本發(fā)明涉及抗癌化合物組蛋白去乙?；敢种苿╊I(lǐng)域，具體涉及組蛋白去乙酰化酶抑制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：組蛋白脫乙?；?HDAC)是一系列鋅離子依賴性的金屬蛋白酶,它們參與染色體結(jié)構(gòu)的修飾和改造,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄以及腫瘤抑制因子p53熱休克蛋白90和α-微管蛋白等一些重要蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子的活性，對腫瘤發(fā)生起到關(guān)鍵作用，是近年來抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的新靶點(diǎn)。組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histonedeacetylaseinhibitor，HDACI)簡稱HDACIs，是一系列化合物，有干擾與組蛋白去乙?；傅墓δ?，能有效抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。組蛋白去乙?；敢种苿┩ㄟ^增加細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭?，提高p21等基因的表達(dá)水平等途徑，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和(或)凋亡。組蛋白去乙?；敢种苿┮殉蔀槟[瘤靶向治療的研究新熱點(diǎn)，其對腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移的抑制作用和抗腫瘤血管生成作用也被證實(shí)，一些在體內(nèi)和體外活性較好的HDACI已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界上7個(gè)傳統(tǒng)的主要藥品市場(英、法、美、德、意、西、日)2000年的結(jié)直腸癌治療藥的銷售額約為6.3億美元(發(fā)病人數(shù)43.85萬人)，2010年的銷售額為17億美元(發(fā)病 人數(shù)53.29萬人)。而根據(jù)在在第三屆羅氏腫瘤論壇(2012年)，如今全球結(jié)直腸癌每年發(fā)病新病例數(shù)達(dá)94萬，每年近50萬人死于結(jié)直腸癌，估計(jì)的的結(jié)直腸癌治療藥市場至少為30億美元?，F(xiàn)今的結(jié)直腸癌發(fā)病率明顯增加，以老年群體和女性群體最為明顯。其中一個(gè)原因是診斷技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的早期患者被確診。用于治療結(jié)直腸癌的奧沙利鉑，伊立替康，5-FU/亞葉酸或卡培他濱皆為傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物，急需新型的靶向藥物來進(jìn)一步提高療效和降低副作用。乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤。根據(jù)CA:ACancerJournalforClinicians雜志(2010年影響因子94.262)公布的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，美國2014年有232670例女性罹患乳腺癌，約占女性新發(fā)惡性腫瘤的29％，排名女性惡性腫瘤發(fā)病率第一位。在我國北京、上海、天津等大城市的統(tǒng)計(jì)顯示乳腺癌同樣是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。乳腺癌發(fā)病的年齡分布在東西方國家有所不同，在高發(fā)區(qū)如北歐、北美等國家，乳腺癌從20歲左右開始出現(xiàn)，在絕經(jīng)期即45-50歲之前保持快速上升勢頭，大約年齡每增長10-20歲發(fā)病率上升1倍，絕經(jīng)期后上升相對緩慢，75-85歲達(dá)到最高。而在亞洲等低發(fā)地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率在絕經(jīng)后會(huì)略下降，一般乳腺癌的發(fā)病高峰在45-55歲之間，亞洲人移居西方國家后仍保持這種年齡分布特征。目前臨床上用于治療乳腺癌的細(xì)胞毒性化學(xué)藥物，如docetaxel和methotrexate，副作用很大；而靶向型新藥，如單克隆抗體類Herceptin和Avastin，價(jià)格都非常昂貴。目前臨床上初步研究的新型抑制劑為組蛋白脫乙酰酶抑制劑FK228(又名depsipeptide，romidepsin；注冊商標(biāo)名Istodax)，其在體外和體內(nèi)的人細(xì)胞系中均表現(xiàn)出抗腫瘤性質(zhì)。但是很多研究確認(rèn)FK228對腫瘤細(xì)胞的治療導(dǎo)致對血管生成和細(xì)胞生長的抑制，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和細(xì)胞分化。在2009年，F(xiàn)K228被FDA批準(zhǔn)用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤和周圍T細(xì)胞淋巴瘤的治療。中國專利201310130579.9，公開了一種組蛋白去乙?；敢种苿?，其結(jié)構(gòu)通式為：或其中，R1基團(tuán)為甲基、乙基、異丙基，R2基團(tuán)為甲基、正辛基；R3基團(tuán)為甲基、乙基、異丙基。該化合物主要用于制備預(yù)防或治療與組蛋白去乙?；刚{(diào)節(jié)異常有關(guān)的哺乳動(dòng)物疾病藥物中，該哺乳動(dòng)物疾病包括癌癥、神經(jīng)變性疾病、瘧疾和糖尿??；淋巴癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病和宮頸癌。中國專利201110364545.7，公開了一種組蛋白去乙?；敢种苿┘捌浜铣煞椒ê椭扑幱猛荆浣Y(jié)構(gòu)通式為：其中，R5基團(tuán)為氫，C1-12烷基，C3-12環(huán)烷基，-O-(C1-12烷基)，-NH-(C1-12烷基)或-S-(C1-12烷基),R1- R8如說明書所定義，這些化合物主要應(yīng)用于制備預(yù)防或者治療與組蛋白去乙酰化酶調(diào)節(jié)異常有關(guān)的哺乳動(dòng)物疾病藥物中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種新型結(jié)構(gòu)的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，其具有更小的毒性，通過作用于癌變細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)過程來恢復(fù)腫瘤抑制基因的正常表達(dá)、以及促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，來達(dá)到抑癌致癌的效果，它們作用于特定的分子靶標(biāo)，選擇性高，副作用低，且作用機(jī)理清晰。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該組蛋白去乙酰化酶抑制劑的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供該新型結(jié)構(gòu)的組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽渲委熃Y(jié)直腸癌以及乳腺癌的藥物組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：組蛋白去乙?；敢种苿┚哂腥缦陆Y(jié)構(gòu)通式或其藥學(xué)可接受的鹽，其中，R1和R2分別選自氫、羥基、硅烷氧基或烷氧基，或R1＝R2＝O；R3選自氫、三苯基甲硫基、對甲氧基芐硫基、2-(三甲基硅基)乙硫基、9-芴甲硫基、正戊酰硫基、正己酰硫基、正庚酰硫基或正辛酰硫基；R4選自三苯基甲基、對甲氧基芐基、2-(三甲基硅基)乙基、9-芴甲基、正戊?；⒄乎；?、正庚?；蛘刘；?。本發(fā)明提供的組蛋白去乙?；敢种苿?，具有更小的毒性，選擇性高，副作用低，且作用機(jī)理清晰，異議較少。進(jìn)一步地，R1為H，R2為OH，或者R1＝R2＝O。進(jìn)一步地，R3為正辛酰硫基或H。進(jìn)一步地，R4為正辛?；?。進(jìn)一步地，組蛋白去乙?；敢种苿┣灏?01(下文簡稱:CA101)的結(jié)構(gòu)式為：進(jìn)一步地，組蛋白去乙?；敢种苿┣灏?02(下文簡稱:CA102)的結(jié)構(gòu)式為：進(jìn)一步地，組蛋白去乙?；敢种苿┣灏?03(下文簡稱:CA103)的結(jié)構(gòu)式為：上述三種化合物CA101-CA103屬于環(huán)肽類高效組蛋白去乙?；敢种苿鼈冏饔糜谔囟ǖ姆肿影袠?biāo)，選擇性高，副作用低，且作用機(jī)理清晰。同時(shí)，本發(fā)明還提供了制備上述組蛋白去乙酰化酶抑制劑的合成方法，其反應(yīng)過程如下式：其中，第二步反應(yīng)中加入的清安101-3(下文簡稱:CA101-3)結(jié)構(gòu)式為優(yōu)選地，上述合成方法的最后兩步中：第6步反應(yīng)中，所述肽鍵縮合劑為：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N'、N'-四甲基脲六氟磷酸酯、苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽、3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸、六氟磷 酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基或雙(2-氧代-3-惡唑烷基)次磷酰氯中的任意一種。所述堿為堿性無機(jī)鹽或者有機(jī)堿。其中，所述堿性無機(jī)鹽為：碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸鉀或磷酸鉀中的任一種；所述有機(jī)堿為三乙胺、二異丙基乙基胺或吡啶中的任意一種。所述有機(jī)溶劑為N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或乙腈。第6步反應(yīng)中，加入的所述正辛酸與反應(yīng)物的摩爾比為1-10:1；其中所述反應(yīng)物:正辛酸:肽鍵縮合劑:1-羥基苯并三唑或1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑:堿的摩爾比為：1:1-2:1-3:1-3:1-5。第7步反應(yīng)中，優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、四氫呋喃、乙腈、二甲基亞砜或丙酮中的任意一種。所述氧化劑為氯鉻酸吡啶鹽、重鉻酸吡啶、2-碘?；郊姿帷⒋魉?馬丁氧化劑中的任意一種。所述氧化劑與反應(yīng)物的摩爾比為1-20:1。該系列合成方法為首次提出的全新方法，利用已知的小分子原料和已知中間體進(jìn)行合成，用化學(xué)合成方法提高了該化合物的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明還提供了所述組蛋白去乙?；敢种苿┰谥苽渲委熃Y(jié)直腸癌以及乳腺癌藥品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑用于治療癌癥包括但不限于結(jié)直腸、乳房；皮膚；淋巴結(jié)；宮頸；子宮；胃腸道； 胰腺，肺；卵巢；前列腺；口；腦；頭部和頸部；喉；睪丸；腎；胰腺；骨；脾；肝；膀胱；喉；或鼻腔的癌癥和復(fù)發(fā)或難治性癌癥。更包括心臟肥大、慢性心力衰竭、炎癥、心血管疾病、血紅蛋白病、地中海貧血癥、鐮狀細(xì)胞病、CNS病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥、MDS、良性前列腺肥大、口腔粘膜白斑、遺傳相關(guān)的代謝失調(diào)、感染、Rubens-Taybi、脆性X綜合征或α-1抗胰蛋白酶缺乏，或用于加速傷口愈合、或用于保護(hù)毛囊或用作免疫抑制劑。所述藥物還可被用于緩解慢性淋巴細(xì)胞性白血病、T-細(xì)胞淋巴瘤或皮膚炎癥，特別是牛皮癬、痤瘡或濕疹的功效。一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明所述的組蛋白去乙?；种苿┘八帉W(xué)可接受的載體或稀釋劑。優(yōu)選地，所述藥物為藥學(xué)接受的載體或者稀釋劑，所述載體或稀釋劑為片劑、膠囊、錠劑、糖錠、水、油懸劑、可分散性粉劑、顆粒劑、舌下片劑或注射劑。所述藥物適于經(jīng)口、直腸、腸胃外、鼻內(nèi)或經(jīng)皮給藥或通過吸入或通過栓劑或注射給藥的形式。所述化合物在HDAC介導(dǎo)病癥的治療或預(yù)防中同時(shí)能夠分別或順序使用其他的HDAC抑制劑、化療或抗腫瘤制劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比：1.與FK228有相似的主體結(jié)構(gòu)、但包含了新的結(jié)構(gòu)功能基團(tuán)。2.比FK228具有更小的毒性。3.作用于特定的分子靶標(biāo)，選擇性高，副作用低，且作用機(jī)理清晰，異議較少，尤其對于結(jié)直腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用。臨床前測試數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明提供的抑制劑能夠獨(dú)立用藥，尤其低劑量的CA101、CA102、CA103與現(xiàn)主流治療結(jié)腸癌藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)混合用藥向?qū)Y(jié)直腸癌HCT-116、SW480細(xì)胞株的活性都非常強(qiáng)；低劑量的CA101、CA102、CA103與現(xiàn)主流治療乳腺癌藥物紫杉醇(TAX)混合用藥向?qū)θ橄侔㎝CF-7細(xì)胞株的活性都非常強(qiáng)，前景相當(dāng)看好，顯然具有極大的開發(fā)價(jià)值。附圖說明圖1為化合物CA101，CA102，CA103和5-FU對腫瘤細(xì)胞株HCT116的抗增殖作用曲線圖；圖2為化合物CA101，CA102，CA103和5-FU對腫瘤細(xì)胞株SW480的抗增殖作用曲線圖；圖3為化合物CA101，CA102，CA103和TAX對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的抗增殖作用曲線圖。具體實(shí)施方式下面通過具體的實(shí)施例子對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。以下實(shí)施例組蛋白去乙酰化酶抑制劑CA101、CA102、CA103的合成路線是為了更好地說明闡述本
發(fā)明內(nèi)容，本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人 員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍包括且不限于所提供的案例。本發(fā)明的實(shí)施例中的組蛋白去乙?；敢种苿〤A101、CA102、CA103的合成路線，具體如下：實(shí)施例1：合成CA101的具體制備方法包括以下步驟：步驟一，制備CA101-2：CA101-2結(jié)構(gòu)式為：稱取原料CA101-1(2.88g，4.54mmol)，CA101-1的結(jié)構(gòu)式為置于50mL燒瓶中，加入重蒸二氯甲烷25mL，攪拌使固體全部溶解，然后緩慢滴加三氟乙酸5.76mL。滴加完成后室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，TLC點(diǎn)板查看反應(yīng)進(jìn)度，原料無剩余。將反應(yīng)液旋干，再用甲苯(5mL×2)溶解后旋干。然后用低壓油泵抽干1小時(shí)，得到淺棕色透明半固體，無需進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。步驟二，制備CA101-4：CA101-4結(jié)構(gòu)式為：將上部反應(yīng)所得產(chǎn)物溶解于25mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，在冰浴條件下依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(1.73g，9.08mmol)、1-羥基苯并三唑(1.23g，9.08mmol)、碳酸氫鈉(2.29g，27.22mmol)和CA101-3(2.89g，5.45mmol)，CA101-3的結(jié)構(gòu)式為繼續(xù)攪拌10分鐘后移除冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)16小時(shí)。TLC點(diǎn)板查看反應(yīng)進(jìn)度，原料無剩余后將反應(yīng)液倒入100mL蒸餾水中，攪拌10分鐘后用乙酸乙酯萃取(40mL×4)。將有機(jī)相合并，飽和食鹽水洗滌后用無水硫酸鈉干燥，拌粗硅膠旋干，過柱分離，PE/EA＝2/1洗脫。得白色固體(CA101-4)3.54g，兩步總產(chǎn)率為74.4％。CA101-4核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.49–7.37(m,12H),7.35–7.26(m,13H),7.23(dt,J＝14.6,7.3Hz,6H),7.00(d,J＝7.5Hz,1H),6.11(t,J＝7.8Hz,2H),5.54–5.42(m,1H),5.36(dd,J＝15.4,6.3Hz,1H),4.36(s,1H),4.23(dd,J＝11.9,8.4Hz,1H),4.07(dd,J＝13.4,6.9Hz,1H),4.02–3.91(m,2H),3.66(s,3H),3.34(s,1H),3.15–2.99(m,1H),2.65(ddd,J＝22.3,14.6,4.7Hz,2H),2.53–2.32(m,3H),2.29–2.21(m,3H),2.09(dd,J＝13.7,6.3Hz,2H),1.91(d,J＝3.4Hz,1H),1.73(s,3H),1.29(dd,J ＝14.1,6.6Hz,7H),1.20–1.11(m,1H),0.90(tt,J＝17.2,3.4Hz,10H)。步驟三，制備CA101-5：CA101-5的結(jié)構(gòu)式為：稱取原料CA101-4(3.50g，3.33mmol)溶解于四氫呋喃(25mL)中，在冰浴條件下伴隨攪拌緩慢滴加氫氧化鋰溶液(0.5mol/L，33.3mL，16.7mmol)，滴加完畢后攪拌10分鐘，然后移走冰浴，室溫下攪拌反應(yīng)2小時(shí)，TLC點(diǎn)板查看反應(yīng)進(jìn)度，確認(rèn)原料無剩余后將反應(yīng)液旋干，加入甲苯再旋干兩次，油泵抽干1小時(shí)，得到淺棕色透明半固體。無需進(jìn)一步純化，直接用于下一步反應(yīng)。步驟四，制備CA101-6：CA101-6的結(jié)構(gòu)式為：將上一步所得產(chǎn)物CA101-5溶解于重蒸二氯甲烷(300mL)，置于500mL恒壓滴液漏斗中；另取一個(gè)5000mL圓底燒瓶一個(gè)，放入磁力攪拌子，加入2-甲基-6-硝基苯甲酸酐(2.27g,6.6mmol)、4-二甲氨基吡啶(1.6g,13.32mmol)后用重蒸二氯甲烷3000mL溶解，將CA101-5二氯甲烷溶液伴隨攪拌緩慢滴加到上述溶液中，滴加時(shí) 間8小時(shí)。滴加完成后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16h，將反應(yīng)液旋干濃縮，拌粗硅膠旋干后，柱層析分離，洗脫液配比為PE/EA＝1/1到DCM/MeOH＝50/1。收集含有產(chǎn)物的洗脫液，濃縮旋干后得到米白色泡沫狀固體(CA101-6)421mg，兩步總產(chǎn)率16％。CA101-6核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.34(m,13H),7.31–7.27(m,10H),7.24–7.16(m,7H),7.03–6.91(m,2H),5.99(d,J＝6.6Hz,1H),5.67–5.56(m,1H),5.55–5.45(m,1H),5.34(dd,J＝15.4,6.7Hz,1H),4.36–4.24(m,1H),4.21(dd,J＝13.7,7.3Hz,1H),3.48(d,J＝33.1Hz,2H),3.25–3.07(m,2H),2.62–2.31(m,5H),2.24–2.14(m,2H),2.11–1.97(m,2H),1.86–1.70(m,2H),1.60–1.49(m,1H),1.39–1.28(m,5H),1.19–1.07(m,1H),0.89–0.91(m,9H)。步驟五，制備CA101-7：CA101-7的結(jié)構(gòu)式為：稱取原料CA101-6(406mg，0.398mmol)溶解于二氯甲烷(5mL)中，在冰浴條件下伴隨攪拌依次加入三乙基硅烷(334mg，1.99mmol，459μL)、三氟乙酸(453mg，3.98mmol，296μL)，繼續(xù)攪拌10分鐘后移走冰浴，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)后原料反應(yīng)完全，將反應(yīng)液旋干，再加入適量甲苯再次旋干兩次，所得混合物用二氯甲烷溶解后 拌粗硅膠旋干，柱層析分離，用PE/EA＝2/1洗脫液洗出第一組分后換洗脫液為DCM/MeOH＝10/1，得到白色固體(CA101-7)143mg，產(chǎn)率67.5％，由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，直接投下一步。步驟六，制備CA101：取原料CA101-7(141mg，0.26mmol)，溶解于5mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴條件下依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(200mg，1.04mmol)、1-羥基苯并三唑(141mg，1.04mmol)和碳酸氫鈉(175mg，2.08mmol)，攪拌10分鐘后緩慢滴加正辛酸(93.6mg，103μL，0.65mmol)，加料完成后冰浴攪拌10分鐘，然后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16小時(shí)。然后冰浴下加入10mL蒸餾水，用EA萃取(5mL×5)，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水溶液洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾后拌粗硅膠旋干，柱層析分離純化，PE/EA＝2/1洗脫，得無色油狀產(chǎn)物(CA101)75mg，產(chǎn)率36.8％。CA101核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(d,J＝7.4Hz,1H),7.11(d,J＝8.1Hz,1H),6.21(d,J＝6.1Hz,1H),5.85–5.65(m,2H),5.48(dd,J＝15.5,6.7Hz,1H),4.55(s,1H),4.36(s,1H),4.24(dd,J＝13.8,5.7Hz,1H),3.45(t,J＝6.3Hz,2H),3.27(s,1H),2.91(dd,J＝15.4,8.2Hz,2H),2.67–2.48(m,7H),2.31(dd,J＝12.8,5.9Hz,2H),2.00(d,J＝5.9Hz,1H),1.66(dd,J＝14.5,7.3Hz,5H),1.32(dd,J＝40.3,8.4Hz,25H),1.04–0.83(m,15H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ199.52,172.72,172.23,170.25,170.02,132.38,128.29,70.87,67.57,58.83,54.74,44.13,44.04,40.61,37.91,35.29,32.29,31.59,31.57,31.52,29.67,28.94,28.89,28.87, 27.87,27.79,27.00,25.68,25.65,22.56,22.30,15.25,14.02,13.83,11.41。實(shí)施例2：合成CA102的具體制備方法包括以下步驟：步驟一，制備CA102-2：CA102-2結(jié)構(gòu)式為：取CA102-1(2.4g，8.2mmol)，其結(jié)構(gòu)式為溶于24mL二氯甲烷中，然后逐滴加入三氟乙酸4.8mL，10分鐘內(nèi)加完。室溫?cái)嚢?小時(shí)后，旋干，并用甲苯(5mL×2)帶兩遍。油泵1小時(shí)抽干后直接投下一步。步驟二制備CA102-3：CA102-3的結(jié)構(gòu)式為：取CA102-2(1.57g，8.2mmol)溶于30mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，0℃下，依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(3.1g，16.4mmol)、1-羥基苯并三唑(2.1g，16.4mmol)和碳酸氫鈉(4.2g，49.2mmol)，然后加入N-Boc-丙氨酸(1.87g，9.8mmol)，0℃攪拌10分鐘，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后加入100mL 蒸餾水、40mL乙酸乙酯，室溫?cái)嚢?0分鐘后，分液，水相用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，合并有機(jī)相，依次用水(40mL)、飽和食鹽水(40mL)洗。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥。旋干過柱(PE/EA＝4/1-2/1),得產(chǎn)物(CA102-3)3g，淡黃色油狀物，產(chǎn)率80％。CA102-3核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.41(s,1H),5.06(d,J＝6.8Hz,1H),4.09(tt,J＝11.3,5.7Hz,1H),4.00–3.89(m,2H),3.67(s,3H),3.44(d,J＝4.6Hz,1H),2.89(d,J＝31.2Hz,1H),2.54(dd,J＝16.5,2.2Hz,1H),2.44(dd,J＝16.5,8.5Hz,1H),2.10(d,J＝35.5Hz,1H),1.92(dt,J＝6.7,4.6Hz,1H),1.41(s,9H),1.33(dd,J＝15.8,7.1Hz,3H),1.28–1.21(m,1H),1.12(tt,J＝14.7,7.4Hz,1H),0.95–0.76(m,6H)。步驟三，制備CA102-4：該步驟的制備方法和CA101-2的制備方法相同，添加同樣的反應(yīng)溶劑得到CA102-4。CA102-4的結(jié)構(gòu)式為：步驟四，制備CA102-5：該步驟的制備方法和CA101-4的制備方法相同，添加同樣的反應(yīng)溶劑得到CA102-5。CA102-5的結(jié)構(gòu)式為：CA102-5核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.42(d,J＝7.6Hz,6H),7.37–7.26(m,6H),7.22(dd,J＝14.2,7.0Hz,3H),6.45(d,J＝9.8Hz,1H),6.28(d,J＝7.5Hz,1H),5.68–5.56(m,1H),5.45(dd,J＝15.0,5.9Hz,1H),4.39(ddd,J＝20.9,16.0,10.1Hz,3H),4.01(dd,J＝13.6,9.9Hz,2H),3.72(s,1H),2.94(d,J＝29.0Hz,2H),2.67–2.40(m,5H),2.32–2.18(m,2H),2.17–2.07(m,3H),1.36(d,J＝7.0Hz,9H),0.91(t,J＝6.9Hz,10H)。步驟五，制備CA102-6：該步驟的制備方法和CA101-5的制備方法相同，添加同樣的反應(yīng)溶劑得到CA102-6。CA102-6的結(jié)構(gòu)式為：步驟六，制備CA102-7：該步驟的制備方法和CA101-6的制備方法相同，添加同樣的反應(yīng)溶劑得到CA102-7。CA102-7的結(jié)構(gòu)式為：CA102-7核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.42(d,J＝7.4Hz,6H),7.31(d,J＝7.3Hz,6H),7.23(t,J＝7.2Hz,3H),5.75–5.58(m,1H),5.50(dd,J＝13.4,6.6Hz,1H),5.40(dd,J＝15.4,6.6Hz,1H),4.38(dd,J＝14.5,7.5Hz,1H),4.26–4.10(m,1H),3.96(s,1H),3.88(s,1H),3.77(t,J＝6.3Hz,1H),2.59–2.32(m,3H),2.29–2.15(m,2H),2.07(d,J＝3.8Hz,2H),1.92–1.85(m,1H),1.78(d,J＝6.1Hz,1H),1.65(dd,J＝18.2,7.3Hz,3H),1.48–1.22(m,10H),0.92(t,J＝6.0Hz,9H)。步驟七，制備CA102-8：該步驟的制備方法和CA101-7的制備方法相同，添加同樣的反應(yīng)溶劑得到CA102-8。CA102-8的結(jié)構(gòu)式為：CA102-8核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.49(d,J＝9.0Hz,1H),5.76(dd,J＝13.8,7.1Hz,1H),5.64–5.47(m,2H),4.48–4.28(m,1H),4.14(d,J＝6.8Hz,1H),3.97(d,J＝26.3Hz,2H),2.64–2.51(m,4H),2.45–2.32(m,3H),1.91–1.72(m,3H),1.63(d,J＝7.1Hz,3H),1.46–1.20(m,12H),1.04–0.82(m,9H)。步驟八，制備CA102：取CA102-8(190mg，0.38mmol)溶于5mL無水N,N-二甲基甲酰胺中，0℃下，依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(146mg， 0.72mmol)、1-羥基苯并三唑(103mg，0.72mmol)、碳酸氫鈉(191.5mg，2.28mmol)，然后加入辛酸(67μL，0.42mmol)，0℃攪拌10分鐘，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。然后加入20mL水、5mL乙酸乙酯，室溫?cái)嚢?0分鐘后，分液，水相用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合并有機(jī)相，依次用水10mL、飽和食鹽水10mL洗，用無水硫酸鈉干燥。旋干過柱(DCM/MeOH＝100/1-40/1)，得產(chǎn)物(CA102)150mg，白色固體，產(chǎn)率63.3％。CA102核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.17(s,1H),7.64(d,J＝10.1Hz,1H),6.52(s,1H),5.86–5.68(m,1H),5.54(dt,J＝9.5,6.2Hz,2H),4.42(dd,J＝14.5,7.8Hz,1H),4.16(s,1H),3.97–3.76(m,2H),3.49(s,1H),2.92(t,J＝7.4Hz,2H),2.62–2.53(m,2H),2.52–2.37(m,3H),2.33(dt,J＝7.3,6.7Hz,3H),1.75(dd,J＝12.2,6.0Hz,2H),1.66(t,J＝8.2Hz,5H),1.45–1.17(m,15H),1.04–0.77(m,12H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ199.74,174.20,174.02,171.09,169.68,131.71,128.92,71.92,67.79,56.47,53.30,44.15,42.24,37.93,34.50,32.92,32.31,31.62,28.91,28.90,27.89,27.68,26.64,25.68,22.58,22.32,16.01,14.47,14.05,13.91,11.26。實(shí)施例3：合成CA103的具體制備方法包括以下步驟：取CA102(20mg，0.03mmol)溶于1mL重蒸二氯甲烷中，氮?dú)獗Ｗo(hù)。0℃冰浴下，加入戴斯-馬丁氧化劑(DMP)(34mg，0.075mmol)，0℃攪拌10分鐘，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。TLC監(jiān)測反應(yīng)完畢后，降溫至0℃，加入1mL二氯甲烷稀釋，然后依次加入飽和碳酸氫鈉1mL及1M硫代硫酸鈉1mL，攪拌 10分鐘后分液，水相用二氯甲烷(3mL×3)萃取，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水3mL洗，無水硫酸鈉干燥。旋干過柱(DCM/MeOH＝50/1)，得無色油狀物(CA103)，15mg，產(chǎn)率75.4％。CA103核磁數(shù)據(jù)：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝8.4Hz,1H),7.60(d,J＝7.1Hz,1H),7.01(d,J＝6.7Hz,1H),5.76–5.57(m,2H),5.42(dd,J＝15.4,6.5Hz,1H),4.37–4.10(m,3H),3.45(dd,J＝67.4,16.6Hz,2H),2.81(t,J＝7.2Hz,2H),2.47(dd,J＝14.8,7.7Hz,2H),2.22(dd,J＝13.6,6.7Hz,4H),1.61–1.54(m,3H),1.44(t,J＝12.9Hz,3H),1.20(d,J＝9.2Hz,15H),0.92–0.73(m,12H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ201.80,199.40,173.05,172.92,170.52,166.75,132.44,128.35,72.35,62.18,54.81,51.40,45.46,44.12,41.55,34.13,32.19,31.59,30.72,29.67,28.88,28.05,27.78,27.03,25.63,22.55,22.34,16.52,14.98,14.02,13.89,11.52。體外活性驗(yàn)證試驗(yàn)：1.結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HCT-116、SW480)體外活性試驗(yàn)：1)試劑配制：2)培養(yǎng)基的配制：細(xì)胞株培養(yǎng)基SW480DMEM+10％FBSHCT116DMEM+10％FBS3)化合物的制備：用DMSO稀釋CA101，CA102，CA103和5-FU，使其最終濃度為10mM，其中5-FU(5-氟尿嘧啶)是結(jié)直腸癌臨床一線藥物。CA101，CA102，CA103和5-FU，4個(gè)候選化合物作用終濃度從100μM至0μM，4倍梯度稀釋，共10或12個(gè)濃度點(diǎn)。4)細(xì)胞培養(yǎng)：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度，接種96孔板，每孔接種100μl細(xì)胞懸液細(xì)胞在37℃，100％相對濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。5)IC50實(shí)驗(yàn)：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度(依照細(xì)胞密度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果確定)，接種96孔板，每孔加100μl細(xì)胞懸液。細(xì)胞在37℃，100％相對濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后，用DMSO稀釋待測化合物，4倍梯度稀釋8或10次；再將稀釋后的化合物用培養(yǎng)基稀釋20倍，共9或11個(gè)點(diǎn)，按25μl/孔加入細(xì)胞，化合物終濃度從100μM至0μM，4倍稀釋，共10或12個(gè)濃度點(diǎn)。細(xì)胞置于37℃，100％相對濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)。吸棄培養(yǎng)基，加入含10％CCK-8的完全培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2-6小時(shí)。輕輕震蕩后在SpectraMaxM5MicroplateReader上測定450nm波長處的吸光度，以650nm處吸光度作為參比，計(jì)算抑制率。6)數(shù)據(jù)處理：按下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％；As:樣品的OA(細(xì)胞+CCK-8+待測化合物)；Ac:陰性對照的OA(細(xì)胞+CCK-8+DMSO)；Ab:陽性對照的OA(培養(yǎng)基+CCK-8+DMSO)；采用軟件GraphpadPrism5擬合IC50曲線并計(jì)算出IC50值。7)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)測試了4個(gè)候選化合物(CA101，CA102，CA103和5-FU)對2個(gè)人源腫瘤細(xì)胞株(HCT116和SW480)的抗增值作用?；衔镒饔媒K濃度從100μM至0μM，4倍梯度稀釋，共10或12個(gè)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1和表2所示：表1和表2分別為各化合物分別在不同細(xì)胞株的IC50值，曲線圖分別見附圖1和2。結(jié)果：其中3個(gè)化合物CA101，CA102和CA103對這2個(gè)腫瘤細(xì)胞株(HCT-116和SW480)的增殖均具有較強(qiáng)的抑制作用，IC50值在1-50nM之間。表1化合物在腫瘤細(xì)胞株HCT11中的IC50值化合物5-FUCA101CA102CA103IC50值(nM)13004.9472.73945.34表2化合物在腫瘤細(xì)胞株SW480中的IC50值化合物5-FUCA101CA102CA103IC50值(nM)95906.63110.4243.632.乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7)的體外活性試驗(yàn)：1)試劑配制：2)培養(yǎng)基的配制：細(xì)胞株培養(yǎng)基MCF-71640培養(yǎng)液+10％FBS3)化合物的制備：用DMSO稀釋CA101，CA102，CA103和TAX，使終濃度為10mM。其中TAX(紫杉醇)是治療乳腺癌的一線藥物。CA101，CA102，CA103和TAX，4個(gè)候選化合物作用終濃度從10μM至1nM，10倍梯度稀釋，共5個(gè)濃度點(diǎn)。4)細(xì)胞培養(yǎng)：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度，接種96孔板，每孔接種100μl細(xì)胞懸液細(xì)胞在37℃，100％相對濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。5)IC50實(shí)驗(yàn)：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度(依照細(xì)胞密度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果確定)，接種96孔板，每孔加100μl細(xì)胞懸液。細(xì)胞在37℃，100％相對濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后，用DMSO稀釋待測化合物，4倍梯度稀釋8或10次；再將稀釋后的化合物用培養(yǎng)基稀釋20倍，共5個(gè)點(diǎn)，按25μl/孔加入細(xì)胞，化合物終濃度從10μM至1nM，10倍稀釋，共5個(gè)濃度點(diǎn)。細(xì)胞置于37℃，100％相對濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)。吸棄培養(yǎng)基，加入含10％CCK-8的完全培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2-6小時(shí)。輕輕震蕩后在SpectraMaxM5MicroplateReader上測定450nm波長處的吸光度，以650nm處吸光度作為參比，計(jì)算抑制率。6)數(shù)據(jù)處理：按下式計(jì)算藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長抑制率％＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％。As:樣品的OA(細(xì)胞+CCK-8+待測化合物)；Ac:陰性對照的OA(細(xì)胞+CCK-8+DMSO)；Ab:陽性對照的OA(培養(yǎng)基+CCK-8+DMSO)；采用軟件GraphpadPrism5擬合IC50曲線并計(jì)算出IC50值。7)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)測試了4個(gè)候選化合物(CA101，CA102，CA103和TAX)對人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的抗增值作用?；衔镒饔媒K濃度從10μM至1nM，10倍梯度稀釋，共5個(gè)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3所示：表3為上述各化合物分別在不同細(xì)胞株的IC50值，曲線圖見附圖3。結(jié)果：相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道藥物作用48h后紫杉醇對MCF-7的IC50為0.4μmol/L，與本實(shí)驗(yàn)測得的0.211μmol/L的結(jié)果相近。其中3個(gè)化合物CA101，CA102和CA103對這1個(gè)腫瘤細(xì)胞株MCF-7的增殖均具有較強(qiáng)的抑制作用,IC50值在10-500nM之間。表3化合物在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中的IC50值化合物TAXCA101CA102CA103IC50值(nM)211.1335.272335.99919.643以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3