一種含胞嘧啶pna單體的公斤級制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含胞嘧啶PNA單體的公斤級制備方法，包括以下步驟：乙二胺與氯乙酸反應(yīng)，用DMSO重結(jié)晶得到N-(2-氨乙基)甘氨酸；以N-(2-氨乙基)甘氨酸為反應(yīng)物，加入原料，反應(yīng)得N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽作為中間體1；以胞嘧啶為反應(yīng)物，加入原料，反應(yīng)得胞嘧啶乙酸乙酯；以胞嘧啶乙酸乙酯和羰基二咪唑?yàn)榉磻?yīng)物，加入原料，反應(yīng)得4-N-(二苯甲氧羰基)胞嘧啶-乙酸；以4-N-(二苯甲氧羰基)胞嘧啶乙酸為反應(yīng)物，加入原料，得到產(chǎn)物。本發(fā)明操作簡單，反應(yīng)條件溫和，屬于大規(guī)模生產(chǎn)工藝，為PNA的大規(guī)模研究做好物質(zhì)準(zhǔn)備，為以后的大規(guī)模應(yīng)用做好工藝準(zhǔn)備。
【專利說明】一種含胞嘧啶PNA單體的公斤級制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥科技領(lǐng)域，具體涉及的是一種含胞嘧啶PNA單體的公斤級制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]寡核苷酸在治療用藥物、分子生物學(xué)研究工具及診斷試劑上應(yīng)用廣泛。寡核苷酸應(yīng)用的主要制約在于它容易被核酸酶所降解、雜交后熱穩(wěn)定性差以及會與蛋白等非特異性結(jié)合等。為改造寡核苷酸的理化和生物學(xué)特性，許多寡核苷酸類似物被研究出來。肽核酸是寡核苷酸模擬物中的較為重要的一種。1991年Nielsen等報(bào)道了用N-(2-氨基乙基)甘氨酸骨架代替糖-磷酸酯骨架作為重復(fù)結(jié)構(gòu)單元，合成了以肽鍵連接的寡核苷酸模擬物，稱為肽核酸(Pept ide nucleic acid,PNA)。盡管PNA在結(jié)構(gòu)上相對寡核苷酸有了顯著的改變，但PNA與互補(bǔ)核酸之間的結(jié)合仍遵循堿基互補(bǔ)配對原則，甚至比天然核苷酸具有更高的親和性，有較強(qiáng)的抗核酸酶和蛋白水解酶降解的能力。科研人員設(shè)計(jì)合成了各種結(jié)構(gòu)的PNA，以優(yōu)化其生物學(xué)穩(wěn)定性和利用度、靶結(jié)合特性以及藥代動力學(xué)特性，并將PNA應(yīng)用于診斷和治療等方面，從而開創(chuàng)了一個(gè)新的研究領(lǐng)域。
[0003]各種各樣的構(gòu)建模塊被用于合成PNA及其類似物，包括骨架結(jié)構(gòu)、在N- (2-氨基乙基)甘氨酸上連接手性和非手性的基團(tuán)、堿基的類型等。經(jīng)典的PNA的骨架單體是N-(2-氨基乙基)甘氨酸，在甘氨酸的氮上連接堿基的衍生物。通常先合成端基N有保護(hù)基的氨基乙基甘氨酸酯，然后再將堿基衍生物連在未受保護(hù)的氮上。常用的方法有:烷基化反應(yīng)、席夫堿的還原反應(yīng)、Mitsunobu反應(yīng)。
[0004]四種堿基都是經(jīng)胺 的烷基化反應(yīng)形成堿基乙酸衍生物，再采用通常的多肽合成的方法，聯(lián)結(jié)堿基乙酸和骨架上的未受保護(hù)的氮。胸腺嘧啶的烷基化反應(yīng)通常不需要使用保護(hù)基團(tuán)，因此當(dāng)與溴乙酸酯反應(yīng)再經(jīng)皂化或直接與溴乙酸反應(yīng)即可得胸腺嘧啶乙酸。其余三種堿基上都有活潑基團(tuán)，需先加以保護(hù)。胞嘧啶上的活潑基團(tuán)為4位上的氨基，可選擇的保護(hù)基有:節(jié)氧羰基(benzyloxycarbonyl, Cbz)、對叔丁基苯甲?；?4-tert-butylbenzoyl,4-t_BuBz)、苯甲酸基(benzoyl, Bz)以及 Mmt 等，再與溴乙酸酯進(jìn)行烷基化反應(yīng)，然后皂化即得胞嘧啶乙酸的衍生物。腺嘌呤的保護(hù)過程與胞嘧啶基本相同，可用的保護(hù)基有Cbz, Mmt,對甲氧基苯基(ani soly, An)。鳥嘌呤的保護(hù)比較復(fù)雜,需要在N9的烷基化的過程中避免N7烷基化的副反應(yīng)干擾。一種常用的方法是在烷基化中用2-氨基-6-氯嘌呤，烷基化后再在酸性或堿性條件下回流，將氯水解轉(zhuǎn)化為羰基，或是直接烷基化N2連有保護(hù)基的腺嘌呤，色譜分離N7 / N9兩種烷基化產(chǎn)物，然后皂化得鳥嘌呤乙酸的衍生物。
[0005]目前國內(nèi)已經(jīng)有部分公司可以定制合成PNA系列產(chǎn)品，但是他們的合成規(guī)模很小，一般在毫克級別，這種局面大大制約了 PNA這種化合物的應(yīng)用以及研究工作。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的以上問題，提供一種公斤級合成含胞嘧啶PNA單體的方法，不通過柱層析的方法，大量生產(chǎn)高純度的含胞嘧啶的PNA單體。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種含胞嘧啶PNA單體的公斤級制備方法，包括以下步驟:
[0009]步驟I)乙二胺與一氯乙酸發(fā)生氮烷基化反應(yīng)，過夜反應(yīng)，得到N-(2_氨乙基)甘氨酸；
[0010]步驟2)以N-(2-氨乙基)甘氨酸為原料加入二氯甲烷和DMF的混合溶劑，室溫下先加入三甲基氯硅烷，反應(yīng)40分鐘，然后降溫至0-5度加入Fmoc-OSu，在5度下滴加NMM，保溫反應(yīng)，至原料反應(yīng)完全，得到N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸；
[0011]步驟3)以N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸為原料，加入甲醇，氯化亞砜加熱回流至原料反應(yīng)完全，得到N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽；
[0012]步驟4)以胞嘧啶為原料，DMF為溶劑先低溫下先加入鈉氫反應(yīng)一段時(shí)間后加入溴乙酸乙酯，室溫反應(yīng)過夜，原料反應(yīng)完全后處理得到胞嘧啶乙酸乙酯；
[0013]步驟5)以胞嘧啶乙酸乙酯為原料，DMF為溶劑，室溫下加入⑶I，待原料全部轉(zhuǎn)化成態(tài)后分批加入二苯甲醇升溫反應(yīng)，至反應(yīng)完全，得到2-[N’ 4-( 二苯甲氧羰基)-1’ -胞嘧啶]-乙酸乙酯；
[0014]步驟6)以2_[N’ 4_( 二苯甲氧羰基)_1’ -胞嘧啶]-乙酸乙酯為原料，在乙腈，水，甲醇的混合溶劑中加入氫氧化鋰水溶液在一定溫度下水解得到2-[N’ 4-( 二苯甲氧羰基)_1’ -胞嘧啶]_乙酸；
[0015]步驟7)以2-[N’4_( 二苯甲氧羰基)-1’-胞嘧啶]-乙酸和N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽為原料在DMF溶劑中加入HBTU，低溫下滴加NMM反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液加入到水中，析出固體，減壓干燥后，用乙腈重結(jié)晶得到Fmoc-PNA-C (Bhoc) -OMe ；
[0016]步驟8)以Fmoc-PNA-C(Bhoc)-OMe為原料，在丙酮與水的混合溶劑，_5度-O度低溫下加入氫氧化鋰水溶液，水解，反應(yīng)完全后用檸檬酸水溶液中和冷卻析晶，過濾，粗品水洗，在用二氯甲烷打漿得到產(chǎn)品Fmoc-PNA-C(Bhoc)-OH ；
[0017]步驟1、2、3的反應(yīng)公式為:
[0018]
【權(quán)利要求】
1.一種含胞嘧啶PNA單體的公斤級制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)乙二胺與一氯乙酸發(fā)生氮烷基化反應(yīng)，過夜反應(yīng)，得到N-(2-氨乙基)甘氨酸；步驟2)以N-(2-氨乙基)甘氨酸為原料加入二氯甲烷和DMF的混合溶劑，室溫下先加入三甲基氯硅烷，反應(yīng)40分鐘，然后降溫至0-5度加入Fmoc-OSu，在5度下滴加NMM，保溫反應(yīng)，得到N-(2_Fmoc-氨乙基)甘氨酸； 步驟3)以N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸為原料，加入甲醇，氯化亞砜加熱回流，得到N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽； 步驟4)以胞嘧啶為原料，DMF為溶劑先低溫下先加入鈉氫反應(yīng)一段時(shí)間后加入溴乙酸乙酯，室溫反應(yīng)過夜，原料反應(yīng)完全后處理得到胞嘧啶乙酸乙酯； 步驟5)以胞嘧啶乙酸乙酯為原料，DMF為溶劑，室溫下加入⑶I，待原料全部轉(zhuǎn)化成態(tài)后加入二苯甲醇升溫反應(yīng)，至反應(yīng)完全，得到2-[N’ 4-( 二苯甲氧羰基)-1’ -胞嘧啶]-乙酸乙酯； 步驟6)以2-[N’ 4_( 二苯甲氧擬基)-1’ _胞嘧唳]-乙酸乙酯為原料，在乙臆，水，甲醇的混合溶劑中加入氫氧化鋰水溶液在一定溫度下水解得到2-[N’ 4-( 二苯甲氧羰基)_1’ -胞嘧啶]_乙酸； 步驟7)以2-[N’ 4_( 二苯甲氧羰基)_1’ -胞嘧啶]_乙酸和N-(2-Fmoc-氨乙基)甘氨酸甲酯鹽酸鹽為原料在DMF溶劑中加入HBTU，低溫下滴加NMM反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液加入到水中，析出固體，減壓干燥后，用乙腈重結(jié)晶得到Fmoc-PNA-C(Bhoc)-OMe ； 步驟8)以Fmoc-PNA-C (Bhoc) -OMe為原料，在丙酮與水的混合溶劑，_5度-O度低溫下加入氫氧化鋰水溶液，水解，反應(yīng)完全后用檸檬酸水溶液中和冷卻析晶，過濾，粗品水洗，在用二氯甲烷打漿得到產(chǎn)品Fmoc-PNA-C(Bhoc)-OH ； 步驟1、2、3的反應(yīng)公式為:
【文檔編號】C07D239/47GK103524426SQ201310480049
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】喻國貞, 吳紹偉, 劉金永, 凌靜 申請人:蘇州維泰生物技術(shù)有限公司