專利名稱：狼尾草及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請案涉及用于培養(yǎng)纖維素分解微生物以產(chǎn)生纖維素酶的培養(yǎng)基、組合物和方法。
背景技術(shù)：
在過去的數(shù)十年中，針對纖維素酶系統(tǒng)的大部分研究主要集中于纖維素分解生物質(zhì)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生富能量(energy-rich)物質(zhì)(例如乙醇、氫氣和甲烷)。因此，已研發(fā)出許多相關(guān)技術(shù)(夏爾漢(Sheehan)和海默爾(Himmel)，1999)。這些生物技術(shù)的關(guān)鍵在于實現(xiàn)微生物和酶促纖維素水解范例的實用目標(biāo)(李德(Lynd)等人，2002)。然而，目前可用于將纖維素轉(zhuǎn)化成生物燃料的生物技術(shù)方法盡管頗具前景，卻相對缺乏深入研究。此外，使用天然形成的木質(zhì)纖維素(源自木材、草、林業(yè)廢料、廢紙、城市廢料，和農(nóng)業(yè)殘余物，例如玉米秸 和禾草)生產(chǎn)纖維素酶的趨勢在世界范圍內(nèi)已明顯增加。在所有原料中，農(nóng)業(yè)生物質(zhì)(由超過50%纖維素和半纖維素組成)因經(jīng)營成本極低而成為生產(chǎn)微生物酶的極佳碳源。降低微生物酶生產(chǎn)的成本已成為當(dāng)下生物燃料研發(fā)與生產(chǎn)的重要研究目標(biāo)。由于纖維素酶在眾多工業(yè)工藝(諸如動物飼料、淀粉加工、制曲和釀酒、谷物酒精發(fā)酵、水果和蔬菜加工、紙漿造紙業(yè)和紡織業(yè))中的應(yīng)用潛力巨大(博艾特(Bhat)，2000)，大量研究已集中于纖維素酶。許多產(chǎn)生各種纖維素分解酶的微生物已研究了數(shù)十年(李德(Lynd)等人，2002)。一些用于增加纖維素酶產(chǎn)量的培養(yǎng)方法已被廣泛報導(dǎo)，包括深層發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵(蓋嘉克(Grajek), 1987)、不同類型和濃度的底物(帕瓦林納(Pavarina)和杜蘭特(Durrant), 2002)、利用碳源和氮源進(jìn)行調(diào)節(jié)(洛克金頓(Lockington)等人,2002)、進(jìn)行共培養(yǎng)來產(chǎn)生纖維素酶(王(Wang)等人，2006)和菌株改良(艾德索爾(Adsul)等人，2007)?？紤]到需要使用纖維素酶進(jìn)行基于纖維素的物質(zhì)的糖化，因此篩選具有高纖維素酶活性、水解產(chǎn)物中無殘余物(例如纖維二糖)留下且具有熱-PH穩(wěn)定性酶的微生物將為有益的。在具有適用性、高活性和高生產(chǎn)力的纖維素酶的研發(fā)和生產(chǎn)過程中，成本問題是一個關(guān)鍵性問題。制備培養(yǎng)基的化學(xué)物質(zhì)是生長纖維素分解微生物以產(chǎn)生纖維素酶的典型花費。需要一種具有成本效益的培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于生長纖維素分解微生物以產(chǎn)生纖維素酶的具有成本效益的培養(yǎng)基和方法。因此,本發(fā)明一方面的特征在于一種含有狼尾(Napier ；NP)草(象草(Pennisetumpurpureum))的培養(yǎng)基。在一實例中，培養(yǎng)基包含約O. I %到5% (w/v)NP草碎片。培養(yǎng)基可含有氮(N)源。在一實例中，培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌。在另一實例中，培養(yǎng)基進(jìn)一步含有抗生素。在第二方面中，本發(fā)明的特征在于一種培養(yǎng)纖維素分解微生物的方法。所述方法包括以下步驟獲得上述培養(yǎng)基；和在所述培養(yǎng)基中，在允許纖維素分解微生物的細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。纖維素分解微生物的實例包括(但不限于)鐮刀菌屬(Fusarium spp·)、曲霉菌屬(Aspergillus spp.)和脈抱菌屬(Neurospora spp.)。優(yōu)選使用的纖維素分解微生物可為真菌，諸如黑曲霉菌(Aspergillus niger)、菌膜假絲酵母(Candida pelliculosa)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、裂裙菌(Schizopphyllum commune)和里氏木霉(Trichoderma reesei);細(xì)菌，諸如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)ATCC 21400、解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circulans)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、產(chǎn)玻拍酸擬桿菌(Bacteroides succinogenes)、幾肥纖維單胞菌(Cellumonas fimi)、潮濕纖維單胞菌(Cellulomonas uda)、熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)、非脫羧埃希菌(Escherichia adecarboxylata)、菊歐文氏菌(Erwiniachrysantemi)、雙抱小雙抱菌(Microbispora bispora)和高溫單抱菌 YX (ThermonosporaYX);或從諸如黃胸散白蟻(Reticulitermes fIavipes)、食木船蛆(Xylophaga)、澳洲土壟家白蟻(Coptotermes Iacteus)、黑胸象白蟻(Nasutitermes walkeri)、大和白蟻(Leucotermes speratus)(散白蟻屬(Reticulitermes))、蓋罩大蝸牛(Helixpomatia)、隱尾爐(Cryptocercus punctulates)、食木蟑螂(Panesthia cribrata)、桑粒肩天牛 (Calolampra elegans)和穴居蟑螂(Geoscapheus dilatatus)等動物獲得的其它微生物。在第三方面中，本發(fā)明的特征在于一種產(chǎn)生纖維素酶的方法。所述方法包括以下步驟獲得上述培養(yǎng)基，并在所述培養(yǎng)基中，在允許表達(dá)纖維素酶的條件下培養(yǎng)含有編碼纖維素酶的核酸的纖維素分解微生物(諸如選自鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬的真菌)的細(xì)胞；和從所培養(yǎng)的細(xì)胞或培養(yǎng)基純化纖維素酶。在第四方面中，本發(fā)明的特征在于一種具有上述培養(yǎng)基和纖維素分解微生物(諸如選自鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬的真菌)的細(xì)胞的組合物。可以使用上述方法和組合物，由木質(zhì)纖維素物質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖和能量。因而，在第五方面中，本發(fā)明的特征在于一種由木質(zhì)纖維素物質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法。所述方法包括提供具有上述培養(yǎng)基和纖維素分解微生物的細(xì)胞的組合物；和使所述組合物與木質(zhì)纖維素物質(zhì)接觸以產(chǎn)生可發(fā)酵糖。在一實例中，培養(yǎng)基含有約O. 1%到5%，例如1.0% (w/v)NP草碎片?？砂l(fā)酵糖可為葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、寡糖(例如纖維素低聚物或木糖低聚物)或其任意組合。木質(zhì)纖維素物質(zhì)的實例包括纖維素性動物廢料、城市固體廢料、廢紙、庭院廢料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物及其任意組合。所述方法可進(jìn)一步包括將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物的步驟。這一轉(zhuǎn)化步驟可通過微生物發(fā)酵或酶處理來進(jìn)行。在第六方面中，本發(fā)明的特征在于一種由木質(zhì)纖維素物質(zhì)產(chǎn)生能量的方法。所述方法包括提供上述組合物；使所述組合物與木質(zhì)纖維素物質(zhì)接觸以產(chǎn)生可發(fā)酵糖；轉(zhuǎn)化所述可發(fā)酵糖以產(chǎn)生可燃發(fā)酵產(chǎn)物；和燃燒所述可燃發(fā)酵產(chǎn)物或水解性固體廢料或殘余物以產(chǎn)生能量。在第七方面中，本發(fā)明的特征在于一種用于飼料或食品添加劑加工、生物制漿或復(fù)合物處理的方法。所述方法包括提供上述組合物，其包含培養(yǎng)基和纖維素分解微生物的細(xì)胞；和使所述組合物與待加工或處理的物質(zhì)接觸。在第八方面中，本發(fā)明的特征在于一種生物反應(yīng)器，其含有木質(zhì)纖維素物質(zhì)和上述組合物。本發(fā)明一個或一個以上實施例的細(xì)節(jié)將于所附圖式和以下描述中予以闡述。根據(jù)這些描述和圖式以及權(quán)利要求書，將易于了解本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢。


圖Ia到圖Ic為顯示與使用1% CMC相比，使用1% (w/v)NP草使(a)鐮刀菌屬、(b)曲霉菌屬和(C)脈孢菌屬3種真菌的總纖維素酶產(chǎn)量(FPase活性)增加的圖。所有菌株都在不存在大豆蛋白胨且以I % NP或I % CMC作為主要碳源的MR培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在不含上述碳源的相同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株指定為對照實驗(即無NP)。一般條件為pH 7.0、25°C到35°C以及150rpm，以1% NP草作為對照實驗。圖2a到圖2c為顯示最佳濃度的NP草使(a)鐮刀菌屬、(b)曲霉菌屬和(C)脈孢菌屬3種真菌的總纖維素酶產(chǎn)量(FPase)明顯增加的圖。所有菌株都在不存在大豆蛋白胨 且以不同百分比的NP作為主要碳源的MR培養(yǎng)基中在相應(yīng)最佳生長條件下培養(yǎng)。一般條件為pH 7. 0、25°C到35°C以及150rpm，以1% NP草作為對照實驗。
具體實施例方式本發(fā)明至少部分基于意外地發(fā)現(xiàn)狼尾草可用作有效而便宜的主要碳源供生長纖維素分解真菌，從而產(chǎn)生纖維素酶。狼尾(NP)草(象草)，常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)，已被廣泛用作反芻動物的飼料，并且其組成、性質(zhì)和部分基因組信息已得到充分研究；然而，尚無報導(dǎo)顯示可利用NP草來產(chǎn)生微生物纖維素酶。本發(fā)明提供NP草作為有效而便宜的碳源以生長最初從稻草或甘蔗渣堆肥分離的纖維素分解真菌(即鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬)的新應(yīng)用。結(jié)果顯示，當(dāng)使用1% (w/v)NP草作為這3種真菌的主要碳源時，總纖維素酶活性(FPase)顯著增加(鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬分別從O. 008增到O. 085、從O增到O. 085、從O. 002增到
O.124U/ml)(圖I)。將所有個別培養(yǎng)條件最佳化后，鐮刀菌屬和脈孢菌屬的最佳纖維素酶產(chǎn)量分別為O. 18到O. 22U/ml和O. 14到O. 16U/ml。在所研究的碳源(即葡萄糖、CMC和NP草)中，含有1% NP草的培養(yǎng)基不僅達(dá)成最佳的纖維素分解活性，而且是所有測試的碳源中最便宜的組合。這一發(fā)現(xiàn)使NP草成為改良由纖維素分解微生物產(chǎn)生生物燃料、紡織業(yè)和其它行業(yè)必需的纖維素酶的可額外選擇的主要碳源。舉例來說，在由木質(zhì)纖維素物質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖和能量時，可以使用纖維素酶。如本文所使用的術(shù)語“木質(zhì)纖維素物質(zhì)”是指含有纖維素和/或半纖維素的物質(zhì)。一般說來，這些物質(zhì)也含有木聚糖、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)，和碳水化合物，諸如淀粉和糖。舉例來說，在植物的莖、葉、外殼、外皮和穗軸(cob)，或樹木的葉、枝和木質(zhì)部中可發(fā)現(xiàn)木質(zhì)纖維素。復(fù)雜碳水化合物(諸如淀粉、纖維素或半纖維素)轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的過程在本文中也稱為“糖化”。如本文所使用的可發(fā)酵糖是指單糖，諸如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖或纖維二糖。木質(zhì)纖維素物質(zhì)可包括原始植物生物質(zhì)和/或非原始植物生物質(zhì)，諸如農(nóng)業(yè)生物質(zhì)、商業(yè)有機(jī)物、建筑物和廢墟碎屑、城市固體廢料、廢紙和庭院廢料。木質(zhì)纖維素物質(zhì)的常見形式包括樹、灌木和草、小麥、小麥秸桿、甘蔗渣、玉米、玉米皮、玉米粒(包括來自谷粒的纖維)、由研磨諸如玉米、稻米、小麥和大麥等谷物(包括濕式研磨和干式研磨)得到的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，以及城市固體廢料、廢紙和庭院廢料。木質(zhì)纖維素物質(zhì)也可為(但不限于)草本物質(zhì)、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物和造紙廠殘余物?！稗r(nóng)業(yè)生物質(zhì)”包括枝、灌木叢、藤莖、玉米和玉米皮、能源作物、森林、果類、花、谷物、草、草本作物、葉、樹皮、針狀葉(needle)、原木、根、苗木、短輪伐期木本作物(short rotation woodycrop)、灌木、柳枝稷(switch grass)、樹木、蔬菜、果皮、藤本植物、甜菜柏、小麥麩、燕麥殼、硬木和軟木(不包括含有害物質(zhì)的木材)、農(nóng)業(yè)過程所產(chǎn)生的有機(jī)廢料(包括耕種和林業(yè)活動，尤其包括林業(yè)木材廢料)或其混合物。此方法中所用木質(zhì)纖維素物質(zhì)的實例包括(但不限于)果園剪枝、樹叢、工廠廢料、城市木材廢料、城市廢料、砍伐廢料、森林撫育間伐(forest thinning)、短輪伐期木本作物、工業(yè)廢料、小麥、小麥秸桿、燕麥秸桿、稻草、大麥秸桿、黑麥秸桿、亞麻秸桿、大豆殼、
稻殼、燕麥殼、甘蔗、玉米、玉米秸、玉米秸桿、玉米面筋飼料、玉米穗、玉米皮、玉米粒、谷粒纖維、大網(wǎng)茅草(prairie grass)、鴨茅狀磨擦禾(gamagrass)、狐尾草、甜菜柏、柑桔果衆(zhòng)、種子殼、纖維素性動物廢料、草坪修剪物、棉花、海藻、樹木、灌木、草、甘蔗渣、谷物濕式研磨或干式研磨的產(chǎn)物和副產(chǎn)物、城市固體廢料、廢紙、庭院廢料、草本物質(zhì)、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物、城市固體廢料、廢紙、紙漿、造紙廠殘余物、枝、灌木叢、藤莖、玉米、玉米皮、能源作物、森林、果類、花、谷物、草、草本作物、葉、樹皮、針狀葉、原木、根、苗木、灌木、柳枝稷、樹木、蔬菜、果皮、藤本植物、甜菜柏、小麥麩、燕麥殼、硬木和軟木、農(nóng)業(yè)過程所產(chǎn)生的有機(jī)廢料、林業(yè)木材廢料或其組合。在此研究中，用含有狼尾(NP)草(象草)、CMC或葡萄糖作為主要碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)這些鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬真菌菌株，以在細(xì)胞外產(chǎn)生纖維素酶。結(jié)果顯示，當(dāng)使用1% (w/v)NP草培養(yǎng)這3種分離的真菌時，曲霉菌屬、鐮刀菌屬和脈孢菌屬的總纖維素酶活性(基于FPase測量值)顯著增加，分別從O (無NP)增到O. 085U/ml (I % NP)、從
0.008增到0. 085U/ml和從0. 002增到0. 124U/ml ;其為用1% (w/v)CMC培養(yǎng)時的總纖維素酶活性的約I到23倍。在最佳化的培養(yǎng)條件下達(dá)到最佳纖維素酶活性(對于曲霉菌屬和脈孢菌屬，分別為0. 18到0. 22U/ml和0. 14到0. 16U/ml)。此外，從I % NP批次收集的纖維素酶具有良好的PH值和溫度工作范圍，且在廣泛pH值下穩(wěn)定。在所有測試的碳源中，含有NP草的培養(yǎng)基不僅達(dá)到最佳的纖維素分解活性，而且還是最便宜的組合。這一發(fā)現(xiàn)提供NP草作為主要碳源的額外利用選擇，以改良由纖維素分解真菌產(chǎn)生生物燃料、紡織業(yè)和其它行業(yè)必需的纖維素酶。因此，本文所揭示的培養(yǎng)基、組合物和方法可按美國申請案20100047869和20080131958 以及美國專利 5232851、5677151、6451063、6602700 和 7226773 中所述的方式用于飼料或食品添加劑加工、生物制漿或復(fù)合物處理中，所述各案的內(nèi)容以引用的方式并入本文中。以下具體實例應(yīng)解釋為僅具說明性，且不以無論任何方式限制本發(fā)明的其余部分。無需進(jìn)一步闡明，相信所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本文的描述最大限度地利用本發(fā)明。本文所引用的所有出版物都以全文引用的方式并入本文中。此外，下文提出的任何機(jī)制不以任何方式限制所主張的發(fā)明的范圍。I.引言:在此研究中，使用3種產(chǎn)生纖維素酶的菌株鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬。這3種真菌菌株的培養(yǎng)條件經(jīng)最佳化以達(dá)到最佳的纖維素酶活性。將3種不同的天然或人工碳源(即狼尾草、CMC或葡萄糖)補(bǔ)充到培養(yǎng)基中以評估其在較低成本下增加纖維素酶產(chǎn)量的潛能。2.方法2. I 底物NP 草是從臺灣畜產(chǎn)試驗所(Taiwan Livestock Research Institute)(信華(Hsin-hua),臺灣臺南(Tainan, Taiwan))。羧甲基纖維素(CMC)、葡萄糖、β-對硝基-苯基-葡糖苷(β -pNPG)、華特曼(Whatman) I號紙和本研究中使用的所有化學(xué)物質(zhì)均購自西格瑪公司(Sigma)。CMC、華特曼I號紙和β -pNPG分別為CMCase、β -葡糖苷酶和FPase測量的底物。將濃度為1% (w/v)的CMC、葡萄糖和NP草用作碳源以檢查3種真菌中纖維素酶的產(chǎn)量。將NP草風(fēng)干，使用切碎機(jī)切成小片,研磨成較小顆粒,接著經(jīng)由通過O. 45mm篩網(wǎng)進(jìn)行最終分離。將通過篩網(wǎng)的部分和市售化學(xué)物質(zhì)用于培養(yǎng)基的制備。
2. 2接種和培養(yǎng)條件將Fp和RS-N菌株在28°C下維持于PDA瓊脂上5到7天，同時將RS-A維持于35°C下5到7天，此時，孢子形成的情況良好。使用來自此培養(yǎng)物的新鮮菌絲作為接種物。通過用5ml滅菌的水洗滌斜面培養(yǎng)物，制得分生孢子懸浮液。使用血球計對孢子懸浮液進(jìn)行計數(shù)，得到IO8個孢子/毫升。使鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬的2毫升孢子懸浮液在含有100ml MR培養(yǎng)基(不含O. I %大豆蛋白胨)的250ml燒瓶中生長，其中分別使用I % NP草、1% CMC或I %葡萄糖作為碳源來檢查纖維素酶產(chǎn)生。在5天培養(yǎng)期間，記錄在不同碳源中生長的3種真菌的纖維素酶活性。對于NP草的最佳濃度，采用不同百分比的NP并在相應(yīng)最佳生長條件下用不含O. I %大豆蛋白胨的MR培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。2. 3由3種真菌得到的粗纖維酶制劑將源自于用I % NP草培養(yǎng)的鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬的培養(yǎng)液在8，000 Xg下離心20分鐘以去除菌絲和未利用的底物。上清液經(jīng)由華特曼I號紙和0.45 μ m膜進(jìn)行過濾，且接著通過用并有3kDa膜(Vivaspin 20)的艾美康(Amicon)濃縮裝置過濾加以濃縮，其中在過濾過程中FPase活性損失小于3%。向上清液中添加O. 01% (v/w)疊氮化鈉(NaN3)以防止微生物生長。含有O. 01% NaNjP O. 01%苯基甲烷磺酰氟(PMSF，一種絲氨酸蛋白酶抑制劑)的濃縮粗酶制劑可在4°C下儲存，且I周后仍可保留80%的活性。使用粗酶制劑研究酶特征，包括最佳pH值、pH值穩(wěn)定性、最佳溫度和熱穩(wěn)定性。2. 4纖維素酶(CMCase、FPase和β -葡糖苷酶)活性分析對于碳源活性測試，使用方法中所述的相應(yīng)I %底物在40°C下測量鐮刀菌屬的粗酶提取物的CMCase、β -葡糖苷酶和FPase活性，但對于曲霉菌屬和脈孢菌屬，則在50°C下進(jìn)行測量。通過在200 μ I反應(yīng)混合物(100 μ I粗酶和100μ I于IOOmM NaOACUOOmMNaCl (pH 5.0)中的2%底物)中測量在10分鐘內(nèi)由I % CMC釋放的還原糖來測定CMCase。使用3mg I號(華特曼)濾紙作為底物，在200 μ I反應(yīng)混合物(如上)中經(jīng)I小時測定FPase活性。使用改進(jìn)的DNS法(伍德(Wood)等人，1988)，在添加200 μ I 二硝基水楊酸(DNS)且在100°C下加熱10分鐘后，測定釋放的總還原糖。一個單位(IU)CMCase和FPase活性定義為，在分析條件下每分鐘釋放Iymol葡萄糖(作為還原糖等效物)的酶量。對于葡糖苷酶活性，通過將β-pNPG(最終濃度lmM)與在乙酸鈉緩沖液(IOOmM NaOAC,IOOmM NaCl，pH5. 0)中制備的10 μ I酶溶液混合得到150 μ I工作體積來進(jìn)行3種真菌的分析。培育10分鐘后，通過添加50 μ I 2Μ碳酸鈉終止反應(yīng)。用分光光度計在400nm下測量3種真菌的反應(yīng)混合物的吸光度?；?-硝基苯酚校準(zhǔn)曲線計算β-葡糖苷酶活性。一個單位的酶活性定義為每分鐘釋放I μ mol 4-硝基苯酚的當(dāng)量數(shù)。3.結(jié)果與討論碳(C)源的影響諸如培養(yǎng)基復(fù)雜性和底物結(jié)構(gòu)復(fù)雜性等培養(yǎng)因素可能影響絲狀真菌分泌水解酶(庫爾琴科(Kurchenko)等人，2001)。在此研究中，估計不同的碳源(即NP草和CMC)改良鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬的纖維素酶分泌的潛能。結(jié)果顯示，3種真菌在無碳源補(bǔ)充的培養(yǎng)基中生長后總纖維素酶活性(FPase)極低。一旦在存在1% (w/v)NP草但無有機(jī)氮條件下培養(yǎng)(表I和圖l)，F(xiàn)Pase活性即顯著增加約60到105倍(即對于鐮刀菌屬、曲霉菌 屬和脈孢菌屬，分別從O增到O. 062U/ml、從O. 008增到O. 085U/ml和從O. 002增到O. 124U/ml)，這表示NP草誘導(dǎo)產(chǎn)生大量纖維素酶。CMCase和β -葡糖苷酶活性也顯示類似的改良(表I)，且與FPase相比，活性提高的程度更大。此外，用1% NP草培養(yǎng)的批次的FPase活性是用1% CMC培養(yǎng)的批次的約I到23倍。這些結(jié)果表明，NP草可用作理想碳源以改良此研究中分離的纖維素分解真菌的纖維素酶產(chǎn)生。此外，進(jìn)一步評估產(chǎn)生纖維素酶的最佳NP草濃度。通常，對于鐮刀菌屬和脈孢菌屬而言，F(xiàn)Pase活性隨NP草的量升高而增強(qiáng)，但5% NP除外(圖2a和圖2c)。鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬分別在2%、5%和3% NP草存在下培育4到5天后出現(xiàn)FPase最大值；這一值甚至比1%NP的值更高。本研究中所研發(fā)的基于NP草的培養(yǎng)基預(yù)期可節(jié)約50%的培養(yǎng)基成本，而碳源花費通常為總培養(yǎng)基成本的一半以上(表2)。據(jù)此推斷，NP草可為用于經(jīng)濟(jì)纖維素酶生產(chǎn)的較佳底物源。表I.使用I % (v/w) NP草作為主要碳源增強(qiáng)3種真菌的纖維素(FPase、CMCase和β-葡糖苷酶)產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)基，其包含狼尾(Napier ；NP)草(象草(Pennisetum purpureum))。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含約O.1%到5% (w/v)狼尾(NP)草(象草)碎片。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基包含約1%到3%(w/v)狼尾(NP)草(象草)碎片。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基經(jīng)滅菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基進(jìn)一步包含抗生素。
6.一種培養(yǎng)纖維素分解微生物的方法，其包含 獲得根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基；和 在所述培養(yǎng)基中，在允許纖維素分解微生物的細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其中所述纖維素分解微生物為一種或一種以上選自鐮刀菌屬(Fusarium spp·)、曲霉菌屬(Aspergillus spp.)和脈抱菌屬(Neurospora spp.)的真菌。
8.—種產(chǎn)生纖維素酶的方法，其包含 獲得根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基；和 在允許表達(dá)纖維素酶的條件下培養(yǎng)含有編碼所述纖維素酶的核酸的纖維素分解微生物的細(xì)胞；和 自所述培養(yǎng)的細(xì)胞或所述培養(yǎng)基純化所述纖維素酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述纖維素分解微生物為一種或一種以上選自鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬的真菌。
10.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基和纖維素分解微生物的細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述纖維素分解微生物為一種或一種以上選自鐮刀菌屬、曲霉菌屬和脈孢菌屬的真菌。
12.—種由木質(zhì)纖維素物質(zhì)產(chǎn)生可發(fā)酵糖的方法，其包含 提供包含根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基和纖維素分解微生物的細(xì)胞的組合物； 使所述組合物與木質(zhì)纖維素物質(zhì)接觸以產(chǎn)生可發(fā)酵糖。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述可發(fā)酵糖選自由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、寡糖及其任一組合組成的群組。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述木質(zhì)纖維素物質(zhì)選自由纖維素性動物廢料、城市固體廢料、廢紙、庭院廢料、農(nóng)業(yè)殘余物、林業(yè)殘余物及其任一組合組成的群組。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一權(quán)利要求所述的方法，其進(jìn)一步包含將所述可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化步驟是通過微生物發(fā)酵或酶處理來進(jìn)行。
17.一種由木質(zhì)纖維素物質(zhì)產(chǎn)生能量的方法，其包含提供根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的組合物； 使所述組合物與所述木質(zhì)纖維素物質(zhì)接觸以產(chǎn)生可發(fā)酵糖； 轉(zhuǎn)化所述可發(fā)酵糖以產(chǎn)生可燃發(fā)酵產(chǎn)物；和 燃燒所述可燃發(fā)酵產(chǎn)物或水解性固體廢料或殘余物以產(chǎn)生能量。
18.—種生物反應(yīng)器，其含有木質(zhì)纖維素物質(zhì)和根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的組合物。
19.一種用于飼料或食品添加劑加工、生物制漿或復(fù)合物處理的方法，其包含 提供包含根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一權(quán)利要求所述的培養(yǎng)基和纖維素分解微生物的細(xì)胞的組合物；和 使所述組合物與待加工或處理的物質(zhì)接觸。
全文摘要
狼尾草及其用途。本發(fā)明揭示用于培養(yǎng)纖維素分解微生物以產(chǎn)生纖維素酶的培養(yǎng)基、組合物和方法。
文檔編號C12R1/77GK102827801SQ201110169038
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日
發(fā)明者余淑美, 賀端華, 池俊利, 郭獻(xiàn)文, 劉建宏 申請人:中央研究院