本發(fā)明涉及五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val，涉及它的制備方法，涉及它的抗血栓活性，涉及它的溶血栓活性以及涉及它治療缺血性中風(fēng)的作用，因而本發(fā)明涉及它在制備抗血栓藥物，溶血栓藥物以及缺血性中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

缺血性中風(fēng)是一類較常見且危害嚴(yán)重的腦血管疾病，特點(diǎn)是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風(fēng)面臨沒有有效藥物的現(xiàn)實(shí)，尤其中風(fēng)面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對中風(fēng)面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經(jīng)公開式I的咪唑啉化合物在中風(fēng)面24h的大鼠缺血性中風(fēng)模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa₁和aa₂可為同時(shí)存在，aa₁存在但aa₂不存在，或同時(shí)不存在；當(dāng)aa₁和aa₂同時(shí)存在時(shí)，aa₁為R(Arg)，且aa₂為G(Gly)，A(Ala)或Q(Gln)；當(dāng)aa₁存在但aa₂不存在時(shí)，aa₁為R(Arg)；aa₃可為S(Ser)，V(Val)或F(Phe)。由于式II的咪唑啉化合物的2-位是4-氧乙酰-Lys。而該Lys的側(cè)鏈氨基和主鏈羧基分別與RGD抗血栓四肽及ARPAK溶栓肽相連接，所以結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜需要簡化。

發(fā)明人經(jīng)過3年實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)用五甲氧色胺基羰丙酰基代替式I的2-(4-氧乙酰基)苯基-4，4，5，5-四甲基-1，3-二氧咪唑啉咪唑啉基取代可以獲得結(jié)構(gòu)簡單和療效好的意想不到的技術(shù)效果。按照這個(gè)發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供下式的五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val。

本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供五甲氧色胺基羰丙酰

-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的制備方法，該方法包括以下步驟：

1)制備五甲氧色胺基羰丙酸；

2)制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl；

3)制備Boc-Arg(NO₂)-Gly；

4)制備Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

5)制備HCl Asp(OBzl)-Val-OBzl；

6)制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

7)制備HCl Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

8)制備Fmoc-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

9)制備Fmoc-Lys-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

10)制備Boc-Pro-Ala-OBzl；

11)制備Boc-Pro-Ala；

12)制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；

13)制備HCl Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；

14)制備Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl；

15)制備Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)；

16)制備Fmoc-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

17)制備Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

18)將Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl與五甲氧色胺基羰丙酸反應(yīng)得五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))

-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

19)將五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl脫保護(hù)得到五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val。

本發(fā)明的內(nèi)容之三是評價(jià)五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val的抗血栓活性，溶血栓活性以及治療缺血性中風(fēng)的作用。

附圖說明

圖1.五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val(1)合成路線：(a)DCC，HOBt，NMM，THF；(b)2N NaOH，THF；(c)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；(d)哌啶/DMF(e)丁二酸酐；(f)TFA/TFMSA。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1接肽通法

將1mmol羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入1.2mmol N-羥基苯駢三氮唑(HOBt)和干燥THF溶解的1.2mmolN，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，攪拌0.5h，將1.05mmol氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，N-甲基嗎啉(NMM)調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，10/1)析純化后得到目標(biāo)化合物。

實(shí)施例2脫除N-叔丁氧羰基保護(hù)基通法

將1mmol含有N-叔丁氧羰基保護(hù)基的化合物用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入10mL 4N氯化氫/乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌1-2h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液減壓濃縮。殘留物加5ml無水乙酸乙酯，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。殘留物加5ml無水乙醚，，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。得到的目標(biāo)化合物直接用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例3水解脫除芐酯保護(hù)基通法

將含有芐酯保護(hù)基的化合物溶于甲醇，冰浴和攪拌下緩慢滴加2M NaOH水溶液，調(diào)至pH12，反應(yīng)5h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH7，減壓濃縮除去甲醇，剩余的水溶液在冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH3，乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯層用飽和NaCl水溶液洗3次，用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到目標(biāo) 化合物。

實(shí)施例4氫解脫除芐酯保護(hù)基通法

將含有芐酯保護(hù)基的化合物溶于甲醇，加入Pd/C(反應(yīng)物量的20％)，減壓抽出反應(yīng)體系內(nèi)的空氣，通入氫氣，室溫?cái)嚢?0h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去Pd/C，濾液減壓濃縮，得到目標(biāo)化合物。

實(shí)施例5制備五甲氧色胺基羰丙酸

由1.9g(10.0mmol)五甲氧色胺溶于干燥THF，冰浴攪拌下加入1.20g(12.0mmol)丁二酸酐，用NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干后得到2.81g(96.9％)標(biāo)題化合物，為淡黃色固體。ESI-MS(m/e)：289[M-H]^-。

實(shí)施例6制備Boc-Pro-Ala-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由0.84g(3.90mmol)Boc-Pro羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入0.63g(4.68mmol)HOBt和干燥THF溶解的0.96g(4.68mmol)DCC，攪拌0.5h，將1.30g(3.7mmol)HCl·Ala-OBzl氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(石油醚/丙酮，3/2)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，100/1)析純化后得到1g(72％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：377[M+H]⁺。

實(shí)施例7制備Boc-Pro-Ala

按照實(shí)施例3水解脫除芐酯保護(hù)基通法將1g(2.66mmol)Boc-Pro-Ala-OBzl溶于甲醇，冰浴和攪拌下緩慢滴加2M NaOH水溶液，調(diào)至pH12，反應(yīng)5h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH7，減壓濃縮除去甲醇，剩余的水溶液在冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH3，乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯層用飽和NaCl水溶液洗3次，用無水Na₂5O₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮，得0.7g(92％)標(biāo)題化合物，為 無色固體。ESI-MS(m/e)：285[M-H]^-。

實(shí)施例8制備Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由1.0g(3.7mmol)Boc-Pro-Ala羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入0.60g(4.44mmol)HOBt和干燥THF溶解的0.91g(4.44mmol)DCC，攪拌0.5h，將1.25g(3.10mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(石油醚/丙酮，1/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，100/1)析純化后得到1.5g(76％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：639[M+H]⁺。

實(shí)施例9制備HCl·Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實(shí)施例2脫除N-叔丁氧羰基保護(hù)基通法將1mmol 1g(1.6mmol)Boc-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入10mL 4N氯化氫/乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌1-2h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液減壓濃縮。殘留物加5ml無水乙酸乙酯，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。殘留物加5ml無水乙醚，，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。得到的目標(biāo)化合物直接用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例10制備Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由1.5g(4.60mmol)Boc-Arg(NO₂)羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入0.75g(5.5mmol)HOBt和干燥THF溶解的1.14g(5.5mmol)DCC，攪拌0.5h，將1.30g(3.7mmol)HCl·Ala-OBzl氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，20/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，20/1)析純化后得4.46g(69％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：841[M+H]⁺。

實(shí)施例11制備制備Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)：

按照實(shí)施例3水解脫除芐酯保護(hù)基通法將1g(1.19mmol)

Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于甲醇，冰浴和攪拌下緩慢滴加2M NaOH水溶液，調(diào)至pH12，反應(yīng)5h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH7，減壓濃縮除去甲醇，剩余的水溶液在冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH3，乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯層用飽和NaCl水溶液洗3次，用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到0.89g(99.7％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：749[M-H]^-。

實(shí)施例12制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由4.98g(15.5mmol)Boc-Arg(NO₂)羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入2.51g(18.6mmol)HOBt和干燥THF溶解的3.81g(18.6mmol)DCC，攪拌0.5h，將6.49g(15.0mmol)HCl·Gly-OBzl氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，15/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，60/1)析純化后得6g(87％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：467[M+H]⁺。

實(shí)施例13制備Boc-Arg(NO₂)-Gly

按照實(shí)施例3水解脫除芐酯保護(hù)基通法將lg(2.14mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-OBzl溶于甲醇，冰浴和攪拌下緩慢滴加2M NaOH水溶液，調(diào)至pH12，反應(yīng)5h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH7，減壓濃縮除去甲醇，剩余的水溶液在冰浴攪拌下緩慢滴加飽和KHSO₄水溶液調(diào)至pH3，乙酸乙酯萃取3次，合并的乙酸乙酯層用飽和NaCl水溶液洗3次，用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮，得0.797g(99％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：376[M-H]^-。

實(shí)施例14制備Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由4.5g(13.85mmol)Boc-Asp(OBzl)羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入2.24g(16.62mmol)HOBt和干燥THF溶解的3.42g(16.62mmol)DCC，攪拌0.5h，將5.0g(13.2mmol)HCl·Val-OBzl氨基端化合物溶于干燥 THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，30/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，60/1)析純化后得6g(91％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：512[M+H]⁺。

實(shí)施例15制備HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例2脫除N-叔丁氧羰基保護(hù)基通法將1g(1.95mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入10mL 4N氯化氫/乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌1-2h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液減壓濃縮。殘留物加5ml無水乙酸乙酯，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。殘留物加5ml無水乙醚，，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。得到的目標(biāo)化合物直接用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例16制備Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由5.03g(15.5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入2.51g(18.6mmol)HOBt和干燥THF溶解的3.81g(18.6mmol)DCC，攪拌0.5h，將6g(13.37mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，20/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，20/1)析純化后得7.02g(68.％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：771[M+H]⁺。

實(shí)施例17制備HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例2脫除N-叔丁氧羰基保護(hù)基通法將1g(1.30mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入10mL 4N氯化氫/乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌1-2h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液減壓濃縮。殘留物加5ml無水乙酸乙酯，溶液減壓濃縮至干。該操 作重復(fù)3次。殘留物加5ml無水乙醚，，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。得到的目標(biāo)化合物直接用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例18制備Fmoc-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由7.82g(16.68mmol)Fmoc-Lys(Boc)羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入2.71g(20.0mmol)HOBt和干燥THF溶解的4.12g(20.0mmol)DCC，攪拌0.5h，將11.796g(16.68mmol)HCl·Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CH₂Cl₂∶CH₃OH，20/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，15/1)析純化后得12.7g(68％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：1121[M+H]⁺。

實(shí)施例19制備Fmoc-Lys-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例2脫除N-叔丁氧羰基保護(hù)基通法將1g(0.89mmol)Fmoc-Lys(Boc)-Arg(NO₂)-Gly-Asp-(OBzl)-Val-OBzl用少量干燥乙酸乙酯溶解，冰浴攪拌下加入10mL 4N氯化氫/乙酸乙酯溶液，冰浴攪拌1-2h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)液減壓濃縮。殘留物加5ml無水乙酸乙酯，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。殘留物加5ml無水乙醚，，溶液減壓濃縮至干。該操作重復(fù)3次。得到的目標(biāo)化合物直接用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例20制備Fmoc-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由4.4g(5.87mmol)Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z)羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入0.95g(7.04mmol)HOBt和干燥THF溶解的1.45g(7.04mmol)DCC，攪拌0.5h，將6.2g(5.87mmol)Fmoc-Lys-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CHCl₃/CH₃OH，10/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙 酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，10/1)析純化后得7.6g(73.9％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：1754[M+H]⁺。

實(shí)施例21制備Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

將0.5g Fmoc-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl用1mL 20％哌啶/DMF溶解，反應(yīng)30分鐘，TLC(CHCl₃/CH₃OH，5∶1)。加入乙醚析出，離心，得標(biāo)題化合物，為無色固體，直接用于下一步反應(yīng)。

實(shí)施例22制備五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例1接肽通法由0.546g(1.88mmol)五甲氧色胺基羰丙酸羧基端化合物溶于干燥THF，冰浴攪拌下依次加入0.30g(2.26mmol)HOBt和干燥THF溶解的0.46g(2.26mmol)DCC，攪拌0.5h，將2.88g(1.88mmol)Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl氨基端化合物溶于干燥THF，加入上述反應(yīng)液中，NMM調(diào)至pH9，室溫?cái)嚢?h，TLC(CHCl₃∶CH₃OH，8/1)顯示羧基端原料完全消失，反應(yīng)結(jié)束。過濾除去DCU，濾液減壓濃縮后用乙酸乙酯溶解，得到的溶液依次用飽和NaHCO₃水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％KHSO₄水溶液洗3次，飽和NaCl水溶液洗3次，5％NaHCO₃水溶液洗3次和飽和NaCl水溶液洗3次。合并的乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，柱層(CHCl₃/CH₃OH，8/1)析純化后得1.60g(47.8％)標(biāo)題化合物，為無色固體。ESI-MS(m/e)：1802[M+H]⁺。

實(shí)施例23制備五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Arg-Pro-Ala-Lys)-Arg-Gly-Asp-Val(1)

冰浴下將100mg(5.54mmol)五甲氧色胺基羰丙酰-Lys(Boc-Arg(NO₂)-Pro-Ala-Lys(Z))-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Val-OBzl與1mL三氟乙酸和0.33mL三氟甲磺酸混合，攪拌40min，倒入50mL無水乙醚，沉淀析出，傾倒乙醚反復(fù)洗滌，減壓濃縮得到淡黃色固體粉末。用水溶解，氨水調(diào)pH＝8，經(jīng)Sephadex G10除鹽，用C18柱純化，收集的餾分凍干。凍干后得23mg(32％)標(biāo)題化合物，為無色固體。

mp：177.4-178.0℃；ESI-MS(m/e)：1298[M+H]⁺。

實(shí)驗(yàn)例1評價(jià)化合物1的抗栓活性試驗(yàn)

將雄性SD大鼠(200±20g)，隨機(jī)分組，每組10只，飼養(yǎng)1天，停止喂食過夜。灌胃給予化合物1的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)或阿司匹林的生理鹽水溶 液(劑量為167μmol/kg)或生理鹽水(劑量為10ml/kg)30min之后，大鼠用20％烏來糖的生理鹽水溶液麻醉，之后手術(shù)。分離大鼠的右頸動(dòng)脈和左頸靜脈，將準(zhǔn)確稱重的絲線置于旁路插管，管的一端插入左靜脈，另一端管插入右側(cè)動(dòng)脈并注射0.2mL肝素鈉抗凝。使得血流從右側(cè)動(dòng)脈流經(jīng)旁路插管進(jìn)入左側(cè)靜脈，15min之后取出附有血栓的絲線稱量，計(jì)算血液循環(huán)前后絲線的重量，得到的血栓重以均值±SD mg表示并代表抗血栓活性，作t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)列入表1。結(jié)果表明口服100nmol/kg化合物1能有效地抑制血栓形成。說明結(jié)構(gòu)簡化之后，技術(shù)效果明顯。

表1化合物1的抗栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01。

實(shí)驗(yàn)例2評價(jià)化合物1的溶血栓活性

SD大鼠(雄性，200±20g)按1200mg/kg^-1的劑量腹腔注射烏拉坦生理鹽水溶液進(jìn)行麻醉。麻醉大鼠后將其仰臥位固定，分離其右頸總動(dòng)脈，近心端處夾住動(dòng)脈夾，將近心端及遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，遠(yuǎn)心端的手術(shù)線結(jié)扎，遠(yuǎn)心端插管，將動(dòng)脈夾松開，取出約1mL動(dòng)脈血，置于1mL離心管中。往垂直固定的橡膠管(長15mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5.0mm，管底用膠塞密封，para膜封緊)內(nèi)注入0.1ml大鼠動(dòng)脈血，隨后在管內(nèi)迅速插入一支不銹鋼材質(zhì)的血栓的固定螺栓(血栓固定螺旋用直徑為0.2mm的不銹鋼絲繞成，螺旋部分長10mm，內(nèi)含15個(gè)螺圈，螺圈的直徑為1.0mm，托柄與螺旋相連，長約7.0mm，呈問號型)。血液凝固45min后，從玻璃管中小心取出被血栓包裹的血栓固定螺旋，精確稱其重量。

旁路插管由三部分構(gòu)成，中間段為長60.0mm，內(nèi)徑3.5mm的聚乙烯膠管；兩端均為長100.0mm，內(nèi)徑1.0mm，外徑2.0mm的相同的聚乙烯管，該管一端拉成尖管，長約10.0mm(用于插入大鼠頸動(dòng)脈及靜脈)，外徑為1.0mm，其另一端的外部套一段長為7.0mm，外徑為3.5mm的聚乙烯管(用于插入中段的聚乙烯膠管內(nèi))，3段管的內(nèi)壁均需要硅烷化(1％的硅油乙醚溶液)。將血栓包裹的血栓固定螺旋置于中段聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的另外兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，保證在循環(huán)的過程中不會(huì)漏血。用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)，排除氣泡，備 用。

分離大鼠的左頸外靜脈，近心端和遠(yuǎn)心端分別穿入手術(shù)線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端的血管，在暴露的左頸外靜脈上剪一小口，將上述制備好的旁路管道尖管由小口插入左頸外靜脈開口處，同時(shí)遠(yuǎn)離旁路管中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)內(nèi)血栓固定螺旋。用注射器通過另一端的尖管注入準(zhǔn)確量的肝素鈉的生理鹽水溶液(50IU/kg)，此時(shí)注射器不要撤離聚乙烯管，用動(dòng)脈夾夾住注射器與聚乙烯管之間的軟管。在右頸總動(dòng)脈的近心端用動(dòng)脈夾止血，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，在離動(dòng)脈夾不遠(yuǎn)處將右頸總動(dòng)脈剪一小口，從聚乙烯管的尖部拔出注射器，將聚乙烯管的尖部插入動(dòng)脈斜口的近心端。旁路管道的兩端均用4號手術(shù)縫線將動(dòng)靜脈固定。

用頭皮針將生理鹽水(3ml/kg)或尿激酶的生理鹽水溶液(劑量為20000IU/kg)或化合物1的生理鹽水溶液(劑量為100nmol/kg)通過旁路管的中段(含精確稱量的血栓固定螺旋)，扎入遠(yuǎn)離血栓固定螺旋的近靜脈端，松開動(dòng)脈夾，使血流通過旁路管道從動(dòng)脈流向靜脈。將注射器中的溶液緩慢注入血液，通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動(dòng)脈的順序作用于螺旋的血栓上。血液循環(huán)1h之后，從旁路管道中取出固定血栓的螺旋，精確稱量。計(jì)算每只大鼠旁路管道中固定血栓的螺旋血液循環(huán)前后血栓的重量差，以均值±SD mg表示并代表溶血栓活性，作t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)列入表3。結(jié)果表明100nmol/kg化合物1能有效地溶解形成的血栓。說明結(jié)構(gòu)簡化之后，技術(shù)效果明顯。

表2化合物1的溶栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01。

實(shí)驗(yàn)例3評價(jià)化合物1對缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用

在雄性SD大鼠(體重300±20g)的頸部正中部豎直開約2cm長切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。用無創(chuàng)動(dòng)脈夾分別夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈開口處和頸總動(dòng)脈近心端，結(jié)扎頸外動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端，在頸外動(dòng)脈剪一小口，松開頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾，取10μl血，之后再用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈的近心端。將取得的10μl血放置在1ml EP管中常溫放置30分鐘使血液凝固，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱 中放置1小時(shí)，使血液凝塊結(jié)實(shí)。大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，劑量為400mg/kg。取出血液凝塊，加入1ml生理鹽水，用鋼鏟把血液凝塊搗成大小均一的細(xì)小血栓塊，制備細(xì)小血栓的懸液并轉(zhuǎn)移至1ml注射器內(nèi)。松開頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾，將1ml血栓混懸液緩慢從大鼠頸外動(dòng)脈向近心端經(jīng)過頸內(nèi)動(dòng)脈注入大鼠的大腦，然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，打開頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈處得動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流。等待蘇醒。大鼠蘇醒24小時(shí)后按Zealonga方法評定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無任何神經(jīng)功能缺失體征、1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展、2分表示向未損傷側(cè)行走、3分表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走、4分表示意識障礙無自主行走、5分表示死亡。按照得分平均分組。各組大鼠經(jīng)尾靜脈每天注射1次化合物1，劑量為100nmol/kg。連續(xù)注射6天，每天評分。結(jié)果列入表3。數(shù)據(jù)表明化合物1連續(xù)治療6天可使7只腦缺血24小時(shí)的大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分全部為1分。因?yàn)椴幌褚呀?jīng)公開的化合物首次劑量需要5μmol/kg，后5次維持劑量需要2μmol/kg，化合物1的6次劑量均為100nmol/kg。這樣一來，首次劑量和維持劑量分別降低了50倍和20倍。加上結(jié)構(gòu)簡化的好處，本發(fā)明獲得了意想不到的技術(shù)效果。

表3化合物1連續(xù)治療6天對腦缺血24小時(shí)大鼠神經(jīng)生物學(xué)評分的影響

n＝8。