本發(fā)明涉及多肽技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有降尿酸活性的多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改善，國內(nèi)外痛風(fēng)的患病率逐年增長，且有年輕化的趨勢。高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，主要是指長期嘌呤代謝紊亂，致使尿酸產(chǎn)生過多或尿酸排泄過少而引起的一種疾病。越來越多的研究表明，高尿酸血癥已經(jīng)不是一個單純的尿酸含量超標(biāo)的病癥，它與多種心腦血管疾病及腎臟疾病緊密相關(guān)，除此之外，與Ⅱ型糖尿病及胰島素抵抗綜合征的關(guān)系也密不可分。

目前，治療高尿酸血癥主要有降低尿酸生成、促進(jìn)尿酸排泄和促進(jìn)尿酸分解等方法。降低尿酸生成的藥物主要包括黃嘌呤氧化酶(XO)抑制劑：別嘌呤醇(Allopurinol)，非布索坦(Febuxostat)，托匹司他(Topiroxostat)等；促進(jìn)尿酸排泄的藥物：丙磺舒(Probenecid)，苯溴馬隆(Benzbromarone)等；促進(jìn)尿酸分解的藥物：拉布立酶((ELITEK,Rasburicase),聚乙二醇尿酸酶(PEG-uricase)等。這些藥物對人體臟器具有一定的毒副作用，易引起嚴(yán)重的過敏及炎癥反應(yīng)，且價格昂貴。因此，開發(fā)一種高效安全的活性物質(zhì)用于高尿酸血癥的預(yù)防及治療具有一定的經(jīng)濟(jì)及社會意義。

黃嘌呤氧化酶是目前研究高尿酸血癥的重要靶點(diǎn)。有研究報道，中草藥制劑可用于治療高尿酸血癥，對其功效成分進(jìn)行分離提純，發(fā)現(xiàn)一些多酚黃酮類物質(zhì)能有效抑制黃嘌呤氧化酶的活性。張珞研究了鼠尾藻各組分對黃嘌呤氧化酶的作用，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯組分對XO無抑制作用，其水溶性組分對XO具有反競爭性抑制作用，抑制常數(shù)為Ki＝0.11mg/ml，IC50＝0.42mg/mL。王曉從核桃殼提取物中分離得到的對香豆醛、β-D-胡蘿卜苷、對羥基苯甲醛和氫化胡桃醌等對黃嘌呤氧化酶具有較高的抑制活性，以166mg/kg核桃殼提取物的劑量灌胃大鼠30d，在30d時提取物組大鼠的血尿酸含量降低到模型組的76.41％，同時大鼠血清中的尿素氮和肌酐含量顯著降低，說明核桃殼提取物具有體內(nèi)降尿酸活性和腎臟保護(hù)作用。但是該多酚黃酮類物質(zhì)的提取得率低，且成本較高，其安全性有待考證。

據(jù)報道，生物活性肽具有抗病毒、抗腫瘤、降血壓、降血糖、抗真菌、抗氧化、抗衰老等生理功能，較蛋白和氨基酸更易被人體吸收，且無毒副作用，可用于醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。目前，對于具有降尿酸活性的生物活性肽的研究尚處于萌芽階段。專利公開號為CN101417119的專利涉及一種用于快速降低個體血液中的尿酸含量的醫(yī)藥組合物，其有效物質(zhì)為鵝肌肽，主要通過調(diào)節(jié)生理pH值及清除體內(nèi)乳酸的含量從而促進(jìn)尿酸的排泄，達(dá)到降低血液中尿酸含量的目的。AliceB.Nongonierma等人研究發(fā)現(xiàn)，Trp及含Trp的二肽(Arg-Trp，Trp-Val，Val-Trp，Lys-Trp和Ile-Trp)能夠抑制黃嘌呤氧化酶的活性。通過雙倒數(shù)作圖及分子對接模擬對其抑制機(jī)理進(jìn)行分析得知，Trp及含Trp的二肽能和XO的至少6個疏水性氨基酸殘基發(fā)生相互作用，占據(jù)其疏水通道，并未阻礙底物黃嘌呤進(jìn)入XO的活性中心，屬于非競爭性抑制劑。

然而，三肽用于降低體外或體內(nèi)尿酸含量相關(guān)的文獻(xiàn)尚未見報道。本發(fā)明提供了一種體外檢測降尿酸活性的方法并對Tyr-Glu-Gly的降尿酸功效及機(jī)理進(jìn)行了研究，對于開發(fā)具有以降尿酸肽為功能因子的保健食品及藥品具有重要的指導(dǎo)意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有降尿酸功效的生物活性肽，可用于開發(fā)具有預(yù)防或治療痛風(fēng)類疾病功效的保健品及藥品。

一種具有降尿酸活性的多肽，氨基酸序列為：Tyr-Glu-Gly(YEG)。

進(jìn)一步地，所述Tyr為酪氨酸的氨基酸殘基，所述Glu為谷氨酸的氨基酸殘基，所述Gly為甘氨酸的氨基酸殘基。

進(jìn)一步地，所述的氨基酸序列采用已有的成熟技術(shù)，通過樹脂的篩選，獲取合理的多肽合成方法：采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，選用Wang樹脂進(jìn)行固相合成。

進(jìn)一步地，所述多肽在體外降尿酸活性檢測中表現(xiàn)出抑制黃嘌呤氧化酶(XO)的活性。

進(jìn)一步地，本發(fā)明采用了HPLC法檢測Tyr-Glu-Gly(YEG)的體外降尿酸活性，分子對接結(jié)果顯示：Tyr-Glu-Gly與XO產(chǎn)生的相互作用主要由疏水作用及氫鍵作用主導(dǎo)。

進(jìn)一步地，所述多肽對黃嘌呤氧化酶抑制的IC50值為13.43±0.73mg/ml，即36.59±2.00mmol/L。

所述多肽用作包括痛風(fēng)疾病的輔助治療藥物或者用于開發(fā)具有以降尿酸為功能因子的保健食品及藥品。

附圖說明

圖1為各實施例生成尿酸含量的色譜圖；

圖2為Tyr-Glu-Gly對XO的抑制曲線。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

固相合成多肽：

1、樹脂選型

采用標(biāo)準(zhǔn)Fomc方案，選用0.0125mmol,2-chlorotritylchlorideresin樹脂(天津市南開合成科技有限公司)，按照氨基酸序列Tyr-Glu-Gly的序列特征，加入0.3mol第一個9-芴甲氧羰基(Fmoc)保護(hù)氨基酸，將N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和5wt％4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入到反應(yīng)器振蕩反應(yīng)，用N-甲基吡咯烷酮(NMP)沖洗樹脂除去多余保護(hù)氨基酸。測定第一個氨基酸與樹脂的連接效率即偶合率，偶合率如表所示。

采用標(biāo)準(zhǔn)Fomc方案，選用Wang樹脂，按照氨基酸序列Tyr-Glu-Gly的序列特征，加入0.3mol第一個Fmoc保護(hù)氨基酸，將DCC和5wt％DMAP加入到反應(yīng)器振蕩反應(yīng)，用NMP沖洗樹脂除去多余保護(hù)氨基酸。測定第一個氨基酸與樹脂的連接效率即偶合率，偶合率如表所示。

表1第一個氨基酸與樹脂的偶合率

2、合成過程

采用標(biāo)準(zhǔn)Fomc方案，選用偶合率較高的樹脂，按照氨基酸序列Tyr-Glu-Gly的序列特征，使肽鏈從C端逐個向N端延伸，各氨基酸的用量為0.1mol，加入0.3mol Fmoc保護(hù)氨基酸，每步縮合都加入1-羥基苯并三氮唑(HOBT)活化保護(hù)氨基酸的羧基，每步縮合采用20％哌啶/二甲基甲酰胺(DMF)溶液(15ml/g)，處理20min，去除Fmoc保護(hù)基。肽側(cè)鏈合成后，將含有樹脂的肽鏈加入到如下反應(yīng)液中：二氯甲烷(99％)三氟乙酸(1％)(體積分?jǐn)?shù))，將肽鏈從樹脂上切割下來。再次將多肽加入到反應(yīng)液：三氟乙酸(94.5％)、酒石酸乙二胺(2.5％)、蒸餾水(2％)、TIS(1％)(體積分?jǐn)?shù))中反應(yīng)2h，脫去側(cè)鏈保護(hù)基。以上過程均在SYMPHONY型12通道多肽合成儀中完成，所合成的多肽經(jīng)SHIMADZU高效液相色譜儀純化，純度達(dá)到95％以上，并經(jīng)ESI-MS鑒定結(jié)構(gòu)。

反相高效液相色譜法(RP-HPLC法)測定尿酸含量的方法如下：

(1)實驗樣品及試劑制備

50mmol/L(pH8.0)Tris-HCl緩沖液：準(zhǔn)確稱取6.0572g Tris，用超純水溶解，以1mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至1000mL，備用。

Tyr-Glu-Gly梯度溶液：準(zhǔn)確稱取20mg Tyr-Glu-Gly，用pH8.0的Tris-HCl緩沖液配成20mg/ml溶液，分別稀釋配制成10、12、14、16、18mg/ml的Tyr-Glu-Gly溶液，備用。

黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.0307g黃嘌呤，用1mL1M NaOH溶解，用pH8.0的Tris-HCl緩沖液定容至100ml，震蕩均勻，備用。

尿酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.0084g尿酸，用1mL 1M NaOH溶解，用pH8.0的Tris-HCl緩沖液定容至100ml，震蕩均勻，分別稀釋至100、200、300、400、500μmol/L，備用。

流動相：95％(V/V)0.015mol/L的NH₄H₂PO₄+5％(V/V)色譜級甲醇，超純水定容至1000ml，過0.22μm有機(jī)膜，超聲，備用。

(2)樣品預(yù)處理

將所述Tyr-Glu-Gly溶液分別取100μl于10ml離心管中，加入50μl黃嘌呤氧化酶，30℃下水浴保溫10min；加入2.9ml所述pH8.0的Tris-HCl緩沖液，400μl黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液，30℃下水浴保溫20min。反應(yīng)結(jié)束后，加入150μl 1M HCl，冷卻后過0.22μm水系膜，以pH8.0的Tris-HCl緩沖液代替多肽樣品溶液作為空白對照，待測。

色譜柱：ZorbaxEClipsePlusC18(4.6×250mm，5μm，安捷倫)

液相條件：洗脫液為5％(V/V)甲醇+95％(V/V)NH₄H₂PO₄，進(jìn)樣體積為20μl，流速lml/min，檢測波長為290nm，運(yùn)行時間15min。

黃嘌呤氧化酶抑制率IXO(％)表達(dá)式：

式中：C_control為空白組中尿酸的生成量，μmol/L；C_sample為樣品組中尿酸的生成量，μmol/L。

實施例1

取100μl 18mg/ml的Tyr-Glu-Gly溶液于10ml離心管中，加入50μl黃嘌呤氧化酶，30℃下水浴保溫10min；加入2.9ml所述pH8.0的Tris-HCl緩沖液，400μl黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液，30℃下水浴保溫20min；反應(yīng)結(jié)束后，加入150μl 1M HCl，冷卻后過0.22μm水系膜，以pH8.0的Tris-HCl緩沖液代替多肽樣品作為空白對照，待測。

實施例2

取100μl 16mg/ml Tyr-Glu-Gly溶液于10ml離心管中，加入50μl黃嘌呤氧化酶，30℃下水浴保溫10min；加入2.9ml所述pH8.0的Tris-HCl緩沖液，400μl黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液，30℃下水浴保溫20min；反應(yīng)結(jié)束后，加入150μl 1M HCl，冷卻后過0.22μm水系膜，以pH8.0的Tris-HCl緩沖液代替多肽樣品作為空白對照，待測。

實施例3

取100μl 14mg/ml Tyr-Glu-Gly溶液于10ml離心管中，加入50μl黃嘌呤氧化酶，30℃下水浴保溫10min；加入2.9ml所述pH8.0的Tris-HCl緩沖液，400μl黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液，30℃下水浴保溫20min；反應(yīng)結(jié)束后，加入150μl 1M HCl，冷卻后過0.22μm水系膜，以pH8.0的Tris-HCl緩沖液代替多肽樣品作為空白對照，待測。

實施例4

取100μl 12mg/ml Tyr-Glu-Gly溶液于10ml離心管中，加入50μl黃嘌呤氧化酶，30℃下水浴保溫10min；加入2.9ml所述pH8.0的Tris-HCl緩沖液，400μl黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液，30℃下水浴保溫20min；反應(yīng)結(jié)束后，加入150μl 1M HCl，冷卻后過0.22μm水系膜，以pH8.0的Tris-HCl緩沖液代替多肽樣品作為空白對照，待測。

實施例5

取100μl 10mg/ml Tyr-Glu-Gly溶液于10ml離心管中，加入50μl黃嘌呤氧化酶，30℃下水浴保溫10min；加入2.9ml所述pH8.0的Tris-HCl緩沖液，400μl黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液，30℃下水浴保溫20min；反應(yīng)結(jié)束后，加入150μl 1M HCl，冷卻后過0.22μm水系膜，以pH8.0的Tris-HCl緩沖液代替多肽樣品作為空白對照，待測。

測得實施例1～5中生成尿酸含量的色譜圖如圖1所示，Tyr-Glu-Gly對XO的抑制率如圖2所示。由圖2可知，所述多肽對黃嘌呤氧化酶抑制的IC50值為13.73mg/ml，即37.41mmol/L。

使用MGL tools 1.5.6、AutoGrid 4和AutoDock 4.0對Tyr-Glu-Gly和黃嘌呤氧化酶進(jìn)行分子對接。Tyr-Glu-Gly與黃嘌呤氧化酶分子對接的結(jié)果顯示：Tyr-Glu-Gly分別與黃嘌呤氧化酶的GLU802、ARG880、LYS771形成氫鍵作用，此外，進(jìn)入由LEU1014、PHE1009、THR1010、PHE914、LEU873、PRO1076、ASN768形成的活性口袋。分子對接的結(jié)果表明，Tyr-Glu-Gly與XO產(chǎn)生的相互作用主要由疏水作用及氫鍵作用主導(dǎo)。