專利名稱：一種云南臭蛙皮膚抗氧化肽及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是提供一種云南臭蛙andersonii )皮膚來(lái)源的抗氧化肽及其基因。
背景技術(shù)：
氧，對(duì)于地球上絕大多數(shù)生命體的生存是至關(guān)重要的，但是，通過產(chǎn)生各種活性氧分子，氧也是一個(gè)能損傷各種生命體的活性分子。這些活性氧分子(R0S，包括02_、H202及HO2'-OH等)能引起DNA損傷、脂類過氧化、蛋白氧化，進(jìn)而損傷細(xì)胞。有大量的研究報(bào)道揭示，ROS和多種人類疾病的產(chǎn)生有著極為密切的聯(lián)系，包括多種癌癥衰老、呼吸系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病等?？寡趸瘎?，顧名思義，是指能抑制其它分子被氧化的分子。自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 2大類抗氧化劑，第一類是大分子量的由基因編碼的蛋白質(zhì)酶類，例如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等 ；第二類主要由小分子物質(zhì)組成，如Vc、Ve等。到目前為止，已經(jīng)有大量的抗氧化劑從不同的生物體中得以識(shí)別，這些抗氧化劑被廣泛應(yīng)用于癌癥和心臟疾病的預(yù)防、食物儲(chǔ)存以及化妝品領(lǐng)域中。但是，這些抗氧化劑都基本上屬于上述2種類型，由于抗氧化劑具有重要的生物學(xué)功能和日常應(yīng)用前景，在國(guó)外，許多科學(xué)家正在積極的尋找不同來(lái)源和不同類型的抗氧化劑。在中國(guó)傳統(tǒng)中藥和民族藥中，許多兩棲類動(dòng)物被作為藥材而被廣泛應(yīng)用。目前，大量的研究報(bào)道已經(jīng)揭示了許多兩棲類皮膚中的藥理學(xué)活性分子，例如抗菌肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗腫瘤肽、鎮(zhèn)痛肽等。最新的研究報(bào)道揭示兩棲類動(dòng)物皮膚中存在一類新穎的抗氧化劑與傳統(tǒng)抗氧化劑不同，其化學(xué)本質(zhì)是由基因編碼的多肽，分子量小，由兩棲類動(dòng)物皮膚分泌。目前，還只有滇蛙、大綠臭蛙皮膚中的抗氧化肽得以報(bào)道?？寡趸木哂袕?qiáng)大、快速的活性氧清除能力，其能最大限度的保護(hù)皮膚，使兩棲類動(dòng)物盡可能少的地受到日照、紫外線等誘導(dǎo)的自由基損傷。該成果是皮膚抗氧化領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，對(duì)生物醫(yī)學(xué)、抗氧化保護(hù)及化妝品研發(fā)等相關(guān)領(lǐng)域具有重要意義。目前，已經(jīng)從云南臭蛙皮膚分泌物中識(shí)別了大量的抗菌肽分子，但是，對(duì)其抗氧化肽的報(bào)道幾乎沒有。發(fā)明人將本發(fā)明的抗氧化肽的氨基酸全序列在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，未能發(fā)現(xiàn)任何相同的多肽；發(fā)明人將本發(fā)明的抗氧化肽的核酸全序列在核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，未能發(fā)現(xiàn)任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的具有強(qiáng)烈抗氧化活性的云南臭蛙皮膚抗氧化肽及其基因。本發(fā)明的云南臭蛙皮膚抗氧化肽是中國(guó)兩棲類云南臭蛙皮膚編碼的一種單鏈條多肽，分子量為765.92 Daltons,從N端到C端的全序列為:FLCVRE。云南臭蛙皮膚抗氧化肽的基因克隆包括:
云南臭蛙皮膚抽提總RNA，cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR方法篩選編碼抗氧化肽的cDNA。其中:
正向引物為:5 ’ - ATGTTCACCTTGAAGAAAACCCTT-3 ’，
反向引物為:5 ’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3，。所獲的陽(yáng)性克隆經(jīng)過基因核苷酸序列測(cè)定表明:云南臭蛙皮膚抗氧化肽由284個(gè)核苷酸編碼，自5’端到3’端的全序列為(序列表I):
atgttcacct tgaagaaaac ccttttactt cttttcttcc ttgggattat caactcatctctctgtgaag aagaggagcg taatgctgaa gaagaggagc gtcgtgatga tcctgatgtt cgtgatgttgaagttgaaaa gcgtttcctt tgcgttagag aatgataatt ggattggaaa tcatttgatg tggaacatcatttagctaaa tgcacatcag atgtcttata aaaaaaataa acatgttgca tacacttaaa gaaaaaaaaaa
序列表I中第147至162位核苷酸編碼云南臭蛙皮膚抗氧化肽成熟肽，從N端到C端的氨基酸全序列為:Phe Leu Cys Val Arg Glu (FLCVRE,序列表2)。云南臭蛙皮膚抗氧化肽的制備方法:
根據(jù)編碼云南臭蛙皮膚抗氧化肽的CDNA推斷其成熟肽序列，用自動(dòng)多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18層析柱脫鹽和純化，同時(shí)測(cè)定其純度，用Edman降解法最終確定其氨基酸序列。本發(fā)明的有益效果在于:由編碼云南臭蛙抗氧化肽的cDNA推導(dǎo)其成熟肽序列，合成的云南臭蛙抗氧化肽具有強(qiáng)烈和快速的自由基清除作用。該云南臭蛙皮膚抗氧化肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、抗氧化活性強(qiáng)的特點(diǎn)，能制備成為相關(guān)的抗氧化產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例:
云南臭蛙抗氧化肽基因克隆:
1.云南臭蛙皮膚總RNA的提取
1.)活體云南臭蛙采集于云南保山，用去離子水沖洗其皮膚，快速取其皮膚，放入液氮速凍保存，取約200 mg皮膚組織，在液氮中研磨成粉末，然后加入5 ml總RNA提取液(Trizol，大連寶生物產(chǎn)品)，之后，用10 ml玻璃勻漿器勻漿30 min ；
2.)室溫放置5min,然后12000 rpm、4°C,離心5 min,留上清；
3.)加入等體積三氯甲烷溶液，震蕩混勻，室溫放置10min,然后12000g，4°C，離心15min,取上清；
4.)加入等體積的異丙醇，室溫放置10min,然后12000 rpm,4°C,離心10 min,去上
清；
5.)沉淀用75%乙醇洗滌一次，晾干，管底干燥物即為云南臭蛙皮膚總RNA。2.云南臭蛙皮膚第二鏈cDNA的合成:采用CL0NTECH公司提供的Creator SMART cDNA Library Construction Kit 來(lái)合成第二鏈 cDNA。A.第一鏈cDNA的合成1.)在0.5ml無(wú)菌PCR管中加入Iμ I云南臭蛙皮膚總RNA、I μ I SMART IV寡聚核苷酸，I μ I CDS 111/3’ PCR引物，然后繼續(xù)加入2 μ I DEPC水，使總體積達(dá)到5 μ ，混勻，72°C保溫2 min，然后快速在冰上冷卻2 min ；
2.)繼續(xù)加入2μI第一鏈緩沖液，I μ I 20 mM DTT, I μ I 10 mM dNTP混合物、Iμ I MMLV反轉(zhuǎn)錄酶,混勻，離心,然后再42°C保溫一小時(shí),之后,將離心管置于冰上,終止合成；
B.第二鏈cDNA的合成。1.)將 2 μ I 第一鏈 cDNA、80 μ I 滅菌水、10 μ I Advantage PCR 緩沖液、2 μ IdNTP混合物、2 μ I 5’PCR引物、2 μ I CDS 111/3’PCR引物、2 μ I大腸桿菌聚合酶按次序加入0.5 ml PCR管中；
2.)在PCR儀中按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:
a.95 °C 20 秒
b.25個(gè)循環(huán):
95 0C 5 秒 68 0C 6分鐘
3.) PCR結(jié)束后，即得到云南臭蛙皮膚第二鏈cDNA ； 3.云南臭蛙抗氧化肽基因克隆篩選:
1.)以云南臭蛙皮膚第二鏈cDNA作為模板，用2個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，
正向引物為:5 ’ - ATGTTCACCTTGAAGAAAACCCTT-3 ’，
反向引物為:5 ’ -ATTCTAGAGGCCGAGGCG GCCGACATG-3，，
PCR在如下條件中進(jìn)行:95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 60秒，30個(gè)循環(huán)，之后，用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物；
2.)在0.5 ml PCR管中加入2 μ I PCR產(chǎn)物、3 μ I滅菌水、5 μ I Solution I (由大連寶生物提供)，16°C過夜反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物連接進(jìn)入PMD19T載體；
3.)將上述10μ I載體連接產(chǎn)物加入到100 μ I DH5 α感受態(tài)大腸桿菌中，冰上放置30分鐘；
4.) 42°C熱激90秒，然后快速放置到冰上I分鐘；
5.)加入37°C溫浴過的LB培養(yǎng)基Iml，37°C震蕩培養(yǎng)60分鐘；
6.)在含有X_gal、IPTG和Amp的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，形成單菌落，挑取白色菌落，進(jìn)行核苷酸測(cè)序；
4.云南臭蛙皮膚抗氧化肽cDNA序列測(cè)定和結(jié)果。挑取的菌落用雙脫氧法進(jìn)行核苷酸序列的測(cè)定，使用的儀器為ABI公司的3730XL全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為PMD19T載體上的測(cè)序引物:RV-M和M13-47。編碼云南臭蛙皮膚抗氧化肽cDNA自5’端到3’端序列為:
atgttcacct tgaagaaaac ccttttactt cttttcttcc ttgggattat caactcatctctctgtgaag aagaggagcg taatgctgaa gaagaggagc gtcgtgatga tcctgatgtt cgtgatgttgaagttgaaaa gcgtttcctt tgcgttagag aatgataatt ggattggaaa tcatttgatg tggaacatcatttagctaaa tgcacatcag atgtcttata aaaaaaataa acatgttgca tacacttaaa gaaaaaaaaaa第147至162位核苷酸編碼云南臭蛙皮膚抗氧化肽成熟肽，其氨基酸序列為:Phe LeuCys Val Arg Glu (FLCVRE)。5.云南臭蛙皮膚抗氧化肽的制備:
O根據(jù)云南臭蛙皮膚抗氧化肽的cDNA序列推斷云南臭蛙皮膚抗氧化肽的成熟肽序列，用自動(dòng)多肽合成儀合成其全序列，然后通過HPLC反相C18層析柱進(jìn)行脫鹽、純化和純度測(cè)定；
2)用Edman降解法測(cè)定其氨基酸序列；
云南臭蛙皮膚抗氧化肽是中國(guó)兩棲類動(dòng)物云南臭蛙皮膚基因編碼的一種單鏈多肽，分子量為765.92 Daltons,從N端到C端的全序列為:FLCVRE。6.云南臭蛙皮膚抗氧化肽的抗氧化活性檢測(cè):
ABTS+清除法檢測(cè)云南臭蛙皮膚抗氧化肽的抗氧化作用:
首先配置ABTS儲(chǔ)存液:在水溶液溶解2.8 mM過硫酸鉀和7 mM ABTS，避光反應(yīng)至少6小時(shí)，之后，立即用水稀釋125倍，50微升溶于水的樣品加入50微升ABTS稀釋液，避光反應(yīng)至少10分鐘，之后，在415 nm波長(zhǎng)下讀其吸光度，樣品抗氧化活性用如下公式進(jìn)行計(jì)算:(A blank-A sample) X 100/ A blank，采用超純水做對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，結(jié)果顯示，I μ g/ml的云南臭蛙皮膚抗氧化肽能在3秒內(nèi)清除99.1±0.5%的ABTS+自由基。這表明，云南臭蛙皮膚抗氧化肽具有很強(qiáng)的抗氧化作用，同時(shí)還具有序列簡(jiǎn)單、合成方便等優(yōu)點(diǎn)，能制備成為相關(guān)的抗氧化產(chǎn) 品。
權(quán)利要求
1.一種云南臭蛙皮膚抗氧化肽基因，其特征在于由284個(gè)核苷酸編碼，自5’端到3’端的全序列如序列表I所示。
2.一種云南臭蛙皮膚抗氧化肽，其特征在于由序列表I中第147至162位核苷酸編碼云南臭娃皮膚抗氧化肽成熟肽，從N端到C端的氨基酸全序列為:Phe Leu Cys Val ArgGlu，分子量為 76 5.92 Daltons。
全文摘要
本發(fā)明是一種云南臭蛙皮膚抗氧化肽及其基因，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。云南臭蛙皮膚抗氧化肽分子量為765.92Daltons，從N端到C端的氨基酸全序列為PheLeuCysValArgGlu。編碼該抗氧化肽的基因cDNA由284個(gè)核苷酸組成，其中第147至162位核苷酸編碼云南臭蛙皮膚抗氧化肽的成熟肽。人工合成的云南臭蛙皮膚抗氧化肽具有很強(qiáng)的且快速的抗氧化活性，能制備成為相關(guān)的抗氧化產(chǎn)品，并且還具有序列簡(jiǎn)單、合成方便等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK103233012SQ20131018352
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者梁醒財(cái) 申請(qǐng)人:梁醒財(cái)