專利名稱：：牛蛙抗菌肽temporin-Lb及其基因和在制藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種牛蛙抗菌肽temporin-Lb及其基因和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：抗菌肽作為一種全新概念的、廣譜抗菌蛋白類抗生素將具有比傳統(tǒng)抗生素更加廣闊的市場前景,有希望成為新一代抗菌劑,其研制目前受到廣泛重視。目前已從不同的無尾目動物皮膚中分離到300多條不同的抗菌肽，并且其數(shù)目還在增加。來自中國科學(xué)院昆明動物研究所生物毒素系的研究人員在Oform朋gra/wm/(無指盤臭蛙，一種兩棲動物)中發(fā)現(xiàn)了107種新型的抗菌肽(antimicrobialpeptides),并進行了抗菌機制研究，這比目前報道的兩棲類抗菌肽數(shù)目多了三倍，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最豐富的抗菌肽資源，這也為抗菌機制研究提供了重要信息。在中國，很多兩棲類動物被作為傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Sw/ogwgw/加ra)等。這些兩棲類動物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。己報道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。據(jù)國內(nèi)外文獻報道，已從各種生物來源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進入臨床治療。例如將esculentin-l基因轉(zhuǎn)入到煙草中，在其體液中檢測到有活性的esculentin-l的存在，同時這種植物對細菌以及真菌的抵抗力明顯增強；從爪蟾(義e"o/n^'皮膚分泌液獲得的抗菌肽Magainin具廣譜抗微生物作用,同時具有抗腫瘤活性,在美國已獲準作為廣譜抗菌藥物,其基因工程產(chǎn)品已進入三期臨床。我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機小分子，對其皮膚活性肽類物質(zhì)的研究不多。發(fā)明人將本發(fā)明的牛蛙抗菌肽全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種牛蛙抗菌肽temporin-Lb，為一種新的牛蛙抗菌肽，具有藥效活性成分。3本發(fā)明還進一步提供了牛蛙抗菌肽temporin-Lb在制藥中的應(yīng)用，制備病原微生物感染疾病的治療藥物和腫瘤治療藥物。本發(fā)明公開的牛蛙抗菌肽為一種新的抗菌肽命名為temporin-Lb，是由無尾兩棲類牛蛙抗菌肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量為1691.11道爾頓，等電點為9.70，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu—AMIDATION。本發(fā)明還提供了牛蛙抗菌肽temporin-Lb基因的核苷酸序列，其特征在于cDNA由322個核苷酸組成，其自5'端至3'端序列分別為atgttcaccatgaagaaatccctgttactcctttttttccttggggccctcaactttttt60atttgtggggaagggggggatgUgatc;a卿tgaEiag肪gggatgattccggtg3aagg120aatgttcaaatggaaaaacgattgtttcggcatgttgtaaagatttttgaaaaatatttg180ggaaaataacccgaa3tgttgaaactttgaaaatgga3ttggaa3tcatttgatgtgg犯240tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaa幼taaataaatatgttgcaaaaa300所述的牛蛙抗菌肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼牛蛙成熟抗菌肽為142-180位核苷酸，其氨基酸序列為LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu-AMIDAT腿。牛蛙抗菌肽基因的克隆包括牛蛙皮膚總RNA的提取，mRNA的純化，mRNA的反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計引物利用PCR方法篩選牛蛙抗菌肽基因。擴增引物長度為20個核苷酸，其序列為-ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3'，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit中的5'PCRPrimer引物，其序列為5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3'。所獲陽性單克隆進行核苷酸序列測定。測序結(jié)果表明牛蛙抗菌肽的基因由322個核苷酸組成，自5'端至3'端序列分別為atgttcaccatgaBgaaatccctgttactcctttttttccttggggccctcaactttttt60atttgtggggaagggggggatgttgatca卿tgaaagaagggatgattccggtgaaagg120aMgttcaaatggaaaaacgattgtttcggcatgttgtaaagatttttgaagLaatatttg180ggaaaataacccgaaatgttgaaactttgaaaatggaattggaaatcatttgatgtggaa2404tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaaaataaataaatatgttgcaaaa^300aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa322編碼牛蛙成熟抗菌肽為第142-180位核苷酸，其氨基酸序為LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu-AMIDATION牛蛙抗菌肽基因作為基因工程制備牛蛙抗菌肽的應(yīng)用。牛蛙抗菌肽的制備方法根據(jù)編碼牛蛙抗菌肽的基因推斷牛蛙抗菌肽的氨基酸序列，用自動多肽合成儀APEX396合成其全序列。通過HPLC反相ds柱層析脫鹽、純化。然后用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。下述的藥理實驗證實了牛蛙抗菌肽具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用，可以作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物被應(yīng)用。l.牛蛙抗菌肽抑制細菌生長的作用抗菌活性檢測，測定最小抑菌濃度(MIC)時，采用二倍稀釋法進行抗菌檢測。以LB液體培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)。將過夜培養(yǎng)的標準菌株用LB培養(yǎng)基稀釋菌落成每毫升含105細菌的菌液，將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基，細菌最終濃度為105。在96孔細胞培養(yǎng)板上加入90(aLLB培養(yǎng)基中，加入經(jīng)0.22pm孔徑膜過濾的溶解于生理鹽水的牛蛙抗菌肽樣品lO^L作為第一孔,混勻后取50pL加入第2管，依次倍比稀釋，自第9孔吸出5(^L棄去，第10管系對照管，每個樣品重復(fù)兩次。細菌菌株均為吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫實驗室保存，結(jié)果如表l.表l.牛蛙抗菌肽抑制細菌生長的作用菌株最小抑菌濃度(嗎/mL)牛蛙抗菌肽temporin-Lb李斯特桿菌ATCC5400431.25金葡菌ATCC259237.8鏈球菌2型CVCC6067.8沙門氏菌ATCC2002062.5大腸桿菌ATCC2592231.25肺炎克雷伯菌ATCC700603125由表1可見，合成的牛蛙抗菌肽具有顯著的抑制細菌生長的作用。2.牛蛙抗菌肽抑制真菌生長的作用抗真菌活性檢測采用杯碟法,培養(yǎng)基采用改良沙保氏(Sabousand)。采用二倍稀釋法進行抗菌活性檢測。在96孔細胞培養(yǎng)板上加入9(^L沙保氏培養(yǎng)基中，加入經(jīng)0.22nm孔徑膜過濾的溶解于生理鹽水的牛蛙抗菌肽樣品1(^L作為第一孔，混勻后取5(^L加入第2管，依次倍比稀釋，自第9孔吸出50^iL棄去，第10管系對照管，每個樣品重復(fù)兩次。白色念珠菌為吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫實驗室保存，結(jié)果如表2.表2.牛蛙抗菌肽抑制真菌生長的作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表2可知，牛蛙抗菌肽具有抑制真菌生長的作用。本發(fā)明的有益效果在于由牛蛙抗菌肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成一種新的牛蛙抗菌肽，具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用，無溶血活性，該牛蛙抗菌肽具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、抗菌譜系廣的有益特點，可以作為制備治療病原微生物感染疾病的藥物被應(yīng)用。具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實施例l:牛蛙抗菌肽基因克隆I.牛蛙皮膚總RNA提取A.活體牛蛙用雙蒸水清洗千凈，滅菌針從牛蛙的延髓腔致癱，取50100mg牛蛙皮膚組織放入千烤過的研缽中，加入lmLTRIZOLReagent(Invitrogen公司產(chǎn)品)迅速在冰水浴中研磨。B.充分混勻后,移入1.5mL離心管中(DEPC管)1530°C放置5min,加入等體積氯仿，旋渦混勻15s,4°C，12000xg離心15min。C.取上清加入500^L異丙醇,153(TC放置5min，旋渦15s混勻，4°C,12000xg離心10min。棄上清,加入lmL75。/。乙醇漂洗沉淀，7500xg離心5min，重復(fù)1次。超凈工作臺中干燥90s，用30nLRNase-freewater溶解,即得到牛蛙皮膚組織總RNA。II.牛蛙皮膚mRNA分離純化采用操作步驟按照德國QIAGEN公司的01igotex⑧mRNAMiniKiU式劑盒說明書進行。III.牛蛙皮膚cDNA文庫的構(gòu)建采用CLONTECH公司的CreatorSMARTcDNALibraryConstructionKit文庫構(gòu)建試劑盒。A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)l.在05ml無菌的離心管加入luL牛蛙皮膚mRNA、lpLSMARTIV寡聚核苷酸、l^LCDSm/3'PCR引物，力fl2去離子水使總體積達到5pL。2.混勻離心管中的試劑并短暫離心，72°C保溫2分鐘。3.將離心管在冰上孵育2分鐘。4.在離心管中加入以下試劑2pL5X第一鏈緩沖、10^L20mM二硫蘇糖醇、l.O^LdNTP(10mM)混合物、1.0Powerscript反轉(zhuǎn)錄酶。5.混合離心管中試劑并短暫離心，在42°C保溫1小時。6.將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。7.從離心管取2pL所合成的cDNA第一鏈備用。B.采用長末端聚合酶鏈式反應(yīng)(LD-PCR)方法擴增第二鏈1.95°C預(yù)熱PCR儀。2.將2pLcDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80pL去離子水、10pL10*Advantage2PCR緩沖液、2pL50*dNTP混合物、2pL5'PCR引物、2pLCDS111/3'PCR引物以及2^L50*Advantage2PolymeraseMix離心管進行反應(yīng)。3.在PCR儀中按以下程序擴增-95°C1分鐘；②22個循環(huán)95°C15秒鐘，68°C復(fù)性6分鐘。4.循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行純化。C.cDNA雙鏈的純化1.蛋白酶K的消化在一個0.5mL的試管中加入50"L經(jīng)擴增得到的雙鏈cDNA(2-3yg)產(chǎn)物，然后向其中加入2uL的蛋白酶K(20iig/iiL)。注意用蛋白酶K處理抑制DNA聚合酶的活性是非常必要的。該系統(tǒng)在操作過程中經(jīng)過優(yōu)化最佳的PCR產(chǎn)物cDNA的量為2-3ug(50uL體系)。過多的雙鏈cDNA會降低文庫的效價。2.顛倒混勻，45。C，20分鐘。3.加50UL去離子水。4.加100uL苯酚:氯仿:異戊醇，連續(xù)輕柔的顛倒混合1-2分鐘。5.14,000rpm，5min，使其兩相分離。6.將上層(水相)移入潔凈的0.5ml的試管(棄去界面和下層液體)。7.加100ul氯仿:異戊醇，連續(xù)輕柔的顛倒混合l-2分鐘。8.14,000rpm，5min，使其兩相分離。9.將上層(水相)移入潔凈的0.5ml的試管(棄去界面和下層液體)10.加入3MNaAc醋酸鈉10yL、Glycogen糖原(20ug/uL)1.3uL、95%乙醇(室溫)260uL，14，OOOrpm，室溫離心20分鐘。注意在離心之前不要對樣品進行-2(TC預(yù)冷或者冰浴，對離心管的冷卻將導(dǎo)致樣品和雜質(zhì)一起沉淀。11.用槍小心的移去上清，槍頭不要碰到析出物，用100uL80X的乙醇清洗析出物。12.蒸發(fā)乙醇，在空氣中干燥析出物，加去離子水懸浮析出物。D.大腸桿菌DH5cx感受態(tài)細胞的制備1.挑取大腸桿菌DH5a單菌落劃線接種在新鮮LB瓊脂平板上，37'C過夜。挑取單菌落接種到25mL的LB液體培養(yǎng)基中。2.以220-225rpm37'C振搖過夜。取10mL過夜培養(yǎng)物接種到1LLB中。在37'C劇烈振搖培養(yǎng)直到OD6。Q達到0.5-0.7，冰浴lh。3.把菌液轉(zhuǎn)移到滅菌的預(yù)冷的離心瓶中。以4000rpm(2800xg)4'C,15min。去上清液，瓶子放在冰上。輕輕地用1L冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。4.4000rpm(2800xg)4'C，15min，輕輕地用0.5L冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。5.4000rpm(2800xg)4°C,15min，輕輕地用250mL冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。6.4000rpm(2800xg)4°C，15min。用甘油重懸使最終體積達3.5mL。細菌密度大約為3xlO"細胞/mL。等體積分裝為100pL/份，迅速放于干冰中，在-8(TC貯存感受態(tài)細胞。7.用超螺旋載體如PUC19進行轉(zhuǎn)化驗證感受態(tài)。應(yīng)產(chǎn)生至少80.5-lxl0^cfu/ug的細胞。E.連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1.在微量離心管中加入0.3pLTaKaRapMD18-T載體、2.2^L牛蛙cDNA雙鏈溶液、加入2.5|aL的SolutionI，全量為5pL。2.16'C連接過夜.3.全量(5pL)加入至100pLDH5a感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘。4.42t:熱擊90秒鐘后，冰浴2分鐘。5.加入LB培養(yǎng)基800pL,37°C緩慢振蕩培養(yǎng)(60-80轉(zhuǎn)/min)45-60分鐘。6.取200pL涂布于含有Amp+的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)16小時，形成單菌落。7.每個LB平皿用5mLLB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30%甘油凍存。本實驗構(gòu)建的cDNA文庫大約含lx106個單獨克隆。IV.牛蛙抗菌肽基因克隆篩選擴增引物長度為20個核苷酸，其序列為5'-ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3'，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTcDNALibraryConstructionKit中的5'PCRPrimer引物，其序列為5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3'。PCR反應(yīng)條件如下94。C30秒，5(TC30秒，72°C2分鐘，共35個循環(huán)，72°C10分鐘。V.牛蛙抗菌肽基因序列測定和結(jié)果提取質(zhì)粒并用M13+與M13-測序，儀器為ABIPRISM3730全自動核苷酸序列測定儀，基因測序結(jié)果自5'端至3'端序列為atgttcaccatgaagaaatccctgttactcctttttttccttggggccctcaactttttt60atttgtggggaagggggggatgttg^tca卿tg犯卿agggatgattccggtg犯鄉(xiāng)120aatgttcaaatggaaaaacgattgtttcggcatgttgtaaagatttttgaaaaatatttg180ggaaaataacccgaaa/tgttgaaactttgaaaatggaattggaaatcatttgatgtggaa240tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaaaataaataaatatgttgcaaaaa300322牛蛙抗菌肽基因核苷酸的序列表為序列長度分別為322個堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，序列種類CDNA，來源牛蛙皮膚9編碼牛蛙成熟肽抗菌肽分別為第142-180位核苷酸，其氨基酸序列為LeuPheArgHisValValLysHePheGluLysTyrLeu—AMIDAT腹合成的牛蛙抗菌肽具有顯著的抑制細菌和真菌生長的作用，可以作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物被應(yīng)用。實施例2:制備牛蛙抗菌肽I、樣品的制備方法根據(jù)編碼牛蛙抗菌肽的基因推斷牛蛙抗菌肽的氨基酸序列，用自動多肽合成儀APEX396合成其全序列。通過HPLC反相C化柱層析脫鹽、純化。II、分子量測定采用電噴霧電離(elec加sprayionization,ESI)，發(fā)射電壓為4.5Kv。III、純化的牛蛙抗菌肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度(流速l.Oml/min;流動相乙腈+水+TFA0.01。/。，梯度洗脫；色譜柱ds，檢測波長220nm)，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。牛蛙抗菌肽是無尾兩棲類動物牛蛙抗菌肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量為1691.11道爾頓，等電點為9.70，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為亮氨酸一苯丙氨酸一精氨酸一組氨酸一纈氨酸一纈氨酸一賴氨酸一異亮氨酸一苯丙氨酸一谷氨酸一賴氨酸一酪氨酸—亮氨酸一酰胺化(LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu—AMIDATION)。權(quán)利要求1、一種牛蛙抗菌肽temporin-Lb，其特征在于為牛蛙抗菌肽基因編碼的一種單鏈多肽，分子量分別為1691.11道爾頓，等電點為9.70，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為LeuPheArgHisValValLysIlePheGluLysTyrLeu-AMIDATION。2.—種牛蛙抗菌肽temporin-Lb基因的核苷酸序歹(j，其特征在于cDNA由322個核苷酸組成，其自5'端至3'端序列分別為atgttcaccatgaagaaatccctgttactcctttttttccttggggccctcaactttttt60amgtggggaagggggggatgttgatca卿tgaa卿agggatgaUccggtgaa郷120aatgttcaaatggaaBaacgattgtttcggcatgttgt犯agatttttgaaaaatatttg180ggaa犯taacccgaaatgttga犯ctttgaaaatggaattggaa^tcatttgatgtggaa240tattatttggctaaatgctcaacagatgttttataaaaataaeLtaaatatgttgcaaaaa3003.權(quán)利要求2所述的牛蛙抗菌肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼牛蛙抗菌肽為142-180位核苷酸，其氨基酸序列為LeuPheArgHisValValLysliePheGluLysTyrLeu—AMIDATION。4.權(quán)利要求1所述的牛蛙抗菌肽temporin-Lb，在制備治療病原微生物感染疾病的藥物和腫瘤藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種牛蛙抗菌肽temporin-Lb及其基因和在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的牛蛙抗菌肽基因是從構(gòu)建的牛蛙皮膚cDNA文庫中篩選得到的，分子量為1691.11道爾頓，等電點為9.70，多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為LeuPheArgHisValValLysIlePheGluLysTyrLeu-AMIDATION。編碼牛蛙抗菌肽的基因由322位核苷酸，其中編碼成熟肽的為第142-180位核苷酸。人工合成的牛蛙抗菌肽具有明顯的抑制細菌和真菌生長的作用，可以作為制備病原微生物感染疾病的治療藥物被應(yīng)用。文檔編號C12N15/12GK101503459SQ200810051639公開日2009年8月12日申請日期2008年12月22日優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日發(fā)明者新馮,孫長江,趙瑞利,雷連成,韓俊友,韓文瑜申請人:吉林大學(xué)