專利名稱：基于分子印跡的fish－in－net固定化酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于無機化學、物理化學和生物化學領域，具體涉及一種利用"網(wǎng)中 魚(fish-in-net)"的方法制備的基于分子印跡的固定化酶，極大的保持了酶的活 性。
背景技術：
近年來，固定化酶在生物工程、醫(yī)學、食品、環(huán)境、藥學、化學分析等方面 的應用越來越廣泛。酶的固定化就是通過化學或物理的處理方法，使原來水溶性 的酶與固態(tài)的水不溶性支持物相結合，使酶束縛或限制于一定的區(qū)域內(nèi)，仍能進 行特有的催化反應、并可回收重復利用的一類技術。固定化方法有物理吸附、交 聯(lián)、共價結合及包埋等方法。固定化酶的載體分為無機載體和有機載體。由于酶 易與有機聚合物發(fā)生化學作用，因此目前應用較為廣泛。但用有機載體作為固定
骨架的酶的負載量小，化學穩(wěn)定性差，高分子親水性差。無機載體在物理性質方 面比有機載體更加有優(yōu)勢，經(jīng)濟實用，固定化骨架的機械強度高，抗微生物侵蝕， 熱穩(wěn)定性好，對有機溶劑有很好的耐受力，使用壽命長，可以再生利用。
采用無機硅或/和金屬氧化物材料作為固定化的骨架，更有其優(yōu)越性。首先， 易于將酶與底物、產(chǎn)物分開，方便后續(xù)的分離純化，而且可以連續(xù)生產(chǎn)，酶的回
收率高，可反復使用；其次，酶的穩(wěn)定性和最適溫度改變，最適PH值改變；第
三，有些固定化酶，增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質量，適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 固定化酶同樣存在著缺點，1)酶處于固定化材料的外表面時，酶容易受到
環(huán)境因素的影響，進而半衰期較短；2)酶處于固定化材料內(nèi)部時，由于固定化 材料內(nèi)部的空間較小且往往存在固定化材料與酶表面基團的相互作用，酶難于保 持其催化活性構象，進而催化活力大大下降；上述兩種情況下，固定化的酶一旦 失去了活性，就只能依靠加入新的固定化酶來彌補催化能力的損失。這些問題， 我們己經(jīng)通過專利200510017112.9給予解決。但是，在實際操作中仍存在下述 問題沒有得到較好的解決(1)有機溶劑的變性作用；(2)有機、無機粒子對 酶活性中心和構象進攻，影響酶的活性和功能。本專利中的新方法，是使用目的 固定化材料底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過渡代謝產(chǎn)物來穩(wěn)定酶。 起兩方面作用(1)保護酶催化活性中心，不易受外界有機、無機粒子進攻；(2) 占領可溶劑化表面(水化層)，減少溶劑對酶構象的影響。而且存在于酶表面的 糖類物是飽和的小分子物質，是作為酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過渡態(tài)代謝產(chǎn)物，可以完全的進出無機外殼上孔道，對催化反應不會造成污 染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決由于有機溶劑對酶的影響和有機、無機粒子對酶活性中 心和構象進攻，所造成的酶不能保持其催化活性構象和酶的催化活力下降問題，
從而提供一種基于分子印跡的fish-in-net固定化酶。
作為印跡分子的糖類物質，不僅能保持酶的活性中心，不易受外界有機、無 機粒子進攻，占領可溶劑化表面(水化層)，減少溶劑對酶構象的影響，且作為 酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過渡代謝產(chǎn)物，可以完全的進 出無機外殼上孔道，對催化反應不會造成污染。
本發(fā)明方法的生物材料固載技術是，以硅或/和金屬氧化物的可溶性鹽為原 料，以表面活性劑為模板劑，后形成溶膠，具體各物質的摩爾配料比見專利 200510017112.9。我們將上述所形成的溶膠稱作前驅體。糖相關的酶、酶系及 酶制劑和酶的印跡分子混合均勻，摩爾配料比為1: 1，前驅體與上述酶的摩爾 配料比為1: 0.03，前驅體與上述混合物組裝成無機一生物反應器。
上述的與糖相關的酶包括糖水解酶、糖異構酶、糖合成酶、糖基化酶等。其 中糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麥芽糖水解酶、纖維二糖水解酶、 半乳糖水解酶；糖異構酶包括葡萄糖異構酶、木糖異構酶、甘露糖異構酶；糖合 成酶包括麥芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉合成酶等。
上述的酶的印跡分子包括酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間 過渡代謝產(chǎn)物。其中所述酶的糖類小分子物質包括寡糖，如果糖、葡萄糖、半乳 糖、乳糖、核糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等。
本發(fā)明方法在制備分子篩的同時利用表面活性劑的自組裝縮聚以及和生物 材料的之間的協(xié)同作用，使得生物材料外表面為無機外殼，從而形成了催化活性 中心為酶、酶系及酶制劑的無機一生物反應器。同時，由于酶在與前驅體混合之 前，酶先與穩(wěn)定酶構象的糖類物質混合，使酶的活性構象得以保持，不易受外界 有機、無機粒子的進攻，替代了酶外表面的水化位點，減少溶劑對酶構象的影響， 并且存在其表面的是飽和的小分子物質，是作為酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或 產(chǎn)物類似物、中間過渡代謝產(chǎn)物，可以完全的進出無機外殼上孔道，對催化反應 不會造成污染，使酶的活性較其它方法的固定化酶活大為的提高。
在最佳的條件下，本方法制備的固定化酶的穩(wěn)定性高，可以反復使用10次 以上，并且較其它方法的固定化酶活大為的提高，幾乎保持了初始固載酶的活性。本發(fā)明方法提供的工藝制備固定化酶過程，是將無機材料，表面活性劑，酶 (酶系或酶制劑)，小分子糖類似物構建在一起的溶膠體系，通過能夠穩(wěn)定所述 酶的糖類小分子物質誘導出酶的活性構象，并且使其以大比例將酶包圍，形成水 化層，替代其水化位點，對其形成保護，后進行固定化，能夠使固定化的酶保持 活性構象，在無機外殼內(nèi)發(fā)揮催化作用時不受空間位阻和外界刺激環(huán)境的影響， 提高了酶活性構象的穩(wěn)定性，同時也使固定化酶的機械強度增加，酶的催化效率 提高，拓寬了酶的應用范圍。
催化活性中心是與糖相關酶、酶系及酶制劑，穩(wěn)定糖相關酶、酶系及酶制劑 的關鍵在于在制備固定化體系的過程中加入了穩(wěn)定酶的小分子的糖類物質。
基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，是由如下方法制備參照我們申請的 專利200510017112.9所述的技術和方法合成無機骨架，它的殼為無機材料，催 化活性中心(催化材料)是與糖相關的酶、酶系及酶制劑，且在酶和酶系固定化 中加入酶的印跡分子，用以保護酶的活性中心的化學結構和幾何構象。
進一步地，上述催化材料的物種來源可以是植物，動物，微生物，人工合成 和/或半合成物。上述酶可以是天然酶，突變酶，改造酶，或是人工模擬酶類。 其中的酶包括糖水解酶、糖異構酶、糖合成酶、糖基化酶等。 糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麥芽糖水解酶、纖維二糖水解 酶、半乳糖水解酶；
糖異構酶包括葡萄糖異構酶、木糖異構酶、甘露糖異構酶； 糖合成酶包括麥芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉合成酶等。 酶的印跡分子包括酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過渡代 謝產(chǎn)物。
進一步的，酶的印跡分子，可以是一種糖類物質，也可以是幾種糖類物質混 合物。
再進一步地，酶的印跡分子包括寡糖，如果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、核 糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等。
具體實施方式
實施例1:
無機骨架的合成
以TEOS (正硅酸乙酯)做硅源，以P123做表面活性劑(模板劑)。合成 介孔硅結構的配料Si02/表面活性劑/CH3CH20H/H20/乳糖酶質量比值為1:
1.46: 15: 1.5: 0.3。首先，將p123溶于乙醇中，然后向其中加入硅源。待此溶于攪拌完全后， 向其中滴加HCL (鹽酸)使其充分水解，使pH在6-8。然后將此混合體系在室 溫下強力攪拌4-10小時。裝入真空裝置中攪拌的同時抽真空12-72小時，直到 溶液成透明粘稠的溶膠為止，制備成前驅體。
催化活性中心樣品的制備
乳糖與乳糖酶的質量比為10: 1,將所用的乳糖酶做初步的純化，然后使乳 糖酶與乳糖混合，在4'C在攪拌2小時，真空旋干成為糊狀。將其與前驅體混合, 在4"C下溫和攪拌繼續(xù)真空條件下反應4-100小時。最后樣品用醇/水多次洗滌 而得包埋乳糖酶的無機一生物反應器。經(jīng)檢測乳糖酶的活性與游離酶相比略有下 降，但酶的穩(wěn)定性提高，且較其它方法的固定化酶活的提高，在使用10次后， 酶活力為初始固定酶活力的90%。
權利要求
1、基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其由如下方法制備合成無機骨架，它的殼為無機材料，催化活性中心是與糖相關的酶、酶系及酶制劑，且在酶和酶系固定化中加入酶的印跡分子，用以保護酶的活性中心的化學結構和幾何構象。
2、 如權利要求1所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 上述催化活性中心的物種來源是植物、動物、微生物、人工合成和/或半合 成物。
3、 如權利要求1所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶是天然酶、突變酶、改造酶或是人工模擬酶類。
4、 如權利要求3所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶包括糖水解酶、糖異構酶、糖合成酶或糖基化酶。
5、 如權利要求書4所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 糖水解酶包括蔗糖酶、半乳糖苷酶、乳糖酶、麥芽糖水解酶、纖維二糖水 解酶、半乳糖水解酶；糖異構酶包括葡萄糖異構酶、木糖異構酶、甘露糖 異構酶；糖合成酶包括麥芽糖合成酶、葡聚糖合成酶、蔗糖合成酶、淀粉 合成酶。
6、 如權利要求書1所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶的印跡分子包括酶的底物或底物類似物、產(chǎn)物或產(chǎn)物類似物、中間過渡 代謝產(chǎn)物。
7、 如權利要求書6所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶的印跡分子是一種糖類物質，或是幾種糖類物質混合物。
8、 如權利要求書7所述的基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，其特征在于 酶的印跡分子為糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、核糖、麥芽糖、蔗糖、纖維 二糖、木糖、阿拉伯糖或甘露糖。
全文摘要
本方法是基于分子印跡的fish-in-net固定化酶，屬于無機化學、物理化學和生物化學領域。以硅或/和金屬氧化物的可溶性鹽為原料，以表面活性劑為模板劑后形成溶膠，使在印跡分子保護下的酶與溶膠組裝成無機-生物反應器。殼為無機材料，催化活性中心是與糖相關的酶、酶系及酶制劑，印跡分子是酶的底物和/或產(chǎn)物中的糖類小分子。由于傳統(tǒng)固定化酶酶活保持差，本方法在酶、酶系及酶制劑固定化中加入了酶的印跡分子，該印跡分子在固定化進程中從兩個方面穩(wěn)定目地催化體系1)類似于印跡分子的作用，保護酶的活性中心的構象及催化活性；2)替代了酶外表面的水化位點，降低了固定化中出現(xiàn)的有機介質對酶的變性作用，極大保持了酶活性。
文檔編號C12N11/14GK101434947SQ200810051590
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月15日 優(yōu)先權日2008年12月15日
發(fā)明者明 呂, 吳卓夫, 揚 李, 李正強, 牛學頓 申請人:吉林大學