本發(fā)明涉及下式(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Ala-Lys，涉及它的制備方法，涉及它治療缺血性中風(fēng)的作用，因而本發(fā)明涉及它在制備缺血性中風(fēng)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
缺血性中風(fēng)是一類較常見且危害嚴(yán)重的腦血管疾病，特點(diǎn)是發(fā)病率高、病死率高、致殘率高和復(fù)發(fā)率高。目前臨床治療缺血性中風(fēng)面臨沒(méi)有有效藥物的現(xiàn)實(shí)，尤其中風(fēng)面4h以上的患者非死即殘。發(fā)明對(duì)中風(fēng)面4h以上的患者有效的藥物是臨床的重要需求。發(fā)明人曾經(jīng)公開式II的咪唑啉化合物在中風(fēng)面24h的大鼠缺血性中風(fēng)模型上，顯示優(yōu)秀療效。即連續(xù)靜脈注射6天式II的咪唑啉化合物，每天1次，首次劑量為5μmol/kg，后5次的劑量為2μmol/kg具有優(yōu)秀療效。式中aa1和aa2可為同時(shí)存在，aa1存在但aa2不存在，或同時(shí)不存在；當(dāng)aa1和aa2同時(shí)存在時(shí)，aa1為R(Arg)，且aa2為G(Gly)，A(Ala)或Q(Gln)；當(dāng)aa1存在但aa2不存在時(shí)，aa1為R(Arg)；aa3可為S(Ser)，V(Val)或F(Phe)。由于式II的取代咪唑啉結(jié)構(gòu)單元比較復(fù)雜需要簡(jiǎn)化。
發(fā)明人在經(jīng)過(guò)3年實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)用4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲?；媸絀I的取代咪唑啉結(jié)構(gòu)單元可以獲得結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和療效好意想不到的雙重技術(shù)效果。按照這個(gè)發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供下式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰 -Lys-Ala-Lys。
本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供上式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Ala-Lys的合成方法，該方法包括：
(1)在DCC和HOBt存在下Boc-Ala在無(wú)水THF中與Lys(Z)-OBzl縮合為Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl；
(2)在氯化氫-乙酸乙酯溶液中Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl脫去Boc保護(hù)基生成Ala-Lys(Z)-OBzl；
(3)在稀硫酸存在下，甲醛與L-組氨酸在60℃下反應(yīng)，生成(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-羧酸；
(4)在DCC和HOBt存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸在無(wú)水四氫呋喃中與Lys(Boc)-OBzl縮合為(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl。
(5)在Pd/C存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl在甲醇溶液中脫去OBzl生成(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)；
(6)在DCC和HOBt存在下(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)在無(wú)水四氫呋喃中與HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl縮合為(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-Ala-Lys(Z)-OBzl。
(7)將步驟(6)所制備的化合物脫去保護(hù)基，得到上式所示的化合物。
其中所述HOBt是N-羥基苯并三氮唑的縮略術(shù)語(yǔ)，DCC是二環(huán)己基羰二亞胺的縮略術(shù)語(yǔ)，Boc為叔丁氧羰基的縮略術(shù)語(yǔ)，Pd/C為鈀/碳。
本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)上式的(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Ala-Lys治療缺血性中風(fēng)的活性。
附圖說(shuō)明
圖1(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys-Ala-Lys的合成路線
(i)H2SO4，HCHO，60℃；(ii)1N NaOH，(Boc)2O；(iii)DCC，HOBt，NMM；(iv)H2，Pd/C；(v)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；(vi)TFA/TFSA。
具體實(shí)施方式
為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅 用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1制備(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(1)
將10g(64.5mmol)L-His用80mL蒸餾水和20mL甲醛混合溶液溶解，然后往里滴加1mL濃H2SO4，60℃微波反應(yīng)5小時(shí)，冷卻到室溫，往反應(yīng)化合物中冰浴下滴加濃氨水調(diào)pH至7，有大量沉淀析出。過(guò)濾，得10.5g(97％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z)167[M+H]+。
實(shí)施例2制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)
冰浴下將1.67g(10mmol)(6s)-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸溶于5mL 2N氫氧化鈉水溶液。往該反應(yīng)液中加5.23g(24mmol)(Boc)2O與10mL二氧六環(huán)的溶液。室溫?cái)嚢?，TLC(CH2Cl2∶MeOH＝15∶1)監(jiān)控反應(yīng)原料點(diǎn)消失。反應(yīng)完成后，過(guò)濾，濾液減壓濃縮除去二氧六環(huán)。殘留的水層用飽和KHSO4水溶液酸化至pH值至2，用乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯層，并用少量水反洗，乙酸乙酯層用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾，減壓濃縮得到的淡黃色固體用乙酸乙酯浸泡磨洗，過(guò)濾，得1.55g(42％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z)367[M+H]+。
實(shí)施例3制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-Lys(Boc)-OBzl(3)
冰浴和攪拌下3.67g(10.0mmol)(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸，1.48g(11.0mmol)HOBt和2.47g(12.0mmol)DCC加50ml無(wú)水THF溶解，反應(yīng)液活化30分鐘。然后將3.91g(10.5mmol)Tos·Lys(Boc)-OBzl與50mL無(wú)水THF并用1.0mL NMM調(diào)節(jié)pH至9的懸浮液滴加到活化的反應(yīng)液中。撤去冰浴，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，濾除二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮至干，殘留物用乙酸乙酯溶解，再濾除DCU。濾液層依次用飽和NaHCO3溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，飽和KHSO4溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，飽和NaHCO3溶液洗3次，飽和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯層用無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾、濾液減壓濃縮，殘留物經(jīng)柱層析(石油醚/丙酮體系8∶1-2∶1)純化得3.97g(58％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體，ESI-MS(m/z)686[M+H]+。
實(shí)施例4制備(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)(4)
稱取200mg(0.29mmol)(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)-OBzl于50mL茄形瓶中，用10mL甲醇溶解后，加入20mg Pd/C，先用真空水泵抽走反應(yīng)瓶中的空氣，然后通入氫氣，如此反復(fù)三次，最后保持通氫氣狀態(tài)反應(yīng)12小時(shí)，利用TLC(石油醚∶丙酮＝3∶1)監(jiān)測(cè)至原料斑點(diǎn)消失后，減壓過(guò)濾，將濾液減壓濃縮至干得160mg(92％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體，ESI/MS(m/e)：596[M+H]+。
實(shí)施例5制備Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl
采用實(shí)施例3的方法從473mg(2.5mmol)Boc-Ala和936mg(2.3mmol)HCl·Lys(Z)-OBzl。反應(yīng)混合物按常規(guī)處理得1.204g(89％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z)565[M+Na]+。
實(shí)施例6制備HCl·Ala-Lys(Z)-OBzl
將1.354g(2.5mmol)Boc-Ala-Lys(Z)-OBzl溶于約10mL無(wú)水氯化氫-乙酸乙酯溶液(4N)，冰浴攪拌3小時(shí)，TLC(CH2Cl2∶MeOH＝10∶1)顯示原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合液在室溫下減壓濃縮，殘留物再用乙酸乙酯溶解并室溫下濃縮，如此反復(fù)數(shù)次，直至除凈游離的氯化氫。殘留物用無(wú)水乙醚析晶，得1.181g(99％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體，直接用于下步反應(yīng)。
ESI-MS(m/e)443[M+H]+。
實(shí)施例7制備3，5-二-N-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-?；?Lys(Boc)-Ala-Lys(Z)-OBzl(5)
采用實(shí)施例3的方法從819mg(1.38mmol)(6s)-3，5-二-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-甲酰-L-Lys(Boc)和689mg(1.44mmol)HCl.Ala-Lys(Z)-OBzl，純化得631mg(45％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/e)：1019[M+H]+；1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.06(s，1H)，7.39-7.28(m，9H)，5.10(s，2H)，5.00(s，2H)，4.80(m，1H)，4.44(m，1H)，4.27-4.20(m，2H)，2.99-2.84(m，5H)，1.69(m，1H)，1.57(s，9H)，1.44(s，9H)，1.37(s，9H)，1.24-1.07(m，7H).
實(shí)施例8制備4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-?；?Lys-Ala-Lys(6)
冰浴下向100mg(0.098mmol)3，5-二-N-Boc-4，5，6，7-四氫-3H-咪唑[4，5-c]并吡啶-6-酰基-Lys(Boc)-Ala-Lys(Z)-OBzl中加3mL TFA和1mL TFMSA，攪拌30min后，TLC(CH2Cl2∶MeOH＝1∶1)顯示原料點(diǎn)消失，停止反應(yīng)。反應(yīng)物用無(wú)水乙醚反復(fù)洗滌，減壓濃縮至干，殘留物用水溶解，用氨水調(diào)pH值至8。得到的溶液先用Sephadex G10除鹽，然后用制備柱T3Prep OBDTM5μm 30×150mm純化。相應(yīng)的餾分凍干得12mg(25％)標(biāo)題化合物，為白色固體。ESI-MS(m/e)：495[M+H]+；1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.671(m，1H)，8.536(m，1H)，8.127(m，1H)，8.099(m，1H)，7.793-7.766(m，5H)，4.356-4.322(m，3H)，4.308-4.231(m，2H)，4.127(m，1H)，3.311(m，1H)，2.808-2.711(m，5H)，1.738-1.685(m，2H)，1.611-1.520(m，6H)，1.350-1.335(m，4H)，1.249-1.225(m，3H)。
實(shí)驗(yàn)例1評(píng)價(jià)化合物6對(duì)缺血性中風(fēng)大鼠的治療作用
評(píng)價(jià)方法：SD雄性大鼠(280-300g)用10％水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，從頸部正中略偏右部豎直開約2cm長(zhǎng)切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)緣分離出右頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾分別夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈開口處和頸總動(dòng)脈近心端，在頸外動(dòng)脈剪一小口，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，松開頸總動(dòng)脈近心端的動(dòng)脈夾，取10μL血，取血之后再用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端。將取得的10μL血裝入1mLEP管中，先在常溫下放置30分鐘使血液凝固，然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中放置1小時(shí)，使血液凝塊結(jié)實(shí)。1小時(shí)后取出血液凝塊，加入1mL生理鹽水用鋼鏟把血液凝塊搗成大小比較均一的細(xì)小血栓，然后把細(xì)小血栓混懸液轉(zhuǎn)移至1mL注射器內(nèi)備用。松開大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈夾的同時(shí)，將上述1mL注射器內(nèi)的血栓混 懸液緩慢從大鼠頸外動(dòng)脈向近心端經(jīng)過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈注入大鼠的大腦，然后結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端，打開頸內(nèi)動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈處得動(dòng)脈夾，恢復(fù)血流。然后分離大鼠頸總靜脈，注入治療藥物，結(jié)扎靜脈，傷口處滴加3滴青霉素(40mg/10mL)，縫合傷口，等待動(dòng)物蘇醒。供試化合物的劑量為1nmol/kg(溶于生理鹽水)。大鼠蘇醒24小時(shí)后按Zealonga方法(Wen Wang，Jingdong Xu，Lei Li，Peichang Wang，Xunming Ji，Houxi Ai，Li Zhang，Lin Li，Neuroprotective effect of morroniside on focal cerebral ischemia in rats.Brain Research Bulletin，2010，83，196-201)評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度。0分表示無(wú)任何神經(jīng)功能缺失體征，1分表示未損傷側(cè)前肢不能伸展，2分表示向未損傷側(cè)行走，3分表示向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈成追尾狀行走，4分表示意識(shí)障礙無(wú)自主行走，5分表示死亡。將以上各組評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，并作t檢驗(yàn)。
大鼠蘇醒24小時(shí)Zealonga方法評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度后，用烏拉坦麻醉后迅速斷頭取腦，將腦組織置于-20℃冰箱2小時(shí)后，從前額極開始行約2mm冠狀連續(xù)切片，共6片，然后置于2％TTC溶液中37℃避光孵育30min，并觀察腦切片的顏色變化，正常組織被TTC染成紅色，而缺血組織呈白色。然后用數(shù)碼相機(jī)照相，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)算冠狀切片中梗死體積和正常組織的面積，統(tǒng)計(jì)各組的梗死體積百分比值，并做t檢驗(yàn)。
大鼠蘇醒后24小時(shí)，按Zealonga方法評(píng)定神經(jīng)功能缺損程度，評(píng)分結(jié)果列入表1，大鼠腦梗死體積百分比如下表2。結(jié)果表明1nmol/kg化合物6能有效地保護(hù)中風(fēng)大鼠的腦神經(jīng)。因?yàn)椴幌褚呀?jīng)公開的化合物需要5μmol/kg劑量，化合物6的劑量為1nmol/kg。這樣一來(lái)，1次劑量降低了5000倍。獲得了意想不到的技術(shù)效果。
表1 1nmol/kg化合物6治療大鼠蘇醒24h后評(píng)分
n＝10；a)與生理鹽水組比較p＜0.01。
表2 1nmol/kg化合物6治療大鼠大腦梗死體積百分比
n＝10；a)與生理鹽水組比p＜0.01，與t-PA比p＞0.05。