大類：1)非基因編碼的小分子無(wú)助，如維生素E、維生素C、谷胱甘肽等；2)基因編碼的大分子物質(zhì)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白等。這些抗氧化劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域，包括健康、食品、化妝品及各種工業(yè)中，比如作為燃料和潤(rùn)滑劑的穩(wěn)定劑防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合從而避免引擎積垢形成的目的，單在2007年，工業(yè)用途的抗氧化劑的就創(chuàng)造了大約37億美元的收入。基于抗氧化劑的重要性，科學(xué)家們一直在孜孜不倦的尋找著新型抗氧化劑。

兩棲動(dòng)物是水生動(dòng)物過度到陸生動(dòng)物之間的重要類群，其皮膚裸露，表面沒有毛發(fā)覆蓋，直接面對(duì)各種生存壓力，承當(dāng)著諸多重要的生物學(xué)功能，比如抵御微生物入侵、體色調(diào)節(jié)、水鹽平衡調(diào)節(jié)等。已經(jīng)有大量的研究證據(jù)表明，兩棲動(dòng)物的皮膚能分泌大量的活性物質(zhì)(主要是蛋白和多肽)使得其能完成這些重要的生物學(xué)功能。最近，在一些兩棲動(dòng)物(大綠臭蛙、滇蛙等)的皮膚中發(fā)現(xiàn)了一類新型的抗氧化劑，其化學(xué)本質(zhì)為多肽，和傳統(tǒng)的兩大類抗氧化劑不同，其由基因編碼，但分子量卻很小。和傳統(tǒng)的抗氧化劑相比，我們對(duì)這一類新型抗氧化劑的結(jié)構(gòu)和功能了解還知之甚少。

大綠臭蛙是中國(guó)特有的一種臭蛙，廣泛分布于強(qiáng)紫外照射的云貴高原，根據(jù)其生境，我們推測(cè)其皮膚能分泌高效的抗氧化劑使得其能抵御紫外照射所造成的傷害。發(fā)明人從中國(guó)產(chǎn)大綠臭蛙的皮膚中得到了1個(gè)新穎的抗氧化多肽AOP-OA6，其抗氧化活性很強(qiáng)，約為維生素E的1000倍。將本發(fā)明的大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA6全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、抗氧化活性強(qiáng)的大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA6及其制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA6，所述抗氧化肽AOP-OA6的氨基酸序列中如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明另一目的是提供大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA6的制備方法，從大綠臭蛙皮膚分泌物中分離純化得到，所分離得到的抗氧化多肽AOP-OA6具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA6的制備方法，具體包括以下步驟：

1)用電刺激法取大綠臭蛙皮膚分泌物，并將其溶解于生理鹽水，制得混合物，真空冷凍干燥，-80°保存?zhèn)溆茫?/p>

2)超濾：將混合物采用超濾管進(jìn)行超濾，截留分子量為10KDa；

3)高效液相色譜反相層析：將步驟2)所得物質(zhì)真空冷凍干燥后溶于去離子水，制得樣品，將樣品上樣于預(yù)先用含有三氟乙酸的超純水平衡好的Hypersil ODS2色譜柱中，在流速為1ml/min的條件下，用含三氟乙酸的乙腈在線性梯度條件下進(jìn)行洗脫即得，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為215nm，線性梯度條件：0-100％in 100min。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：超純水中三氟乙酸的質(zhì)量含量為0.1％。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：乙腈中三氟乙酸的質(zhì)量含量為0.1％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明得到的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6在自由基ABTS+清除實(shí)驗(yàn)中顯示了較強(qiáng)的抗氧化活性，揭示本發(fā)明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6有潛在的應(yīng)用前景。大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、抗氧化活性強(qiáng)的有益特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6的HPLC反相C₁₈柱層析圖。

圖2為本發(fā)明分離純化大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6的自由基ABTS⁺清除活性圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6，其制備方法可以通過生物化學(xué)分離純化方法，由大綠臭蛙皮膚分泌物中得到。上述方法制備的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6，可通過質(zhì)譜及抗氧化活性進(jìn)行鑒定。

大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6的制備也可通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法，采用化學(xué)合成或基因表達(dá)的方式得到，它們的氨基酸序列與本發(fā)明SEQ ID NO:1相同。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例中，大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6分離純化和鑒定

1、分離純化

大綠臭蛙活體采自大綠保山，用電刺激法取其皮膚分泌物(溶解于生理鹽水)，真空冷凍干燥，-80°保存?zhèn)溆谩?/p>

第一步：超濾(用millipore超濾管，截留分子量為10KDa)。

第二步：高效液相色譜反相層析：

第一步所得樣品真空冷凍干燥后溶于去離子水后上樣于預(yù)先用超純水(含0.1％的三氟乙酸)平衡好的Hypersil ODS2 5mm柱子(伊利特產(chǎn)品，尺寸為4.6mm×300mm)，實(shí)驗(yàn)儀器為Waters 1525高壓液相系統(tǒng)，在流速為1ml/min的條件下，用乙腈(含0.1％的三氟乙酸)在線性梯度(0-100％in 100min)條件下進(jìn)行洗脫，監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為215nm。

AOP-OA6對(duì)應(yīng)HPLC反相C₁₈柱層析圖(圖1)中的5峰所示。

2、分子鑒定

氨基酸序列的測(cè)定：

純化得到的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6在全自動(dòng)蛋白質(zhì)序列測(cè)定儀(島津PPSQ-31A)上經(jīng)Edman降解法，測(cè)定了大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6氨基酸全序列，結(jié)果表明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6具有本發(fā)明SEQ ID NO:1所示的結(jié)構(gòu)：

Phe ProAsnCysAsnAsn LysArg。

實(shí)施例2

大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6的抗氧化活性

本發(fā)明利用自由基ABTS+清除活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6的抗氧化活性，結(jié)果表明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA6具有較強(qiáng)的抗氧化活性7.2mM的ABTS在水中和2.9mM的過硫酸鉀混合，室溫黑暗環(huán)境中反應(yīng)7個(gè)小時(shí)，使得ABTS被氧化成為ABTS⁺自由基，之后用去離子水稀釋60倍，取55μL稀釋液和55μL樣品混合，室溫黑暗環(huán)境下反應(yīng)30分鐘，之后，在415nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度。自由基ABTS⁺的清除率(％)用下述公式進(jìn)行計(jì)算：(A_blank-A_sample)×100/A_blank。不同濃度大綠臭蛙抗氧化肽AOP-OA6的抗氧化活性如圖2所示。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。