本發(fā)明涉及3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-AA，涉及它們的制備方法，涉及它們的抗血栓活性，涉及它們的溶血栓活性以及涉及它們治療腦缺血大鼠的作用，因而本發(fā)明涉及它們在制備抗血栓藥物，溶血栓藥物以及治療缺血性中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

缺血性中風(fēng)是一類較常見且危害嚴(yán)重的腦血管疾病，特點是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風(fēng)面臨沒有有效藥物的現(xiàn)實，尤其中風(fēng)面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對中風(fēng)面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經(jīng)公開式II的咪唑啉化合物在中風(fēng)面24h的大鼠缺血性中風(fēng)模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa₁和aa₂可為同時存在，aa₁存在但aa₂不存在，或同時不存在；當(dāng)aa₁和aa₂同時存在時，aa₁為R(Arg)，且aa₂為G(Gly)，A(Ala)或Q(Gln)；當(dāng)aa₁存在但aa₂不存在時，aa₁為R(Arg)；aa₃可為S(Ser)，V(Val)或F(Phe)。由于式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys。而該Lys的側(cè)鏈氨基和主鏈羧基分別與RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相連接，所以結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜需要簡化。

發(fā)明人經(jīng)過3年實驗研究，發(fā)現(xiàn)用3，4-二羥基-Phe殘基代替上式中的1-取代苯基咪唑啉基可以獲得結(jié)構(gòu)簡單和療效好的雙重意想不到的技術(shù)效果。按照這個發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

1.本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供下式的3，4-二羥-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-AA(當(dāng)AA＝Val時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Val；當(dāng)AA＝Phe時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Phe；當(dāng)AA＝Ser時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Ser)

2.本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供3，4-二羥-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-AA(當(dāng)AA＝Val時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Val；當(dāng)AA＝Phe時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Phe；當(dāng)AA＝Ser時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Ser)的制備方法，該方法以下方法構(gòu)成。

(1)制備(S)-3，4-二羥基-Phe-OBzl；

(2)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)；

(3)制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-OBzl；

(4)制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]；

(5)制備Ia：

(5a)制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(5b)制備Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(5c)制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(5d)制備(S)-3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val；

(6)制備Ib：

(6a)制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；

(6b)制備Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；

(6c)制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl；

(6d)制備(S)-3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Phe；

(7)制備Ic：

(7a)制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；

(7b)制備Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；

(7c)制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl；

(7d)制備(S)-3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Ser。

4.本發(fā)明的內(nèi)容之三是評價3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-AA(當(dāng)AA＝ Val時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Val；當(dāng)AA＝Phe時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Phe；當(dāng)AA＝Ser時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Ser)的抗血栓活性。

5.本發(fā)明的內(nèi)容之四是評價3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-AA(當(dāng)AA＝Val時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Val；當(dāng)AA＝Phe時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Phe；當(dāng)AA＝Ser時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Ser)的溶血栓活性。

6.本發(fā)明的內(nèi)容之五是評價3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-AA(當(dāng)AA＝Val時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Val；當(dāng)AA＝Phe時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Phe；當(dāng)AA＝Ser時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Ser在腦缺血24h后治療腦缺血的活性。

附圖說明

圖1是3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-AA(當(dāng)AA＝Val時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Val；當(dāng)AA＝Phe時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Phe；當(dāng)AA＝Ser時Arg-Gly-Asp-AA為Arg-Gly-Asp-Ser)的合成路線，(i)Cyclohexane，benzyl alcohol，Tosh；(ii)HATu，HOBt，THF，NMM；(iii)DCC，HOSu，THF；(iv)DCC，HOBt，THF，NMM；(v)Pd/C，methanol；(vi)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；(vii)TFA，TFMSA。

具體實施方式

為了進一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。

實施例1制備(S)-3，4-二羥基-Phe-OBzl

向100mL茄瓶中分別加入1g(5.08mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe、1.02g對甲苯磺酸、8mL苯甲醇、8mL正己烷，瓶口加上分水器及其冷凝管，油浴90～95℃加熱反應(yīng)，攪拌36h，使變澄清。待反應(yīng)混合液冷卻至室溫，倒入大量乙醚，析出大量白色固體，靜置充分析出后，過濾，用乙醚磨洗上層固體，干燥后得1.08g(77％)標(biāo)題化合物，為黃色粉末。ESI-MS(m/z)：288[M+H]⁺。

實施例2制備Boc-Pro-Ala

將1.075g(5.0mmol)Boc-Pro溶于20mL無水THF，冰浴下向溶液中加入0.637g(5mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(HOSu)，并使完全溶解。冰浴下，把已溶于少量無水THF的二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)1.236g(6.0mmol)加入反應(yīng)液中。室溫攪拌7小時，TLC(CHCl₂∶MeOH＝10∶1)監(jiān)測反應(yīng)。濾除二環(huán)己基脲(DCU)，濾液減壓濃縮除去THF。濃縮物用乙酸乙酯(EA)溶解，依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次、飽和NaCl水溶液洗 3次，然后將EA層減壓濃縮至干，加入適量THF溶解。再加入已溶于少量水的Ala 0.489g(5.5mmol)，用NaHCO₃固體調(diào)pH到8-9，常溫反應(yīng)12小時，減壓濃縮除去THF，加入5mL水溶解，用飽和KHSO₄水溶液調(diào)pH到2，用EA少量多次萃取，合并EA層，用飽和NaCl水溶液洗至中性，無水硫酸鈉干燥。過濾，濾液減壓濃縮至干，得1.41g(98％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：285[M-H]^-。

實施例3制備Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl

將314mg(1.1mmol)Boc-Pro-Ala溶于15mL無水四氫呋喃(THF)，冰浴下往里加149mg(1.1mmol)N-羥基苯并三唑(HOBt)和268mg(1.3mmol)二環(huán)己基羰二亞胺(DCC)的無水THF溶液。反應(yīng)混合物冰浴攪拌20分鐘，得對應(yīng)的活潑酯溶液。將372mg(1.0mmol)HCl·Lys(Boc)-OBzl用無水THF溶解，然后與剛剛得到的活潑酯溶液混溶，滴加少量N-甲基嗎啉(NMM)來調(diào)節(jié)pH 9，得到的反應(yīng)混合物室溫反應(yīng)24小時。過濾除去二環(huán)己基脲(DCU)，濾液減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，然后再濾除DCU，濾液依次用飽和NaHCO₃溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，飽和KHSO₄溶液洗3次、飽和NaCl溶液洗3次、飽和NaHCO₃溶液洗3次、飽和NaCl溶液洗3次，所得乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾、減壓濃縮得黃色油狀物，經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮體系6∶l-1∶1)，TLC(石油醚∶丙酮＝2∶1)，得412mg(65％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：605[M+H]⁺。

實施例4制備Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)

向604mg(1.0mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)-OBzl中加入20mL甲醇和30mg的Pd/C。往得到的懸浮液中通氫氣，室溫攪拌24小時，TLC(CH₂Cl₂∶MeOH＝15∶1)監(jiān)控反應(yīng)原料點消失，反應(yīng)完成。濾除Pd/C，濾液減壓濃縮除去溶劑，得496mg(97％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：513[M-H]^-。

實施例5制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-OBzl

將564mg(1.1mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)溶于15mL無水四氫呋喃(THF)，冰浴下往里加149mg(1.1mmol)N-羥基苯并三唑(HOBt)和468mg(1.3mmol)HATu的無水THF溶液。反應(yīng)混合物冰浴攪拌20分鐘，得對應(yīng)的活潑酯溶液。將460mg(1.0mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe-OBzl用無水THF溶解，然后與剛剛得到的活潑酯溶液混溶，滴加少量N-甲基嗎啉(NMM)來調(diào)節(jié)pH 8，得到的反應(yīng)混合物室溫反應(yīng)24小時。過濾，濾液減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，濾液依次用飽和KHSO₄溶液洗3次、飽和NaCl溶液洗3次，所得乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾、減壓濃縮得黃色油狀物，經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮體系6∶1-1∶1)，TLC(石油醚：丙酮＝2∶1)，得 412mg(65％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：605[M+H]⁺。

實施例6制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]

按照實施例4的方法從784mg(1.1mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-OBzl得624mg(89％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：695[M-H]^-。

實施例7制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl

按照實施例3的方法從350mg(1.1mmol)Boc-Arg(NO₂)和337mg(1.0mmol)HCl·Gly-OBzl，得312mg(67％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：466[M+H]⁺。

實施例8制備Boc-Arg(NO₂)-Gly

將466mg(1.0mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl置于100mL茄瓶中，20mL甲醇溶解，冰浴下加入4N NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到12，冰浴反應(yīng)3h，TLC(CHCl₂∶MeOH＝30∶1)顯示原料點消失。后處理：加入5％KHSO₄水溶液調(diào)節(jié)pH至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋去甲醇，再加入飽和KHSO₄水溶液調(diào)節(jié)pH至2，乙酸乙酯萃洗，干燥，旋干得到310mg(78％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：375[M-H]^-。

實施例9制備Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實施例3的方法從355mg(1.1mmol)Boc-Asp(OBzl)和243mg(1.0mmol)HCl·Val-OBzl，得到338mg(66％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：513[M+H]⁺。

實施例10制備HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

向511mg(1mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl中加入10mL 4mol/L氯化氫-乙酸乙酯溶液，室溫攪拌3小時，TLC(CHCl₂∶MeOH＝30∶1)顯示原料點消失。反應(yīng)液減壓濃縮至干，加少量干燥乙酸乙酯，減壓濃縮至干，重復(fù)上述操作3次；加少量無水乙醚，減壓濃縮至干，重復(fù)上述操作3次，得400mg(94％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：412[M+H]⁺。

實施例11制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實施例3的方法從413mg(1.1mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和448mg(1.0 mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl，得533mg(69％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：771[M+H]⁺。

實施例12制備HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實施例10的方法從770mg(1mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，得680mg(96％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：671[M+H]⁺。

實施例13制備Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

按照實施例3的方法從355mg(1.1mmol)Boc-Asp(OBzl)和291mg(1.0mmol)HCl·Phe-OBzl，得284mg(50％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：561[M+H]⁺。

實施例14制備HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl

按照實施例10的方法從560mg(1mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，得440mg(96％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：461[M+H]⁺。

實施例15制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

按照實施例3的方法從413mg(1.1mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和496mg(1.0mmol)HCl·Asp(OBzl)-Phe-OBzl，得368mg(45％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：819[M+H]⁺。

實施例16制備HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

按照實施例10的方法從818mg(1mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，得690mg(93％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：719[M+H]⁺。

實施例17制備Boc-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

按照實施例3的方法從355mg(1.1mmol)Boc-Asp(OBzl)和291mg(1.0mmol)HCl·Ser-OBzl，得309mg(62％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI-MS(m/z)：501[M+H]⁺。

實施例18制備HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl

按照實施例10的方法從500mg(1mmol)Boc-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，得390mg(97％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：401[M+H]⁺。

實施例19制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

按照實施例3的方法從413mg(1.1mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和436mg(1.0mmol)HCl·Asp(OBzl)-Ser-OBzl，得309mg(41％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：759[M+H]⁺。

實施例20制備HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

按照實施例10的方法從758mg(1mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl，得640mg(92％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：659[M+H]⁺。

實施例21制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實施例5的方法從764mg(1.1mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]和670mg(1.0mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl，得到635mg(47％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：1346[M+H]⁺。

實施例22制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl

按照實施例5的方法從764mg(1.1mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]和754mg(1.0mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl，得到279mg(20％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：1394[M+H]⁺。

實施例23制備(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl

按照實施例5的方法從764mg(1.1mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]和694mg(1.0mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl，得到284mg(21％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/z)：1334[M+H]⁺。

實施例24制備(S)-3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val(Ia)

冰浴下向268mg(0.2mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-

Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl依次加3mL TFA和1mL TFMSA，反應(yīng)30min，TLC(CHCl₂∶MeOH＝15∶1)監(jiān)測反應(yīng)，加入大量的冰乙醚，析出大量固體，靜置，傾倒上層乙醚，再加入乙醚，反復(fù)3次，減壓濃縮至干。殘留物進行Sephadex G15除鹽，C18純化。凍干得到4mg(2％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：921[M+H]⁺¹H-NMR(D₂O，300MHz)：δ/ppm＝6.67(d，1H)，6.606(s，1H)，6.531(d，1H)，4.391(m，1H)，4.232(m，1H)，4.170(m，1H)，4.09(m，1H)，4.050(m，1H)，3.740(s，2H)，3.255(s，2H)，2.832(m，1H)，2.780(m，2H)，2.748(m，2H)，2.652(m，2H)，2.050(m，2H)，1.906(m，2H)，1.660(m，2H)，1.540(m，2H)，1.482(m，2H)，1.410(m，2H)，1.211(d，3H)，1.151(m，2H)，0.783(d，J＝4.5Hz，6H)。

實施例25制備(S)-3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Phe(Ib)

按照實施例24的方法從279mg(0.2mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Phe-OBzl得到4mg(2％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：969[M+H]⁺¹H-NMR(D₂O，300MHz)：δ/ppm＝7.208(s，1H)，7.184(s，1H)，7.152(s，1H)，7.115(s，1H)，7.095(s，1H)，6.700(d，J＝8.1Hz，1H)，6.606(s，1H)，6.53(d，J＝7.8Hz，1H)，4.540(m，1H)，4.501(m，1H)，4.415(m，1H)，4.239(m，1H)，4.193(m，1H)，4.107～4.072(m，2H)，3.699(s，2H)，3.261(s，2H)，3.105(m，1H)，3.033(m，1H)，2.929(m，1H)，2.817(m，2H)，2.801(m，2H)，2.671-2.656(m，2H)，2.320(m，1H)，2.050(m，2H)，1.911(m，3H)，1.660(m，1H)，1.560-1.506(m，5H)，1.406(m，2H)，1.229(d，J＝6.9Hz，3H)，1.162(m，2H)。

實施例26制備(S)-3，4-二羥基-Phe(Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Ser(Ic)

按照實施例24的方法從266mg(0.2mmol)(S)-3，4-二羥基-Phe[Boc-Pro-Ala-Lys(Boc)]-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser-OBzl得到4mg(2％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI-MS(m/e)：909[M+H]⁺¹H-NMR(D₂O，300MHz)：δ/ppm＝6.70(d，J＝9Hz，1H)，6.67(s，1H)，6.65(s，1H)，4.83(m，1H)，4.47(m，1H)，4.38(m，1H)，4.29(m，1H)，4.19-4.11(m，2H)，3.80-3.69(m，2H)，3.27(s，2H)，3.15(m，1H)，3.03(m，1H)，2.96(m，1H)，2.87(m，2H)，2.76(m，2H)，2.51(m，2H)，2.05(s，1H)，1.76～1.70(m，4H)，1.54(s，4H)，1.18(m，6H)。

實驗例1評價化合物I(a，b，c)的抗血栓活性

將雄性SD大鼠(200±20g)，隨機分組，每組10只，飼養(yǎng)1天，停止喂食過夜。灌胃給予化合物Ia-c的生理鹽水溶液(劑量為1nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10mL/kg)30min之后，大鼠用20％烏來糖的生理鹽水溶液麻醉，之后手術(shù)。分離大鼠的右頸動脈和左頸靜脈，將準(zhǔn)確稱重的絲線置于旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側(cè)動脈并注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側(cè)動脈流經(jīng)旁路插管進入左側(cè)靜脈，15min之后取出附有血栓的絲線稱量，計算血液循環(huán)前后絲線的重量，得到的血栓重以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t檢驗。數(shù)據(jù)列入表1。結(jié)果表明口服1nmol/kg化合物Ia-c能有效地抑制血栓形成。說明本發(fā)明獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表1 1nmol/kg化合物Ia-c的抗血栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01；b)與生理鹽水比p＜0.01，與阿司匹林相比p＞0.05。

實驗例2評價化合物Ia-c的溶血栓活性

SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進行麻醉。麻醉大鼠后將其仰臥位固定，分離其右頸總動脈，近心端處夾住動脈夾，將近心端及遠心端分別穿入手術(shù)線，遠心端的手術(shù)線結(jié)扎，遠心端插管，將動脈夾松 開，取出約1mL動脈血，置于1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長15mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內(nèi)注入0.1mL大鼠動脈血，隨后在管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼材質(zhì)的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長10mm，內(nèi)含15個螺圈，螺圈的直徑為1.0mm托柄與螺旋相連，長約7.0mm，呈問號型)。血液凝固45min后，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。

旁路插管由三部分構(gòu)成，中間段為長60.0mm，內(nèi)徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長100.0mm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長約10.0mm(用于插入大鼠頸動脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))，3段管的內(nèi)壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環(huán)的過程中不會漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備用。

分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠心端分別穿入手術(shù)線，結(jié)扎遠心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述制備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時遠離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋。用注射器通過另一端的尖管注入準(zhǔn)確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時注射器不要撤離聚乙烯管，用動脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動脈的近心端用動脈夾止血，結(jié)扎遠心端，在離動脈夾不遠處將右頸總動脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號手術(shù)縫線將動靜脈固定。

用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IU/kg)或化合物Ia-c的生理鹽水溶液(劑量為1nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)，扎入遠離血栓固定螺旋的近靜脈端，松開動脈夾，使血流通過旁路管道從動脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動脈的順序作用于螺旋的血栓上。血液循環(huán)1h之后，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環(huán)前后血栓的重量差，以均值±SD mg表示并代表溶血栓活性，作t檢驗。數(shù)據(jù)列入表2。結(jié)果表明1nmol/kg化合物Ia-c能有效地溶解形成的血栓。

表2 1nmol/kg化合物Ia-c的溶血栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01，與尿激酶相比p＞0.05。

實驗例3評價化合物Ia-c對缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用

在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈。用無創(chuàng)動脈夾分別夾閉頸內(nèi)動脈開口處和頸總動脈近心端，結(jié)扎頸外動脈的遠心端，在頸外動脈剪一小口，松開頸總動脈近心端的動脈夾，取10μL血，之后再用無創(chuàng)動脈夾夾閉頸總動脈的近心端。將取得的10μL血放置在1mL EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置1小時，使血液凝塊結(jié)實。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為400mg/kg。取出血液凝塊，加入1mL生理鹽水，用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細小血栓塊，制備細小血栓的懸液并轉(zhuǎn)移至1mL注射器內(nèi)。松開頸總動脈近心端的動脈夾，將1mL血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動脈向近心端經(jīng)過頸內(nèi)動脈注入大鼠的大腦，然后結(jié)扎頸外動脈近心端，打開頸內(nèi)動脈和頸總動脈處得動脈夾，恢復(fù)血流。等待蘇醒。大鼠蘇醒24小時后按Zealonga方法評定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無任何神經(jīng)功能缺失體征、1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展、2分表示向未損傷側(cè)行走、3分表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走、4分表示意識障礙無自主行走、5分表示死亡。按照得分平均分組。各組大鼠經(jīng)尾靜脈每天注射1次化合物Ia-c，劑量為1nmol/kg。連續(xù)注射6天，每天評分。結(jié)果列入表3-5。數(shù)據(jù)表明化合物Ia連續(xù)治療6天除可使3只腦缺血24小時的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分為0分外，還可將7只腦缺血24小時神經(jīng)生物學(xué)評分為2分、3分的大鼠改善為1分，將2只腦缺血24小時神經(jīng)生物學(xué)評分為4分的大鼠改善為2分。化合物Ib連續(xù)治療6天除可使3只腦缺血24小時的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分為0分外，還可將8只腦缺血24小時神經(jīng)生物學(xué)評分為2分、3分的大鼠改善為1分，將1只腦缺血24小時神經(jīng)生物學(xué)評分為4分的大鼠改善為2分。化合物Ic連續(xù)治療6天除可使8只腦缺血24小時的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分為0分外，還可將1只腦缺血24小時神經(jīng)生物學(xué)評分為3 分的大鼠改善為1分。因為不像已經(jīng)公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg，后5次維持劑量需要2μmol/kg，化合物Ia-c的6次劑量均為1nmol/kg。這樣一來，首次劑量和維持劑量分別降低了5000倍和2000倍。

表3 化合物Ia連續(xù)治療6天對腦缺血24小時大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分的影響

n＝12

表4 化合物Ib連續(xù)治療6天對腦缺血24小時大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分的影響

n＝12

表5 化合物Ic連續(xù)治療6天對腦缺血24小時大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分的影響

n＝9。