本發(fā)明涉及Leu-Asp-Val修飾的雙吲哚乙酸，即2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-ValA-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷，涉及它的合成，涉及它的抗血栓活性，因而本發(fā)明涉及它作為抗血栓抑制劑的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

吲哚乙酸的衍生物吲哚美辛(Indomethacin)除具有抗炎以及解熱鎮(zhèn)痛作用外，還可以通過(guò)抑制血栓素TXA2的合成而抑制血小板的聚集。我們的前期發(fā)明披露，通式II的雙吲哚衍生物(式中AA為氨基酸殘基)在1nml/kg口服劑量下具有抗血栓活性。在急性毒性研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)劑量通式II的雙吲哚衍生物的不能溶解。在通式II的雙吲哚衍生物的代謝研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)大鼠的糞便中含較高量通式II的雙吲哚衍生物。這些發(fā)現(xiàn)使發(fā)明人認(rèn)識(shí)到，提高雙吲哚衍生物的生物利用度至關(guān)重要。

經(jīng)過(guò)3年摸索，終于發(fā)現(xiàn)將通式II的乙基用3-羥基-4-甲氧基苯基代替，乙酰-AA用乙酰-Leu-Asp-Val替代可以達(dá)到改善生物利用度的目標(biāo)。于是，發(fā)明人提出來(lái)本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供下式Leu-Asp-Val修飾的雙吲哚乙酸，即2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-ValA-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷。

本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-ValA-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷的合成方法，該方法包括：

(1)吲哚乙酸在乙醇中經(jīng)濃硫酸催化，與異香草醛進(jìn)行Pictet-Spengler縮合，生成2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酸乙酯-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷；

(2)2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酸乙酯-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷在NaOH溶液(4N)中皂化反應(yīng)生成2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酸-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷；

(3)按照標(biāo)準(zhǔn)接肽方法制備Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(4)2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酸-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷與Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl偶聯(lián)得到2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷；

(5)2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷在甲醇中Pd/C催化氫解生成2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-Val-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷。

本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評(píng)價(jià)2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-Val-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷的抗栓活性。

附圖說(shuō)明

圖1 2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-Val-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷的合成路線.i)HOBt，DCC，NMM；ii)2N NaOH；iii)4N氯化氫-乙酸乙酯溶液；iv)Pb/c，H₂，甲醇。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1制備2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酸乙酯-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷(1)

1g(5.71mmol)吲哚-3-乙酸溶于40ml無(wú)水乙醇，滴加1ml濃硫酸，活化20min。加500mg(3.29mmol)3-羥基4-甲氧基苯基醛，室溫反應(yīng)6h，減壓濃縮至干。柱層析純化(石油醚/丙酮＝9/1-5/1)，得到870mg(57％)標(biāo)題化合物，為淡黃色糖漿。ESI/MS(m/e)：541[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：δ＝8.40(s，2H)，7.55(m，2H)，7.34(m，2H)，7.13(m，4H)，6.78(m，3H)，6.15(m，1H)，4.18(m，4H)，3.83(s，3H)，3.56(m，4H)，1.30(m，6H)。

實(shí)施例2制備2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酸-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷(2)

200mg(0.37mmol)2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酸乙酯-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷(1)溶于5ml丙酮，4N NaOH調(diào)pH＝12。室溫反應(yīng)6h。冰浴下用飽和KHSO₄調(diào)pH＝7， 減壓濃縮除去丙酮后，用飽和KHSO₄調(diào)pH＝2，水層用50ml乙酸乙酯萃取3遍，合并乙酸乙酯層，用飽和NaCl洗至中性，無(wú)水Na₂SO₄干燥。減壓過(guò)濾，濾液減壓濃縮至干，得到172mg(98％)標(biāo)題化合物，為紫色粉末。ESI/MS(m/e)：483[M-H]^-；¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ＝8.40(s，2H)，7.55(m，2H)，7.34(m，2H)，7.13(m，4H)，6.78(m，3H)，6.15(m，1H)，3.83(s，3H)，3.56(m，4H)。

實(shí)施例3制備Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

將808mg(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)溶于20ml無(wú)水THF中，冰浴下加入338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC，活化30min。往里加558mg(2.3mmol)HCl·Val-Obzl，用N-甲基嗎啉調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至9，室溫反應(yīng)8h，原料點(diǎn)消失。濾除DCU，減壓濃縮得到的油狀物用乙酸乙酯溶解，依次用40ml飽和NaHCO₃溶液洗3次，40ml飽和NaCl溶液洗3次，40ml飽和KHSO₄洗3次，40ml飽和NaCl溶液洗3次，40ml飽和NaHCO₃洗3次，40ml飽和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯層用Na₂SO₄干燥12h，濾除Na₂SO₄，濾液減壓濃縮，得到1.12g(93％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色油狀液體。ESI-MS(m/z)：512.4[M+H]⁺。

實(shí)施例4制備HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

將1.28g(2.5mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于少量的干燥乙酸乙酯中，冰浴下加入15ml氯化氫-乙酸乙酯溶液(4N)攪拌3h，原料點(diǎn)消失后減壓濃縮，殘留物用無(wú)水乙醚析晶，得到的目標(biāo)化合物化合物直接用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例5制備Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

將575mg(2.5mmol)Boc-Leu溶于20mL無(wú)水THF中，冰浴下加入338mg(2.5mmol)HOBt和619mg(3mmol)DCC，反應(yīng)液活化30min。往里加入1.03g(2.3mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl，用N-甲基嗎啉調(diào)反應(yīng)液pH至9，室溫?cái)嚢?h。原料點(diǎn)消失后濾除DCU，減壓濃縮得到的油狀物用100mL乙酸乙酯溶解，依次用40ml飽和NaHCO₃洗3次，40ml飽和NaCl溶液洗3次，40ml飽和KHSO₄洗3次，40ml飽和NaCl溶液洗3次，40ml飽和NaHCO₃洗3次，40ml飽和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯層用Na₂SO₄干燥12h。濾除Na₂SO₄，濾液減壓濃縮得到1.24g(83％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z)：626[M+H]⁺。

實(shí)施例6制備HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

將1.56g(2.5mmol)Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl溶于少量無(wú)水乙酸乙酯中，冰浴下加入20ml氯化氫-乙酸乙酯溶液(4N)攪拌3h，原料點(diǎn)消失后減壓濃縮，殘留物用 無(wú)水乙醚析晶，得到的目標(biāo)化合物化合物直接用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例7制備2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷(3)

將1g(2.07mmol)2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酸-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷(2)溶于50ml無(wú)水THF中，冰浴下加入586mg(4.35mmol)HOBt和937mg(4.55mmol)DCC，反應(yīng)液活化30min。往里加2.38g(4.55mmol)HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl，用N-甲基嗎啉調(diào)反應(yīng)液pH至9，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8h。原料點(diǎn)消失后濾除DCU，減壓濃縮，得到的油狀物用100ml乙酸乙酯溶解。溶液依次用40ml飽和NaHCO₃洗3次，40ml飽和NaCl溶液洗3次，40ml飽和KHSO₄洗3次，40mL飽和NaCl溶液洗3次，40ml飽和NaHCO₃洗3次，40mL飽和NaCl溶液洗3次，乙酸乙酯層用Na₂SO₄干燥12h。濾除Na₂SO₄，濾液減壓濃縮，得到1.70g(55％)標(biāo)題化合物，為無(wú)色固體。ESI-MS(m/z)：1499[M+H]⁺；Mp 121-122℃；(c＝0.08，CH₃OH).¹HNMR(300MHz，CDCl₃)：δ＝10.6(s，1H)，10.09(s，1H)，7.39(m，26H)，7.12(m，6H)，6.58(m，2H)，6.25(m，1H)，6.23(m，2H)，5.96(s，1H)，5.79(s，1H)，5.10(m，8H)，4.89(m，1H)，4.79(m，1H)，4.49(m，4H)，3.85(s，3H)，3.55(m，3H)，3.18(m，1H)，2.88(m，4H)，2.15(m，2H)，1.59(m，6H)，0.83(m，24H)。

實(shí)施例8制備2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp-Val-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷(4)

將50mg(0.03mmol)2，2’-雙(1H-吲哚-3-乙酰-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl-2-基)-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-甲烷(3)溶于20ml甲醇，加10mg Pd/C，通入氫氣。TLC(石油醚∶丙酮1.5∶1)檢測(cè)原料點(diǎn)消失，減壓過(guò)濾，濃縮至干，得到30mg(79％)標(biāo)題化合物，為紫色粉末。ESI-MS(m/z)：1138[M+H]⁺；Mp 176-177℃；(c＝0.10，CH₃OH).¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ＝12.49(s，2H)，11.57(s，1H)，10.90(m，1H)，8.49(m，2H)，8.42(m，2H)，7.59(m，4H)，7.29(m，1H)，7.20(s，1H)，6.99(s，2H)，6.93(m，2H)，6.79(m，1H)，6.59(s，1H)，6.42(m，1H)，6.19(s，1H)，4.63(m，2H)，4.40(m，2H)，4.13(m，2H)，3.72(s，3H)，3.56(m，4H)，3.13(m，2H)，2.73(dd，J＝16.5，6Hz，2H)，2.04(m，2H)，1.54(m，2H)，1.44(m，4H)，0.79(m，24H)。

實(shí)施例9評(píng)價(jià)4d1抗血栓活性

1)聚乙烯管的組裝：將聚乙烯管拉成一端為斜口的細(xì)管，定長(zhǎng)為10.0cm，分別為右經(jīng)靜脈(管徑較粗)及左頸動(dòng)脈(管徑較細(xì))插管；中段聚乙烯管定長(zhǎng)為8.0cm，血栓線壓在頸動(dòng)脈插管方向，插管前需在管中充滿肝素。

2)SD大鼠以0.1nmol/kg劑量4灌胃，30分鐘后腹腔注射20％的烏拉坦進(jìn)行麻醉。仰臥位將大鼠固定于鼠板上，剪開(kāi)頸部皮膚，分離右頸總動(dòng)脈及左頸靜脈，血管下壓線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，靜脈靠遠(yuǎn)心端處剪一小口，進(jìn)行靜脈端插管，注射肝素，系線固定，再用動(dòng)脈夾夾住動(dòng)脈近心端，靠近遠(yuǎn)心端方向剪一小口，進(jìn)行動(dòng)脈端結(jié)扎，系線固定后松開(kāi)動(dòng)脈夾，建立體外循環(huán)旁路。循環(huán)15分鐘后先剪斷靜脈端觀察血液循環(huán)是否正常，若正常從動(dòng)脈端取出血栓線，在紙上沾干浮血后稱(chēng)量并記錄其濕重，大鼠斷頸處死。每組大鼠10只，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并評(píng)價(jià)化合物活性。以栓重表示化合物的活性。表1的數(shù)據(jù)表明，4具有優(yōu)秀的抗血栓活性，有效劑量低達(dá)0.1nmol/kg，比發(fā)明入先前公開(kāi)的雙吲哚化合物的有效劑量低10倍，獲得了顯著的技術(shù)效果。此外，4的有效劑量是阿司匹林的1/1670000。

表1化合物4對(duì)SD大鼠栓重的影響

n＝10；a)與生理鹽水比，p＜0.01；b)與生理鹽水比p＜0.01，與阿司匹林比，p＞0.05。