專利名稱：固相多肽合成生長(zhǎng)激素促分泌素五肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生長(zhǎng)激素促分泌素的生產(chǎn)方法，尤其涉及固相多肽合成生長(zhǎng)激素促分泌素的新生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
中文名生長(zhǎng)激素促分泌素、生長(zhǎng)激素促分泌素五肽。英文名Growth Hormone Secretagogue，GHS0
結(jié)構(gòu)式
Gly-Ser-Trp-Phe-Arg-OH
分子式及分子量=C31H41N9O7,651.73。
臨床用途它能刺激天然的或內(nèi)源性生長(zhǎng)激素釋放能力。該五肽可以用來(lái)治療需要刺激生長(zhǎng)激素產(chǎn)生或分泌的疾病，例如用于天然生長(zhǎng)激素缺乏的人或用于食用或產(chǎn)毛動(dòng)物，以刺激生長(zhǎng)激素，從而得到更大、更高產(chǎn)的動(dòng)物。
中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6199388. X公開(kāi)了一種生長(zhǎng)激素促分泌素及其制備方法，該專利提供的產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)式與本發(fā)明不同該專利不是多肽類產(chǎn)品，本發(fā)明是由五個(gè)氨基酸級(jí)成的五肽，因此，所述專利提供的方法，難以用于本發(fā)明的產(chǎn)品的制備。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種固相多肽合成生長(zhǎng)激素促分泌素五肽的方法，以滿足有關(guān)領(lǐng)域發(fā)展的需要。
本發(fā)明的方法包括如下步驟
以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用HBTU及HOBT為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的五肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，收集切肽后的生長(zhǎng)激素促分泌素粗品， 并經(jīng)C18高效液相柱進(jìn)行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥后，制得生長(zhǎng)激素促分泌素精品。
具體的，本發(fā)明的方法，包括如下步驟
(I)Fmoc-Arg(Pbf)-樹(shù)脂的制備
取2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂，用DCM浸泡，使樹(shù)脂溶脹，抽干，加入溶于DMF的 Fmoc-Arg(Pbf) -OH及DIPEA，于32 38 °C反應(yīng)I 2小時(shí)，優(yōu)選1. 5小時(shí)，再加甲醇繼續(xù)32 37 °C反應(yīng)25 35分鐘，優(yōu)選30分鐘，抽干，樹(shù)脂依次用甲醇、DMF洗滌，獲得 Fmoc-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；
所說(shuō)的三苯氯甲基樹(shù)脂顆粒為85-95目，取代度為0. 8 1. 2mmol/g ；
DMF 中，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
DIPEA與2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂的摩爾比為1: 5 7;
Fmoc-Arg (Pbf)-OH與2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂的摩爾比為I O. 9 1.1 ;
其中，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH為保護(hù)的氨基酸；
(2) Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂的制備
在步驟(I)的Fmoc-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入重量濃度為20 30%，優(yōu)選25%的 PIP的DMF溶液，30 32°C脫帽反應(yīng)25 35分鐘，優(yōu)選30分鐘，抽干，依次用甲醇、DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-0H、HBTU、H0BT和DIPEA的混合物，36_39°C縮合反應(yīng) 65 75分鐘，優(yōu)選70分鐘，抽干，用乙醇和DMF洗滌，抽干，獲得Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)
DMF 溶液中，F(xiàn)moc-Phe-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
各個(gè)組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為基準(zhǔn)，為
重量濃度為20 30%的PIP的DMF溶液2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=6 8 1， 重量比；
Fmoc-Phe-OH 2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1. 7 1，摩爾比；
HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
DIPEA 2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 6 2. O 1，摩爾比；
其中，F(xiàn)moc-Phe-OH為保護(hù)的氨基酸；
(3) Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂的制備
在步驟(2)的Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入重量濃度為20 30 %，優(yōu)選25 % 的PIP的DMF溶液，30 32°C脫帽反應(yīng)25 35分鐘，優(yōu)選30分鐘，抽干，用甲醇、DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Trp-OH、HBTU, HOBT, DIPEA的混合物，36 39°C縮合反應(yīng)65 75分鐘，優(yōu)選70分鐘，抽干，用DMF洗滌，抽干，分別用乙醇和DMF洗滌，抽干，獲得 Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；
DMF 溶液中，F(xiàn)moc-Trp-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
各個(gè)組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為基準(zhǔn)，為
重量濃度為20 30%的PIP的DMF溶液2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=6 8 1， 重量比；
Fmoc-Trp-OH 2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1. 7 1，摩爾比；
HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
DIPEA 2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 6 2. O 1，摩爾比；
其中，F(xiàn)moc-Trp-OH為保護(hù)的氨基酸；
(4) Fmoc-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂的制備
在步驟(3)的Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入重量濃度為20 30%，優(yōu)選 25%的PIP的DMF溶液，30-32°C脫帽反應(yīng)25 35分鐘，優(yōu)選30分鐘，抽干，用甲醇、DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Ser (tBu) -OH、HBTU, HOBT、DIPEA的混合物，36 39°C縮合反應(yīng)65 75分鐘，優(yōu)選70分鐘，抽干，用DMF洗滌，抽干，分別用乙醇和DMF洗滌，抽干， 獲得 Fmoc-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；
DMF 溶液中，F(xiàn)moc-Ser (tBu) -OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
各個(gè)組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為基準(zhǔn)，為
重量濃度為20 30%的PIP的DMF溶液2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=6 8 1，重量比；
Fmoc-Phe-OH 2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1. 7 1，摩爾比；
HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
DIPEA 2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 6 2. O 1，摩爾比；
其中，F(xiàn)moc-Ser (tBu) -OH為保護(hù)的氨基酸；
(5) Boc-Gly-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂的制備
在步驟⑷的Fmoc-Ser (tBu)-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入重量濃度為20 30%,優(yōu)選25%的PIP的DMF溶液，進(jìn)30-32°C脫帽反應(yīng)25 35分鐘，優(yōu)選30分鐘，抽干， 用甲醇、DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的Boc-Gly-0H、HBTU、H0BT、DIPEA的混合物，36 39 °C縮合反應(yīng)65 75分鐘，優(yōu)選70分鐘，抽干，分別用DMF、甲醇洗滌，抽干，獲得Boc-Gly -Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；
DMF 溶液中，Boc-Gly-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；
各個(gè)組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為基準(zhǔn)，為
重量濃度為20 30%的PIP的DMF溶液2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=6 8 1， 重量比；
Boc-Gly-OH 2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1. 7 1，摩爾比;
HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 I，摩爾比；
DIPEA 2_氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 6 2. O 1，摩爾比；
其中，Boc-Gly-OH為保護(hù)的氨基酸；
(6) Gly-Ser-Trp-Phe-Arg 的制備
在步驟(5)的Boc-Gly-Ser (tBu)-Trp-Phe-Arg(Pbf)-樹(shù)脂中，加入預(yù)冷至 5 7°C的切肽試劑，32 35 V反應(yīng)2. O 3. O小時(shí)，減壓除溶劑后，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，獲得切肽后的生長(zhǎng)激素促分泌素粗品；
所述的切肽試劑由如下體積比的組分組成
TFA/TIS/Ph0H/3-Map/H20 = 900/40ml/25ml/25/10ml ；
(7)將粗品溶于釋醋酸中，過(guò)濾，濾液經(jīng)C18高效液相柱純化，柱直徑為210mm，柱長(zhǎng)為245mm，流速為920ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm ;流動(dòng)相0. 15mol/L磷酸三乙胺乙腈 (81 19，體積比)；用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，再除盡乙腈、凍干，獲得成品?？偸章蕿?8.4%。
本發(fā)明的方法的有益效果是工藝穩(wěn)定，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本較低， 三廢污染較少。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
實(shí)施例和前述過(guò)程中所采用的原料列表如下
權(quán)利要求
1.固相多肽合成生長(zhǎng)激素促分泌素五肽的方法，其特征在于，包括如下步驟以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用HBTU及HOBT為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的五肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，收集切肽后的生長(zhǎng)激素促分泌素粗品，并經(jīng)C18高效液相柱進(jìn)行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥后，制得生長(zhǎng)激素促分泌素精品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用HBTU及HOBT為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的五肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，收集切肽后的生長(zhǎng)激素促分泌素粗品的方法，包括如下步驟(1)Fmoc-Arg(Pbf)-樹(shù)脂的制備取2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂，用DCM浸泡，使樹(shù)脂溶脹，抽干，加入溶于DMF的Fmoc-Arg (Pbf)-OH及DIPEA，反應(yīng)，再加甲醇繼續(xù)32 37°C反應(yīng)25 35分鐘，優(yōu)選30分鐘，抽干，樹(shù)脂依次用甲醇、DMF洗漆，獲得Fmoc-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；(2)Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂的制備在步驟(I)的Fmoc-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入重量濃度為20 30% PIP的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，抽干，依次用甲醇、DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Phe-OH、HBTU, HOBT和DIPEA的混合物，縮合反應(yīng)，抽干，用DMF洗滌，抽干，獲得Fmoc-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；(3)Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂的制備在步驟(2)的Fmoc-Phe-Arg(Pbf)-樹(shù)脂中，加入重量濃度為20 30% PIP的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，抽干，用甲醇、DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Trp-OH、HBTU, HOBT,DIPEA的混合物，縮合反應(yīng)，抽干，用DMF洗滌，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；(4)Fmoc-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂的制備在步驟(3)的Fmoc-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入重量濃度為20 30% PIP的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，抽干，用甲醇、DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的Fmoc-Ser (tBu) _0H、HBTU、HOBT、DIPEA的混合物，縮合反應(yīng)，抽干，用DMF洗滌，抽干，分別用DMF和乙醇洗滌，抽干，獲得 Fmoc-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；(5)Boc-Gly-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂的制備在步驟(4)的Fmoc-Ser (tBu)-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入重量濃度為20 30%PIP的DMF溶液，脫帽反應(yīng)，抽干，用甲醇、DMF洗滌，抽干，加入用DMF溶解的Boc-Gly-OH、HBTU, HOBT, DIPEA的混合物，縮合反應(yīng)，抽干，用DMF洗滌，抽干，獲得Boc-Gly-Ser (tBu) -Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；(6)Gly-Ser-Trp-Phe-Arg 的制備在步驟(5)的Boc-Gly-Ser (tBu)-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入切肽試劑,反應(yīng),減壓除溶劑后，加入乙醚沉淀，收集沉淀物，用乙醚洗，P2O5真空干燥，獲得切肽后的生長(zhǎng)激素促分泌素粗品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(I)中，取2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂，用DCM浸泡，使樹(shù)脂溶脹，抽干，加入溶于DMF的Fmoc-Arg (Pbf) -OH及DIPEA，于32 38°C反應(yīng)I 2小時(shí)，再加甲醇繼續(xù)32 37°C反應(yīng)25 35分鐘，優(yōu)選30分鐘，抽干，樹(shù)脂依次用甲醇、DMF洗滌，獲得Fmoc-Arg (Pbf)-樹(shù)脂；所說(shuō)的三苯氯甲基樹(shù)脂顆粒為85-95目，取代度為0. 8 1. 2mmol/g ；DMF 中，F(xiàn)moc-Arg (Pbf)-OH 的含量為 O. 08 O. 12g/ml ；DIPEA與2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂的摩爾比為1: 5 7;Fmoc-Arg(Pbf)-OH與2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂的摩爾比為1: O. 9 1.1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2) (5)中，30 32°C脫帽反應(yīng)25 35分鐘，36 39 °C縮合反應(yīng)65 75分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2) (5)中，各個(gè)組分的用量，以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為基準(zhǔn)，為重量濃度為20 30% PIP的DMF溶液2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=6 8 1，重量比；保護(hù)的氨基酸2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1.7 1，摩爾比；HBTU 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1. 7 I，摩爾比；HOBT 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 2 1. 7 I，摩爾比；DIPEA 2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂=1. 6 2. O I，摩爾比。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在步驟(5)的Boc-Gly-Ser(tBu)-Trp-Phe-Arg (Pbf)-樹(shù)脂中，加入預(yù)冷至5 7 °C的切肽試劑，32 35 °C反應(yīng)2. O 3.O小時(shí)，所述的切肽試劑由如下體積比的組分組成TFA/TIS/Ph0H/3-Map/H20 =900/40ml/25ml/25/10ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，經(jīng)C18高效液相柱進(jìn)行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥后，制得生長(zhǎng)激素促分泌素精品的方法，包括如下步驟將所述粗品溶于釋醋酸中，過(guò)濾，濾液經(jīng)C18高效液相柱純化，柱直徑為210mm，柱長(zhǎng)為245mm，流速為920ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為:280nm;流動(dòng)相:0. 15mol/L磷酸三乙胺乙腈(81 19，體積比);用液相色譜儀跟蹤收集所需要的流出液，樣品峰合并后去鹽，再除盡乙腈、凍干，獲得成品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種固相多肽合成生長(zhǎng)激素促分泌素五肽的方法，包括如下步驟以2-氯-三苯氯甲基樹(shù)脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸，其間依次脫去Fmoc-保護(hù)基團(tuán)，用HBTU及HOBT為縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得保護(hù)的五肽樹(shù)脂后，同步進(jìn)行脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽，收集切肽后的生長(zhǎng)激素促分泌素粗品，并經(jīng)C18高效液相柱進(jìn)行分離純化，再經(jīng)冷凍干燥后，制得生長(zhǎng)激素促分泌素精品。本發(fā)明的方法的有益效果是工藝穩(wěn)定，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本較低，三廢污染較少。
文檔編號(hào)C07K7/06GK103012556SQ201110281279
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月21日
發(fā)明者周逸明, 崔頎, 蔡華成 申請(qǐng)人:上海蘇豪逸明制藥有限公司, 周逸明, 崔頎