專利名稱：固相多肽合成cw7213的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及CW7213的制備方法，具體涉及CW7213的固相多肽合成的制備方法。
背景技術(shù)：
中文名無指盤臭蛙胰島素釋放促進肽縮寫CW7213等電點10.32分子量2632.3結(jié)構(gòu)式:Phe-Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Ala-Ala-Asn(Trt)-Phe-Leu-Pro-L ys(boc)-Leu-Phe-Cys(trt)-Lys(boc)-Ile-Thr(tbu)-Arg(pbf)-Lys(boc)-Gly-OH糖尿病是以持續(xù)高血糖為基本生化特征的綜合征。各種原因造成胰島素相對或絕對缺乏以及不同程度的胰島素抵抗，使碳水化合物、脂肪及蛋白質(zhì)代謝紊亂，臨床上表現(xiàn)為糖尿病。隨著病程的延長，可出現(xiàn)廣泛的微血管及大血管病變，導(dǎo)致雙目失明、腎功能衰竭、 肢端壞疽、心肌梗死及腦血管病變，嚴(yán)重威脅患者的生命。近年來，糖尿病的患病率急劇上升，全世界糖尿病患者已由1997年的1. 3億發(fā)展到2005年的2. 37億，我國預(yù)計有糖尿病患者6千萬。有關(guān)專家預(yù)測，2025年全球糖尿病患者可達3億。目前，我國糖尿病的發(fā)病率已達20歲以上人群總數(shù)的3. 2%。2型糖尿病發(fā)病機制復(fù)雜，目前普遍認(rèn)為胰島素抵抗和β細(xì)胞分泌缺陷是2型糖尿病發(fā)病機制的2個主要環(huán)節(jié)。經(jīng)典的抗2型糖尿病藥物存在多種缺陷，不能從根本上治愈糖尿病患者。胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)受體屬于G蛋白偶聯(lián)胰高血糖素受體家族，廣泛分布于胰腺β、δ細(xì)胞、胃小凹和小腸黏膜以及心、肺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)。GLP-I與GLP-I受體特異性結(jié)合后，主要通過cAMP為第二信使的信號通路發(fā)揮血糖調(diào)控作用。其主要優(yōu)點一是具有血糖依賴性的腸促胰島素分泌作用，從而避免了糖尿病藥物治療中常存在的低血糖癥的危險；二是阻止胰腺β細(xì)胞退化，刺激β細(xì)胞的增值和分化，從根本上改善糖尿病病程的發(fā)展。但GLP-I在體內(nèi)易被二肽基肽酶IV (DPP-IV)降解，半衰期僅aiiin左右。DPP-IV 是一種絲氨酸蛋白酶，可特異性識別GLP-I的N末端第二位丙氨酸殘基，并從此處切除二肽使GLP-I失活。針對內(nèi)源性GLP-I的優(yōu)點和不足，人們從GLP-I受體激動劑和DPP- IV抑制劑兩個方面進行新藥設(shè)計。這類藥物將以其獨特的降糖活性，在2型糖尿病的治療中發(fā)揮重要的作用。CW7213是胰高血糖素樣肽_1 (GLP-I)類似物，具有多種生理功能能夠降低患者體重，更平穩(wěn)地控制血糖水平，不會產(chǎn)生低血糖。此外，GLP-I類似物還能維持、并且改善II 型糖尿病患者的基礎(chǔ)和葡萄糖刺激后的β細(xì)胞功能，延緩疾病進程。由于這些無可比擬的治療優(yōu)點，CW7213有非常廣闊的市場前景。傳統(tǒng)的多肽合成方法多為液相合成法或固相boc策略合成法，由于工藝三廢較嚴(yán)重，使用劇毒的氟化氫，接肽效率低，反應(yīng)時間較長，工藝復(fù)雜，產(chǎn)品收率較低，不具備大規(guī)模生產(chǎn)的能力，而CW7213的制備工藝尚未見報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種固相多肽合成CW7213的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。本發(fā)明的方法包括如下步驟以Fmoc-Gly-WANG樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次以Fmoc保護的氨基酸為單體，以HBTU/HoBT為縮合劑，以DIPEA為催化劑，在砂芯漏斗中通入氮氣逐個接上氨基酸，獲得保護的二十四肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護基團，同步進行脫側(cè)鏈保護基團和切肽，加入乙醚沉淀，獲得CW7213的粗品，并經(jīng)C18柱進行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥，獲得產(chǎn)品(包括醋酸鹽、三氟乙酸鹽等醫(yī)學(xué)上可用的鹽)。按照本發(fā)明優(yōu)選的方案，依次連接具有Fmoc保護的氨基酸，獲得保護的二十四肽樹脂，依次包括如下步驟(1)將Fmoc-Gly-WANG樹脂用DMF浸泡60分鐘，使樹脂溶脹，樹脂的載量為 0.48mmol/g；(2)在上述樹脂中，加入脫保護試劑，進行脫保護反應(yīng)，然后樹脂用DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的具有Fmoc保護基團的氨基酸和HBTU/HoBT的混合物以及DIPEA，進行接肽反應(yīng)，抽干，用DMF洗滌六次，然后再加入脫保護試劑，進行脫保護反應(yīng)，再加入用DMF 溶解的具有Fmoc保護的氨基酸，如此重復(fù)，最后一個氨基酸脫保護后用DMF洗滌四次、二氯甲烷洗滌兩次、甲醇洗滌兩次，獲得Fmoc-Phe-Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Ala-Ala-A sn(Trt)-Phe-Leu-Pro-Lys(boc)-Leu-Phe-Cys(trt)-Lys(boc)-Ile-Thr(tbu)-Arg(pbf)-Lys (boc)-Gly-樹脂；所說的具有Fmoc基團的氨基酸，依次為(I)Fmoc-Lys (boc)-0H、(2) Fmoc-Arg (pbf) -0H> (3) Fmoc-Thr (tbu)-0H、(4) Fmoc-Ile-OH、 (5)Fmoc-Lys(boc)-OH、 (6)Fmoc-Cys(trt)-OH、 (7)Fmoc-Phe-OH、 (8) Fmoc-Leu-OH、 (9)Fmoc-Lys(boc)-OH、 (10)Fmoc-Pro-OH、 (11)Fmoc-Leu-OH、 (12) Fmoc-Phe-OH、(13)Fmoc-Asn(trt)-OH, (14)Fmoc-Ala-OH、(15)Fmoc-Ala-OH、(16) Fmoc-Leu-OH、 (17)Fmoc-Gly-OH、 (18)Fmoc-Ala-OH、 (19)Fmoc-Leu-OH、 (20)Fmoc-Leu-0H> (21)Fmoc-Pro-OH、 (22)Fmoc-Leu-OH、 (23)Fmoc-Phe-OH0所說的脫保護試劑的組分和體積比為PIP DMF=I 4;具有Fmoc保護基團的氨基酸的摩爾數(shù)為樹脂載量的3倍；HBTU/HoBT的摩爾數(shù)為樹脂載量的3倍；DIPEA的摩爾數(shù)為樹脂載量的7倍；脫保護反應(yīng)溫度為10_30°C，反應(yīng)時間為20分鐘；接肽反應(yīng)溫度為10_30°C，反應(yīng)時間為1-2小時。同步進行脫側(cè)鏈保護基團和切肽，獲得CW7213的粗品包括如下步驟將配制好的切割試劑，加入步驟(2)中最后脫去保護的二十四肽樹脂中，10-30°C 切肽反應(yīng)2小時，漏斗過濾后得濾液，加入冰乙醚沉淀靜置30分鐘，抽濾得到多肽沉淀物， 室溫置于干燥器中，減壓干燥10-14小時，獲得CW7213粗品。所說的切割試劑為TFA/EDT/H20/TIS = 9. 5 0. 2 0. 2 0. 1，體積比；
優(yōu)選的，CW7213粗品經(jīng)C18柱進行分離純化包括如下步驟將CW7213粗品溶于水溶液中，過濾，濾液經(jīng)C18柱進行分離純化，流動相為A 10%甲醇+90%水+0. 1 % TFA, B 90%甲醇+10%水+0. TFA，體積比；流速為anl/min ；檢測波長為:214nm ；用制備型高效液相色譜跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后旋蒸并冷凍干燥，獲得目標(biāo)產(chǎn)物(MW 2632. 3)，切肽后的收率為72%，分離純化后總產(chǎn)率約為21%。由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明的方法采用Fmoc-Gly-WANG樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次以Fmoc保護的氨基酸為單體，以HBTU/HoBT為縮合劑，以 DIPEA為催化劑，在砂芯漏斗中通入氮氣逐個接上氨基酸。每步接肽收率大于98%，采用 TFA/EDT/H20/TIS為切割試劑切割粗肽，經(jīng)乙醚沉淀獲得產(chǎn)品的方法，避免使用氟化氫等劇毒試劑，污染少，且收率提高。具備規(guī)?；a(chǎn)能力，工藝穩(wěn)定，原輔料來源方便，生產(chǎn)周期短。切肽后的收率為74. 8%，分離純化后總產(chǎn)率約為21. 3%。
具體實施例方式實施例1實施例和前述過程中所采用的原料列表如下
權(quán)利要求
1.一種固相多肽合成CW7213的制備方法，其特征在于，包括如下步驟以 Fmoc-Gly-WANG樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次以Fmoc保護的氨基酸為單體， 以HBTU/HoBT為縮合劑，以DIPEA為催化劑，在砂芯漏斗中通入氮氣逐個接上氨基酸，獲得保護的二十四肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護基團，同步進行脫側(cè)鏈保護基團和切肽，加入乙醚沉淀，獲得CW7213的粗品，并經(jīng)C18柱進行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥，獲得產(chǎn)品(包括醋酸鹽、三氟乙酸鹽等醫(yī)學(xué)上可用的鹽)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，依次連接具有Fmoc保護基團的氨基酸，獲得保護的二十四肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護基團的方法包括如下步驟(1)將Fmoc-Gly-WANG樹脂用DMF浸泡60分鐘，使樹脂溶脹，樹脂的載量為0.48mmol/g ；(2)在上述樹脂中，加入脫保護試劑，進行脫保護反應(yīng)，然后樹脂用DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的具有Fmoc保護基團的氨基酸和HBTU/HoBT的混合物以及DIPEA，進行接肽反應(yīng)，抽干，用DMF洗滌六次，然后再加入脫保護試劑，進行脫保護反應(yīng)，再加入用DMF溶解的具有Fmoc保護的氨基酸，如此重復(fù)，最后一個氨基酸脫保護后用DMF洗滌四次、二氯甲烷洗滌兩次、甲醇洗滌兩次，獲得 Fmoc-Phe-Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Ala-Ala-Asn (Tr t)-Phe-Leu-Pro-Lys(boc)-Leu-Phe-Cys(trt)-Lys(boc)-Ile-Thr(tbu)-Arg(pbf)-Lys (b oc)-Gly-樹脂；所說的具有Fmoc基團的氨基酸，依次為(1)Fmoc-Lys(boc)-OH>(2)Fmoc-Arg (pbf) -OH >(3)Fmoc-Thr(tbu)-OH>(4)Fmoc-Ile-OH^(5)Fmoc-Lys(boc)-OH>(6)Fmoc-Cys(trt)-0H、(7)Fmoc-Phe-OH、(8)Fmoc-Leu-OH、(9)Fmoc-Lys(boc)-OH>(10)Fmoc-Pro-OH、(11)Fmoc-Leu-OH、(12)Fmoc-Phe-OH,(13)Fmoc-Asn(trt)-OH、(14)Fmoc-Ala-0H,(15)Fmoc-Ala-0H、(16)Fmoc-Leu-OH、(17)Fmoc-Gly-0H,(18)Fmoc-Ala-0H、(19)Fmoc-Leu-OH、(20)Fmoc-Leu-OH、(21)Fmoc-Pro-0H、(22)Fmoc-Leu-OH、(23)Fmoc-Phe-OH0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的脫保護試劑的組分和體積比為 PIP DMF=I 4;具有Fmoc保護基團的氨基酸的摩爾數(shù)為樹脂載量的3倍；HBTU/HoBT 的摩爾數(shù)為樹脂載量的3倍；DIPEA的摩爾數(shù)為樹脂載量的7倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，加入脫保護試劑后，10-30°C反應(yīng)20分鐘； 加入用DMF溶解的具有Fmoc保護基團的氨基酸和HBTU/HoBT的混合物以及DIPEA，10-30°C 反應(yīng)1-2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，同步進行脫側(cè)鏈保護基團和切肽，加入乙醚沉淀，獲得CW7213的粗品，包括如下步驟將配制好的切割試劑，加入最后脫去保護的二十四肽樹脂中，10-30°C切肽反應(yīng)2小時，漏斗過濾后得濾液，加入冰乙醚沉淀靜置30分鐘，抽濾得到多肽沉淀物，室溫置于干燥器中，減壓干燥10-14小時，獲得CW7213粗品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所說的切割試劑為TFA/EDT/H20/TIS= 9.5 0.2 0.2 0. 1，體積比；10-30°C切肽反應(yīng)2小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，CW7213粗品經(jīng)C18柱進行分離純化包括如下步驟將CW7213粗品溶于水溶液中，過濾，濾液經(jīng)C18柱進行分離純化，流動相為A 10% 甲醇+90%水+0. 1% TFA、B 90% 甲醇+10%水+0. 1% TFA，體積比；流速為 2ml/min ； 檢測波長為214nm ；用制備型高效液相色譜跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后旋蒸并冷凍干燥，獲得成品(MW :2632. 3)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種固相多肽合成CW7213的制備方法，包括如下步驟以Fmoc-Gly-WANG樹脂為起始原料，以Fmoc保護的氨基酸為單體，以HBTU/HoBT為縮合劑，在砂芯漏斗中通入氮氣逐個接上氨基酸，獲得保護的二十四肽樹脂，其間依次脫去Fmoc保護基團，同步進行脫側(cè)鏈保護基團和切肽，加入乙醚沉淀，獲得CW7213的粗品，并經(jīng)C18柱進行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥，獲得產(chǎn)品(包括醋酸鹽、三氟乙酸鹽等醫(yī)學(xué)上可用的鹽)。本發(fā)明的方法工藝穩(wěn)定成熟，原輔料來源方便，接肽收率高，避免使用氟化氫等劇毒試劑，污染較少，便于工業(yè)化實施。
文檔編號A61P3/10GK102174101SQ20111000368
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者孔毅, 賴伊麗, 郭佳維, 顏天華, 黃世龍, 黃海 申請人:中國藥科大學(xué)