專利名稱：一種務川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2及其編碼序列的基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學領域,尤其是一種務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2及及編碼序列的基因與應用。
背景技術：
自由基指任何包含一個未成對電子的原子或原子團。生物體與外界接觸和自身產生的自由基主要是活性氧自由基，包括超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫、脂質過氧自由基、二氧化氮、一氧化氮自由基、單線態(tài)氧和臭氧。在較高濃度下，活性氧自由基對生物細胞的細胞結構、核酸、脂類和蛋白質造成損傷。造成DNA損傷，進一步引起復制錯誤、基因組不穩(wěn)定、轉錄意外起始或終止，從而導致生物體變異或疾病發(fā)生；引起細胞膜流動性和通透性改變，導致細胞結構和功能改變；引起蛋白質氧化，導致蛋白質變性和失活。目前發(fā)現，活性氧自由基與多種人類疾病有關,如癌癥、心腦血管疾病、缺血再灌注損傷、類風濕性關節(jié)炎、糖尿病、阿爾茨海默病、帕金森病和衰老等。為了抵抗活性氧自由基對機體的損害，在漫長的進化過程中生物體形成多種不同的自由基清除系統(tǒng)，包括非基因編碼的小分子物質，如尿酸、維生素C、維生素E、胡蘿卜烯類、硫辛酸和輔酶Q等；基因編碼的大分子抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶、過氧化物酶、硫氧還蛋白酶系統(tǒng)和谷胱甘肽酶系統(tǒng)；基因編碼的小分子抗氧化肽類，如從兩棲類蛙科動物皮膚中發(fā)現的各種小分子抗氧化多肽。各種不同類型的自由基清除劑在醫(yī)藥和化妝品領域具有極大的應用潛力，如維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)和小分子抗氧化多肽?？寡跷锬壳霸趪鴥韧鈶脧V泛，需求量逐漸增多，現在被用于預防治療多種疾病，如心血管疾病、腫瘤、關節(jié)炎、腎功能損傷、糖尿病、自 身免疫性疾病等。此外，抗氧化物近年在化妝品領域的應用興起，尤其是天然抗氧化物。由于皮膚的光老化作用是由于紫外線誘導皮膚細胞產生大量的氧自由基堆積而造成的。現在許多護膚品中加入抗氧化劑，有減少雀斑、防輻射、延緩衰老、調節(jié)免疫和提高皮膚自我保護的作用。務川臭娃fracAwafleflsis)屬于兩棲綱無尾目娃科臭娃屬，為中國特有種，僅分布于貴州省務川仡佬族苗族自治縣。目前關于務川臭蛙來源抗氧化多肽的研究還沒有報道。

發(fā)明內容
技術要求
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種務)11臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述蛋白片段的編碼序列。本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述基因片段在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的應用。本發(fā)明是這樣實現的:一種務川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2,它是具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質。所述的務川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該務川臭蛙抗氧化肽wuChuanin-B2是直鏈多肽，含有16個氨基酸殘基，分子量為1833.17 Da，等電點為 11.26。務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的編碼基因，它是下列核苷酸之一:
(1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列；
(2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸；
(3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

務川臭蛙抗氧化肽wuchuanin_B2在制備抗氧化藥物或化妝品添加劑的應用。有益效果
通過基因工程的方法將本發(fā)明提供的務川臭蛙抗氧化肽wuChuanin-B2具有極強的抗氧化活性、分子量小、結構簡單、溶血活性低、制備方法簡單的特點，將其應用在抗氧化藥物或化妝品添加劑中，可以提高藥物或化妝品添加劑的抗氧化效果。由于該基因是務川臭蛙本身存在的內源基因，因此，該基因的超量表達不會影響其安全性，可廣泛應用于藥物或化妝品添加劑生產中。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。本發(fā)明的實施例1:務川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2基因克隆。I)務川臭蛙皮膚總RNA提取:
①取300 mg務川臭蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉移到EP管中，加入I ml總RNA提取緩沖液(Trizol,美國Invitrogen公司產品)，充分混勻，而后于4°C,12000 rpm 離心 10 min。②離心取上清，加入0.2 ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C，12000 rpm離心10分鐘，棄除沉淀。③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000 rpm離心10分鐘，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為務川臭蛙皮膚總RNA。2)務川臭蛙皮膚cDNA文庫構建:采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(l)cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄):
①經DEPC處理(DEPC處理是在含0.1% (V/V)DEPC的水浸泡過夜，高壓滅菌，烘干)的離心管中加入I μ I務川臭蛙皮膚總RNA、1 μ I 3’端一鏈合成引物(3’In-Fusion SMARTerCDS Primer)和2.5 μ I DEPC處理的水(DEPC處理的水是含0.1% DEPC (V/V)的水，放置過夜，高壓滅菌)使總體積達到4.5 μ 1，混勻后短暫離心(2000 rpm, 30 S)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。 ②在上述離心管中加入以下試劑(均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)，2.0 μ I 5 X第一鏈緩沖液、0.25 μ I 100 mM DTTU.0 μ I 10 mM dNTP Mix、1.0 μ I SMARTer
VOligonucleotide、。.25 μ I RNase Inhibitor 和 1.0 μ I SMARTScribe ReverseTranscriptase反轉錄酶,混合離心管中試劑并短暫離心(2000 rpm, 30 s),在42°C保溫90 min，然后68°C保溫10 min。保溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2 μ I所合成的cDNA第一鏈備用。(2)采用長末端聚合酶鏈式反應(LD- PCR)方法擴增第二鏈(所用試劑均為CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)
①將 2 μ I cDNA 第一鏈(mRNA 反轉錄)、80 μ I 去離子水、10 μ I IOXAdvantage 2PCR 緩沖液、2 μ I 50XdNTP 混合物、2 μ I 5’PCR 引物、2 μ I CDS ΠΙ/3’ PCR 引物以
及 2 μ I 50 XAdvantage 2 Polymerase Mix 在 95°C預熱的 PCR 管中進行混合。②在PCR儀中按以下程序擴增:95°C，1 min ; 18個循環(huán):95°C，15 sec，65°C，30sec,68°C,6 min。循環(huán)結束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一 80°C保存。(3)務川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2基因克隆篩選:
根據蛙科抗菌肽信號肽區(qū)保守序列設計正向引物進行PCR擴增，其序列為5， -CCAAAGATGTTC ACCTTGAAG-3’， PCR 另一擴增引物為 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3，-PCR 引物，其序列為S’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-S'PCR反應在如下條件下進行:94 °C 4 min,94 °C 30 sec,57°C 30 sec和72 V I min，30個循環(huán)。擴增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進行目的片段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連)，轉化進CaCl2-MgCl2法制備好的DH5ci感受態(tài)細胞。涂板并進行氨芐青霉素和藍白斑雙重篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落,搖菌提取質粒,使用Applied BiosystemsDNA sequencer, model ABI PRISM 377 進行核苷酸測序。測定結果:
編碼務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的基因自5’端至3’端序列SEQ ID N0.1所示:務川臭蛙抗氧化肽wuChuanin-B2基因核苷酸的序列表為:序列長度為336個堿基，序列類型:核酸，鏈數:單鏈，拓撲學:直鏈狀，序列種類:cDNA，來源:務川臭蛙皮膚。
本發(fā)明的實施例2:務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的化學合成:
1、務川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2的化學合成方法:根據基因推導的成熟肽氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽。I1、分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALD1-T0F)。II1、純化的務川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALD1-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。務川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2是務川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2基因編碼的一種直連多肽，含有十六個氨基酸殘基，分子量1833.17Da，等電點11.26。務川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2全序列如SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明的實施例3:務川臭娃抗氧化肽wuchuanin_B2的藥理實驗:
1、wuchuanin-B2抗氧化活性測定:
ABTS (3-ethyIbezothiazoIine-6-sulfonic acid) (3_ 乙基苯并噻唑啉 _6_ 橫酸)用PBS緩沖液(pH7.4)配成2 mM的ABTS儲存液。將ABTS儲存液和70 mM過硫酸鉀(K2S2O8)水溶液按體積比250:1混合，于室溫避光放置15-16 h。試驗開始前，將ABTS.+釋至734nm波長處的吸光值為0.80±0.03。將4 μ 不同濃度的上述wuchuanin_B2抗氧化肽樣品和96 μ 上述校正過的ABTS.+溶液混合，室溫放置10 min后，于734 nm波長處檢測反應液的吸光值?？瞻讓φ战M為溶解樣品所用滅菌去離子水。實驗做三個平行(表I)。ABTS.+清除率 I(%)= (Ab — Aa)/ Ab XlOO (AB:空白對照組吸光值；AA:樣品組吸光值)。表1.wuchuanin_B2 抗氧化活性
權利要求
1.一種務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2,其特征在于:它是具有序列表中SEQ ID NO:I所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNO:2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2,其特征在于:所述的務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；該務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2是直鏈多肽，含有16個氨基酸殘基，分子量為1833.17 Da，等電點為11.26。
3.—種如權利要求1所述的務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的編碼基因，其特征在于:它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:I所不的核昔酸序列； (2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸； (3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的編碼基因,其特征在于:務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2的編碼基是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.—種如權利要求3所述的務川臭娃抗氧化肽wuchuanin-B2在制備抗氧化藥物或化妝品添加 劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種務川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2，它是具有序列表中SEQIDNO1所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQIDNO2的氨基酸殘基序列經過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQIDNO2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQIDNO2衍生的蛋白質。本發(fā)明提供的務川臭蛙抗氧化肽wuchuanin-B2具有極強的抗氧化活性、分子量小、結構簡單、溶血活性低、制備方法簡單的特點，將其應用在抗氧化藥物或化妝品添加劑中，可以提高藥物或化妝品添加劑的抗氧化效果。由于該基因是務川臭蛙本身存在的內源基因，因此，該基因的超量表達不會影響其安全性，可廣泛應用于藥物或化妝品添加劑生產中。
文檔編號A61K38/10GK103193866SQ20131013131
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月16日 優(yōu)先權日2013年4月16日
發(fā)明者周江, 凌桂英, 高久香, 李莉, 王義鵬 申請人:貴州師范大學