本發(fā)明涉及一種紫蘇籽抗氧化肽及其應(yīng)用，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物的種類繁多，但由于受加工技術(shù)條件的所限，農(nóng)作物的加工大都處于初級階段，其加工后的殘余物中仍有較大含量營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)等，而它們大多主要用于動物飼料或肥料工業(yè)及自然排放，不僅浪費了資源，同時也造成環(huán)境污染。植物活性肽概念的提出及分離檢測技術(shù)的提高，使人們開始逐漸重視對富含蛋白質(zhì)的農(nóng)副產(chǎn)品的深加工并從中獲得多種活性肽，如酪蛋白磷酸肽、降血壓肽、抗菌肽和易消化吸收肽等，植物來源活性肽的研究和開發(fā)對提高我國農(nóng)產(chǎn)品深加工的附加值具有重要作用。

抗氧化劑近些年來在國內(nèi)外發(fā)展很快，用途也越來越廣。研究認為人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老和許多疾病有關(guān)，因此抗氧化劑不僅用于含脂肪食品的抗氧化，而且作為功能因子用于保健食品及化妝品等的開發(fā)?？寡趸瘎┑姆N類很多，但一些化學合成的抗氧化劑如BHA、BHT等，由于其本身肯能具有毒副作用，各國政府紛紛對其強制規(guī)定了ADI值控制其過量添加。于是人們把目光逐步轉(zhuǎn)向從各種植物和動物組織中提取天然抗氧化劑?？寡趸钚远嚯挠捎诘投?、高效等特點，作為食品和機體的抗氧化劑，被認為是人工合成抗氧化劑的理想替代者。

抗氧化肽能有效地清除體內(nèi)過剩的活性氧自由基，保護細胞和線粒體的正常結(jié)構(gòu)和功能，防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，而氧化與人類及其他動物的許多疾病諸如癌癥、老化、動脈硬化等的發(fā)病機理有關(guān)。適當攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可以降低體內(nèi)自由基水平，防止脂質(zhì)過氧化，幫助機體抵御疾病。

紫蘇籽又稱蘇子，為唇形科紫蘇屬一年生草本植物紫蘇(Perilla frutescens)干燥成熟果實。紫蘇原產(chǎn)于中國，在我國華北、華南、華中、西南及臺灣省均有野生種和栽培種，是我國衛(wèi)生部首批許可的60種藥食同源植物之一。紫蘇作為我國傳統(tǒng)中藥藥材始載于明代醫(yī)圣李時珍《本草綱目》，具有“行氣寬中，清痰利肺，和血，溫中，止痛，定喘，安胎”的功效。紫蘇籽富含油脂，由于受到加工技術(shù)條件的限制，目前紫蘇籽在我國食品工業(yè)中主要局限于提煉油脂。

目前國內(nèi)外對紫蘇籽的研究大量集中在油脂的提煉和生物活性方面，而對其副產(chǎn)物中富含的蛋白質(zhì)開發(fā)和利用研究較少，對其活性多肽或其藥理研究國內(nèi)外幾乎沒有報道。因此，有必要充分利用我國十分豐富的紫蘇（紫蘇籽）植物資源，對其進行深入系統(tǒng)研究，為實現(xiàn)紫蘇籽中藥現(xiàn)代化和開發(fā)新型、高效、安全的健康食品提供科學依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種制備簡單，抗氧化活性強的紫蘇籽抗氧化肽，并且可以將該抗氧化肽應(yīng)用于保健食品和藥品的研制與開發(fā)。

本發(fā)明的一種抗氧化寡肽，其氨基酸序列Tyr-Leu，用單字母表示為YL，即由酪氨酸和亮氨酸2個氨基酸殘基構(gòu)成。

該抗氧化寡肽能夠有效的清除ABTS，超氧陰離子自由基以及各種活性氧自由基(ORAC)，同時具有很好的脂質(zhì)過氧化抑制效果；

該抗氧化寡肽對CHO及HepG-2細胞沒有毒害作用，且能夠保護HepG-2細胞免受過氧化氫誘導的細胞損傷。

紫蘇籽抗氧化肽的酶解制備方法：采用堿提酸沉法從紫蘇籽粕中得到紫蘇籽蛋白，采用堿性蛋白酶將其在酶解條件：pH 9.80、酶添加量3000U/g、底物濃度3%（w/v）、解酶時間5.00h，沸水浴10min滅酶，經(jīng)12000rpm離心10min，取上清液冷凍干燥，即為紫蘇籽蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物；

所述抗氧化肽分離純化方法：紫蘇籽蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物利用Sephadex G-25凝膠色譜進行分離，以去離子水為洗脫液，流速0.3 mL/min，測量洗脫組分214 nm波長處的吸光值；收集具有最佳抗氧化活性部分，利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）進一步分離；RP-HPLC的洗脫梯度為0~60 min，5%~40%（V/V）乙腈；流速為2.0 mL/min，檢測波長214 nm，收集保留時間為34min的洗脫峰，冷凍干燥即得所述抗氧化肽。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

所述抗氧化肽具有強自由基清除活性，對超氧陰離子和ABTS自由基及活性氧自由基都有強的清除作用，表明其在抗氧化活性開發(fā)和應(yīng)用方面有重要價值。紫蘇籽天然抗氧化肽YL對ABTS自由基清除率的IC₅₀值為3.71μg/mL; 當濃度為1.0mg/mL時，其對超氧陰離子自由基的清除率為42.63±0.47%。天然抗氧化肽YL的ORAC值為3.90±0.10μmol TE/mg 多肽。

此外，此天然抗氧化肽YL對體外亞油酸脂質(zhì)過氧化以及鼠肝脂質(zhì)過氧化都有很好的抑制效果。濃度為1.0mg/mL的抗氧化肽YL與亞油酸混合并放置在40℃的條件下，前四天其對亞油酸過氧化的抑制率接近30%，說明此天然抗氧化肽YL能夠有效地緩解脂質(zhì)過氧化速度，能夠防止含油脂食品腐敗，延長貨架期。此天然抗氧化肽YL對小鼠肝臟提取物脂質(zhì)過氧化抑制率的IC₅₀值為3.02 mg/mL，說明一定濃度的抗氧化肽YL對肝組織具有很好的保護效應(yīng)。

此天然抗氧化肽YL對正常CHO細胞及HepG-2細胞均無細胞毒性，且具有保護HepG-2免受過氧化氫氧化損傷的作用。CHO細胞經(jīng)0.1mg/mL YL 處理24小時后，正常細胞比例96.3%相對于未處理組96.7%沒有明顯變化，說明YL對CHO細胞沒有毒害作用。HepG-2細胞經(jīng)0.1mg/mL YL 處理24小時后，正常細胞比例77.0%相對于未處理組79.1%略有下降，但死細胞比例9.8%明顯下降，說明YL能誘導HepG-2細胞輕微衰亡但不致死。HepG-2細胞經(jīng)1mM H₂O₂誘導損傷后，正常細胞比例下降至44.3%，死亡細胞達到39.9%，若在過氧化氫誘導氧化損傷之前用0.1mg/mL YL 預處理HepG-2細胞，則會降低細胞的凋亡率（正常細胞61.7%，死亡細胞29.6%），說明此天然抗氧化肽YL能夠有效的保護HepG-2細胞氧化損傷。

附圖說明

圖1：紫蘇籽粕粗蛋白酶解產(chǎn)物Sephedex G-25凝膠過濾色譜圖。

圖2：凝膠色譜洗脫峰c峰反相高效液相色譜圖。

圖3：抗氧化肽的質(zhì)譜圖。

圖4：抗氧化肽YL對自由基的清除作用。A：ABTS自由基清除活性；B：超氧陰離子自由基清除活性；C：活性氧自由基清除能力(ORAC)。

圖5：抗氧化肽YL對亞油酸脂質(zhì)過氧化(A)及鼠肝脂質(zhì)過氧化(B)的抑制作用。

圖6：抗氧化肽YL細胞毒性實驗。A：正常CHO細胞；B：CHO+0.1mg/mL YL；C：HepG-2細胞；D：HepG-2+0.1mg/mL YL。

圖7：抗氧化肽YL對過氧化氫誘導HepG-2細胞氧化損傷的保護作用。A：HepG-2細胞；B：HepG-2+1mM H₂O₂；C：HepG-2+1mM H₂O₂+0.1mg/mL YL。

具體實施方式

本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于下述的實施實例。

實施例1

本發(fā)明所述抗氧化肽的分離純化包括Sephadex G-25凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜（RP-HPLC）兩個步驟。

紫蘇籽粗蛋白酶解產(chǎn)物的制備：先將紫蘇籽用石油醚進行脫脂處理，然后采用堿提酸沉法得到紫蘇籽粗蛋白，用堿性蛋白酶酶解紫蘇籽粗蛋白，采用堿性蛋白酶在其最佳酶解條件（pH 9.80，酶添加量3000U/g, 底物濃度3%（w/v））下解酶時間5.00h， 沸水浴10min滅活，經(jīng)12000rpm離心10min，取上清液冷凍干燥，即為紫蘇籽蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物；

Sephadex G-25凝膠過濾色譜：將紫蘇籽酶解產(chǎn)物凍干粉，溶解于去離子水中，12000 rpm離心30 min。取上清液用0.22 μm孔徑微濾膜過濾。Sephadex G-25凝膠柱（1.6cm×100 cm）用去離子水平衡，將已過濾的樣品上柱。用去離子水洗脫，流速0.3 mL/min，于214 nm波長處檢測洗脫液吸光值，繪制洗脫曲線，如圖1所示。收集洗脫c峰，冷凍干燥，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

高效液相色譜：去離子水溶解上述c峰凍干粉，采用RP-HPLC進一步分離。液相色譜系統(tǒng)為LC-20A，裝配Gemini 5μ C18 （250mm×10mm）反相柱 （Phenomenex，UK） ，用水和乙腈（含0.05%（V/V）三氟乙酸）構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫。洗脫梯度：0~60 min，5%~40%（V/V）乙腈；洗脫流速2.0 mL/min，檢測波長214 nm，洗脫曲線如圖2所示。收集洗脫留時間為34.17min，冷凍干燥即為本發(fā)明所述抗氧化寡肽。

將收集到的抗氧化組分冷凍干燥，采用高效液相色譜檢驗所得到的組分純度。經(jīng)檢測，該抗氧化肽組分純度達到95%，可測定其氨基酸序列。

用液相色譜與質(zhì)譜連用（LC-MS/MS）方法測定氨基酸序列（圖3），得到此抗氧化肽的氨基酸序列為Tyr-Leu(YL)。

實施例2

實施例1中得到的天然抗氧化肽活性進行研究：

ABTS自由基清除作用：用蒸餾水配制7 mmol/L的ABTS⁺溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液（使用前必須先在室溫下放置16 h）,分別將ABTS⁺和過硫酸鉀溶液按1∶1體積比混合,臨用前用pH 7.4 ，5 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液將混合液稀釋至吸光值A(chǔ)₇₃₄ 為0.70±0.02。取0.5 mL不同濃度的樣品和0.5 mL的ABTS自由基溶液混合靜置10 min后于734 nm下測其吸光值。用去離子水和還原型谷胱甘肽代替樣品分別作空白對照和陽性對照。ABTS自由基清除活力按下列公式（1）計算：

（1）

式中，A₀：空白對照組吸光值；A_s：樣品組吸光值。

超氧陰離子自由基清除作用：取0.4 mL樣品溶液加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.3）0.4 mL，以蒸餾水代替樣品做為空白對照管。震蕩混勻，25℃水浴中保溫10 min后加入1.5 mmol/L的鄰苯三酚鹽酸溶液0.1 mL（25 ℃水浴預熱），迅速混勻反應(yīng)5 min，每隔30 s在320 nm 處測定吸光度值A(chǔ)₃₂₀。用去離子水和還原型谷胱甘肽代替樣品分別作空白對照和陽性對照。作吸光值隨時間變化的回歸方程，曲線斜率為鄰苯三酚自氧化速率，樣品對超氧陰離子的清除活力按下列公式（2）計算：

（2）

式中，ΔA₀/min：空白對照組吸光值曲線斜率；ΔA_s/min：樣品組吸光值曲線斜率。

活性氧自由基清除能力（ORAC）：將50μL樣品溶液與100μL 70nM 熒光素鈉溶液混合在不透明的96孔板內(nèi)，并在37℃下孵化15min，然后，迅速在每個孔加入50μL 200mM AAPH 溶液，振蕩30s后迅速放入熒光酶標儀進行熒光測量。激發(fā)波長485nm， 發(fā)射波長530nm，每隔1min測量一次直至熒光強度不再變化。試驗中所有試劑必須用75 mM pH 7.0 磷酸緩沖液配置。用磷酸緩沖液和GSH溶液分別作為空白對照和陽性對照。配置0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM水溶性維生素E（Trolox）溶液作抗氧化標準定義抗氧化性。熒光衰減曲線面積(AUC)按下列公式(3)計算：

(3)

式中：f₀表示最初的熒光強度，f_i表示第i分鐘時的熒光強度。凈熒光衰減曲線面積(net-AUC)按下列公式(4)計算：

(4)

根據(jù)抗氧化強度與net-AUC呈線性相關(guān)確定Trolox標準曲線，最終ORAC值表示為μM Trolox equivalent (TE)/mg 多肽。

亞油酸過氧化抑制活性：將1.0 mg/ml樣品1.0 mL、2.5%（V/V）亞油酸無水乙醇溶液1.0 mL、50 mmol/L磷酸鹽（pH 7.0）2.0 mL和去離子水1.0 mL置于具塞試管，在40℃下避光恒溫培育7天。每隔24 h測定硫氰化鐵值表示亞油酸過氧化的程度。取0.1 mL上述反應(yīng)液與4.7 mL 75%（V/V）乙醇、0.1 mL 30%（W/V）硫氰酸銨溶液、0.1 mL 20 mmol/L 氯化亞鐵鹽酸（3.5%，W/V）溶液混合，反應(yīng)3 min后在500 nm下測定光吸收值，吸光值A(chǔ)500nm與亞油酸氧化程度呈正相關(guān)。用去離子水作陰性對照，以GSH和BHA作陽性對照。

鼠肝脂質(zhì)過氧化的抑制活性：取小鼠肝組織1.0 g, 用冰冷的生理鹽水漂洗后, 濾紙吸干, 稱重。置于5 mL小燒杯中, 量取9倍于體積塊體積的生理鹽水, 將2/3 的生理鹽水倒入燒杯中, 以眼科剪迅速剪碎組織塊, 再將剪碎的組織連同生理鹽水一起倒入玻璃勻漿器中, 然后用剩余的生理鹽水沖洗燒杯和眼科剪, 并倒入勻漿器, 勻漿6 ～ 8 min, 使組織勻漿化, 整個過程應(yīng)置于冰浴中完成。勻漿完全后將勻漿液以3000 ～ 4000 r/min離心10 ～ 15 min, 上清液即為10%肝組織勻漿液。

快速將0.1ml抗氧化肽樣品（濃度分別是0.5、1、2、4、8mg/ml）與1ml 0.5%肝組織勻漿液、0.1ml 6mM FeSO₄溶液、0.1ml 60mM H₂O₂溶液混合，并在37℃水浴1h。隨后加入1ml 15%三氯乙酸和1ml 0.67%硫代巴比妥酸溶液，并在95℃下加熱15min。冷卻至25℃，然后3000rpm 離心10min。測量在532nm波長下的吸光度。GSH作為對照組，蒸餾水作為空白組。鼠肝脂質(zhì)過氧化抑制率按下列公式（5）計算：

(5)

式中，A₀：空白對照組吸光值；A_s：樣品組吸光值。

經(jīng)本實施例測定，紫蘇籽天然抗氧化肽YL對ABTS自由基清除率的IC₅₀值為3.71μg/mL（圖4A）; 當濃度為1.0mg/mL時，其對超氧陰離子自由基的清除率為42.63±0.47%（圖4B）。天然抗氧化肽YL的ORAC值為3.90±0.10μmol TE/mg 多肽（圖4C）。

濃度為1.0mg/mL的抗氧化肽YL前四天其對亞油酸過氧化的抑制率接近30%（圖5A），說明此天然抗氧化肽YL能夠有效地緩解脂質(zhì)過氧化速度。此天然抗氧化肽YL對小鼠肝臟提取物脂質(zhì)過氧化抑制率的IC₅₀值為3.02 mg/mL，說明一定濃度的抗氧化肽YL對肝組織具有很好的保護效應(yīng)（圖5B）。

實施例3：

將實施例1中得到的天然抗氧化肽進行細胞毒性及抗氧化性研究：

細胞毒性實驗：經(jīng)復蘇的中國倉鼠卵巢細胞（CHO）和肝癌細胞(HepG-2)用含有10% 胎牛血清、2.0 mmol/L谷氨酸鹽和100 U/mL青霉素-鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基在濕潤的，含5%二氧化碳，溫度為37 ℃的環(huán)境下貼壁培養(yǎng)24~48 h。用胰酶在37 ℃下消化后加入RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)基進行吹打使細胞充分分散，接種到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)直至細胞貼壁面積達到80%以上。用終濃度為0.1mg/mL的 YL處理細胞24 h后用細胞雙染試劑Annexin V-FITC 和PI染色經(jīng)流式細胞儀檢測每孔細胞的細胞狀態(tài)。

對過氧化氫誘導肝癌細胞氧化損傷的保護實驗：經(jīng)復蘇的肝癌細胞(HepG-2)按上述方法培養(yǎng)，在6孔板內(nèi)細胞貼壁面積達到80%以上，終濃度為0.1mg/mL的 YL處理細胞18 h后再用1mmol/L過氧化氫處理細胞6h后，用細胞雙染試劑Annexin V-FITC 和PI染色經(jīng)流式細胞儀檢測每孔細胞的細胞狀態(tài)。

經(jīng)本實施實例測定，CHO細胞經(jīng)0.1mg/mL YL 處理24小時后，正常細胞比例96.3% (圖6B)相對于未處理組96.7% (圖6A)沒有明顯變化，說明YL對CHO細胞沒有毒害作用。HepG-2細胞經(jīng)0.1mg/mL YL 處理24小時后，正常細胞比例77.0% (圖6D)相對于未處理組79.1% (圖6C)略有下降，但死細胞比例9.8%明顯下降，說明YL能誘導HepG-2細胞輕微衰亡但不至死。HepG-2細胞經(jīng)1mM H₂O₂ 誘導損傷后，正常細胞比例下降至44.3%，死亡細胞達到39.9% (圖7B)，若在過氧化氫誘導氧化損傷之前用0.1mg/mL YL 預處理HepG-2細胞，則會降低細胞的凋亡率（正常細胞61.7%，死亡細胞29.6%） (圖7C)，說明此天然抗氧化肽YL能夠有效的保護HepG-2細胞氧化損傷。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大學

<120> 一種紫蘇籽抗氧化肽及其應(yīng)用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Tyr Leu

1