專利名稱：一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗氧化肽的制備方法，具體為一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法。
背景技術(shù)：
隨著人們生活水平的提高，活性氧和自由基導(dǎo)致的各種疾病嚴(yán)重危害了人類的健康，已經(jīng)引起了社會各界的廣泛關(guān)注。近年來，評價和篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)研究的新趨勢，而各種原料產(chǎn)生的抗氧化肽由于其低毒、 高效等特點，成為國內(nèi)外研究的熱點。目前，以酶水解蛋白質(zhì)獲得抗氧化肽的方法得到了很大的發(fā)展，各種不同來源的蛋白質(zhì)在專一酶的作用下，得到了許多具有高抗氧化活性的肽段。近年來，從廉價易得的動植物原料制備抗氧化肽的研究有很多，這些原料主要有大豆蛋白、玉米蛋白、麥胚蛋白、乳蛋白、魚類蛋白等，此外在牛奶蛋白、家蠅幼蟲蛋白等動物蛋白原料，以及黑米、菜籽、靈芝、 枸杞等植物蛋白原料中均獲得了具有抗氧化作用的活性肽。由此可見，生產(chǎn)抗氧化肽的原料范圍非常廣泛。南瓜籽作為南瓜的副產(chǎn)品，蛋白質(zhì)含量高達30% 40%，南瓜籽含有平衡性很好的各種必需氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸和兒童必需的組氨酸，并且有與人體所需氨基酸組成模式相似的必需氨基酸比例。南瓜籽蛋白質(zhì)在人體中的吸收率可達88 % 97 %， 生理效價為73 % 86 %，蛋白質(zhì)的品質(zhì)好、含量高，可見南瓜籽是一種優(yōu)質(zhì)的、廉價易得、產(chǎn)量巨大的植物蛋白資源。但是目前這些籽資源大多被用作飼料或被堆積甚至直接廢棄，不僅造成資源的浪費，而且造成環(huán)境污染。其實南瓜籽經(jīng)過清理、去皮后，可采用壓榨法、浸出法、超臨界(X)2萃取法等方法提取油脂，同時對提取的粗油進行精煉，即可得到香味濃郁、 風(fēng)味獨特的南瓜籽油，其品質(zhì)可以和大豆色拉油等油脂相媲美。提油后的餅粕含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，在美國和加拿大早有將其加工成高蛋白的動物飼料或肥料的報道，目前開發(fā)的重點則是其中的蛋白質(zhì)。國內(nèi)對榨油后的南瓜籽餅粕未能充分開發(fā)利用， 還處于起步階段。李燕杰等對南瓜籽餅粕的可開發(fā)性和其中蛋白質(zhì)資源的綜合利用進行綜述，提出了南瓜籽餅粕開發(fā)的兩種思路，即作為全部蛋白原料和作為部分蛋白原料，指出南瓜籽蛋白產(chǎn)品和蛋白飲料的開發(fā)具有一定的市場前景。但是目前國內(nèi)外對于南瓜籽多肽及其生理活性的研究幾乎沒有，還未見有將南瓜籽蛋白抗氧化肽作為抗氧化劑的報道，這對南瓜籽餅粕資源的開發(fā)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種原料來源廣泛、制造成本低、抗氧化活性高的南瓜籽抗氧化肽的制備方法。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法，包括以下步驟(1)南瓜籽分離蛋白溶液的制備以脫脂南瓜籽粉為原料，利用堿溶酸沉法得到南瓜籽分離蛋白，然后加水配制成質(zhì)量濃度為4 8%的南瓜籽分離蛋白溶液，攪拌均勻；(2)酶解將步驟(1)得到的南瓜籽分離蛋白溶液在沸水浴中加熱5 15分鐘使蛋白變性，冷卻后調(diào)節(jié)PH到2. 5 3. 5，然后加蛋白酶500(T8000U/g，在45 55°C水浴中水解2 6h，水解過程中保持PH恒定；(3)滅酶離心后的酶解液通過超濾富集活性肽，最后經(jīng)濃縮和冷凍干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。所述堿溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工藝條件是溫度為4(T50°C，料液比為 1 3(Γ40，pH值為l(Tll，浸提時間為1.5Uh。所述堿溶酸沉淀法為本領(lǐng)域公知技術(shù)， 本發(fā)明通過單因素和正交實驗確定了堿溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的最佳工藝條件是條件為溫度為50°C，料液比為1 30，pH值為11，浸提時間為1.5h，在此條件下蛋白質(zhì)的提取率達到85. 52%，純度為91. 07%。所述的蛋白酶是酸性蛋白酶或木瓜蛋白酶或風(fēng)味蛋白酶或2709堿性蛋白酶或 Alcalase2. 4L堿性蛋白酶中的任意一種。上述五種蛋白酶均為現(xiàn)有公知商品，其中酸性蛋白酶至少可從寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司購得，酶活力> 10萬，木瓜蛋白酶至少可從廣西南寧龐博生物工程有限公司購得，酶活力為80萬U/g，風(fēng)味蛋白酶至少可從廣西南寧龐博生物工程有限公司購得，2709堿性蛋白酶至少可從天津諾奧科技發(fā)展有限公司購得，酶活力為20萬U/g，Alcalase2. 4L堿性蛋白酶至少可從丹麥Novo Nordisk公司購得，酶活力為 2. 4AU-A/g。所述超濾所用超濾膜的截留分子量為4KDa，超濾壓力為0. 15^0. 25MPa、料液質(zhì)量濃度為廣3%、料液pH為6 8，操作時間為5(Γ70分鐘。所述離心時轉(zhuǎn)速為450(T5500r/min，離心時間為10 30分鐘。本發(fā)明所述南瓜籽抗氧化肽的最佳制備方法，包括以下步驟(1)南瓜籽分離蛋白溶液的制備以脫脂南瓜籽粉為原料，利用堿溶酸沉法得到南瓜籽分離蛋白，然后加水配制成質(zhì)量濃度為5%的南瓜籽分離蛋白溶液，攪拌均勻；(2)酶解將步驟(1)得到的南瓜籽分離蛋白溶液在沸水浴中加熱10分鐘使蛋白變性，冷卻后調(diào)節(jié)pH到2. 5，然后加酸性蛋白酶6000U/g，在50°C水浴中水解證，水解過程中保持pH恒定；(3)水解完成后迅速煮沸10 分鐘，使酶失活，冷卻后在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心20分鐘，然后將酶解液通過超濾富集活性肽，超濾膜的截留分子量為4KDa，超濾壓力為0. 2MPa、料液質(zhì)量濃度為2%、料液pH 為7，操作時間為60分鐘，最后經(jīng)濃縮和冷凍干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。上述步驟中，脫脂南瓜籽粉的制備方法為現(xiàn)有公知技術(shù)，本發(fā)明提供以下最佳方法將去皮南瓜籽在60°C烘箱中烘4小時，使水分含量在5%以下，然后粉碎，利用超臨界CO2 萃取技術(shù)進行脫脂，脫脂條件為萃取釜壓力25MPa，萃取溫度45°C，分離柱壓力lOMPa，分離溫度 50 0C，CO2 流量 2. 4-4. 2L/h。本發(fā)明通過以下實驗及數(shù)據(jù)分析得出上述工藝步驟的最佳參數(shù)，具體過程為 一、實驗方法
1、測定方法
1.1蛋白酶活力的測定
采用福林-酚法測定蛋白酶活力
1. 2水解度的測定
水解度(腿)=游離氨基氮含量 ^總氮含量1勸
其中游離氨基氮含量用甲醛電位滴定法，總氮含量用微量凱氏定氮法。1. 3 DPPH自由基(二苯代苦味?；杂苫?清除率的測定
DPPH自由基清除率采用比色法，具體過程為在反應(yīng)管中加入aiil 0. 2mmol/L的 DPPH乙醇溶液，再加入aiil不同濃度的南瓜籽蛋白水解液，混合均勻，室溫下避光反應(yīng) 50min后，于517nm波長處測定吸光度。同時以^iil DPPH溶液與^iil蒸餾水混合后的吸光度為對照組；以ani蒸餾水與ani乙醇混合后的吸光度為空白組。清除率(%)= [1-(A1-A2 )/A3] XlOO
式中A1為加水解液后DPPH溶液的吸光度；A2為空白水解液的吸光度；A3為未加水解液時DPPH溶液的吸光度。2、南瓜籽蛋白酶解液的制備
配置一定濃度的南瓜籽分離蛋白溶液，在沸水中加熱處理10 min，冷卻至酶解反應(yīng)的最適溫度，調(diào)節(jié)一定的PH值，然后按一定比例加入蛋白酶，反應(yīng)過程中使pH值保持恒定。反應(yīng)到預(yù)定時間，沸水浴滅酶10 min，冷卻后離心分離，上清液置于冰箱中待用。3、蛋白酶的篩選實驗
3.1單酶水解
參照廠家提供的酶最適反應(yīng)條件，選定底物(南瓜籽分離蛋白溶液，以下同)濃度為 0. 05g/mL(即質(zhì)量濃度為5%)，充分攪拌后，100°C水浴IOmin使蛋白變性，冷卻后調(diào)節(jié)pH到規(guī)定值，加酶量為2000U/g，水解4h。水解過程中保持pH基本恒定。水解完迅速煮沸IOmin 使酶失活，冷卻離心后分別測定水解度和DPPH清除率。4、單因素實驗設(shè)計
4.1酶添加量的確定
配置底物濃度為0. 05g/mL的蛋白溶液，在溫度為50°C，pH為3. 5，加酶量分別為500、 2000、4000、6000、8000 U/g的條件下水解4 h。以DPPH清除率為第一指標(biāo)，水解度為第二指標(biāo)，確定最佳的加酶量。4. 2最適溫度的確定
分別在溫度為30、40、45、50、55 °C的條件下進行水解，其它同上述操作，確定水解的最適溫度。4. 3最適pH值的確定
分別在pH2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5的條件下進行水解，其它同上述操作，確定水解的最適PH值。4. 4底物濃度的確定
分別在底物濃度為0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0. 10 g/ml的條件下進行水解，其它同上述操作，確定水解的最佳底物濃度。4. 5酶解時間的確定
分別測定水解2 h、4 h、6 h、8 h、10 h時的DPPH清除率，其它同上述操作，確定最佳的水解時間。5、酶解工藝條件的優(yōu)化在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用MINITAB15. 0軟件設(shè)計5因素兩水平的Plackett-Burman 篩選試驗，從5個因素中篩選出具有顯著性的因素，然后采用Box-Behnken中心組合試驗對其工藝參數(shù)進行優(yōu)化。
二、結(jié)果與分析 1、蛋白酶的篩選 1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如

圖1，得到回歸方程 y=0. Olllx+O. 0461，R2=O. 9996，線性良好，符合測定酶活力的要求。 1.2蛋白酶活力的測定 由于不同產(chǎn)家生產(chǎn)的蛋白酶采用不同的單位符號，給實際操作帶來不便，此外隨著儲藏時間和條件的影響，實際應(yīng)用時的酶活力已經(jīng)和出廠時有了一定的差別，故本發(fā)明采用福林酚法統(tǒng)一測定實驗選取的各種蛋白酶的實際活力，以便于操作，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，不同的蛋白酶所表現(xiàn)的酶活力具有較大的差異。由于植物蛋白的酶解比動物蛋白難，故有必要進行蛋白水解酶的篩選，以期獲得能夠產(chǎn)生較高活性的抗氧化肽的酶制劑。1. 3單酶的篩選
從圖2可以看出，5種蛋白酶對南瓜籽蛋白的酶解效果有差異。從抗氧化活性來看，C (酸性蛋白酶)效果最好，D (木瓜蛋白酶)和E (風(fēng)味蛋白酶)相當(dāng)；從水解度來看，A (2709 堿性蛋白酶)和B (Alcalase2.4L堿性蛋白酶)兩種酶占優(yōu)勢。本實驗的目的是制備抗氧化肽，因此以抗氧化活性為第一指標(biāo)，水解度為第二指標(biāo)，選擇C (酸性蛋白酶)作為第一步酶解用酶。2、酸性蛋白酶酶解的單因素結(jié)果 2. 1加酶量對酶解效果的影響
由圖3看出，南瓜籽蛋白酶解液對DPPH的清除率和水解度都隨著酶用量的增加而增大。當(dāng)加酶量超過6000 U/g時，清除率增加變得緩慢。這可能是由于加酶量小于6000 U/ g時，在底物濃度一定的情況下，增加的酶量未使底物濃度飽和，隨著加酶量的增大，反應(yīng)速度越快，蛋白質(zhì)水解度也越高，得到的多肽液清除DPPH的能力越強。而當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時，底物濃度相對較低，酶分子過飽和，所以水解程度變化不大，活性多肽的量不再增加。同時，酶量的增加也會使生產(chǎn)成本大大增加，所以本發(fā)明選擇酶用量為500(T8000U/g較為合適，最佳為6000 U/g。2. 2溫度對酶解效果的影響
溫度對酶催化反應(yīng)的影響是多方面的，溫度提高會影響酶的穩(wěn)定性和底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的速度。由圖4可知，隨著溫度的升高，水解度程度加大，DPPH清除能力增強，50 °C左右時南瓜籽蛋白酶解液表現(xiàn)出最強的抗氧化活性，這可能是因為隨著溫度的升高，酶促反應(yīng)的速度加快，體系中活性多肽的含量增加；當(dāng)溫度高于50 ！時，蛋白酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶活降低，使活性肽的含量保持在一定水平。因此較適宜的酶解溫度為45飛5 °C，最佳為50 "C。2. 3 pH值對酶解效果的影響
PH能影響酶活性部位的解離和底物蛋白的解離，從而直接影響了酶與底物蛋白的結(jié)合與催化，每個催化反應(yīng)都有一個最適宜的PH，此外，不同的反應(yīng)條件對酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)有著不同的影響，從而使產(chǎn)物表現(xiàn)出不同的清除DPPH自由基的活性。由圖5可見，水解度隨著PH的增大先增加后減小，在pH=3. 5左右酶活性最高，水解度最大。酶解液的DPPH 清除能力隨著PH值的升高而下降并逐漸趨于平緩，旨在得到抗氧化活性較高的多肽片段， 因此選擇pH2. 5^3. 5作為較合適的pH值，最佳為2. 5。2. 4底物濃度對酶解效果的影響
由圖6所示，水解度隨著底物濃度的增加而減小，酶解液的DPPH清除能力卻先增大后減小，在0.06 g/ml左右達到最大。考慮到在低濃度時，溶液太稀不利于酶分子與蛋白質(zhì)分子相互作用，而實際生產(chǎn)也希望底物濃度較大，獲得較多的活性多肽；但是濃度過高，溶液比較粘稠，也會阻礙酶與蛋白之間的充分作用，使水解度降低。故初步確定酶解體系的較適底物濃度為0. 04 0. 08 g/ml (即質(zhì)量濃度為4 8%)，最佳為0. 06 g/ml (質(zhì)量濃度為6%)。2.5時間對酶解效果的影響
由圖7可以看出，隨著時間的延長，水解度和DPPH清除率都增大，但是4 h以后DPPH 清除率增加緩慢。由于在反應(yīng)的初始階段，蛋白酶活力最強，能與底物充分結(jié)合，而且底物濃度最大，酶作用位點也最多，此時水解度和酶解液活性顯著增加。隨著反應(yīng)的繼續(xù)進行， 底物濃度減少，產(chǎn)物濃度增加，對酶催化反應(yīng)起到抑制作用，同時酶活力也隨時間的延長而降低。這些因素共同導(dǎo)致酶解液的活性趨于穩(wěn)定，因此選擇較適合的反應(yīng)時間為2飛h，最佳為4 h。3、Plackett-Burman設(shè)計確定關(guān)鍵影響因素 3. 1 PB實驗設(shè)計與結(jié)果
根據(jù)單因素實驗得結(jié)果，設(shè)計了 N= 12的Plackett-Burman篩選實驗。每個因子取高 (+ 1)低(-1)兩個水平，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值Y，結(jié)果如表2所示。對PB實驗結(jié)果擬合模型的回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。各因素的效應(yīng)評價及系數(shù)顯著性檢驗見表4，P小于0. 05，說明該因素是顯著的，可進一步對其進行考察。表2 PB實驗設(shè)計與結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)南瓜籽分離蛋白溶液的制備以脫脂南瓜籽粉為原料，利用堿溶酸沉法得到南瓜籽分離蛋白，然后加水配制成質(zhì)量濃度為4 8%的南瓜籽分離蛋白溶液，攪拌均勻；(2)酶解將步驟(1)得到的南瓜籽分離蛋白溶液在沸水浴中加熱5 15分鐘使蛋白變性，冷卻后調(diào)節(jié)pH到2. 5 3. 5，然后加蛋白酶500(T8000U/g，在45 55 °C水浴中水解2飛h， 水解過程中保持PH恒定；(3)滅酶離心后的酶解液通過超濾富集活性肽，最后經(jīng)濃縮和冷凍干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法，其特征是堿溶酸沉淀法提取南瓜籽蛋白的工藝條件是溫度為4(T50°C，料液比為1 3(Γ40，ρΗ值為l(Tll，浸提時間為1. 5 2. 5h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法，其特征是所述的蛋白酶是酸性蛋白酶或木瓜蛋白酶或風(fēng)味蛋白酶或2709堿性蛋白酶或Alcalase2. 4L堿性蛋白酶中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法，其特征是所述超濾所用超濾膜的截留分子量為4KDa，超濾壓力為0. 15^0. 25MPa、料液質(zhì)量濃度為廣3%、料液pH為 6 8，操作時間為50 70分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法，其特征是所述離心時轉(zhuǎn)速為450(T5500r/min，離心時間為10 30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的一種南瓜籽抗氧化肽的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)南瓜籽分離蛋白溶液的制備以脫脂南瓜籽粉為原料，利用堿溶酸沉法得到南瓜籽分離蛋白，然后加水配制成質(zhì)量濃度為5%的南瓜籽分離蛋白溶液，攪拌均勻；(2)酶解將步驟(1)得到的南瓜籽分離蛋白溶液在沸水浴中加熱10分鐘使蛋白變性， 冷卻后調(diào)節(jié)pH到2. 5，然后加酸性蛋白酶6000U/g，在50°C水浴中水解證，水解過程中保持 PH恒定；(3)水解完成后迅速煮沸10分鐘，使酶失活，冷卻后在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心20分鐘，然后將酶解液通過超濾富集活性肽，超濾膜的截留分子量為4KDa，超濾壓力為 0. 2MPa、料液質(zhì)量濃度為2%、料液pH為7，操作時間為60分鐘，最后經(jīng)濃縮和冷凍干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗氧化肽的制備方法，目的在于提供一種原料來源廣泛、成本低、抗氧化活性高的南瓜籽抗氧化肽的制備方法，(1)南瓜籽分離蛋白溶液制備以脫脂南瓜籽粉為原料，利用堿溶酸沉法得到南瓜籽分離蛋白，然后加水配制成南瓜籽分離蛋白溶液；(2)酶解將南瓜籽分離蛋白溶液在沸水浴中加熱使蛋白變性，冷卻后調(diào)節(jié)pH到2.5~3.5，然后加蛋白酶5000~8000U/g，在45~55℃水浴中水解2~6h；(3)滅酶離心后的酶解液通過超濾富集活性肽，最后經(jīng)濃縮和冷凍干燥，得到南瓜籽抗氧化肽。所得抗氧化肽具有顯著的還原能力，較強的清除自由基的能力，應(yīng)用廣泛，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟效益；酶解工藝條件最優(yōu)，提高原料的利用率；原料來源廣泛，實現(xiàn)了廢物利用的目的。
文檔編號A23J3/34GK102197856SQ20111016935
公開日2011年9月28日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者劉艷榮, 范三紅 申請人:山西大學(xué)