專利名稱：一種利用木瓜蛋白酶檢測重金屬污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用木瓜蛋白酶檢測重金屬污染的方法。
背景技術(shù)：
木瓜蛋白酶(Papain，E C 3. 4. 22. 2)，主要存在于番木瓜莖葉與果實(shí)中，未成熟果實(shí)的乳汁中含量最高，因其穩(wěn)定性好，蛋白水解能力強(qiáng)，并且對多種蛋白質(zhì)均具有較好的降解作用，目前已被廣泛地應(yīng)用于諸多行業(yè)。在食品行業(yè)中，用于肉類嫩化、啤酒澄清、飼料添加劑和魚類加工；在工業(yè)行業(yè)中，用于明膠制造、蠶繭脫膠、皮革脫毛等；在醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)中，用于驅(qū)腸蟲劑、治療消化不良、各種炎癥以及水腫等疾病。但迄今為止國內(nèi)還未見將其用于重金屬檢測中的相關(guān)研究報(bào)道。隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，不規(guī)范、超常的工業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。人們?nèi)粘Ｉ钪谐涑庵罅亢亟饘俚膹U棄物(如電池、電器設(shè)備等)，這些廢棄物沒有得到有效的管理和處置，進(jìn)一步加劇了重金屬的污染和危害。當(dāng)重金屬通過土壤-植物系統(tǒng)遷移轉(zhuǎn)化，并經(jīng)過食物鏈的積累和放大作用，會對生物產(chǎn)生更大的毒害。為了保證食品和飲用水的安全，確保人們的身體健康，適用的方法和檢測手段顯得尤為重要和迫切。傳統(tǒng)的重金屬檢測方法有原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法、原子熒光光譜法和陽極溶出伏安法等，這些方法和技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，但存在著樣品前處理較為復(fù)雜、儀器費(fèi)用高和需要專業(yè)人員進(jìn)行操作等缺陷，難以用于重金屬的現(xiàn)場檢測。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的改善，人們對食品安全的要求不斷提高，待測樣品量迅速增加，傳統(tǒng)的檢測技術(shù)已無法滿足這種需求。因此，食品污染物的快速檢測技術(shù)越來越受到關(guān)注。近年來，酶已被用于測定環(huán)境介質(zhì)(水、土和廢棄物)和食品中的痕量有害物質(zhì)。酶抑制法作為一種快速檢測有害物質(zhì)殘留的方法，與傳統(tǒng)分析方法相比，具有簡便、快捷和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。它直接利用酶的抑制率大小來表示有害物質(zhì)殘留程度的高低，能在較短時(shí)間內(nèi)快速、靈敏的篩選出大量超標(biāo)樣品。而現(xiàn)在比較常用的檢測用酶主要集中在脲酶、磷酸酯酶、過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖氧化酶、丁酰膽堿脂酶和異檸檬酸脫氫酶等，其中，最常用的是脲酶。利用蛋白酶尤其是木瓜蛋白酶對重金屬進(jìn)行檢測的研究報(bào)道在國內(nèi)還是空白。而本方法的實(shí)施將可以有效拓寬酶抑制法的使用范圍更加擴(kuò)大、使用方法更加靈活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用木瓜蛋白酶檢測重金屬污染的方法。本發(fā)明所提供的利用木瓜蛋白酶檢測重金屬污染的方法包括以下步驟1)自新鮮番木瓜中提取木瓜蛋白酶；以標(biāo)準(zhǔn)R)lin法測定木瓜蛋白酶酶活；將木瓜蛋白酶和與重金屬離子溶液在30-50°C條件下混合，20-30min后以酪蛋白為底物，F(xiàn)olin 法測定木瓜蛋白酶酶活；2)制作重金屬對酶活的抑制曲線，根據(jù)酶活抑制率測定待測樣品中重金屬含量。
本發(fā)明測定重金屬濃度的方法屬于酶抑制法測定重金屬方法的范疇。是根據(jù)重金屬離子對木瓜蛋白酶的抑制率，進(jìn)而測定重金屬濃度的方法。本發(fā)明以木瓜蛋白酶為測定酶對待測樣品中的重金屬離子濃度進(jìn)行測定，有效擴(kuò)展了酶抑制法測定重金屬的方法。本發(fā)明所提供的重金屬檢測的方法具有操作簡單、反應(yīng)條件溫和、經(jīng)濟(jì)性好、檢測酶易獲得，以及能降低檢測成本等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為金屬離子對木瓜蛋白酶酶活的影響圖2為檢測Cu2+工作方程
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所述百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、酶液制備取未成熟的新鮮木瓜汁液離心取上清液，經(jīng)硫酸銨分級沉淀、sephadex-G50柱色譜純化得到木瓜蛋白酶。4 °C冰箱冷藏備用。實(shí)施例2、酶體系酶活測定蛋白酶活力采用Folin法測定。用50mM磷酸緩沖溶液(pH6. 5)配制的2%酪蛋白 (sigma)為底物。將酶液稀釋合適的倍數(shù)。取Iml稀釋的酶液，在40°C下保溫lmin，加入同樣溫度的底物lml，在40°C下反應(yīng)IOmin后，加入2ml三氯乙酸(1%)終止反應(yīng)。在40°C 下保溫15min,以12000rpm離心15min，取Iml上清液加入5ml 0. 4M碳酸鈉，混勻加入Iml 福林試劑(sigma)，混勻后在40°C保溫20min，測定OD66tl值。標(biāo)準(zhǔn)曲線用不同濃度的酪氨酸來制定，酶活力定義為在40°C下，每毫升酶液每分鐘催化酪蛋白水解生成1微克酪氨酸的酶量為1個(gè)單位(U/ml)。實(shí)施例3、酶體系對重金屬敏感性的篩選等體積酶液與重金屬溶液互溶至終濃度為lg/L，40°C放置反應(yīng)20min，而后按照實(shí)施例2進(jìn)行酶活測定。篩選出酶敏感的重金屬。重金屬離子可與酶蛋白結(jié)合使之變性或與某些蛋白的巰基結(jié)合而使酶失活，不同濃度金屬離子對酶活的影響如圖1所示，酶活抑制差異很大。酶對Cu2+最敏感，其次是Ag+。 其中Ag+對酶的活性抑制率達(dá)93%以上，而1 2+對酶的活性抑制率為36. 7%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。實(shí)施例4、木瓜蛋白酶體系檢測污水中Cu2+酶活測定方法同實(shí)施例2，以不同濃度Cu2+溶液為橫坐標(biāo)，酶活抑制率為縱坐標(biāo)， 每次測定重復(fù)3次，做Cu2+濃度抑制酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以Cu2+濃度為橫坐標(biāo)，酶活抑制率為縱坐標(biāo)，得到Cu2+濃度對酶活影響的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如附圖2所示，方程為y= 102. 67x+2. 1309， R2 = 0. 9890。計(jì)算其IC50為0. 47mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢出限為0. 0005mg/L。
權(quán)利要求
1. 一種利用木瓜蛋白酶對常見重金屬(鉛、汞等)污染進(jìn)行檢測的方法，包括以下步驟檢測體系基于蛋白質(zhì)含量測定法——Folin法，反應(yīng)體系特征是(1)將一定濃度的木瓜蛋白酶(預(yù)溶于50mM，pH6.5的磷酸緩沖溶液中)與一定濃度的干酪素建立的反應(yīng)為被檢測體系。(2)用50mM磷酸緩沖溶液(pH6.5)配制的2%酪蛋白為底物。將酶液稀釋合適的倍數(shù)，將其與一定濃度重金屬溶液混合后40°C下保溫30min。取Iml待測酶液，在40°C下保溫 lmin，加入同樣溫度的底物lml，在40°C下反應(yīng)IOmin后，加入2ml三氯乙酸(1%)終止反應(yīng)。在40°C下保溫15min，以12000rpm離心15min，取Iml上清液加入5ml 0. 4M碳酸鈉，混勻加入lml Folin試劑，混勻后在40°C保溫20min，測定0D660值。以空白樣品作為參比， 根據(jù)工作方程核算重金屬濃度。其檢測體系特征是以i^olin法測定木瓜蛋白酶酶活為反應(yīng)體系，利用重金屬離子對酶的的抑制作用，定量測定待測樣品中重金屬濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用木瓜蛋白酶酶抑制法測定重金屬濃度的方法。本發(fā)明所提供的重金屬濃度的方法，包括以下步驟1)自未成熟的番木瓜提取木瓜蛋白酶；2)以Folin法測定蛋白酶酶活；將不同濃度的重金屬與木瓜蛋白酶混合，40℃保溫30min后測定酶活抑制率；制作工作方程。3)將待測樣品稀釋至合適濃度，按照步驟2)測定木瓜蛋白酶酶活；利用2)得到的工作方程計(jì)算樣品中的重金屬濃度。本發(fā)明所提供的測定重金屬濃度的方法具有操作簡單、反應(yīng)條件溫和、經(jīng)濟(jì)性好、并能顯著降低檢測成本等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/37GK102286609SQ201110169299
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者朱運(yùn)平, 李秀婷, 滕超 申請人:北京工商大學(xué)